抗肝癌基因工程单链抗体scFv25的制作方法

专利名称：抗肝癌基因工程单链抗体scFv25的制作方法技术领域：本发明主要涉及基因工程。特别是关于一种抗肝癌基因工程单链抗体。背景技术：按照世界卫生组织的统计，全世界每年就有100余万患者死于肝癌，而我国肝癌的发病率占全世界的42.5％。迄今国外的Shouval及Dunk等和国内的谢弘及我们等都报道了抗肝癌单克隆抗体，其中的一些单克隆抗体用131I标记后，进行了有效的临床肝癌放射免疫显像。然而鼠源性单克隆抗体用于病人会产生人抗鼠免疫球蛋白抗体，限制了在治疗中重复使用，因而使用基因工程的手段对单克隆抗体进行改造成鼠/人嵌合或单链抗体才是解决问题的好办法。虽然抗结肠癌、乳腺癌等肿瘤的基因工程鼠/人嵌合抗体、单链抗体等在国外已有许多报道，但抗肝癌的基因工程抗体国外目前尚未见报道，国内连我们的工作单位共有5个单位报导了肝癌单链抗体，如(1)牛利国等.细胞与分子免疫学杂志，1998，14(2)102-104。(2)毕向军、杨冬华.第一军医大学学报，2001，21(12)910-913.《肿瘤》2001，14(2)102-104。(3)谢捷明等。福建医学杂志，2000，22(1)203-205。(4)李赏等.免疫学杂志，2002，18(B)(06)20-21。我们最早在我国1996年克隆了单克隆抗体HAb25的轻链与重链的基因，1998年相继发表了抗肝癌基因工程单链抗体scFv25的应用论文，对scFv25进行了人源化、二硫键稳定以及融合蛋白的制备。发明内容本发明的目的是提供一种抗肝癌基因工程单链抗体scFv25，它利用基因工程将单克隆抗体改造成单链抗体，用于克服上述缺点。本发明的技术方案是制备了一种抗肝癌基因工程单链抗体scFv25，它的氨基酸序列是ATG CAG GTG CAG CTG TTG GAG TCT GGG ACT GAA CTG GTG AAG CCT GGG GCT TCAM Q V Q L L E S G T E L. V K P G A SGTG AAA CTG TCC TGC AAA GCT TCT GGC TAC ACC TTC ACC AGT TAT TGG ATG CACV K L S C K A S G Y T F TS Y W M HVH-CDR1TGG GTG AAG CAG AGG CCT GGA CAA GGC CTT GAG TGG ATT GGA GAG ATT AAT CCTW V K Q R P G Q G L E WI G EIA PAGC AAC GGT CGT ATT TAC TAC AAT GAA AAG TTC AAG AAC AAG GCC ACA CTG ACTS N G R I Y Y N E K F KN KA T LTVH-CDR2 GTA GAC AAA TCC TCC AAC ACA GCC TAT ATG GAA CTC ACC AGC CTG ACA TCT GAGV D K S SN T AY M E LT S L T SEGAC TCT GCG GTC TAT TCT TGT GCA AGA TTG GTG GGA CCC TTC TCT TAC TGG GGCD S A V Y S C ARL V GP F S Y WGVH-CDR3CAA GGC ACC CTG GTC ACC GTC TCC TCA GAG CTC GGT GGA GGC GGT TCA GGT GGAQ G TL V T V S S E LGG G G SG GGGT GGC TCT GGC GGT GGC GGA TCT GGA TCC AGA TGT GAG CTC GTG ATG ACC CAGG G SG G G GSG S R CE L V MT QLinkerACT CCA CTC TCC CTG CCT GTC AGT CTT GGA GAT CAA GCC TCC ATC TCT TGC AGAT P L S L P V S L G D QA S I S CRTCT AGT CAG AGC CTT GTA CAC AGT AAT GGA AAC ACC TAT TTA CAT TGG TAC CTGS S QS L V H S NGN TY L H W Y LVL-CDR1CAG AAG CCA GGC CAG TCT CCA AAG CTC CTG ATC TAC AAA GTT TCC AAC CGA TTTQ K P G Q S P K LL I YK V S N R FVL-CDR2TCT GGG GTC CCA GAC AGG TTC AGT GGC AGT GGA TCA GGG ACA GAT TTC ACA CTCS G V P D R F SG S G SG T D FT LAAG ATC AGC AGA GTG GAG GCT GAG GAT CTG GGA GTT TAT TTC TGC TCT CAA AGTK I S R V E A ED L G VY F CSQ SACA CAT GTT CCG TAC ACG TTG GGA GGG GGG ACC AAG GTC GAG ATC AAA CGT GTCT H V P Y TL GG G T KL E L KR VVL-CDR3GACD。