具有负的表面电荷的微粒和纳米颗粒的制作方法

本申请要求于2016年12月12日提交的第62/432,810号美国临时申请的权益。上述申请的全部教导通过引用并入本文。

背景技术：

当将某些羧基化颗粒，例如羧基化聚苯乙烯颗粒、羧基化聚(乳酸-羟基乙酸)共聚物(plga)颗粒或羧基化金刚石颗粒施用于个体时，可以改善某些病症，例如病理性炎症免疫应答(参见wo2014/089160)。

炎性疾病和疾患是这样的病症，其中异常的或以其他方式失调的炎性反应是疾病的病因或使疾病变严重。实例包括诸如类风湿性关节炎、多发性硬化和糖尿病的自身免疫疾病，诸如结核病和各种形式的脑膜炎和脑炎(包括西尼罗河病毒性脑炎)的感染性疾病，以及包括动脉粥样硬化和缺血性再灌注的其他疾病。

许多这种疾病的特征在于组织损伤或其他损伤部位的单核细胞浸润。在这些浸润中观察到的单核细胞的实例包括淋巴细胞，尤其是t淋巴细胞，和单核巨噬细胞系统(mps)的细胞，例如单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、小神经胶质细胞等。

然而，使用常规方法生产的羧基化plga颗粒通常不具有生物相容性，因此由这种制造方法得到的plga颗粒可能不能安全用于人和动物。此外，使用常规方法生产的plga颗粒可能不包含足够数量的用于将活性药物成分(api)或其他化学实体(chemicalentity)连接至微粒和纳米颗粒的cooh基团。

需要制备具有增强的治疗性质的带负电荷的(例如，羧基化的plga)微粒和纳米颗粒。

技术实现要素：

本发明的一个方面提供了一种制备包含具有负的表面电荷的聚(乳酸-羟基乙酸)共聚物(plga)微粒或纳米颗粒的组合物的方法，所述方法包括：(1)将1克或更多的plga(和任选的活性药物成分，例如水溶性差的活性药物成分)溶解在第一溶剂中以形成plga溶液；(2)将所述聚合物溶液在第二溶剂的溶液中乳化以形成乳液，其中所述第一溶剂与所述第二溶剂不混溶或部分混溶，并且其中所述第二溶剂的溶液包含选自聚丙烯酸和透明质酸的药学上可接受的带负电剂，所述第二溶剂的溶液任选还包含表面活性剂和/或可溶于第二溶剂的活性药物成分；和(3)除去所述第一溶剂以形成具有负的表面电荷的所述微粒或纳米颗粒。

本发明的相关方面提供了一种制备包含具有负的表面电荷的聚(乳酸-羟基乙酸)共聚物微粒或纳米颗粒的组合物的方法，所述方法包括：(1)将1克或更多的plga(和任选的活性药物成分，例如水溶性差的活性药物成分)溶解在第一溶剂中以形成聚合物溶液；(2)向所述聚合物溶液中加入少量第二溶剂的第一溶液以形成混合物，其中所述第一溶剂与所述第二溶剂不混溶或部分混溶，并且其中所述第二溶剂的第一溶液任选地包含活性药物成分；(3)将所述混合物乳化以形成第一乳液；(4)将所述第一乳液在大量的所述第二溶剂的第二溶液中乳化以形成第二乳液，其中所述第二溶剂的第二溶液包含选自聚丙烯酸和透明质酸的药学上可接受的带负电剂，并任选还包含表面活性剂；和(5)除去所述第一溶剂以形成具有负的表面电荷的所述微粒或纳米颗粒。

优选地，该方法还包括洗涤所述微粒或纳米颗粒，和/或将所述微粒或纳米颗粒浓缩至所需的体积。

优选地，负的表面电荷可以承受某些洗涤试验，例如实施例10中举例说明的洗涤试验，而不会明显损失由δ电位测定的负的表面电荷(例如，不会变为明显更小的负值-，即比原始负值更接近0的负值)。

优选地，在所述洗涤或洗涤试验之后，通过δ电位测量，所述微粒或纳米颗粒保留至少约75％、80％、85％、90％、95％或99％的负的表面电荷。

优选地，所述plga的平均分子量为约500至约1000000da，优选约1000至约50000da。

优选地，所述plga的乳酸/羟基乙酸比为约100/0至0/100，约95/5至5/95，约85/15至15/85以及约50/50。

优选地，所述plga含有多个带负电荷的末端基团。

优选地，所述plga含有羧基。

优选地，将药学上可接受的带负电剂掺入所述微粒或纳米颗粒中，以增加所述微粒或纳米颗粒上的负的表面电荷。

优选地，将药学上可接受的带负电剂掺入所述微粒或纳米颗粒中，以增加所述微粒或纳米颗粒表面上的cooh基团的数目。

优选地，所述微粒或纳米颗粒具有约-40mv或更低、约-45mv或更低或约-50mv或更低的δ电位，例如-40mv至-65mv。

优选地，所述第一溶剂是二氯甲烷、乙酸乙酯或氯仿。

优选地，所述第二溶剂的溶液包含表面活性剂，该表面活性剂包含有机药物赋形剂或无机药物赋形剂、各种聚合物、低聚物、天然产物、非离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性离子表面活性剂或离子表面活性剂以及它们的混合物。

优选地，该表面活性剂包括聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、吐温系列表面活性剂、普朗尼克系列、泊洛沙姆系列或曲拉通x-100或其盐、衍生物、共聚物或混合物。

优选地，所述乳化步骤包括均质化、机械搅拌和/或微流化。

优选地，通过溶剂交换和/或蒸发除去第一溶剂。

优选地，所述微粒或纳米颗粒包含活性药物成分。

优选地，所述活性药物成分包封在所述微粒或纳米颗粒内。

优选地，所述活性药物成分通过共价键共价连接至所述微粒或纳米颗粒的表面。

优选地，在乳化过程中在将第一溶剂的plga溶液加入到第二溶剂的溶液中之前，所述第二溶剂的溶液还包含第一溶剂或者被第一溶剂饱和。这可能是有益的，因为当被加入到第二溶剂的溶液中进行乳化时，第一溶剂中的plga不太可能沉淀。优选地，第一溶剂是乙酸乙酯，第二溶剂的溶液(例如水溶液或含水溶液)包含约7-8％(v/v)的乙酸乙酯。

应当理解，本文描述的本发明的任何优选特征可以与任何其他优选特征组合，包括仅在本发明的一个方面描述的优选特征，以及仅在实施例中描述的优选特征。

具体实施方式

1.概述：

在药物和生物技术领域，通常需要将药物/活性药物成分包封在聚合物颗粒中。例如，可以将药物包封到诸如聚(乳酸-羟基乙酸)共聚物(plga)的可生物降解的聚合物的微球中，用于长效、持续的释放。商业化产品的实例包括醋酸亮丙瑞林、艾塞那肽、利培酮和纳曲酮的聚(乳酸-羟基乙酸)共聚物或聚乳酸微球。

除微球制剂外，药物分子还可以被包封在聚合物纳米颗粒中，用于靶向药物递送，靶向药物递送涉及将药物递送至特定的部位、细胞、器官和受体。将药物包封到纳米颗粒中可以以不同方式促进靶向药物递送。例如，纳米颗粒可利用“增强的渗透和滞留效应”或epr效应将药物递送到肿瘤组织中。epr效应是某些分子或颗粒在肿瘤组织中比在正常组织中更容易累积的特性(matsumuraandmaeda,cancerresearch.46(12pt1):6387-6392,1986；duncanandsat,ann.oncol.9,suppl.2:39,1998；kaye,etal.clinicalcancerresearch.5(1):83–94,1999)。

也可以通过首先将药物包封到纳米颗粒中，然后将靶向剂连接到纳米颗粒的表面上来实现靶向药物递送。在大多数情况下，需要通过化学缀合将靶向剂连接到表面上。通常，这种缀合涉及靶向剂与纳米颗粒表面上的适当反应性基团之间的化学反应。常见的反应性基团包括羧基、氨基、硫醇、醛、马来酰亚胺、环氧化物和酸酐。

聚乳酸(pla)、聚(乳酸-羟基乙酸)共聚物(plga)、聚已内酯(pcl)和几种其他的可生物降解和生物相容的聚合物已被用于包封活性药物成分以用于多种应用。许多美国fda批准的产品基于包封在plga颗粒中的药物分子。

这种负载的聚合物颗粒的表面性质对于靶向药物递送非常重要。至少有以下两个方面涉及需要考虑的载药颗粒的表面性质：

1)表面电荷-对于每种特定的药物输送应用，颗粒表面可能需要为正电性的、负电性的或中性的，并且δ电位可能需要在特定的范围内。

2)表面上的官能团-为了能够在载药颗粒的表面上缀合生物实体或靶向剂，必须将功能性反应性基团，例如羧基、氨基、硫醇、醛、马来酰亚胺、缩水甘油基和酸酐添加到表面上。

在某些情况下，可以通过单一解决方案实现这两个目标。例如，可以将羧基添加到载有药物的聚合物颗粒的表面上，以同时在表面上产生负电荷和官能团。

本文描述的本发明提供了包含微粒和纳米颗粒的药物制剂(具有或不具有药物/活性药物成分负载)，以及能够仅使用药学上可接受的成分生产具有高表面密度的羧基和高度带负电的表面电荷的包含微粒和纳米颗粒的这种药物制剂的改进的方法。

本发明部分基于以下发现：由疏水的和/或中性的生物相容性聚合物(例如plga或pla)与聚阴离子聚合物(例如聚丙烯酸)的共沉淀或凝聚制备的微粒和纳米颗粒在颗粒的表面上提供高密度的阴离子，从而改善了免疫原性，使得能够以高负载量包封活性剂。不受任何理论束缚，认为聚合物主链在乳液的有机相中交织，而亲水性阴离子有利于乳液液滴的表面。由此形成的互连网络形成一种颗粒，在该颗粒中，原本水溶性的聚阴离子聚合物不能被洗掉并同时保留有利于包封的疏水微环境。

