柽柳铁蛋白基因的cDNA序列及其编码的氨基酸序列的制作方法

专利名称：柽柳铁蛋白基因的cDNA序列及其编码的氨基酸序列的制作方法技术领域：本发明涉及铁蛋白基因的cDNA序列及其编码的氨基酸序列。背景技术：铁是植物生长发育的必需元素。虽然土壤中含有丰富的铁，但在干旱或半干旱的土壤中，通常以稳定的氧化物形态存在，其平衡浓度只有10 17pmol/L，远远不能满足植物生长的需要。缺铁会影响植物氧化还原酶活性及电子在光合和呼吸传递链的正常转移，还可导致叶绿素合成受阻，影响植物的正常生长发育和产量。发明内容本发明目的是为了解决在干旱或半干旱的土壤中铁离子浓度低而不能满足植物生长需要的问题，而提供柽柳铁蛋白基因的cDNA序列及氨基酸序列。本发明柽柳铁蛋白cDNA基因全长为1179bp，基因序列如SEQ ID No.l所示。本发明柽柳铁蛋白基因的cDNA序列编码的氨基酸序列包括265个氨基酸，柽柳铁蛋白基因编码的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。本发明柽柳铁蛋白cDNA基因是从木本植物柽柳的基因中提取筛选的铁蛋白基因，通过实时定量PCR技术验证其铁离子的应答情况，证实本发明的柽柳铁蛋白基因在柽柳中具有对铁离子的应答功能，将本发明的柽柳铁蛋白基因转入到模式植物中，提高了植物新品种对铁离子的利用效率，提高了转基因烟草的吸收和贮存铁离子的能力，满足了植物生长的需要。将本发明的柽柳铁蛋白基因转入到模式植物烟草中，转基因烟草的含铁量比未转基因的烟草的含铁量提高20%以上，株高和鲜重也提高了 10% 20%，铁还原酶活性提高了30%~50%。柽柳铁蛋白是一种由24个亚基组成的高分子贮藏蛋白质，可以储存多达4500个铁离子，对动植物及微生物铁离子的新陈代谢起着非常重要的作用。具体实施方式本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。具体实施方式一本实施方式柽柳铁蛋白cDNA基因全长为1179bp，基因序列为CTGGTGAAAAAA AAAAAAAAAAAAA 。本实施方式的铁蛋白基因的序列是按照以下方法得到的 一、利用CTAB法提取柽柳的总RNA，用Promega公司的mRNA分离试剂盒分离的mRNA，再用Copy试剂盒(Invitrogeb, Groningen, New Zealand)合成双链cDNA，然后用cDNA文库构建试剂盒(ZAP-cDNA Synthesis Kit禾卩ZAP-cDNAGigapackIII Gold Cloning Kit)构建柽柳cDNA文库，经过3'端测序获得铁蛋白基因片段未知区域的克隆根据已知3'端的序列设计引物Rl :'CAACGTAAGCCAAAAGCCTGTATCACAAC 和 引 物 R2 :GATCCCAACTGAAGCCTCAAGCAGCAG,结合RACE技术(Roche MolecularBiochemicals Mannheim, Germany),对5，端未知区域进行了扩增，并将该片段克隆到了 PCRTOPO载体(TOPO AT Cloning Kit, Groningen, TheNethdand)进行测序，得到了全长铁蛋白基因cDNA序列；三、将步骤一和步骤二所得的cDNA片段进行比对拼接；即得到完整的铁蛋白基因。将本实施方式中所得铁蛋白基因cDNA构建到植物表达载体pBI121植物表达载体中，用一对引物(R3: 5'-GGTCAATAACACTATGCTTCTC-3，和R4:5，-GCCTCAAGCAGCAGCTCCATCAGC-3，)进行RT-PCR扩增，克隆柽柳铁蛋白cDNA的编码序列，在cDNA的5，和3'端分别加入了 Xbal和Sacl酶切位点，使cDNA能够在RT-PCR扩增中定向克隆到植物表达载体pBI121的启动子下游，取代GUS基因(转P-葡糖醛酸酶基因)，这个组成型表达系统应用的是花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子和胭脂碱合成酶(nos)终止子系统以及卡那抗性基因(NPTii;新霉素磷酸转移酶n)。