所述的抗肝癌基因工程单链抗体scFv25，它的重链氨基酸序列是ATG CAG GTG CAG CTG TTG GAG TCT GGG ACT GAA CTG GTG AAG CCT GGG GCT TCAM Q VQ L LE SG T E L. V K P G A SGTG AAA CTG TCC TGC AAA GCT TCT GGC TAC ACC TTC ACC AGT TAT TGG ATG CACV K LS C K A SG Y T F TS Y WM HVH-CDR1TGG GTG AAG CAG AGG CCT GGA CAA GGC CTT GAG TGG ATT GGA GAG ATT AAT CCTW V KQ R P G Q G L E WI G EIA PAGC AAC GGT CGT ATT TAC TAC AAT GAA AAG TTC AAG AAC AAG GCC ACA CTG ACTS N GR I Y Y N E K F KN KA TL TVH-CDR2 GTA GAC AAA TCC TCC AAC ACA GCC TAT ATG GAA CTC ACC AGC CTG ACA TCT GAGV D KS S N T A Y M E L TS L T SEGAC TCT GCG GTC TAT TCT TGT GCA AGA TTG GTG GGA CCC TTC TCT TAC TGG GGCD SA V Y S C ARL V G PF S Y WGVH-CDR3CAA GGC ACC CTG GTC ACC GTC TCC TCA GAG CTCQ G T L V T V S S E L ；它的轻链氨基酸序列是GGA TCC AGA TGT GAG CTC GTG ATG ACC CAGG S R C E L V M T QACT CCA CTC TCC CTG CCT GTC AGT CTT GGA GAT CAA GCC TCC ATC TCT TGC AGAT P L S L P VS L G D Q AS IS CRTCT AGT CAG AGC CTT GTA CAC AGT AAT GGA AAC ACC TAT TTA CAT TGG TAC CTGS S QS L V HS N GN T YL HW Y LVL-CDR1CAG AAG CCA GGC CAG TCT CCA AAG CTC CTG ATC TAC AAA GTT TCC AAC CGA TTTQ K P G Q S P K LL I YK V S N R FVL-CDR2TCT GGG GTC CCA GAC AGG TTC AGT GGC AGT GGA TCA GGG ACA GAT TTC ACA CTCS G V P D R FS G S GS G T D F TLAAG ATC AGC AGA GTG GAG GCT GAG GAT CTG GGA GTT TAT TTC TGC TCT CAA AGTK I S R V E A ED L G V YF CSQ SACA CAT GTT CCG TAC ACG TTG GGA GGG GGG ACC AAG GTC GAG ATC AAA CGT GTCT H V P Y TL GG G T K LE L KR VVL-CDR3GACD；它的连接肽是GGT GGA GGC GGT TCA GGT GGA GGT GGC TCT GGC GGT GGC GGAG GGG S GG G GS G GG GlinkerTCTS。