本发明部分基于以下令人惊讶的发现：当本发明的方法应用于大规模生产纳米颗粒时，例如，使用1克、3克、5克、10克、50克、100克、200克、300克、500克、800克、1千克或更多的药学上可接受的聚合物(例如plga)，并且在药学上可接受的带负电剂(例如聚丙烯酸和透明质酸)的存在下，与使用基本相同成分的成比例的但更小规模的(例如，小于1克或小于0.5克的plga)生产相比，所生产的颗粒具有带更高负电荷的表面(例如，通过δ电位测定的)。

因此，在一个方面，本发明提供了一种制备包含具有负的表面电荷的聚(乳酸-羟基乙酸)共聚物微粒或纳米颗粒的组合物的方法，所述方法包括：(1)将1克或更多的聚(乳酸-羟基乙酸)共聚物溶解在第一溶剂中以形成聚(乳酸-羟基乙酸)共聚物溶液；(2)将所述聚合物溶液在第二溶剂的溶液中乳化以形成乳液，其中所述第一溶剂与所述第二溶剂不混溶或部分混溶，并且其中所述第二溶剂的溶液包含选自聚丙烯酸和透明质酸的药学上可接受的带负电剂；和(3)除去所述第一溶剂以形成具有负的表面电荷的所述微粒或纳米颗粒。

在一个相关方面，本发明提供了一种制备包含具有负的表面电荷的聚(乳酸-羟基乙酸)共聚物微粒或纳米颗粒的组合物的方法，所述方法包括：(1)将1克或更多的聚(乳酸-羟基乙酸)共聚物溶解在第一溶剂中以形成聚合物溶液；(2)向所述聚合物溶液中加入少量第二溶剂的第一溶液以形成混合物，其中所述第一溶剂与所述第二溶剂不混溶或部分混溶，并且其中所述第二溶剂的第一溶液任选地包含活性药物成分；(3)将所述混合物乳化以形成第一乳液；(4)将所述第一乳液在大量的所述第二溶剂的第二溶液中乳化以形成第二乳液，其中所述第二溶剂的第二溶液包含选自聚丙烯酸和透明质酸的药学上可接受的带负电剂，并任选还包含表面活性剂；和(5)除去所述第一溶剂以形成具有负的表面电荷的所述微粒或纳米颗粒。

如本文所用，“少(量)”是指与具有plga聚合物的第一溶剂的体积相比，第二溶剂的第一溶液的相对较少的量/体积，使得第二溶剂的第一溶液在第一溶剂的聚合物溶液中乳化形成乳液(即第一乳液)，其中连续相为聚合物溶液。通常，该少量的第二溶剂的第一溶液与第一溶剂之间的体积比为约1比1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100。

如本文所用，“大(量)”是指与第一乳液的体积相比，第二溶剂的第二溶液的相对较大的量/体积，使得第一乳液在第二溶剂的第二溶液中乳化形成乳液(即，第二乳液)，其中连续相为第二溶剂的第二溶液。通常，第一乳液与该大量的第二溶剂的第二溶液之间的体积比为约1比1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100。

优选地，大规模生产得到具有约-40mv或更低、约-45mv或更低或约-50mv或更低的δ电位的微粒或纳米颗粒。

使用本发明的方法，药学上可接受的带负电剂与所制备的微粒或纳米粒子紧密结合。因此，优选地，将药学上可接受的带负电剂掺入所述微粒或纳米颗粒中以增加所述微粒或纳米颗粒上的负的表面电荷。优选地，将药学上可接受的带负电剂掺入所述微粒或纳米颗粒中，以增加所述微粒或纳米颗粒表面上的cooh基团的数目。

将药学上可接受的带负电剂掺入微粒或纳米颗粒中是稳定且紧密的。因此，优选地，该方法还包括洗涤所述微粒或纳米颗粒，和/或将所述微粒或纳米颗粒浓缩至所需的体积。

虽然不希望受任何特定理论的束缚，但申请人认为负的表面电荷(可能主要是或完全是由于羧基的存在而带负电荷)紧密地锚定在所述微粒和纳米颗粒的表面上，并因此可以承受各种洗涤条件或洗涤试验，而不会造成这种负的表面电荷和/或羧基的明显损失。

使用本发明的方法制备的微粒和纳米颗粒可以常规地进行洗涤，作为去除杂质和/或浓缩所制备的微粒和纳米颗粒的纯化过程的一部分。

使用本发明的方法制备的微粒和纳米颗粒也可以承受更严格的洗涤试验，例如作为质量控制过程的一部分，以确保负的表面电荷和/或羧基稳定地掺入到所制备的微粒和纳米颗粒中。

优选地，洗涤试验使用与实施例10中例举的那些相同的或相似的条件。优选地，在洗涤试验之后，微粒和纳米粒子不会明显损失由δ电位测定的负的表面电荷(例如，不会变为明显更小的负值-即比原始负值更接近0的负值)。

优选地，在洗涤之后，通过δ电位测量，所述微粒或纳米颗粒保留至少约75％、80％、85％、90％、95％或99％的负的表面电荷。

以上一般性地描述了本发明，在以下部分中进一步描述本发明的特定方面。

2.定义：

如本文所用，“药学上可接受的”包括在合理的医学判断范围内适合于医学或兽医用途的那些化合物、材料、组合物和/或剂型，当其与人和动物的组织接触时不会产生过多的毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症，与合理的利益/风险比相称。优选地，药学上可接受的材料(例如，由其制备的聚合物或微粒/纳米颗粒)适合于或被批准用于人类医学用途。

如本文所用，“微粒”的形状大致为圆形、球形或类球形，并且通常在例如约1-1000μm之间或约10-100μm之间的尺寸范围内。所述微粒还可包括不太可能在体内聚集的颗粒。

如本文所用，“纳米颗粒”的形状大致为圆形、球形或类球形，并且通常在例如约1-1000nm之间，约10-1000nm之间或约50-1000nm之间或约100-500nm之间的尺寸范围内。所述纳米颗粒还可包括不太可能在体内聚集的颗粒。

粒度和粒度分布可通过诸如马尔文纳米粒度仪(malvernzetasizer)的动态光散射仪器测量。替代性技术包括例如沉降场流分级、光子相关光谱、光散射、动态光散射、光衍射和盘式离心。术语“微粒”和“纳米颗粒”不旨在表达任何特定的形状限制。这些颗粒包括但不限于具有通常的多面体或球形几何形状的颗粒。优选的颗粒的特征在于通常通过基于乳液的包封方法产生的球形几何形状。应理解，术语“微粒”和“纳米颗粒”在本文中可互换使用，除非附有尺寸的具体描述。例如，当称为“微粒和/或纳米颗粒”时，除非上下文另有要求，否则术语“微粒”也旨在包括“纳米颗粒”。

虽然每个微粒或纳米颗粒的大小通常足以引发抗原提呈细胞(apc)或其他单核巨噬细胞系统(mps)细胞的吞噬作用，但每个微粒或纳米颗粒的大小不必是均匀的。优选地，所述微粒和纳米颗粒具有足以引发抗原提呈细胞或其他mps细胞的吞噬作用的直径。

根据本发明，所述微粒或纳米颗粒具有负的(表面)电荷。羧基化微粒和纳米颗粒上的负电荷密度可以通过“δ电位”来量化。具有负的表面电荷的微粒和纳米颗粒的δ电位通常在颗粒的水悬浮液中在4至10，优选5至8的ph下测量。优选地，通过本发明的方法制备的微粒或纳米颗粒可具有约-5mv至约-200mv、优选约-15mv至约-100mv、最优选-35mv至-85mv的δ电位。比约-40mv更负的δ电位在本文中称为“高度带负电的颗粒”。

如本文所用，“约”通常指最多为所修饰的特定术语的±10％。

尽管掺入所述微粒和纳米颗粒中的负电荷可以是例如羧酸盐、磺酸盐、硝酸盐、氟酸盐、氯化物、碘化物、过硫酸盐和许多其他带负电荷的化学基团的形式，但最优选的是羧酸盐。因此，优选地，负电荷主要是，大部分是或仅由羧基赋予。羧基可以来自plga，来自聚丙烯酸和/或来自透明质酸。

所述微粒或纳米颗粒具有净负的表面电荷，并且可以包含或不包含一些正的表面电荷。

可以使用本领域已知的任何技术测量负的表面电荷，例如通过测量δ电位(参见实施例)。

3.plga

plga通常通过丙交酯和乙交酯的开环聚合制备。在该反应中，辛酸亚锡通常用作催化剂，但也可以使用其他催化剂。通常使用引发剂(例如醇)来引发聚合反应。如果没有有意地添加引发剂，则痕量的含有活性质子的极性化合物(例如醇和水)可以作为引发剂。聚合通常发生在链末端具有羧基的plga聚合物，如下所示：

r-oh+l(丙交酯单体)+g(乙交酯单体)＝plga-cooh

因此，每个plga聚合物分子通常是线性的，并且通常在链末端包含单个cooh基团。因此，由这种plga聚合物制备的常规plga颗粒仅在表面上具有少量的cooh基团，并且其上的负电荷可能不足以用于某些用途，例如治疗炎性疾病。此外，可能没有足够数量的cooh基团将活性药物成分或其他化学部分(例如蛋白质配体或其他靶向剂)共价连接到所述微粒和纳米颗粒的表面。此类蛋白质配体或其他靶向剂可以与靶细胞、组织、器官或部位表面上的受体或结合配偶体结合。

本发明提供了各种方法或其组合，用于在plga颗粒表面上制备具有附加的带负电基团(例如羧基)的plga颗粒。具有增加的净负表面电荷的这种plga颗粒特别有用，例如，用于治疗某些疾病(例如炎性疾病)并促进活性药物成分或其他化学实体与微粒和纳米颗粒的缀合。

