金菇多糖锗提取分离与纯化及其对艾滋病病毒逆转录酶的抑制作用的制作方法

专利名称：金菇多糖锗提取分离与纯化及其对艾滋病病毒逆转录酶的抑制作用的制作方法技术领域：本发明属生物食用真菌技术领域。食用菌的药用效果，特别是香菇、金针菇的药用效果已是众所周知的了。据报道，日本已研制成功在培养基中添加二氧化锗，使锗成分被菌丝体同化吸收，这时就可以从菌丝体中提取更有效的药用成分提取液。经过添加二氧化锗的菌丝体提取液，含锗成分为90PPM，并以多糖和锗盐的状态存在，但二氧化锗毒性较大，培养产物分离困难。而不加二氧化锗培养的菌丝体，其提取液含锗成分为1-3PPM。故前者提取液具有更强的降血压，去除胆固醇和抗癌效果。其原因是从外部添加锗在人体中没有活性，如要得到锗的活性物质，就必须制成生物制品，或锗的有机物。本发明的目的在于避免上述现有技术中的不足之处而提供一种添加有机锗(Ge—132)经培养将有机锗的锗元素与金菇菌代谢产物结合转化为多糖锗，提高锗的生物活性，并将金菇多糖锗提取分离与纯化。本发明的目的可以通过以下措施来达到一种金菇多糖锗提取分离与纯化法，其特征是取定量金菇锗营养液加水，提取，薄膜浓缩，加入乙醇，离心得深褐色粗多糖制品；将粗多糖制品经H2O2处理后，再加入乙醇，离心得淡黄色金菇多糖锗；在多糖水溶液中加入氯仿，正丁醇(5∶1)之混合剂，离心去除杂蛋白层，糖溶液经水透析，减压浓缩，加入乙醇，得到多糖金菇锗半精品；半精品加入DEAE—sephadexA-25柱(2.5×35cm)，依次用H2O，0.15NNacl，0.25NNacl进行阶段洗脱，分部收集，经透析，浓缩后加入乙醇，得乳白色金菇多糖锗纯品。本发明下面将结合实施例作进一步详述1，金菇多糖锗的提取分离与纯化取100ml金菇锗营养液加水，于90℃水浴中搅拌提取二次，每次2小时，合并抽提液，薄膜浓缩到粘稠状，离心去除不溶物，加入6倍量95％乙醇，离心得到深褐色粗多糖制品。为脱去粗金菇多糖锗中含有的色素，将10％粗多糖溶液在50％水浴保温，调PH至8.5，经H2O2处理后，再加入5倍量95％乙醇，于冰箱放置过夜，次日离心得到淡黄色的金菇多糖锗。采用SeVag法将脱色的金菇多糖锗进行去杂蛋白处理。在多糖水溶液中加入氯仿，正丁醇(5∶1)之混合剂，振荡30分钟后，离心去除杂蛋白层，按上法，重复数次，去尽杂蛋白。糖溶液经水透析72小时，减压浓缩至粘稠状，加入5倍量95％乙醇，离心，沉淀，依次用乙醇，丙酮洗涤后，P2O5真空干燥得到金菇多糖锗半精品。取多糖金菇锗半精品，溶于少量水中，去杂后，加入DEAE-sepadexA～25柱(2.5×35cm)，依次用H2O，0.15NNacl，0.25NNacl进行阶段洗脱，分部收集，用蒽酮比色法测定各管糖含量，以鉴定多糖部位，合并多糖部位试管溶液，经透析，浓缩后加入5倍量95％乙醇，得到乳白色金菇多糖锗纯品。该纯品安全、无毒、符合食品的基本要求。2，金菇多糖锗的分析鉴定(1)多糖的一般性质多糖水溶液，经紫外线扫描，在紫外区域无特征吸收，不含有蛋白质和核酸。多糖在水解前对Fehling试剂呈阴性反应，当用盐酸水解后，与Fehling试剂发生反应，产生棕红色沉淀。多糖与α-奈酚硫酸试剂反应产生紫红色环，与硫酸-苯酚试剂反应产生桔黄色，将多糖的水溶液点在滤纸上用schiff试剂染色呈红色，用甲苯胺蓝染色呈蓝色，具有一般多糖的性质。(2)多糖的纯度鉴定凝胶柱层析取样品15mg，上sephadex G-200柱(2.5×30cm)，用0.05NNacl洗脱流速4-5ml/hr，每管收集2ml，蒽酮法测定含糖部位，结果发现为单一峰，其洗脱高峰体积分别在50ml。 sephadex G-200层析图超速离心多糖溶解于0.85％ Nacl溶液中，在MSE75centriscan型分析超速离心机上分离，转速50000r、p、m、结果显示为单一区带，使用schlieren光学系统进行光电扫描，图谱显示为单峰。