所述的人源化及二硫键稳定的scFv25氨基酸序列是GAA TTC GAG GTA CAG CTG GTT GAA TCT GGT GGT GGT CTG GTT CAG CCG GGT GGTTCT CTG AAA CTG TCT TGC GCT GCT TCT GGT TAC ACT TTC ACT TCT TAC TGG ATGCAC TGG GTT CGT CAG GGC CCG GGT AAA GGT CTG GAA TGG ATC GGT GAA ATT AACCCG TCT AAC GGT CGT ATC TAC TAC AAC GAA AAG TTC AAG AAC AAA GCT ACT CTG ACT GTT GAC AAA TCT AAG AAC ACT GCT TAC CTG CAG ATG AAC TCT CTG CGT GCTGAG GAC ACT GTG GTC TAT TCT TGT GCA AGA TTG GTG GGA CCC TTC TCT TAC TGGGGC TGT GGC ACC CTG GTC ACC GTC TCC TAG GAG CTC GGT GGA GGC GGT TCA GGTGGA GGT GGC TCT GGC GGT GGC GGA TCT GGA TCC ATG ACC CAG ACT CCA CTC TCCCTG CCT GTC AGT CTT GGA GAT CAA GCC TCC ATC TCC TGC AGA TCT AGT CAG AGCCTT GTA CAC AGT AAT GGA AAC ACC TAT TTA CAT TGG TAC CTG CAG AAG CCA GGCCAG TGT CCA AAG CTC CTG ATC TAC AAA GT T TCC AAC CGA TTT TCT GGG GTCCCA GAC AGG TTC AGT GGC AGT GGA TCA GGG ACA GAT TTC ACA CTC GAG ATC AGCAGA GTG GAG GCT GAG GAT CTG GGA GTT TAT TTC TGC TCT CAA AGT ACA CAT GTTCCG TAC ACG TTG GGA GGG ACC AAG GTC GAG ATC AAA本发明与已有技术对比特点是抗肝癌基因工程单链抗体scFv25除具有一般单链抗体的优点外，如分子量小、穿透能力强、免疫原性低、血循环及全身廓清快和容易基因工程大量生产等，进一步证明它保留并超出了HAb25的特异性及亲合性，并进行了人源化、稳定性及融合蛋白制备及应用，是一种非常具有临床应用潜力的基因工程抗体。下面对本发明抗肝癌基因工程单链抗体scFv25的实施进行详细说明。具体实施例方式一，抗肝癌单克隆抗体HAb25的制备用外科手术切除的新鲜的原发性肝细胞肝癌标本制备肝癌细胞悬液为免疫原免疫BALB/C小鼠，采用腹腔免疫途径，选择了腹腔巨噬细胞或胸腺细胞作为饲养细胞。将免疫后的小鼠脾细胞与SP2/O细胞融合，获得杂交瘤细胞，用石蜡切片进行免疫组织化学方法筛选，凡与正常肝细胞石蜡切片不反应而与肝癌切片反应的予以保留，得到可持续分泌抗体的杭肝癌单克隆抗体HAh25杂交瘤细胞株，将HAb25杂交瘤细胞株接种于小鼠腹腔，收集腹水，腹水内蛋白经硫酸胺沉淀和阳离子常压液相色谱纯化，获得HAb25活性蛋白。HAb25经检测证明具有较强的特异性和较高的亲和力，具体表现在；1、肝细胞肝癌石蜡切片阳性反应率为84％(79/94)，与癌周肝、肝炎、肝血管瘤、肝囊肿和肝转移瘤无交叉反应，与肝硬化只有5.7％(3/53)的交叉反应。2、经胶体金标记后，在4℃下与肝癌细胞作用1小时后，37℃下培养0，5，10、20、30、60、120分钟后，在电经电镜下观察到抗体通过胞饮、被覆内陷、绒毛折断吞噬、糖萼内陷及直接扩散途径内化到肝癌细胞。3.HAb25经131I标记后，注入荷人肝癌裸鼠，72小时可在肿瘤部位清晰显像(ECT)，T/N值为6.844.HAb25经131I标记后以3-5mci/人注入5名疑为肝癌的病人，其中4例在ECT下可显像。HAb25和药物的免疫交联物对荷人肝癌裸鼠有一定治疗作用。二、抗肝癌单链抗体(scFv25)的制备；从HAb25杂交瘤细胞中提取总RNA，逆转录合成cDNA，RT-PCR法扩增出单克隆抗体HAb25的轻、重链可变区基因(YL，VH)，经分析是重排的IgV区基因。将VLVH通过人工合成的多肽Linker连接起来，形成一个分子量只有全抗体1/6的活性抗体分子。具体说明如下1、取HAb25杂交细胞株，提取总RNA，经Oligo(dT)为引物逆转录合成cDNA，加轻、重链引物经PCR扩增出VL和VH，克隆入pUC19质粒载体并进行序列分析，与已知IgV序列比较，有较高的同源性，并右新抗体的一定变异，成功的获得了HAb25的轻、重链可变区基因VL.VH。2、单链抗体的构建先将人工合成的短肽Linker克隆入pUC19克隆载体，构建成pUC19-Linker，进一部将VL克隆入pUC19-Linker，构建成pUC19-Linker-VL，再将VH克隆入pUC19-Linker-VL，构建成pUC19-VH-Linke-VL，即重组抗肝单链抗体克隆载体pUC19-scFv25，然后将scFv25亚克隆入pET15b，构建成抗肝癌单链抗体的重组原核表达载体pET15b-SCFV25。