优选地，所述药学上可接受的聚合物plga的平均分子量在所需的范围内。

该范围的下限优选不小于约100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1200、1500、2000、2500或3000da。所需的范围具有为任何上述值的下限。

该范围的上限优选不超过50000、40000、35000、30000、25000、20000、15000、10000、7500或5000da。所需的范围具有为任何上述值的上限。

例如，所需的范围可为约500至约50000da，或约1000至约30000da。

优选地，plga的平均分子量为约500至约1000000da，优选约1000至约50000da。

优选地，plga含有多个带负电荷的末端基团。

对于plga，平均分子量可以用其他物理性质表示，例如固有粘度。固有粘度(iv)是测量分子大小的粘度测量方法。固有粘度是基于相对于纯溶剂通过毛细管的流动时间，聚合物溶液通过窄毛细管的流动时间。对于本申请中的确定性度量(certaintymeasure)，所用溶剂通常为氯仿，聚合物浓度为约0.5％(w/v)。测量粘度的温度为约30℃。固有粘度的单位通常以分升每克(dl/g)表示。因此，例如，本发明中使用的plga可具有约0.01至约20dl/g或约0.05至约2.0dl/g的固有粘度。

所述plga聚合物的组成和生物降解性部分地由聚合物中丙交酯(l)与乙交酯(g)单元的摩尔比或l/g比决定。本发明中plga聚合物的l/g比可以为100/0至0/100。如本文所用，l/g比“100/0”是指聚丙交酯或pla，而l/g比“0/100”是指聚乙交酯或pga。优选地，plga聚合物的l/g比为约100/0至0/100，或约95/5至5/95，更优选为约85/15至15/85。本发明中最优选的l/g比为约50/50。

在制备plga微粒和纳米颗粒时，可以将其他聚合物与plga聚合物混合。例如，通常将聚乙二醇或peg加入plga中以提高性能。聚乙二醇化颗粒是有用的，因为它们通常在人体或动物体内具有增加的循环时间。

优选地，也可以使用peg与plga的共聚物。

由peg与plga的混合物或peg与plga的共聚物制备的微粒和纳米颗粒称为聚乙二醇化的plga微粒和纳米颗粒。

这种“聚乙二醇化”过程也可以在形成微粒和纳米颗粒之后进行。在这种情况下，peg聚合物或含有peg单元的其他聚合物通过物理吸附涂覆到plga微粒和纳米颗粒上。

peg单元也可以通过共价键连接到plga微粒或纳米颗粒的表面。这种过程通常被称为“缀合”。在缀合过程中，含有peg单元的反应性实体与微粒和纳米颗粒表面上的某些官能团反应以形成化学键。

因此，优选地，药学上可接受的聚合物是plga，并且微粒或纳米颗粒是聚乙二醇化的。通过在制备微粒和纳米颗粒期间与聚乙二醇或含有聚乙二醇的实体混合，可以使微粒或纳米颗粒聚乙二醇化。还可以通过使用peg和plga的共聚物使微粒或纳米颗粒聚乙二醇化。还可以通过将peg聚合物或含有peg单元的聚合物物理吸附到plga微粒和纳米颗粒上，使微粒或纳米颗粒聚乙二醇化。此外，还可以通过共价键将peg单元缀合到plga微粒或纳米颗粒的表面，使微粒或纳米颗粒聚乙二醇化。

4.具有增强的负电性表面的纳米颗粒或微粒的制备

本文所述的发明提供了几种制备具有高度带负电的表面电荷的颗粒的基本方法。这些方法不是相互排斥的，并且可以彼此组合以产生叠加的甚或协同的效果，以制备具有高度带负电的表面的微粒和纳米颗粒。

因此，在一个方面，本发明提供了一种制备包含具有负的表面电荷的微粒或纳米颗粒的组合物的方法，该方法包括使用乳液法或沉淀法(优选乳液法，包括双乳液法)，用药学上可接受的聚合物(例如plga)制备微粒或纳米颗粒，其中该方法包括下述任何一个或多个特征，或其组合。

具体地，本发明的方法的一个特征包括在具有促进药学上可接受的聚合物电离的ph的水溶液中实施乳液法或沉淀法。例如，药学上可接受的聚合物(例如，plga)可包含在碱性ph下离子化(例如带负电荷)的羧基。在另一个实例中，药学上可接受的聚合物(例如，plga)可以包含具有低pka的化学部分，使得该部分在相对酸性的ph(例如，ph5或6)下离子化。

虽然不希望受任何特定理论的束缚，但与其非离子化形式相比，离子化的基团或部分更倾向于暴露在使用本发明的方法制备的最终形成的微粒或纳米颗粒的表面上，并且倾向于较少地被埋在最终形成的微粒或纳米颗粒内。

本发明的方法的另一个特征包括使用具有低平均分子量的药学上可接受的聚合物(例如，低平均分子量plga)。如本文所述，plga通常通过使用辛酸亚锡作为催化剂和醇作为引发剂的丙交酯和乙交酯的开环聚合来制备。聚合通常产生在链末端具有单个羧基的线性plga聚合物。因此，通过使用具有较低分子量或较短聚合物链的plga聚合物，可以在纳米颗粒和微粒中达到相对较高的羧基密度。在此，羧基密度可以定义为每克聚合物的羧基的数目。

本发明的方法的另一个特征包括使用药学上可接受的聚合物(例如，plga)，该聚合物含有多个(即，两个或更多个、≥2、≥3、≥4、≥5、≥10、≥20、≥50、≥75、≥100或任何两个所列值之间的范围等)潜在地带负电荷的末端基团。优选地，多个带负电荷的末端基团是羧基。

含有多个羧基的聚合物可通过各种方法获得，所述方法包括：1)在制备聚合物时使用羧基官能引发剂，常见的羧基官能引发剂包括但不限于α-羟基酸，例如，乳酸、乙醇酸；2)将含羧基的实体接枝到聚合物链上；3)通过化学反应将plga聚合物上的其他官能团转化为羧基，例如，可将plga聚合物上的羟基通过羟基与酸酐(例如二氢呋喃-2,5-二酮)反应而转化为羧基，示例性反应在以下方案中描述：

和

4)使用包含多个含羧基臂的超支化plga聚合物，例如，通过使用在其分子上含有多个羧基的引发剂获得。

每种(plga)聚合物上的羧基数优选为1至100，更优选为2至10(例如，2、3、4、5、6、7、8、9或10)。

本发明的方法可包括本文所述的任何一个或多个特征。

任何本领域公知的乳液法均可用于本发明的方法中。优选地，所述微粒和纳米颗粒(例如，plga微粒和纳米颗粒)可以通过乳化过程制备，所述乳化过程包括以下步骤(不一定按此顺序)：1)将药学上可接受的聚合物(例如，plga)溶解在第一溶剂(例如，二氯甲烷)中以形成聚合物溶液；2)在第二溶剂(例如，水溶液或有机溶剂)的溶液中乳化聚合物溶液(例如，plga溶液)以形成乳液，其中第一溶剂与第二溶剂不混溶或部分混溶，并且其中第二溶剂的溶液任选地包含药学上可接受的带负电剂，例如聚丙烯酸和透明质酸；和3)除去第一溶剂以形成具有负的表面电荷的微粒或纳米颗粒。

优选地，纳米颗粒或微粒中存在至少一种活性药物成分，并且乳液法包括：(1)将所述至少一种活性药物成分和药学上可接受的聚合物(例如，plga)溶解在第一溶剂(例如，有机溶剂)中以形成聚合物-活性药物成分溶液；(2)将药学上可接受的带负电剂(例如聚丙烯酸和透明质酸)溶解在任选包含溶解于其中的表面活性剂或表面稳定剂的第二溶剂(例如含水溶液)中；(3)在所述第二溶剂/含水溶液中乳化聚合物-活性药物成分溶液；和(4)通过诸如溶剂蒸发法或溶剂交换法除去第一/有机溶剂。

优选地，在乳化过程中，plga溶液与水溶液的重量比通常为1:1000至10:1，优选1:100至1:1。

如本文所用，可混溶性定义为液体以任意比例混合形成均匀溶液的性质。如果在某种比例下物质/液体不形成溶液，则物质/液体被称为非混溶或不混溶。

可与水混溶的示例性溶剂包括丙酮、四氢呋喃(thf)、乙腈、二甲基亚砜(dmso)、二甲基甲酰胺(dmf)。

另一种本领域公知的乳液法通常称为双乳液法，这在下述情况下可能特别有用：当首先用药学上可接受的聚合物溶液乳化活性药物成分(例如在含水溶液中制备的基于蛋白质的治疗剂)以形成第一乳液，使得基于蛋白质的治疗剂被包封在聚合物溶液中。然后，在形成微粒或纳米颗粒之前，将聚合物和包封在其中的治疗剂再次在更大体积的溶剂中乳化以形成第二乳液(例如，水包油包水或水/油/水型双乳液)。

例如，在上述水/油/水技术中，可将相对较少量的第二溶剂的第一溶液(例如，蛋白质含水溶液)(例如，有机溶剂的约20％、15％、10％、5％(v/v))引入溶解有疏水聚合物plga的相对较大量的第一溶剂(例如，诸如二氯甲烷或乙酸乙酯的有机溶剂)中。然后使用合适的方法(例如探针超声处理或均质化)形成第一乳液。在形成第一乳液后，通过将第一乳液引入含有乳化剂(例如聚乙烯醇)的更大体积(例如，为第一乳液的约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、10倍)的第二溶剂的第二溶液来形成第二乳液。同样，用均质化法形成第二乳液。接下来进行一段时间的溶剂蒸发，通常通过几个小时的搅拌，使聚合物硬化。结果，蛋白质溶液被捕获到plga聚合物的相对疏水的基质中，形成小的夹杂物。最后，收集形成的微粒或纳米颗粒，通过反复离心或过滤进行洗涤(例如用蒸馏水)，然后通常通过冷冻干燥进行脱水。

