兽药青霉素g降解物苄青霉噻唑酸人工抗原及其特异性抗体的制作方法

专利名称：兽药青霉素g降解物苄青霉噻唑酸人工抗原及其特异性抗体的制作方法技术领域：本发明属于小分子化合物(分子量小于1000道尔顿)免疫化学和残留分析技术 领域；涉及有机合成，免疫化学，生物化学及物化测试技术等；特别涉及具有涉及具有氢化 噻唑环与β-内酰胺环并合的杂环分子结构的青霉素类兽药青霉素G降解物苄青霉噻唑酸 小分子化合物人工半抗原、特异性抗原的设计合成。背景技术：青霉素G(亦称苄青霉素)是青霉素类抗生素的一种，青霉素类抗生素是进入临 床应用最早的一类抗生素，也是我国生产量最大、使用量最多的抗生素。青霉素类抗生素 已经成为治疗奶牛和其他可食性动物疾病最常用的药物，但由于用药的不规范和奶样收集 的不当，致使动物源性食品中青霉素类药物残留现象严重。青霉素类药物在体内残留会产 生严重的过敏反应，且过敏反应率高居各类药物之首。由于青霉素易在内酰胺酶作用 下降解为青霉噻唑酸，使青霉素失去抗菌活性，这使现有的检测方法无法检测出青霉素残 留，更加助长了牛奶生产中内酰胺类抗生素的滥用，加速了耐药菌的传播，严重威胁了 中国奶业的长期发展。为此，对青霉素残留的限制也因此越来越严格，并且对分析测定对 象、种类、数量、范围、指标等诸方面，都提出新的要求和更高的标准。中国农业部发布的动 物性食品中兽药最高残留限量，对青霉素G的规定肌肉≤50μ g/kg，脂肪≤50μ g/kg，肝 ≤ 50μ g/kg，肾≤50μ g/kg，奶≤4μ g/kg，虽然并没有对苄青霉噻唑酸作出相应规定，但 其造成的危害不容忽视。分子量小于1000道尔顿的小分子有毒化学品，如农药、兽药及其 代谢产物，其传统的残留分析主要是依靠气相色谱、液相色谱或色谱-质谱联用等分析手 段。这些理化分析方法，繁琐复杂、成本较高、分析速度慢，难以满足实际分析的需要，因此 迫切需要开发简便、快速、灵敏的分析技术。但是与大分子不同，小分子化合物免疫分析有自身特点(1)小分子化合物〔MW ≤ lOOOdolton〕一般不具有免疫原性，不能直接免疫动物产 生特异性抗体、必须合成突出分子立体结构特异性部位的半抗原，并与大分子载体连接构 成接合物，才能免疫动物产生针对这一目标小分子化合物的特异性抗体。这种半抗原与大 分子载体的结合物称为人工抗原。人工抗原的制备不是任意的，包括结合位点、结合方式、 载体种类、以及半抗原与目标分析物任何结构上的差异如大小、形状、成份、构型、构象、极 性、电子云密度等等在内的诸因素，都可能极大地影响着相应抗体的性质，因此它们是决定 产生其特异性抗体和建立免疫分析方法的关键。(2)虽然小分子化合物不具有免疫原性，但具有反应原性，即具有与相应抗体发生 免疫学反应的能力，并可体外定量进行，遵循质量作用定律。(3)基于抗原抗体免疫反应检测小分子化台物的分析技术，目前多采用酶联免疫 分析(ELISA)。利用酶促反应显示抗原抗体的定量结合，操作简单，又具有相当的灵敏度，近 年来发展很快。80年代以来发展起来的兽药ELISA和简易酶免疫EIA技术，使兽药残留分析在方法上获得更大的生命力；对使用快速分析样本基质过于复杂，用普通理化方法难以 分析的兽药残留，具有相当的应用价值。免疫分析技术被引入兽药残留分折领域，成为一种最有发展和应用潜力的定量分 析技术之一，受到广泛的重视。该技术研究的关键是半抗原的分子设计、合成和人工全抗原 及抗体的制备。因此，目标分析物分子免疫学特性，以及如何通过化学或生化技术突出和利 用这些特性，是该领域重要的研究内容。这一技术目前已成为微量分析研究的一个崭新领 域，可与传统分析方法并列作为一项新的分析途径。小分子化合物(分子量小于1000道尔顿)，依靠免疫学、免疫化学基本原理和生物 技术手段。该技术研究的关键是半抗原的分子设计、合成和人工全抗原及抗体的制备。因 此，目标分析物分子免疫学特性，以及如何通过化学或生化技术突出和利用这些特性，是该 领域重要的研究内容。这一技术目前已成为微量分析研究的一个崭新领域，可与传统分析 方法并列作为一项新的分析途径。目前青霉素G及其降解物苄青霉噻唑酸人工抗原尚未见 报道。发明内容需要解决的科学问题针对上述情况，当前急需一种简易快速有效地检测青霉素 G及其降解物苄青霉噻唑酸的方法。