3、scFv 25的诱导表达重组pET15b-scFv25.原核表达载体宿主菌经IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)诱导表达，收集菌体—提取包涵体 变性—>复性—>进一步纯化，获得抗肝癌单链抗体scFv 25；活性蛋白。4、scFv25的活性测定scFv25与SMMC-7721肝癌细胞作用封闭抗原后加亲本抗体HAb25，作用后加FITC标记的羊抗鼠IgG，以亲本抗体自身及无关抗体作对照。流式细胞仪测定结果显示，scFv25可封闭亲本抗体53％的亲和活性，在裸鼠内瘤/肝比值scFv25提高到9.6。三、scFv25的人源化改造及二硫键稳定和融合蛋白的制备应用1、人源化改造单克隆抗体在临床上有极大的应用价值，但应用于体内会诱导人抗鼠抗体(HAMA)反应，严重限制了它的应用前景。为降低鼠源抗体的免疫原性，必须将其进行人源化，HAb25是肝细胞癌特异性鼠源单克隆抗体，进行人源化改造，表达出的单链抗体将可能用于放射免疫显像及生物导向治疗。用同源模建预测抗体可变区的三维结构及利用蛋白质工作站，以计算机辅助设计确定人源化突变方案。根据人源化替换方案，重链可变区将对21处进行人源化，保留8处；轻链进行2处替换而保留其余7处差异残基。由于重链可变区的人源化突变集中于前80个氨基酸，可通过部分基因合成、重叠PCR方法构建人源化重链可变区基因；轻链可变区的两个突变则在引物中引入。根据人源化设计的结果，构建了肝细胞癌特异性鼠单抗HAb25的鼠源及人源化单链抗体基因并以3种不同的表达途径进行了表达研究。结果表明，不论是融合表达、胞内表达或分泌表达，还是降低培养温度、改变诱导物IPTG的浓度，表达产物都是以包涵体形式存在，经过其融合蛋白对裸鼠肝癌的治疗效果是满意的。2、二硫键稳定人源化hscFv25是1株很有前途的抗肝癌人源化抗体，但作为临床应用而言，重组抗肝癌单链抗体-hTNF仍存在一定的缺陷，这主要表现在单链抗体的稳定性差。由于上述缺陷，我们以二硫键稳定的单链抗体(ds-scFv)替代原来的单链抗体，提高了稳定性。二硫键稳定的单链抗体是在保留单链抗体的Linker的基础上，在轻、重链内各定点突变引入1个半胱氨酸，以完整的1条链的形式进行表达，并在轻重链可变区之间形成二硫键，达到提高稳定性的作用。由原来的37℃，1小时的半衰期，达到在4℃放置3个月活性无明显下降。3、融合蛋白制备及治疗效果制备并高效表达抗肝癌鼠及人源化单链抗体m/hscFv25，与人天然型TNF-α连接后取得了一定的治疗效果。但由于天然型TNF-α的毒副作用很大，用高活性、低毒性的突变型TNF-α(mTNF-α)将之替代，构建新型、高效、低毒的抗肝癌抗体原核表达载体pGEX4T-1/scFv25-mTNF-α，通过诱导表达、纯化后，对SMMC-7721肝癌细胞及荷肝癌裸鼠进行导向治疗研究。体内荷肝癌(SMMC-7721)裸鼠抑瘤实验结果显示，经抗体治疗14天后，mscFv25-mTNF-α和hscFv25-mTNF-α治疗组的肿瘤抑制率均为5/5，其中2/5为完全缓解，3/5为部分缓解，两组的疗效相似(P＞0.05)；mTNF-α对照组的肿瘤缓解率为5/5，均为部分缓解，较m/hscFv25-mTNF-α治疗组疗效明显降低(P＜0.05)。权利要求1.抗肝癌基因工程单链抗体scFv25，它的特殊氨基酸序列是ATG CAG GTG CAG CTG TTG GAG TCT GGG ACT GAA CTG GTG AAG CCT GGG GCT TCAM Q V Q L L E S G T E L. V K P G A SGTG AAA CTG TCC TGC AAA GCT TCT GGC TAC ACC TTC ACC AGT TAT TGG ATG CACV K L S C K A S G Y T F TS Y W M HVH-CDR1TGG GTG AAG CAG AGG CCT GGA CAA GGC CTT GAG TGG ATT GGA GAG ATT AAT CCTW V K Q R P G Q G L E W I G E I A PAGC AAC GGT CGT ATT TAC TAC AAT GAA AAG TTC AAG AAC AAG GCC ACA CTG ACTS N G R I Y Y N E K F K N KA T L TVH-CDR2GTA GAC AAA TCC TCC AAC ACA