因此，优选地，所述微粒和纳米颗粒(例如，plga微粒和纳米颗粒)可以通过双重乳化法制备，所述双重乳化法包括以下步骤(不一定按此顺序)：1)将药学上可接受的聚合物(例如，plga)溶解在第一溶剂(例如，诸如二氯甲烷的有机溶剂)中以形成聚合物溶液；2)向聚合物溶液中加入相对较少量(例如，与有机溶剂相比，约20％、15％、10％、5％(v/v))的第二溶剂的第一溶液以形成混合物，其中第一溶剂与第二溶剂不混溶或部分混溶，并且其中第二溶剂的第一溶液任选地包含活性药物成分；3)乳化混合物以形成第一乳液；4)在更大体积(例如，为第一乳液的约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、10倍)的第二溶剂的第二溶液中乳化第一乳液，以形成第二乳液，其中第二溶剂的溶液任选地包含药学上可接受的带负电剂，例如聚丙烯酸和透明质酸，并且任选地还包含表面活性剂；和5)除去第一溶剂以形成具有负的表面电荷的所述微粒或纳米颗粒。

优选地，纳米颗粒或微粒中存在至少一种活性药物成分，并且乳液法包括：(1)将药学上可接受的聚合物(例如，plga)和任选的活性药物成分溶解在第一溶剂(例如，有机溶剂)中以形成溶液a；(2)将所述活性药物成分溶解在第二溶剂的第一溶液(例如，第一含水溶液)中以形成溶液b；(3)将药学上可接受的带负电剂(例如聚丙烯酸和透明质酸)溶解在第二溶剂的第二溶液(例如，第二含水溶液)中以形成溶液c，所述第二水溶液任选包含溶解于其中的表面活性剂或表面稳定剂；(4)在溶液a中乳化溶液b以形成第一乳液；(5)在溶液c中进一步乳化第一乳液以形成第二乳液；和(6)通过诸如溶剂蒸发法或溶剂交换法除去第二乳液的有机溶剂。

优选地，基于plga溶液的体积，添加到聚合物溶液中用于产生第一乳液的少量第二溶剂溶液的体积通常为0.01％至50％，优选0.1％至10％。

优选地，如上述步骤4)中描述的第一乳液与第二溶剂的第二溶液的体积比通常为10:1至1:10000，优选1:1至1:100，例如1:10或1:4-5。

任何本领域公知的沉淀法均可用于本发明的方法中。优选地，所述微粒和纳米颗粒(例如，plga微粒和纳米颗粒)可以通过包括以下步骤(不一定按此顺序)的沉淀法制备：1)将药学上可接受的聚合物(例如，plga)溶解在第一溶剂(例如，丙酮)中以形成聚合物溶液；2)制备第二溶剂的溶液(例如，含水溶液，例如1mmnaoh溶液)，其中第一溶剂可与第二溶剂混溶，并且其中第二溶剂的溶液任选地包含药学上可接受的带负电剂，并任选包含表面活性剂；和3)在混合的同时将聚合物溶液加入到第二溶剂的溶液中，从而形成具有负的表面电荷的微粒或纳米颗粒，其中第二溶剂的溶液任选为含水溶液。

优选地，沉淀法包括：(1)将药学上可接受的聚合物(例如，plga)和至少一种活性药物成分溶解在第一溶剂(例如，有机溶剂)中以形成聚合物-活性药物成分溶液，所述有机溶剂可与水混溶；(2)将药学上可接受的带负电剂(例如聚丙烯酸和透明质酸)溶解在第二溶剂(例如水溶液)中，所述第二溶剂/水溶液任选地包含溶解于其中的表面活性剂或表面稳定剂；和(3)在混合的同时将聚合物-活性药物成分溶液合并(例如添加)到水溶液中，从而形成表面具有负电荷和羧基的负载活性药物成分的纳米颗粒或微粒。

优选地，在沉淀法中，plga溶液与水溶液的体积比通常为10:1至1:1000，优选1:1至1:10。

优选地，作为沉淀法中步骤3)的替代步骤，可以将第二溶剂的溶液(例如水溶液)加入到聚合物溶液(例如plga溶液)中。

优选地，药学上可接受的带负电剂可以覆盖微粒或纳米颗粒的表面，和/或至少部分地并入所述微粒或纳米颗粒中以增加微粒或纳米颗粒上的负的表面电荷。代表性的药学上可接受的带负电剂可包括聚丙烯酸。

在上述任何方面中，优选地，第一溶剂是二氯甲烷、乙酸乙酯或氯仿。优选地，第二溶剂的第二溶液包含表面活性剂，所述表面活性剂包含有机药物赋形剂或无机药物赋形剂、各种聚合物、低聚物、天然产物、非离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性离子表面活性剂或离子表面活性剂、以及它们的混合物。表面活性剂可包括聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚山梨醇酯(吐温系列)表面活性剂、聚环氧乙烷-聚环氧丙烷三嵌段共聚物peo-ppo-peo(普朗尼克系列或泊洛沙姆系列)表面活性剂或叔辛基苯基聚氧乙烯(曲拉通x-100)表面活性剂或其盐、衍生物、共聚物或混合物。优选地，表面活性剂是聚乙烯醇(参见实施例)。

优选地，乳化步骤包括均质化、机械搅拌和/或微流化。

优选地，通过溶剂交换和/或蒸发除去第一溶剂。

5.药学上可接受的带负电剂

本发明的方法利用药学上可接受的带负电剂来进一步增加所述微粒和纳米颗粒的负的表面电荷。这种带负电剂优选是药学上可接受的含羧基剂，例如可用于制备表面上具有额外数量的羧基的(plga)微粒和纳米颗粒。这种含羧基剂包括但不限于透明质酸或其类似物或衍生物、明胶、多糖、羟乙基甲基丙烯酸、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、氨基酸或它们的盐、衍生物、共聚物和混合物。最优选地，药学上可接受的带负电剂选自聚丙烯酸、透明质酸、其类似物或衍生物或其组合/混合物。

基于制剂中使用的药学上可接受的聚合物(例如plga)的重量，本发明中使用的药学上可接受的带负电剂的量为0.01％至30％，优选0.1％至15％。

透明质酸类似物包括许多已经硫酸化的天然多糖，其可以表现得像硫酸化的糖胺聚糖，例如肝素(hoffmanetal.,1982,carbohydrateres.,2:115；kindnessetal.,1980,brit.j.pharmac.,69:675；hortonetal.,1973,carbohydrateres.,30:349；okadaetal.,1979,makromol.chem.,180:813；kikuchietal.,1979,nipponkagakukaishi,1:127；manzacetal.,1981,proc.thirdm.i.s.a.o.,5:504)。此外，硫酸基、羧基或磺化基团已连接到合成聚合物上，例如聚苯乙烯(kanmaugueetal.,1985,biomaterials,6:297)和聚氨酯(itoetal.,1992,biomaterials,13:131)，这可在本发明中用作透明质酸(ha)类似物。当作为透明质酸类似物添加到所述微粒/纳米颗粒中时，这些透明质酸类似物上的高密度负电荷(例如，葡糖胺残基的n-硫酸化基团)(该高密度负电荷可以是ph依赖性的)赋予其他益处。

透明质酸类似物可以通过已知用于多糖硫酸化的化学反应来制备(参见，例如，wo88/00211；ep0340628；carbohydrateresearch,158:183-190,1986)。

透明质酸类似物的重要家族包括通过修饰透明质酸产生的透明质酸衍生物。

某些透明质酸衍生物是本领域已知的。例如，wo95/25751(通过引用并入本文)描述了各种肝素样硫酸化多糖衍生物，例如不同分子量范围的硫酸化透明质酸，使得每个重复单元的硫酸根基团的数量在0.5至3.5的范围内。当使用分子量在约10000至约50000道尔顿范围内的硫酸化透明质酸时，硫酸化透明质酸不仅在每个重复单元中包含更多的负电荷，而且还抑制肿瘤坏死因子(tnf)的产生。过量的tnfα活性与炎性细胞的增殖有关，并且是许多炎性疾病病症的原因。因此，使用这种硫酸化透明质酸可以进一步增强所述微粒/纳米颗粒的抗炎作用。

优选地，硫酸化透明质酸的分子量为约10000至约50000道尔顿，或约50000至约250000道尔顿，或约250009至约750000道尔顿，或约750000至约1250000道尔顿，其中，在每种情况下，所述硫酸化透明质酸的硫酸化程度为每个透明质酸重复单元具有2.5、3.0或3.5个硫酸根。

wo1998/045335a1描述了透明质酸的某些生物相容的硫酸化化合物及其衍生物，任选被盐化，其中葡糖胺被部分n-硫酸化，或被部分n-硫酸化并在6位部分或完全地o-硫酸化。具体地，这种透明质酸衍生物是通过透明质酸(根据p.shaklee(1984)biochem.j.,217:187-197(并入本文)中描述的方法预先将透明质酸n-去乙酰化)的葡糖胺的氨基的受控硫酸化反应获得。除了它们的生物相容性特征外，这种n-硫酸化衍生物还具有抗病毒活性、抗炎活性、抗血栓形成和抗凝血特性。

优选地，氨基的每个二聚单元的硫酸化程度在1-70％之间变化，而在6位的羟基的硫酸化程度在0-100％之间变化。优选地，氨基的每个二聚单元的硫酸化程度在5-40％之间变化，而在6位的羟基的硫酸化程度在0-100％之间变化。

其他的透明质酸衍生物描述于第7,993,678号美国专利中，其中通过与芳基/烷基琥珀酸酐(asa)的反应，衍生物的至少一个透明质酸的羟基被取代，以产生芳基/烷基琥珀酸酐透明质酸衍生物。该衍生物在每个重复单元中携带更多的负电荷，并且可以在本发明的方法中与透明质酸一起使用或代替透明质酸。