将重组的质粒用电穿孔法导入根癌农杆菌(EHA105菌株)中，通过叶盘转化法培育转基因烟草，在含有卡那霉素的MS培养基因上筛选Tl代转基因烟草，用PCR-Southern和Northern杂交方法检测叶片中外源铁蛋白基因的表达情况，初步选出的转化子进行自花授粉，得到T2代植株，以下所有的试验都是用T2代植株进行的将10个转基因株系和IO个非转基因株在含MS培养基(Fe"浓度为100pmol/mL)的培养瓶中生长l个月，分别测量转基因烟草和非转基因烟草的苗高及鲜重，结果表明转基因烟草株系的苗高比非转基因株系平均高出15%，转基因烟草株系的鲜重比非转基因株系平均高出20%;通过测定紫色的Fe(II)-ferrozine复合物的分光光度值定量分析不同烟草株系的根部三价铁还原酶的活性，转基因株系和非转基因株系进行比较可以发现，转基因株系的铁还原酶活性比非转基因株系均高出1.3 1.5倍；通过测定不同株系叶片在510nm下Fe-O-邻二氮杂菲的吸收值计算铁离子含量，叶片含铁量比非转基因株系均高出1.3~1.5倍。这些堯.果表明，在转铁蛋白基因烟草增加了铁离子还原能力，提高了内源铁蛋白基因的表达水平和铁离子吸收储存能力。具体实施方式二本实施方式与具体实施方式一的不同点为柽柳铁蛋白基因cDNA序列中包含5，端非翻译区lbp-70bp、蛋白质编码区71bp-868bp和3'端非翻译区869bp-1179bp。其它与具体实施方式一相同。具体实施方式三本实施方式的柽柳铁蛋白基因的cDNA序列编码的威基酸序列包括265个氨基酸，柽柳铁蛋白基因编码的氨基酸序列为IXHGDAVADGAAA。将具体实施方式一的所得铁蛋白基因cDNA构建到植物表达载体pBI121植物表达载体中，用一对引物(R3: 5，-GGTCAATAACACTATGCTTCTC-3，和R4: 5'-GCCTCAAGCAGCAGCTCCATCAGC-3，)进行RT-PCR扩增， 一克隆柽柳铁蛋白cDNA的编码序列，在cDNA的5，和3，端分别加入了 Xbal和Sacl7酶切位点，使cDNA能够在RT-PCR扩增中定向克隆到植物表达载体pBI121的启动子下游，取代GUS基因(转P-葡糖醛酸酶基因)，这个组成型表达系统应用的是花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子和胭脂碱合成酶(nos)终止子系统以及卡那抗性基因(NPTii;新霉素磷酸转移酶n)。将重组的质粒用电穿孔法导入根癌农杆菌(EHA105菌株)中，通过叶盘转化法培育转基因烟草，在含有卡那霉素的MS培养基因上筛选Tl代转基因烟草，用PCR-Southem和Northern杂交方法检测叶片中外源铁蛋白基因的表达情况，初步选出的转化子进行自花授粉，得到T2代植株，随机取30株T2代植株的叶片，采用Western杂交对转基因烟草叶片中所含蛋白质进行检测，结果表明所有叶片均能检测出含有与本实施方式氨基酸序列相同的蛋白质，说明外源柽柳铁蛋白基因在转基因烟草中得到了正确、稳定表达。序列表<110>东北林业大学<120>柽柳铁蛋白基因的cDNA序列及其编码的氨基酸序列<160>7<210> 1<211>1179<212>DNA<213>柽柳属(Tamarix L.)<220><221> CDS<222> (71)…(865)<400> 1acttatctat caatttcaaa ccgtcgaact cctgaattta ccccgttgtg agagaaaggt 60caataacact atg ctt etc aag ggc get gcc get get tct act ttt tea 109Met Leu Leu Lys Gly Ala Ala Ala Ala Ser Thr Phe Ser15tac ttcTyr Phe15ttg ageLeu Ser30gtg gttVal Valgtt gttVal Valcc3 actPro Thrtgt gaaCys Glu95tat gttTyr Val110ctg aagLeu 