GCC TAT ATG GAA CTC ACC AGC CTG ACA TCT GAGV D K S S N T A Y M E L T S L T S EGAC TCT GCG GTC TAT TCT TGT GCA AGA TTG GTG GGA CCC TTC TCT TAC TGG GGCD S A V Y S C A RL V G P F S Y W GVH-CDR3CAA GGC ACC CTG GTC ACC GTC TCC TCA GAG CTC GGT GGA GGC GGT TCA GGT GGAQ G T L V T V S S E LG G G G S G GGGT GGC TCT GGC GGT GGC GGA TCT GGA TCC AGA TGT GAG CTC GTG ATG ACC CAGG G S G G G G SG S R C E L V M T QLinkerACT CCA CTC TCC CTG CCT GTC AGT CTT GGA GAT CAA GCC TCC ATC TCT TGC AGAT P L S L P V S L G D Q A S I S CRTCT AGT CAG AGC CTT GTA CAC AGT AAT GGA AAC ACC TAT TTA CAT TGG TAC CTGS S Q S L V H S N GN T Y L H W Y LVL-CDR1CAG AAG CCA GGC CAG TCT CCA AAG CTC CTG ATC TAC AAA GTT TCC AAC CGA TTTQ K P G Q S P K L L I YK V S N R FVL-CDR2TCT GGG GTC CCA GAC AGG TTC AGT GGC AGT GGA TCA GGG ACA GAT TTC ACA CTCS G V P D R F S G S G S G T D F T LAAG ATC AGC AGA GTG GAG GCT GAG GAT CTG GGA GTT TAT TTC TGC TCT CAA AGTK I S R V E A E D L G V Y F CS Q SACA CAT GTT CCG TAC ACG TTG GGA GGG GGG ACC AAG GTC GAG ATC AAA CGT GTCT H V P Y TL G G G T K L E L K R VVL-CDR3GACD。2.根据权利要求1所述的抗肝癌基因工程单链抗体scFv25，其特征是它的重链氨基酸序列是ATG CAG GTG CAG CTG TTG GAG TCT GGG ACT GAA CTG GTG AAG CCT GGG GCT TCAM Q V Q L L E S G T E L. V K P G A SGTG AAA CTG TCC TGC AAA GCT TCT GGC TAC ACC TTC ACC AGT TAT TGG ATG CACV K L S C K A S G Y T F TS Y W M HVH-CDR1TGG GTG AAG CAG AGG CCT GGA CAA GGC CTT GAG TGG ATT GGA GAG ATT AAT CCTW V K Q R P G Q G L E W I G EI A PAGC AAC GGT CGT ATT TAC TAC AAT GAA AAG TTC AAG AAC AAG GCC ACA CTG ACTS N G R I Y Y N E K F K N KA T L TVH-CDR2GTA GAC AAA TCC TCC AAC ACA GCC TAT ATG GAA CTC ACC AGC CTG ACA TCT GAGV D K S S N T A Y M E L T S L T S EGAC TCT GCG GTC TAT TCT TGT GCA AGA TTG GTG GGA CCC TTC TCT TAC TGG GGCD S A V Y S C A RL V G P F S Y WGVH-CDR3CAA GGC ACC CTG GTC ACC GTC TCC TCA GAG CTCQ G T L V T V S S E L ；它的轻链氨基酸序列是GGA TCC AGA TGT GAG CTC GTG ATG ACC CAGG S R C E L V M T QACT CCA CTC TCC CTG CCT GTC AGT CTT GGA GAT CAA GCC TCC ATC TCT TGC AGAT P L S L P V S L G D Q A S I S