优选地，透明质酸类似物或衍生物不超过药学上可接受的聚合物的10、15、20、25或30％(w/w)。

聚丙烯酸(paa或卡波姆)是合成的高分子量丙烯酸聚合物的总称。它们可以是丙烯酸的均聚物，使用烯丙基醚季戊四醇、蔗糖的烯丙基醚或丙烯的烯丙基醚进行交联。在ph中性的水溶液中，聚丙烯酸是阴离子聚合物，即聚丙烯酸的许多侧链将失去其质子并获得负电荷。

市售的干燥聚丙烯酸为白色蓬松的粉末。卡波姆代码(910、934、940、941和934p)表示聚合物的分子量和特定组分。聚丙烯酸可以以碱金属或铵盐的形式使用，例如，聚丙烯酸钠。

聚丙烯酸是一种弱阴离子聚电解质，其电离度取决于溶液的ph值。在低ph下，聚丙烯酸可以以其非离子化形式与各种非离子聚合物(例如聚环氧乙烷、聚-n-乙烯基吡咯烷酮、聚丙烯酰胺和一些纤维素醚)缔合并形成氢键键合的互聚物络合物。在含水溶液中，聚丙烯酸可以与带相反电荷的聚合物(例如，壳聚糖)、表面活性剂和药物/活性药物成分分子形成多络合物。

优选地，微粒或纳米颗粒具有负的(表面)电荷。羧基化微粒和纳米颗粒上的负电荷密度可以通过δ电位来量化。羧基化微粒和纳米颗粒的δ电位通常在颗粒的水悬浮液中在4-10、优选5-8的ph下测量。优选地，通过本发明的方法制备的微粒或纳米颗粒可具有约-5mv至约-200mv、优选约-15mv至约-100mv、最优选-35mv至-85mv的δ电位。

优选地，微粒或纳米颗粒的δ电位为约-40mv或更低，约-45mv或更低，或约-50mv或更低，例如-40mv至-65mv。

6.溶剂和表面活性剂

在聚合物的溶解步骤中使用的溶剂可以是溶解聚合物(例如plga)的任何类型的溶剂。但是，优选使用挥发性溶剂以便于去除。例如，用于形成plga溶液的优选溶剂包括二氯甲烷、乙酸乙酯和氯仿。

在乳化步骤中，(含水)溶液可包含表面活性剂或表面稳定剂。表面活性剂通常包括降低液体表面张力、两种液体之间的界面张力或液体和固体之间的界面张力的化合物。表面活性剂可用作洗涤剂、润湿剂、乳化剂、发泡剂和分散剂。表面活性剂通常是两亲性的有机化合物，其含有疏水性基团(通常为支链、直链或芳香烃链、氟碳链或硅氧烷链，作为“尾”)和亲水性基团(通常为头)。表面活性剂最常根据其极性头部基团分类：非离子表面活性剂在其头部没有电荷基团；离子型表面活性剂带有净电荷-如果该电荷为负，则表面活性剂为阴离子表面活性剂，如果该电荷为正，则表面活性剂为阳离子表面活性剂。如果表面活性剂包含具有两个带相反电荷的基团的头部，则称为两性离子表面活性剂。优选地，阴离子表面活性剂或两性离子表面活性剂，例如含有羧基(“羧酸盐”)的表面活性剂，优选用于本发明。羧酸盐是最常见的表面活性剂，包括烷基羧酸盐(例如硬脂酸钠、月桂酰肌氨酸钠)，和基于羧酸盐的含氟表面活性剂，例如全氟壬酸盐、全氟辛酸盐(pfoa或pfo)。

虽然不希望受任何特定理论的束缚，但表面活性剂可用于乳液液滴的形成和稳定。表面活性剂还可包含有机药物赋形剂或无机药物赋形剂、各种聚合物、低聚物、天然产物、非离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性离子表面活性剂或离子表面活性剂、以及它们的混合物。

可用于制备所述(plga)微粒/纳米颗粒的表面活性剂包括聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、吐温系列，普朗尼克系列、泊洛沙姆系列、曲拉通x-100等。下文提供了其它合适的表面活性剂。

乳化过程可以通过本领域公知的任何方法进行，例如均质化、超声波处理、机械搅拌、微流化或其组合。

通常通过例如溶剂交换和蒸发来实现溶剂的去除。

优选地，为了确保大多数羧基在所述(例如，plga)微粒和纳米颗粒的表面上存在，将含水溶液调节至促进聚合物上的部分(moiety)的电离的ph，例如用于plga上的羧基的碱性ph。取决于可被电离以携带负电荷的聚合物基团的pka，ph优选在约4-14、6-14、6-10或约8-12的范围内。通过添加例如碱或其溶液，例如氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸氢钠、碳酸钠、碳酸氢钾、碳酸钾等，可以将水溶液的ph调节至优选范围。

一种以上表面活性剂的组合可用于本发明。可用于本发明的有用的表面活性剂或表面稳定剂可包括但不限于已知的有机药物赋形剂和无机药物赋形剂。这些赋形剂包括各种聚合物、低分子量低聚物、天然产物和表面活性剂。表面活性剂或表面稳定剂包括非离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性离子表面活性剂和离子表面活性剂。

其它有用的表面活性剂或表面稳定剂的代表性实例包括羟丙基甲基纤维素、羟丙基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、十二烷基硫酸钠、二辛基硫代琥珀酸钠、明胶、酪蛋白、卵磷脂(磷脂)、葡聚糖、阿拉伯树胶、胆固醇、黄蓍胶、硬脂酸、苯扎氯铵、硬脂酸钙、单硬脂酸甘油酯、十六十八醇、聚西托醇(cetomacrogol)乳化蜡、脱水山梨糖醇酯、聚氧乙烯烷基醚(例如，聚乙二醇醚，例如聚西托醇1000)、聚氧乙烯蓖麻油衍生物、聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯(例如市售的例如tween和tween(ici专用化学品))；聚乙二醇类(例如，carbowaxs和(联合碳化物公司))、聚氧乙烯硬脂酸酯、胶体二氧化硅、磷酸盐、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、非结晶纤维素、硅酸铝镁、三乙醇胺、聚乙烯醇、4-(1,1,3,3-四甲基丁基)-酚与环氧乙烷和甲醛的聚合物(也称为泰洛沙泊、superione和曲通)、泊洛沙姆(例如，pluronics和它们是环氧乙烷和环氧丙烷的嵌段共聚物)；泊洛沙胺(例如tetronic也称为泊洛沙胺其是一种四官能嵌段共聚物，由环氧丙烷和环氧乙烷顺序加成到乙二胺而得到(巴斯夫怀恩多特公司(basfwyandottecorporation)，帕西波尼，新泽西州))；tetronic(t-1508)(巴斯夫怀恩多特公司)、tritons(其是烷基芳基聚醚磺酸盐(罗门哈斯公司))；crodestas(其是蔗糖硬脂酸酯和蔗糖二硬脂酸酯的混合物(禾大公司))；对-异壬基苯氧基聚(缩水甘油)，也称为或表面活性剂(奥林化学品公司(olinchemicals)，斯坦福，康涅狄格州)；crodestassl-40(禾大公司)；sa9ohco(其为c18h37ch2(con(ch3)-ch2(choh)4(ch2oh)2(伊斯曼柯达公司))；癸酰基-n-甲基葡糖酰胺；正癸基β-d-吡喃葡萄糖苷；正癸基β-d-吡喃麦芽糖苷；正十二烷基β-d-吡喃葡萄糖苷；正十二烷基β-d-麦芽糖苷；庚酰基-n-甲基葡糖酰胺；正庚基-p-d-吡喃葡萄糖苷；正庚基β-d-硫代葡糖苷；正己基β-d-吡喃葡萄糖苷；壬酰基-n-甲基葡糖酰胺；正壬基β-d-吡喃葡萄糖苷；辛酰基-n-甲基葡糖酰胺；正辛基β-d-吡喃葡萄糖苷；辛基β-d-硫代吡喃葡萄糖苷；peg衍生的磷脂、peg-衍生的胆固醇、peg衍生的胆固醇衍生物、peg衍生的维生素a、peg衍生的维生素e、溶菌酶、乙烯基吡咯烷酮和乙酸乙烯酯的无规共聚物等。

有用的阳离子表面活性剂或表面稳定剂的实例包括但不限于聚合物、生物聚合物、多糖、纤维素、藻酸盐、磷脂和非聚合化合物，例如两性离子稳定剂、聚-n-甲基吡啶鎓、蒽基吡啶鎓氯化盐、阳离子磷脂、壳聚糖、聚赖氨酸、聚乙烯基咪唑、聚凝胺、聚甲基丙烯酸甲酯三甲基溴化铵(pmmtmabr)、己基二苯乙酮基三甲基溴化铵(hdmab)、聚乙烯吡咯烷酮-2-二甲基氨基乙基甲基丙烯酸二甲基硫酸酯、1,2-双棕榈酰基-sn-丙三氧基-3-磷酸乙醇胺-n-[氨基(聚乙二醇)(2000)](钠盐)(也称为dppe-peg(2000)-胺钠)(阿凡提极性脂质(avantipolarlipids)，阿拉巴斯特，阿拉巴马州)、聚(2-甲基丙烯酰氧基乙基三甲基溴化铵)(polysciences公司，沃灵顿，宾夕法尼亚州)(也称为s1001)、泊洛沙胺(例如tetronic也称为泊洛沙胺是一种四官能嵌段共聚物，由环氧丙烷和环氧乙烷到乙二胺的顺序加成得到(巴斯夫怀恩多特公司，帕西波尼，新泽西州))、溶菌酶、长链聚合物(例如海藻酸、角叉菜胶(fmc公司)和保益乐(polyox，陶氏公司，米德兰德，密歇根州))。