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260GluLeu85GinAlaPheGluMet 165 AlaLeuGluLysGly 245 AspVal70AlalieTyrLysTyr 150 ProMetAsnPhelie 230 ValGly55Lys Lys Glu LeuArg Gin LysAsn Val Glu 105Phe Asp Arg120 Glu Ser Ser 135Gin Asn LysLeu Ser GluGlu Leu Ala 185Leu His His200 lie Glu Gly 215Ser Glu TyrTrp His PheAla Ala Ala 265Phe90TyrAspLeuArgPhe 170 LeuValGluValAsp 25060Gin Met Val Pro Thr Leu 75Val Asp Glu CysAsn Val Ser Tyr 110Asn Val Ala Leu 125Glu Glu Arg Glu 140Gly Gly Arg Val 155Asp His Met GluSer Leu Glu Lys 190Ala Glu Glu Asn 205Tyr Leu Ser Glu 220Ala Gin Leu Arg 235Gin Met Leu Leu80 Glu Ala 95Val TyrLys GlyHis AlaLys Leu 160 Lys Gly 175Leu ThrHis AspGin ValArg lie 240 His Gly 255<210> 3<211>450<212>DNA〈213〉柽柳属(T謹rixL.)<220><223>柽柳铁蛋白基因序列3'端部分cDNA片段 <400> 3 'gagtgagcag gtggatgcta tca卿aaat atccgaatat gttgctcagc tc卿卿at 60tggcaaagga cacggggtgt ggcatttcga tcaaatgctt cttxacgggg atgctgUgc 120tgatggagct gctgcttgag gcttcagttg ggatctgtat caatattttg gggaatggtc 180aUagttact ttgttgtgat acaggctttt ggcttacgtt gtgtttgaat ttaattgaca 240cgggatggta gataaaaaa/t tgcttcaaaa acaattttct ttctattm cctgggtttg 300gUagcatac cttgtcatgt atgacccata tgttgUaga ccgatUtcc tgatgcagtt 360caaggtggtt tacccgcctc atgtgattgc aUtttgttt tgcattatca acctgagatt 420 gttctctggt gaaa肪a幼a 3aa3助幼幼450<210>4 <211>29 <212> DNA <213>人工序列<220><223>根据已知3'端的序列设计的引物R1 <400> 4caacgtaagc caaaagcctg tatcacaac 29<210>5 <211>27 <212>DNA <213>人工序列<220><223>根据已知3'端的序列设计的引物R2 <400> 5gatcccaact gaagcctcaa gcagcag 27<210> 6 <211>22 <212> DNA <213>人工序列<220><223>用于反转录扩增目的片段设计的引物R3 <400> 6ggtcaataac actatgcttc tc 22<210>7 <211>24 <212> DNA <213>人工序列<220><223>用于反转录扩增目的片段设计的引物R4 <400> 7gcctcaagca gcagctccat cage 