CRTCT AGT CAG AGC CTT GTA CAC AGT AAT GGA AAC ACC TAT TTA CAT TGG TAC CTGS S Q S L V H S N GN T Y L H W Y LVL-CDR1CAG AAG CCA GGC CAG TCT CCA AAG CTC CTG ATC TAC AAA GTT TCC AAC CGA TTTQ K P G Q S P K L L I YK V S N R FVL-CDR2TCT GGG GTC CCA GAC AGG TTC AGT GGC AGT GGA TCA GGG ACA GAT TTC ACA CTCS G V P D R F S G S G S G T D F T LAAG ATC AGC AGA GTG GAG GCT GAG GAT CTG GGA GTT TAT TTC TGC TCT CAA AGTK I S R V E A E D L G V Y F CS Q SACA CAT GTT CCG TAC ACG TTG GGA GGG GGG ACC AAG GTC GAG ATC AAA CGT GTCT H V P Y TL G G G T K L E L K R VVL-CDR3GACD；它的连接肽是GGT GGA GGC GGT TCA GGT GGAG G G G S G GGGT GGC TCT GGC GGT GGC GGA TCTG G S G G G G S。3.根据权利要求1所述的抗肝癌基因工程单链抗体scFv25，其特征是所述的人源化及二硫稳定后的氨基酸序列是GAA TTC GAG GTA CAG CTG GTT GAA TCT GGT GGT GGT CTG GTT CAG CCG GGT GGTTCT CTG AAA CTG TCT TGC GCT GCT TCT GGT TAC ACT TTC ACT TCT TAC TGG ATGCAC TGG GTT CGT CAG GGC CCG GGT AAA GGT CTG GAA TGG ATC GGT GAA ATT AACCCG TCT AAC GGT CGT ATC TAC TAC AAC GAA AAG TTC AAG AAC AAA GCT ACT CTGACT GTT GAC AAA TCT AAG AAC ACT GCT TAC CTG CAG ATG AAC TCT CTG CGT GCTGAG GAC ACT GTG GTC TAT TCT TGT GCA AGA TTG GTG GGA CCC TTC TCT TAC TGGGGC TGT GGC ACC CTG GTC ACC GTC TCC TAG GAG CTC GGT GGA GGC GGT TCA GGTGGA GGT GGC TCT GGC GGT GGC GGA TCT GGA TCC ATG ACC CAG ACT CCA CTC TCCCTG CCT GTC AGT CTT GGA GAT CAA GCC TCC ATC TCC TGC AGA TCT AGT CAG AGCCTT GTA CAC AGT AAT GGA AAC ACC TAT TTA CAT TGG TAC CTG CAG AAG CCA GGCCAG TGT CCA AAG CTC CTG ATC TAC AAA GT T TCC AAC CGA TTT TCT GGG GTCCCA GAC AGG TTC AGT GGC AGT GGA TCA GGG ACA GAT TTC ACA CTC GAG ATC AGCAGA GTG GAG GCT GAG GAT CTG GGA GTT TAT TTC TGC TCT CAA AGT ACA CAT GTTCCG TAC ACG TTG GGA GGG ACC AAG GTC GAG ATC AAA。全文摘要本发明主要涉及基因工程。特别是关于一种抗肝癌基因工程单链抗体。这种抗肝癌基因工程单链抗体scFv25，它利用基因工程将单克隆抗体改造成单链抗体，用于克服鼠源性单克隆抗体用于病人会产生人抗鼠免疫球蛋白抗体的缺点。它除具有一般单链抗体的优点外，如分子量小、穿透能力强、免疫原性低、血循环及全身廓清快和容易基因工程大量生产等，进一步证明它保留并超出了HAb25的特异性及亲合性，并进行了人源化、稳定性及融合蛋白制备及应用，是一种非常具有临床应用潜力的基因工程抗体。文档编号C07K16/44GK1535985SQ03114660公开日2004年10月13日 申请日期2003年4月9日 优先权日2003年4月9日发明者刘彦仿 申请人:中国人民解放军第四军医大学