本发明的目的是通过设计合成具有6-氨基己酸分子结 构和β-内酰胺环分子结构的青霉素类兽药青霉素G及其降解物苄青霉噻唑酸的半抗原和 人工抗原，制备针对青霉素G及其降解物苄青霉噻唑酸的特异性抗体；独特之处在于突出 了这类兽药分子特异性抗原决定簇，又克服了化学合成的困难，免疫动物诱导产生亲合性 很高的特异性抗体。技术方案本发明设计、合成了小分子目标分析物的半抗原，并与载体蛋白质偶联，制备有效 的人工抗原，免疫动物制备针对小分子分析物的特异性抗体。其选择性决定于免疫学反应 的特异性，可为建立快速准确的青霉素G及其降解物苄青霉噻唑酸残留定量分析方法奠定 基础。该技术研究的关键是半抗原的分子设计、合成和人工全抗原的制备。苄青霉噻唑酸结构如下图所示权利要求1.兽药青霉素G降解物苄青霉噻唑酸人工抗原和抗体其特征在于使用分子式为2.权利要求1所述的兽药青霉素G降解物苄青霉噻唑酸半抗原的制备方法，其特征 在于是用下述步骤制得取OS，5R，6R) -3，3- 二甲基-6- (2-苯乙酰氨基)_7_氧代-4-硫 杂-1-氮杂双环[3，2，0]庚烷-2-甲酸钾盐1.500g，WA4.0ml IM盐酸，得到半抗原 (2S，5R，6 -3，3-二甲基-6-(2-苯乙酰氨基)-7-氧代-4-硫杂-1-氮杂双环[3,2,0]庚 烷-2-甲酸白色固体，双蒸水洗涤并干燥即可得到半抗原；3.权利要求1所述的兽药青霉素G降解物苄青霉噻唑酸人工抗原的制备方法，其特征 在于是用下述步骤制得取权利要求2所得白色固体0. 5000g溶于2ml四氢呋喃中，加入 0. 1500gN-羟基琥珀酰亚胺和0. 5000gN, N-二环己基碳二亚胺，在22_25°C下，搅拌反应过 夜，然后放于4°C冰箱内18小时，离心除去沉淀，将上层活化酯液加入到pH 7. 0溶有IOmg 钥孔血蓝蛋白的anlPBS溶液中，经搅拌后于4°C下反应5小时，将反应液装入透析袋，4°C 下、在PH 7. 4的PBS中透析三天即可得到人工抗原；4.权利要求1所述的兽药青霉素G降解物苄青霉噻唑酸酶标抗原的制备方法，其特征 在于是用下述步骤制得取权利要求2所合成的半抗原1. 9mg溶于2ml 二甲基甲酰胺配成 溶液A，0. 54mg辣根过氧化物酶溶于aiil pH 7. 4的0. 2mol/L磷酸缓冲液中配成溶液B，然 后在冰浴下将溶液A缓慢的加入溶液B中，经搅拌后在4°C下反应过夜，最后将反应液置入 透析袋中，在4°C下用pH7.4的0. 2mol/L磷酸缓冲液透析三天即可得到酶标抗原，用于显色 反应；5.权利要求1所述的兽药青霉素G降解物苄青霉噻唑酸抗体的制备方法，其特征在于 是用下述步骤制得免疫动物选用雌性新西兰大白兔，免疫方法采用皮下和肌肉注射法，初免后进行四次 加强免疫，加强免疫分别于初次免疫后2周、4周和6周后免疫三次，此后间隔一个月，进行 第五次免疫，9天后由兔子的耳缘静脉取血，进行效价检测，具体做法是初次免疫取Img按照权利要求3所述方法合成的人工抗原溶于0. 9%的NaCl溶液和 弗氏完全佐剂等体积所配制的溶液中，进行动物免疫；加强免疫用0. 5mg上述人工抗原溶于0. 9%的NaCl溶液和弗氏不完全佐剂等体积所 配制的溶液，进行动物免疫；抗体纯化定时监测动物抗体效价，当抗体对一定的包被抗原达到适宜效价时，采集血 液，并离心获得抗血清，使用G-kpharose蛋白亲和层析柱对抗血清进行纯化，获得抗兽药 青霉素G降解物苄青霉噻唑酸的特异性抗体。全文摘要兽药青霉素G降解物苄青霉噻唑酸人工抗原和抗体及其制备方法，涉及具有(2S，5R，6R)-3，3-二甲基-6-(2-苯乙酰氨基)-7-氧代-4-硫杂-1-氮杂双环[3，2，0]庚烷-2-甲酸结构的苄青霉噻唑酸半抗原，人工抗原和抗体的制备及其在建立免疫分析方面的应用。本发明克服了传统的理化分析方法繁琐复杂，成本较高，分析速度较慢的问题，提供了简洁，快速，灵敏，准确的免疫分析技术。它以(2S，5R，6R)-3，3-二甲基-6-(2-苯乙酰氨基)-7-氧代-4-硫杂-1-氮杂双环[3，2，0]庚烷-2-甲酸为半抗原，分别与KLH和HRP连接合成人工抗原和酶标抗原。人工抗原再经动物免疫，取血，分出抗血清，纯化制的抗体。该抗体稳定，具有良好的特异性和灵敏度，且合成方法简单，可用于兽药青霉素G降解物苄青霉噻唑酸的快速免疫检测，具有良好的应用前景。文档编号C07K1/113GK102040661SQ20091007086公开日2011年5月4日 申请日期2009年10月19日 优先权日2009年10月19日发明者张燕, 江月明, 王俊平, 王硕 申请人:天津科技大学