2权利要求1、柽柳铁蛋白基因cDNA序列，其特征在于柽柳铁蛋白cDNA基因全长为1179bp，柽柳铁蛋白cDNA基因序列为ACTTATCTATCAATTTCAAACCGTCGAACTCCTGAATTTACCCCGTTGTGAGAGAAAGGTCAATAACACTATGCTTCTCAAGGGCGCTGCCGCTGCTTCTACTTTTTCATACTTCGCCGCTACCAGTGCTGAAAATCAGGTTACCTGTGCACAATCGTTGAGCGGTTCAGTCAGGTTTTCATCGCCGAGTAATGGAAGAAGATTGGTGGTTTCTGCATCTGCTCCGGAGGCGAATAATAGGCCTCTGACCGGTGTTGTTTTTAAGCCGTTTGAAGAGGTTAAGAAAGAGCTTCAAATGGTTCCAACTCTACCGCAGGTTTCACTTGCTCGTCAGAAGTTTGTTGATGAGTGTGAAGCTGCCATTAATGAGCAGATTAACGTGGAGTATAATGTATCATATGTTTATCACGCCATGTATGCTTACTTTGATCGGGATAATGTCGCACTGAAGGGGCTCGCTAAGTTTTTCAAGGAATCAAGTTTGGAGGAAAGGGAGCACGCTGAAAAGCTTATGGAATATCAGAACAAGCGTGGTGGTAGAGTGAAGTTGCAGTCCATTGTGATGCCTCTGTCTGAGTTCGATCATATGGAGAAAGGAGATGCTCTATACGCTATGGAGCTTGCTTTGTCCTTGGAGAAGCTTACTAATGAGAAATTATTGAACCTTCACCATGTTGCGGAGGAAAACCATGATGTTCAGTTGCAAGAATTTATTGAAGGCGAATATTTGAGTGAGCAGGTGGATGCTATCAAGAAAATATCCGAATATGTTGCTCAGCTCAGAAGAATTGGCAAAGGACACGGGGTGTGGCATTTCGATCAAATGCTTCTTCACGGGGATGCTGTTGCTGATGGAGCTGCTGCTTGAGGCTTCAGTTGGGATCTGTATCAATATTTTGGGGAATGGTCATTAGTTACTTTGTTGTGATACAGGCTTTTGGCTTACGTTGTGTTTGAATTTAATTGACACGGGATGGTAGATAAAAAATTGCTTCAAAAACAATTTTCTTTCTATTTTTCCTGGGTTTGGTTAGCATACCTTGTCATGTATGACCCATATGTTGTTAGACCGATTTTCCTGATGCAGTTCAAGGTGGTTTACCCGCCTCATGTGATTGCATTTTTGTTTTGCATTATCAACCTGAGATTGTTCTCTGGTGAAAAAAAAAAAAAAAAAAA。2、根据权利要求1所述的柽柳铁蛋白基因cDNA，其特征在于柽柳铁蛋 白基因cDNA序列中包含5，端非翻译区lbp-70bp、蛋白质编码区71bp-868bp和3，端非翻译区869bp-1179bp。3、柽柳铁蛋白基因的cDNA序列编码的氨基酸序列，其特征在于柽柳铁 蛋白基因的cDNA序列编码的氨基酸序列包括265个氨基酸，柽柳铁蛋白基因 编码的氨基酸序列为-LLHGDAVADGAAA 。全文摘要柽柳铁蛋白基因的cDNA序列及其编码的氨基酸序列，本发明涉及了铁蛋白基因的cDNA序列及其编码的氨基酸序列。本发明解决了在干旱或半干旱的土壤中铁离子浓度低而不能满足植物生长需要的问题。本发明柽柳铁蛋白基因全长为1179bp，基因序列如SEQ ID No.1所示。本发明铁蛋白基因的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明所得的铁蛋白基因转入到烟草中，可使转基因烟草的铁离子含量提高20％以上，该基因可以提高转基因植物对铁离子的利用效率，满足了植物生长的需要。文档编号C07K14/415GK101550417SQ200910072120公开日2009年10月7日 申请日期2009年5月25日 优先权日2009年5月25日发明者丁宝建, 周博如, 姜廷波, 曲跃军, 雷 王, 王玉成 申请人:东北林业大学