Mt生产的新工艺的制作方法

专利名称：Mt生产的新工艺的制作方法金属硫蛋白(Metallothionein，简称MT)是一类低分子量(约6500D)、富含半胱氨酸的金属结合蛋白。1957年Margoshes& Vallee在研究Cd++对生物体的效应时，从蓄积镉的马肾中首先分离出来了MT(Margoshes M.& Vallee，B.L.A cadmiumprotein from equine kidney cortex.J.Am.Chem.Soc.，1957，79，4813-4814.)，如今已发现MT几乎存在于哺乳动物所有的组织中(连接组织除外)，而且近年来从植物和微生物中也分离出来了这种类似的金属蛋白结合体。研究证明MT可高效地清除导致人衰老的超氧游离基(·O2-)和羟游离基(·OH)(Mayo，K.E.& Palmiter，R.D.Glucocorticoid regulation of themouse metallothionein in rats.Am.J.Physiol.1986，251E688-E694.)，而人们已较熟悉的SOD却对后者无作用。故MT有”人体衰老因子清道夫”的美称。许多国家的科技工作者也为此做了广泛深入的研究与应用探讨，到如今已召开了四次国际性的专题讨论会，我国已将MT的研究列入国家863计划，其应用已列入了国家火炬计划。本发明涉及生产MT生物工程技术的革新，到目前为止，已有的生产工艺系采用对人体有毒的CdCl2诱导，所制备出的MT虽经纯化处理，但仍有结合态的Cd原子存在，一般在1个MT分子中含有4～5个Cd，不宜直接用于保健品或药品。本发明的新工艺主要特征包括1.是采用了无毒的二价盐(其通式为MX，式中M＝Zn2+、Cu2+、Fe2+、Cr2+；X＝Cl-、SO42-)代替了有毒的Cd2+作为诱导剂；2.以磷酸盐缓冲液代替了Tris-HCl缓冲液；3.精减了柱层析纯化过程。新工艺的总收率达到1.3％，缩短了生产周期并大大降低了成本；4.为了减少血红蛋白对产品色质的污染，在诱导结束处死动物时采用断头法放血，并用挤压法尽量使残留血流出；5.在产品的后期处理中，采用无水乙醇和无水乙醚沉淀的办法，精减了冰冻干燥步骤和所需设备；6.在提取过程中采用煮沸法使MT与其它杂蛋白分离，而丝毫不降低产品的活性，这不但简化了生产工艺，而且保证了安全操作；7.用于提取的材料除取用肝脏外，还取用了小肠和肾脏组织，从而再一次降低了生产成本。实施例1取家兔(体重为3～4公斤)2只，耳朵皮下注射ZnSO4(生理盐水配制)四次，即第一天注射15mg Zn/kg，第二天和第四天注射22.5mg Zn/kg，第七天注射30mg/kg，第八天断头处死，尽量把血放干净，取出肝脏、小肠和肾脏，称重并剪成小块后，加入等体积的0.01M磷酸盐缓冲液，用组织捣碎机制成匀浆，调pH至8.6，低温离心(8000rpm)，弃渣，取上清液在旋转蒸发仪上使总体积浓缩至300～400ml，再加入足够量的卫生酒精，最终使醇浓度达到70％，静置使MT充分沉淀。用虹吸法移出上清液，沉淀用无水乙醇洗涤，抽滤，再用少量无水乙醚洗涤，即可得到近乎白色的MT干粉。产率～1.3％(按组织湿重计算)。实施例2家兔2只(体重3～4公斤)，耳朵皮下注射ZnSO4(生理盐水配制)四次，即第一天注射15mg Zn/kg，第二天和第四天注射22.5mg Zn/kg，第七天注射30mg/kg，第八天断头处死，尽量把血放干净，取出肝脏、小肠和肾脏，称重并剪成小块后，加入等体积的0.01M Tris-HCl缓冲液，用组织捣碎机制成匀浆，调pH至8.6，沸水浴上加热处理10分钟，使杂蛋白变性沉淀，离心(8000rpm)弃渣，取上清液在旋转蒸发仪上使总体积浓缩至300～400ml，再加入足够量的卫生酒精，最终使醇浓度达到70％，静置使MT充分沉淀。用虹吸法移出上清液，沉淀用无水乙醇洗涤，抽滤，再用少量无水乙醚洗涤，即可得到近乎白色的MT干粉。产率1.0％(按组织湿重计算)。MT含量测定—单扫示波极谱法(SSP)取20～50μl，收集管中溶液，加0.5ml，1mol/L HNO3，混匀后加入0.5ml 3mol/L NaAc，加水至5ml，再加入50μl 4×10-3mol/Lα，α-联吡啶，摇匀后转入10ml小烧杯中，起始电位-0.8伏，阴极化扫描，记录-1.13伏处导数峰高，其中MT-I和MT-II的混合含量为1.3～1.5％。权利要求1.MT系Metallothionein的简称，是一种金属蛋白结合体，或称金属硫蛋白，研究证明它具有很好的消除黄褐斑、老年斑等抗衰老功能。本发明的主要内容是采用了无毒的二价盐，如Zn++、Cu++、Fe++、Cr++等作为诱导剂代替有毒的Cd++诱导剂，以磷酸盐缓冲液代替了Tris-HCl缓冲液，精简了柱层析纯化过程，提高了收率并大大降低了成本；2.根据权利要求1所述，当诱导结束处死动物时，用断头法放血，尽量减少血红蛋白对产品的污染；3.根据权利要求1所述，以无水乙醇和无水乙醚多次洗涤沉淀并使产品快速干燥，从而省却了冰冻干燥等设备要求，且保持了产品应有的活性；4.根据权利要求1所述，本发明所使用的原材料除原用的肝脏外，还增加了小肠与肾脏，进一步降低了成本。5.根据权利要求1所述，本发明在提取MT时，采用煮沸的方法将MT与其它杂蛋白分离，而丝毫不降低MT的生物活性，并由此大大简化了工艺流程，并保证了安全操作。全文摘要本发明涉及用对生物体无毒有益的二价盐诱导的生物工程技术生产金属蛋白结合体(Metallothionein，以下简称MT)的新方法。到目前为止，已有的生产工艺系采用对人体有毒的CdCl文档编号C07K14/435GK1155547SQ9511782公开日1997年7月30日 申请日期1995年12月7日 优先权日1995年12月7日发明者丁鉴, 张祖丰, 阮慎康 申请人:丁鉴, 张祖丰, 阮慎康