纸层析多糖水溶液，点样于新华3号滤纸，展开剂为正丙醇∶浓氨水∶水＝40∶50∶5室温上行展开13cm，吹干后以0.5％甲苯胺蓝乙醇溶液染色，95％乙醇漂洗背景，结果为单一斑点。(3)多糖的理化分析分子量的测定采用超速离心法，根据schlieren扫描结果在同一浓度下分别测定每个样品的沉降系数S和扩散系数D，代入svedbers方程MW＝RTS/D(1-Vρ)(R-气体常数，T-实验绝对温度，ρ-溶剂密度，V样品的偏比容)求得样品的重均分子量。样品S DMW金菇多糖锗2.910 6.51035280元素分析与比旋度用240元素分析仪测定多糖体的C、H、N含量，ICP测定Ge的含量，W自动显示旋光仪测定比旋度，样品 元素分析C％ H％N％ [2]D18Ge金菇多糖锗37.1 6.58 ＜0.20 ＋58.4120红外光谱(IR)分析多糖以KBr压片，在NICOLET-170SXFT型红外光谱仪上扫描分析，吸收光谱如下 金菇多糖锗红外光谱图核磁共振(H—NMR)分析由H—NMR测得多糖体化学位移值δ为5.13PPM。 金菇多糖锗核磁共振(H—NMR)图谱(4)金菇多糖锗的组成分析取金菇锗营养粉多糖20mg，用2NH2SO4在封管下100℃水解5小时，Ba(OH)2中和滤液浓缩点样于新华1号滤纸。用正丁醇∶冰醋酸∶水(4∶1∶5)为展开剂，苯胺一邻苯二甲酸为显色剂，下行展开31.5小时，与相应标准品对照，结果发现多糖的组成为D-葡萄糖，阿拉伯糖和木糖。若以D-葡萄糖的Rf值为1，则它们相对Rf值之比为葡萄糖∶阿拉伯糖∶木糖＝1.0∶0.38∶0.24(5)金菇多糖锗中锗的结合率从以上实验可知，经提取纯化的金菇锗营养粉多糖只含有C、H、O、G和少量的N元素。金菇锗营养的锗含量为120.5PPM，而金菇多糖锗中则含220.9PPM，因此，金菇多糖锗中的锗为菇液中锗的97/120.5＝80.5％，也即菇液中80.5％的锗被结合在金菇多糖锗中。(6)金菇锗营养液，经提取纯化所得的蛋白质中含锗量为2.17PPM，即菇液中约1.8％的锗被结合在蛋白质中。3.金菇多糖锗对艾滋病病毒逆转录酶的抑制作用(1)药物名称有机锗，多糖锗(2)检测方法a.药物稀释以灭菌去离子水将药物按1∶1、1∶5、1∶10、1∶20、1∶50和1∶100稀释。b.稀释后的药物与等量艾滋病病毒逆转录酶混合，加入逆转录反应体系，37℃水浴45分钟。c.取50μl点膜，洗涤后烘干，液闪计数CPM值并计算抑制百分率。(3)结果二种药物对艾滋病病毒逆转录酶的抑制百分率(％)药物1∶11∶51∶10 1∶20 1∶50 1∶100有机锗8 00 0 00多糖锗 100 60 0 0 0 0(4)结论金菇多糖锗复合物对艾滋病病毒逆转录酶具有强烈的抑制作用，而有机锗(Ge—132)对艾滋病病毒逆转录酶的抑制作用很弱。权利要求1.一种金菇多糖锗提取分离与纯化法，其特征是取定量金菇锗营养液加水，提取，薄膜浓缩，加入乙醇，离心得深褐色粗多糖制品；将粗多糖制品经H2O2处理后，再加入乙醇，离心得淡黄色金菇多糖锗；在多糖水溶液中加入氯仿，正丁醇(5∶1)之混合剂，离心去除杂蛋白层，糖溶液经水透析，减压浓缩，加入乙醇，得到多糖金菇锗半精品；半精品加入DEAE—sephadexA-25柱(2.5×35cm)，依次用H2O，0.15NNacl，0.25Nacl进行阶段洗脱，分部收集，经透析，浓缩后加入乙醇，得乳白色金菇多糖锗纯品。全文摘要本发明提供了一种添加有机锗经培养将有机锗的锗元素与金菇菌代谢产物结合转化为多糖锗，并将金菇多糖锗提取分离与纯化。其方法为取定量金菇营养液加水，提取，薄膜浓缩，加乙醇，离心得粗多糖制品；将粗多糖溶液经H文档编号C07F7/30GK1120543SQ9511102公开日1996年4月17日 申请日期1995年4月26日 优先权日1995年4月26日发明者潘维新, 傅庭治 申请人:中国药科大学