其它有用的阳离子稳定剂包括但不限于阳离子脂质、锍、鏻和季铵化合物，例如硬脂基三甲基氯化铵、苄基-二(2-氯乙基)乙基溴化铵、椰子三甲基氯化铵或椰子三甲基溴化铵、椰子甲基二羟乙基氯化铵或椰子甲基二羟乙基溴化铵、癸基三乙基氯化铵、癸基二甲基羟乙基氯化铵或癸基二甲基羟乙基溴化铵、c12-15二甲基羟乙基氯化铵或c12-15二甲基羟乙基溴化铵、椰子二甲基羟乙基氯化铵或椰子二甲基羟乙基溴化铵、肉豆蔻基三甲基铵甲基硫酸盐、月桂基二甲基苄基氯化铵或月桂基二甲基苄基溴化铵、月桂基二甲基(乙烯氧基)4氯化铵或月桂基二甲基(乙烯氧基)4溴化铵、n-烷基(c12-18)二甲基苄基氯化铵、n-烷基(c14-18)二甲基苄基氯化铵、n-十四烷基二甲基苄基氯化铵一水合物、二甲基二癸基氯化铵、n-烷基和(c12-14)二甲基1-萘甲基氯化铵、三甲基卤化铵、烷基-三甲基铵盐和二烷基二甲基铵盐、十二烷基三甲基氯化铵、乙氧基化烷基酰氨基烷基二烷基铵盐和/或乙氧基化三烷基铵盐、二烷基苯二烷基氯化铵、n-二癸基二甲基氯化铵、n-十四烷基二甲基苄基氯化铵一水合物、n-烷基(c12-14)二甲基1-萘基甲基氯化铵和十二烷基二甲基苄基氯化铵、二烷基苯烷基氯化铵、月桂基三甲基氯化铵、烷基苄基甲基氯化铵、烷基苄基二甲基溴化铵、c12、c15、c17三甲基溴化铵、十二烷基苄基三乙基氯化铵、聚二烯丙基二甲基氯化铵(dadmac)、二甲基氯化铵、烷基二甲基卤化铵、三鲸蜡基甲基氯化铵、癸基三甲基溴化铵、十二烷基三乙基溴化铵、十四烷基三甲基溴化铵、甲基三辛基氯化铵(aliquat336tm)、polyquat10tm、四丁基溴化铵、苄基三甲基溴化铵、胆碱酯(例如脂肪酸胆碱酯)、苯扎氯铵、硬脂酰氯化合物(例如硬脂基三甲基氯化铵和二硬脂基二甲基氯化铵)、十六烷基吡啶溴化物或十六烷基吡啶氯化物、季铵化聚氧乙基烷基胺的卤化物盐、mirapol^tm和alkaquat^tm(alkaril化学公司)、烷基吡啶盐；胺类(例如烷基胺、二烷基胺、链烷醇胺、聚乙烯多胺、n,n-二烷基氨基烷基丙烯酸酯和乙烯基吡啶)、胺盐(例如月桂基胺乙酸盐、十八烷基胺乙酸盐、烷基吡啶鎓盐和烷基咪唑鎓盐)以及氧化胺；咪唑啉盐(imideazoliniumsalt)；质子化的四级丙烯酰胺；甲基化四级聚合物，例如聚[二烯丙基二甲基氯化铵]和聚[n-甲基乙烯基吡啶氯化物]；和阳离子瓜尔胶。

这种示例性阳离子表面活性剂或表面稳定剂和其它有用的阳离子表面活性剂或表面稳定剂描述于以下文献中：j.crossande.singer,cationicsurfactants:analyticalandbiologicalevaluation(marceldekker,1994)；p.andd.rubingh(editor),cationicsurfactants:physicalchemistry(marceldekker,1991)；andj.richmond,cationicsurfactants:organicchemistry,(marceldekker,1990)，以上各文献通过引用整体并入本文。

非聚合阳离子表面活性剂或表面稳定剂为任何非聚合化合物，例如苯扎氯铵、碳鎓化合物、鏻化合物、氧鎓化合物、卤鎓化合物、阳离子有机金属化合物、季磷化合物、吡啶鎓化合物、苯铵化合物、铵化合物、羟基铵化合物、伯铵化合物、仲铵化合物、叔铵化合物和式nr1r2r3r4(+)的季铵化合物。对于式nr1r2r3r4(+)的化合物作如下说明：(i)r1-r4均不是ch3；(ii)r1-r4中的一个是ch3；(iii)r1-r4中的三个是ch3；(iv)所有r1-r4均为ch3；(v)r1-r4中的两个是ch3，r1-r4中的一个是c6h5ch2，r1-r4中的一个是具有7个或更少的碳原子的烷基链；(vi)r1-r4中的两个是ch3，r1-r4中的一个是c6h5ch2，并且r1-r4中的一个是具有十九个碳原子或更多个碳原子的烷基链；(vii)r1-r4中的两个是ch3，r1-r4中的一个是c6h5(ch2)n基团，其中n>1；(viii)r1-r4中的两个是ch3，r1-r4中的一个是c6h5ch2，r1-r4中的一个包含至少一个杂原子；(ix)r1-r4中的两个是ch3，r1-r4中的一个是c6h5ch2，r1-r4中的一个包含至少一个卤素；(x)r1-r4中的两个是ch3，r1-r4中的一个是c6h5ch2，r1-r4中的一个包含至少一个环状片段；(xi)r1-r4中的两个是ch3，r1-r4中的一个是苯环；或(xii)r1-r4中的两个是ch3，r1-r4中的两个是纯脂肪族片段。

这些化合物包括但不限于山嵛基苄基二甲基氯化铵(behenalkoniumchloride)、苄索氯铵、氯化十六烷基吡啶、山嵛基三甲基氯化铵、劳拉氯铵、西他氯铵、西曲溴铵、西曲氯铵、十六烷基胺氢氟化物(cethylaminehydrofluoride)、氯化氯烯丙基六亚甲基四胺(季铵盐-15)、二硬脂基二甲基氯化铵(季铵盐-5)、十二烷基二甲基乙基苄基氯化铵(季铵盐-14)、季铵盐-22、季铵盐-26、季铵盐-18锂蒙脱石、二甲基氨基乙基氯化物盐酸盐、半胱氨酸盐酸盐、二乙醇铵poe(10)油醚磷酸酯、二乙醇铵poe(3)油醚磷酸酯、牛脂基二甲基苄基氯化铵(tallowalkoniumchloride)、二甲基二十八烷基铵膨润土、司拉氯铵、溴化度米芬、苯酸苄铵酰铵、肉豆蔻基苄基二甲基氯化铵、月桂基三甲基氯化铵、二盐酸乙二胺、盐酸胍、盐酸吡哆醇、盐酸碘非他胺、盐酸葡甲胺、氯化苄乙氧铵、肉豆蔻基三甲基溴化铵、油基三甲基氯化铵、聚季铵盐-1、盐酸普鲁卡因、椰油基甜菜碱、司拉氯铵膨润土、司拉氯铵水辉石、硬脂基三羟乙基丙二胺二氢氟化物、牛脂基三甲基氯化铵和十六烷基三甲基溴化铵。

这些表面活性剂或表面稳定剂中的大多数是已知的药物赋形剂，并且详细描述于下述文献中：handbookofpharmaceuticalexcipients,publishedjointlybytheamericanpharmaceuticalassociationandthepharmaceuticalsocietyofgreatbritain(thepharmaceuticalpress,2000)，特别地，该文献通过引用并入本文。

表面活性剂或表面稳定剂可商购获得和/或可通过本领域已知的技术制备。

优选地，所述微粒或纳米颗粒的表面由使颗粒表面和间质之间的非特异性的或不需要的生物相互作用最小化的材料组成，例如，颗粒表面可以涂覆有防止或减少非特异性相互作用的材料。如由皮下注射后淋巴摄取的改善所证明的，通过用亲水性层(例如聚乙二醇及其共聚物(例如普朗尼克(pluronics)，包括聚乙二醇-嵌段-聚丙二醇-嵌段-聚乙二醇的共聚物))涂覆颗粒来进行立体稳定化，可以减少与间质蛋白质的非特异性相互作用。

7.颗粒尺寸

所述微粒和纳米颗粒的尺寸为约1nm至约1000μm，优选约10nm至约100μm，最优选约20nm至约5μm，最优选约50nm至约2μm。例如，微粒和纳米颗粒可具有约100、300、500、700或900nm的平均尺寸。

如本文所用，颗粒尺寸可通过本领域技术人员熟知的任何常规的颗粒尺寸测量技术来测定。这些技术包括，例如，沉降场流分级、光子相关光谱、光散射、动态光散射、光衍射和盘式离心。

8.其他组分

优选地，本发明的颗粒还可含有其他组分。例如，载体可以具有掺入或缀合到载体的成像剂。具有目前可商购的成像剂的载体纳米球的实例是kodakx-sight纳米球。无机量子限制发光纳米晶体，称为量子点(qd)，已成为荧光共振能量转移(fret)应用中的理想供体：它们的高量子产率和可调的尺寸依赖性斯托克斯位移使得不同尺寸能够在单一紫外激发下发射蓝色到红外光(bruchezetal.,science,1998,281:2013；niemeyer,c.m.,angew.chem.int.ed.,2003,42:5796；waggoner,a.methodsenzymol.,1995,246:362；brus,l.e.,j.chem.phys.,1993,79,5566)。量子点，例如基于一类称为树枝状聚合物的混合有机/无机量子点，可用于生物标记、成像和光学生物传感系统(lemonetal.,j.am.chem.soc.,2000,122:12886)。与传统的无机量子点的合成不同，这些混合量子点纳米颗粒的合成不需要高温或高毒性、不稳定的试剂(etienneetal.,appl.phys.lett.,87:181913,2005)。

9.活性药物成分(api)

本发明的另一方面提供了一种组合物，其包含具有负的表面电荷的所述微粒或纳米颗粒，其中该组合物由根据本文所述的任何一种方法或其组合来制备。

优选地，该组合物不含其他活性药物成分或api，例如被连接的肽或抗原部分。

优选地，该组合物包含活性药物成分，并且活性药物成分通过共价键共价连接至微粒或纳米颗粒的表面，所述共价键为，例如在蛋白质的酰胺基团与微粒或纳米颗粒的表面上的羧基之间形成的键。

优选地，活性药物成分的量可以是微粒或纳米颗粒的约0.01-50％(w/w)，或者是微粒或纳米颗粒的约0.05-25％，约0.1-10％，约0.2-5％，0.5-3％，1-5％，或2-5％(w/w)。

优选地，该组合物包含代替活性药物成分的靶向部分，例如共价连接于微粒或纳米颗粒表面的肽或蛋白质配体或结构域，该靶向部分特异性地或优先地结合靶位点(例如用于靶向部分的细胞表面受体或结合配偶体)，使得带有这种靶向部分的微粒或纳米颗粒将在体内特异性地或优先地靶向靶位点。带有靶向部分的微粒或纳米颗粒可以进一步包含被包封或嵌入微粒或纳米颗粒内的活性药物成分，所述活性药物成分可以在靶位点释放或以其他方式起作用。

本发明的相关方面提供了一种药物组合物，该药物组合物包含本发明的组合物和药学上可接受的载体或赋形剂。以下在单独的部分中更详细地描述药物组合物。

优选地，活性药物成分是水溶性的。

优选地，活性药物成分具有相对差的水溶性。优选地，代替或除了在本发明方法中的含水溶液或第二溶剂中包含活性药物成分之外，本发明提供了在用于溶解聚合物(例如plga)的第一溶剂中包括活性药物成分的等效方法。在将活性药物成分溶液与包含plga的第一溶剂混合之前，可将活性药物成分溶解在用于溶解plga的相同的第一溶剂中，或者溶解在合适的溶剂(可以与第一溶剂相同或不同)中以形成活性药物成分溶液，从而使得活性药物成分和plga都保留在所得溶液中。

优选地，在将活性药物成分溶液加入第二溶剂之前，可以首先将活性药物成分溶解在其自身的溶剂(可以与第二溶剂相同或不同)中以形成活性药物成分溶液。

活性药物成分或治疗剂可包括多种不同的化合物，包括化学化合物和化学化合物的混合物，例如小的有机分子或无机分子；糖精；寡糖；多糖；生物大分子，例如肽、蛋白质和肽类似物及衍生物；模拟肽(peptidomimetic)；抗体及其抗原结合片段；核酸；核酸类似物和衍生物；由诸如细菌、植物、真菌或动物细胞等生物材料制成的提取物；动物组织；天然存在的或合成的组合物；及它们的任何组合。优选地，治疗剂是小分子。

如本文所用，术语“小分子”可以指“天然产物样”的化合物，然而，术语“小分子”不限于“天然产物样”的化合物。相反，小分子的典型特征在于它含有数个碳-碳键，并且分子量小于5000道尔顿(5kda)，优选小于3kda，更优选小于2kda，最优选小于1kda。在某些情况下，优选小分子的分子量等于或小于700道尔顿。

示例性治疗剂包括但不限于经fda批准的治疗剂、向fda提出新药申请的治疗剂、处于临床试验或临床前研究中的治疗剂。

活性药物成分或治疗剂包括本文公开的类别和具体实例。所述类别不受具体实例的限制。根据本发明，本领域普通技术人员还将确认属于这些类别并且有用的许多其他化合物。实例包括放射增敏剂、类固醇、黄嘌呤、β-2-激动剂支气管扩张剂、抗炎剂、镇痛剂、钙拮抗剂、血管紧张素转换酶抑制剂、β-阻断剂、中枢活性α-激动剂、α-1-拮抗剂、抗胆碱能/解痉剂、加压素类似物、抗心律失常药、抗帕金森病药、抗心绞痛/抗高血压药、抗凝血剂、抗血小板药、镇静剂、溶血剂、肽剂、生物聚合剂、抗肿瘤药、缓泻药、止泻剂、抗微生物剂、抗真菌剂、疫苗、蛋白质或核酸。另一方面，药物活性剂可以是香豆素，白蛋白，类固醇(例如倍他米松、地塞米松、甲基强的松龙、泼尼松龙、泼尼松、曲安奈德、布地奈德、氢化可的松和药学上可接受的氢化可的松衍生物)；黄嘌呤(例如茶碱和多索可可碱)；β-2-激动剂支气管扩张剂(例如沙丁胺醇、非诺特罗(fenterol)、克伦特罗、班布特罗、沙美特罗、酚丙喘宁(fenoterol)；抗炎药，包括抗哮喘抗炎药、抗关节炎抗炎药和非甾体抗炎药，其实例包括但不限于硫化物、美沙拉嗪、布地奈德、柳氮磺吡啶、双氯芬酸、药学上可接受的双氯芬酸盐、尼美舒利、萘普生、对乙酰氨基酚、布洛芬、酮洛芬和吡罗昔康；镇痛剂，例如水杨酸盐；钙通道阻滞剂，例如硝苯地平、氨氯地平和尼卡地平；血管紧张素转换酶抑制剂，例如卡托普利、盐酸贝那普利、福辛普利钠、群多普利、雷米普利、赖诺普利、依那普利、盐酸喹那普利和盐酸莫西普利；β受体阻滞剂(即β-肾上腺素能阻滞剂)，例如盐酸索他洛尔、马来酸噻吗洛尔、盐酸艾司洛尔、卡替洛尔、盐酸普萘洛尔、盐酸倍他洛尔、硫酸巴替洛尔、酒石酸美托洛尔、琥珀酸美托洛尔、盐酸醋丁洛尔、阿替洛尔、吲哚洛尔和富马酸比索洛尔；中枢活性α-2-激动剂，例如可乐定；α-1-拮抗剂，例如多沙唑嗪和哌唑嗪；抗胆碱能/抗痉挛药，例如盐酸双环胺、氢溴酸东莨菪碱、格隆溴铵、克利溴铵、黄酮酸盐和奥昔布宁；加压素类似物，例如加压素和去氨加压素；抗心律失常药，例如奎尼丁、利多卡因、盐酸托西坦、盐酸美西律、地高辛、盐酸维拉帕米、盐酸普罗帕酮、醋酸氟卡尼、盐酸普鲁卡因胺、盐酸莫雷西嗪和磷酸二丙酰胺等；抗帕金森病药，例如多巴胺、左旋多巴/卡比多巴、司来吉兰、二氢麦角环肽、培高利特、麦角乙脲、阿扑吗啡和溴隐亭；抗心绞痛药和抗高血压药，例如单硝酸异山梨酯、硝酸异山梨酯、心得安、阿替洛尔和维拉帕米；抗凝血剂和抗血小板药，例如香豆素、华法林、乙酰水杨酸和噻氯匹定；镇静剂，例如苯二氮卓类和巴比妥类；溶血剂，例如劳拉西泮、溴西泮和地西泮；肽剂和生物聚合剂，例如降钙素、亮丙瑞林和其他lhrh激动剂、水蛭素、环孢菌素、胰岛素、生长抑素、普罗瑞林、干扰素、去氨加压素、生长激素、胸腺五肽、匹多莫德、促红细胞生成素、白细胞介素、褪黑激素、粒细胞/巨噬细胞-csf和肝素；抗肿瘤药，例如依托泊苷、依托泊苷磷酸盐、环磷酰胺、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、长春新碱、多柔比星、顺铂、羟基脲、甲酰四氢叶酸钙、他莫昔芬、氟他胺、天冬酰胺酶、六甲蜜胺、米托坦和盐酸丙卡巴肼；缓泻药，例如番泻叶浓缩物、鼠李蒽酚、比沙可啶和匹可硫酸钠；止泻剂，例如盐酸地诺考因、盐酸洛哌丁胺、呋喃唑酮、盐酸地芬诺酯和微生物；疫苗，例如细菌疫苗和病毒疫苗；抗微生物剂，例如青霉素、头孢菌素和大环内酯类；抗真菌剂，例如咪唑和三唑衍生物；和核酸，例如编码生物蛋白质的dna序列和反义寡核苷酸。

合适的活性药物成分的实例包括英夫利昔单抗、依那西普、贝伐单抗、雷珠单抗、阿达木单抗、赛妥珠单抗、戈利木单抗、白细胞介素1(il-1)阻断剂(例如阿那白滞素)、t细胞共刺激阻断剂(例如阿巴西普)、白细胞介素6(il-6)阻断剂(例如托珠单抗)；白细胞介素l3(il-13)阻滞剂(例如罗氏单抗lebrikizumab)；干扰素α(ifn)阻断剂(例如罗利珠单抗(rontalizumab))；β7整合素阻断剂(例如rhumabβ7)；ige途径阻断剂(例如抗-m1prime)；分泌的同源三聚体lta3和膜结合的异源三聚体ltα1/β2阻断剂，例如抗淋巴毒素α(lta)或抗vegf剂等。

为方便起见，本文使用术语“api(活性药物成分)”。应理解，该术语可在本说明书中由术语生物分子、蛋白质和核酸替换，如在每种情况下具体叙述的那样。

10.示例性用途

本发明的方法可用于制备具有多种应用的纳米颗粒和微粒。

优选地，纳米颗粒和微粒可用于治疗有需要的个体的疾病或病症的方法，或者减少有需要的个体的疾病或病症的持续时间或严重程度的方法，其中所述疾病或病症可用具有负的表面电荷的微粒或纳米颗粒(任选地具有特定api)治疗，治疗方法包括向个体施用包含微粒或纳米颗粒的组合物或药物组合物，从而治疗疾病或病症。

在相关方面，本发明提供一种调节有需要的个体(优选哺乳动物，更优选人)的免疫应答的方法，该方法包括向个体施用包含微粒或纳米颗粒的组合物或药物组合物，从而调节免疫应答。本发明提供的免疫调节方法包括压抑和/或抑制先天免疫应答或适应性免疫应答(包括但不限于免疫刺激多肽或病毒或细菌成分刺激的免疫应答)的方法。以足以调节免疫应答的量施用所述颗粒。如本文所述，免疫应答的调节可以是体液的和/或细胞的，并且使用本领域的标准技术并如本文所述进行测量。

优选地，疾病或病症的特征在于炎性免疫应答。

可治疗的疾病或病症包括但不限于：自身免疫疾病，例如多发性硬化症、硬皮病、i型糖尿病、类风湿性关节炎、甲状腺炎、系统性红斑狼疮、reynauud综合征、斯耶格伦综合征、自身免疫性葡萄膜炎、自身免疫性心肌炎、或克罗恩病。优选地，自身免疫疾病是多发性硬化。患有自身免疫疾病或炎性疾病的个体是具有现有自身免疫疾病或炎性疾病的可识别症状的个体。

自身免疫疾病可分为两大类：器官特异性的和全身性的自身免疫疾病。自身免疫疾病包括但不限于类风湿性关节炎(ra)、系统性红斑狼疮(sle)、i型糖尿病、ii型糖尿病、多发性硬化症(ms)、免疫介导的不育症(例如卵巢早衰)、硬皮病、干燥综合征(sjogren’sdisease)、白癜风、脱发(秃)、多发性衰竭、格雷夫斯病、甲状腺功能减退症、多发性肌炎、寻常性天疱疮、落叶型天疱疮、炎症性肠病(包括克罗恩病和溃疡性结肠炎)、自身免疫性肝炎(包括与乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒相关的肝炎)、垂体功能低下、移植物抗宿主病(gvhd)、心肌炎、艾迪生病、自身免疫性皮肤病、葡萄膜炎、恶性贫血和甲状旁腺功能减退症。

自身免疫疾病还可包括但不限于桥本氏甲状腺炎、i型和ii型自身免疫性多腺体综合征、副肿瘤性天疱疮、牛瘟类天疱疮、疱疹样皮炎、线性iga病、大疱性表皮松解症、结节性红斑、妊娠性类天疱疮、瘢痕性类天疱疮、原发性混合型冷球蛋白血症、儿童慢性大疱性疾病、溶血性贫血、血小板减少性紫癜、goodpasture综合征、自身免疫性中性粒细胞减少症、重症肌无力、eaton-lambert肌无力综合征、僵硬综合征、急性播散性脑脊髓炎、格林-巴利综合征、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、多灶性运动神经病变伴传导阻滞、慢性神经病变伴单克隆丙种球蛋白病、眼阵挛-肌阵挛综合征、小脑退化症、脑脊髓炎、视网膜病变、原发性胆汁硬化、硬化性胆管炎、麸质敏感性肠病、强直性脊柱炎、反应性关节炎、多发性肌炎/皮肌炎、混合性结缔组织病、behcet综合征、牛皮癣、结节性多动脉炎、过敏性血管炎和肉芽肿病(churg-strauss病)、多血管炎重叠综合征、过敏性血管炎、wegener肉芽肿病、颞动脉炎、takayasu动脉炎、川崎病、孤立中枢神经系统血管炎、血栓闭塞性脉管炎、结节病、肾小球肾炎和冷冻病。这些病症在医学领域中是众所周知的，并且描述于，例如，以下文献中：harrison’sprinciplesofinternalmedicine,14thedition,fauci,a.s.etal.,eds.,newyork:mcgraw-hill,1998。

优选地，所述疾病或病症包括过敏性病症或病症，例如过敏性疾病、变态反应、湿疹、哮喘、过敏性鼻炎或皮肤过敏症。患有过敏性疾病或哮喘的个体是具有现有过敏性疾病或哮喘的可识别症状的个体。

优选地，所述疾病或病症包括细菌感染或病毒感染。患有细菌感染或病毒感染的个体是具有现有细菌感染或病毒感染的可识别症状的个体。

优选地，个体患有病毒感染。优选地，病毒感染是疱疹病毒感染、肝炎病毒感染、西尼罗河病毒感染、黄病毒感染、流感感染、鼻病毒感染、乳头瘤病毒感染、副粘病毒感染或副流感病毒感染。优选地，病毒感染感染所述个体的中枢神经系统。优选地，病毒感染引起病毒性脑炎或病毒性脑膜炎。

优选地，个体患有细菌感染。可用本发明的所述颗粒治疗的细菌感染的非限制性例子包括葡萄球菌感染、链球菌感染、分枝杆菌感染、杆菌感染、沙门氏菌感染、弧菌感染、螺旋体感染和奈瑟菌感染。优选的是感染个体的中枢神经系统的细菌。最优选的是引起脑炎或脑膜炎的细菌。

优选地，当向患有细菌感染或病毒感染的个体施用时，本发明的方法诱导免疫耐受。优选地，当向患有细菌感染或病毒感染的个体施用时，该方法改善或抑制炎性免疫应答。

优选地，个体是移植受体。移植是指将组织样本或移植物从供体个体转移到受体个体，并且经常在需要组织的人类接受者上进行以恢复由组织提供的生理功能。移植的组织包括(但不限于)整个器官，例如肾、肝、心脏、肺；器官成分，例如皮肤移植物和眼角膜；细胞悬浮液，例如骨髓细胞和从骨髓或循环血液中选择和扩增的细胞培养物，以及全血输注。

任何移植的严重潜在并发症都源于宿主受体和移植组织之间的抗原差异。取决于差异的性质和程度，可能存在由宿主对移植物或者由移植物对宿主进行的免疫攻击或者两者都可能发生的风险。通过跟踪具有相似表型的类似治疗的个体群体中的反应模式，并根据普遍接受的临床程序将各种可能的促成因素相关联来确定风险的程度。免疫攻击可以是预先存在的免疫应答(例如预先形成的抗体)的结果，或者是在移植时刻(例如th细胞产生时)开始的免疫攻击的结果。抗体、辅助t细胞(th细胞)或细胞毒性t细胞(tc)可以彼此任意组合并与各种效应分子和细胞组合。然而，参与免疫应答的抗原通常是未知的，因此在设计抗原特异性疗法或诱导抗原特异性耐受方面造成困难。本发明的改性的颗粒在防止器官排斥方面特别有用，因为为了使所述颗粒能够有效地诱导耐受或改善炎性免疫应答，不需要将连接的肽或抗原与所述改性的颗粒缀合。

优选地，本发明涉及降低导致受体排斥组织移植物的宿主抗移植物疾病的风险。可以进行治疗以预防或减少超急性、急性或慢性排斥反应的影响。优选在移植前足够长的时间开始治疗，以便在安装移植物时能够耐受；但是如果不可能，可以在移植的同时或之后开始治疗。无论开始时间如何，治疗通常至少在移植后的第一个月定期进行。如果移植物充分适应，则可能不需要后续给药(follow-updose)，但是如果有任何移植物排斥或炎症的迹象，则可以恢复后续给药。当然，本发明的耐受建立方法(tolerizationprocedure)可以与其他形式的免疫抑制组合以达到更低的风险水平。

优选地，所述疾病或病症包括不需要的免疫激活，例如动脉粥样硬化、缺血性再灌注损伤和心肌梗塞。

优选地，本发明涉及与不需要的超敏反应有关的病理状况的治疗。超敏反应可以是i、ii、iii和iv型中的任何一种，可以是速发型(i型)超敏反应。施用频率通常与过敏原暴露的时间相对应。合适的动物模型是本领域已知的(例如，gundeletal.,am.rev.respir.dis.,146:369,1992,wadaetal,j.med.chem.,39:2055,1996；andwo96/35418)。

优选地，可治疗的疾病或病症包括由炎性单核细胞、自身免疫、心血管疾病(例如心肌缺血，或心肌梗塞和移植后的缺血再灌注损伤)、病毒性脑炎、多发性硬化(ms)、炎性肠病(ibd)、腹膜炎、致死性黄病毒性脑炎、免疫病理性病毒感染(包括流感和西尼罗河病毒(wnv))、类风湿性关节炎、hiv脑炎、慢性肝病、动脉粥样硬化、心肌梗塞、实验性自身免疫性脑脊髓炎(eae)及其相应的疾病、结肠炎、溃疡性结肠炎等引发的疾病或病症。

优选地，本发明的微粒或纳米颗粒(例如，用本发明的方法制备的微粒或纳米颗粒)可以与能够有效治疗任何一种可治疗病症的第二种治疗剂组合使用。

优选地，个体是人类患者。优选地，个体是非人类哺乳动物，例如非人灵长类动物、牲畜(马、骡子、牛、公牛、奶牛、羊、山羊、猪、骆驼等)、啮齿动物(兔子、仓鼠、老鼠、大鼠等)或宠物(猫、狗)。

优选地，该方法包括通过任何合适的手段或途径(例如口服、经鼻、静脉内、肌肉内、眼睛、透皮或皮下)施用包含所述微粒或纳米颗粒(例如羧基化颗粒)的所述组合物或药物组合物。优选地，颗粒经鼻施用。优选地，静脉内施用颗粒。

本发明的颗粒可以以有效抑制有需要的个体的炎性免疫应答或者有效治疗有需要的个体的细菌感染或病毒感染的任何剂量施用。优选地，向个体施用约10²至约10²⁰个颗粒。优选地，向个体施用约10³至约10¹⁵个颗粒。优选地，向个体施用约10⁶至约10¹²个颗粒。优选地，向个体施用约10⁸至约10¹⁰个颗粒。优选地，优选剂量为0.1％固体物/ml。因此，对于0.5μm珠子，优选剂量为约4×10⁹个珠子，对于0.05μm珠子，优选剂量为约4×10¹²个珠子，对于3μm珠子，优选剂量为2×10⁷个珠子。然而，任何能有效治疗待治疗的特定病症的剂量都包括在本发明中。

优选地，在施用给有需要的个体时，含有本发明的微粒或纳米颗粒(例如羧基化颗粒)的所述组合物或所述药物组合物诱导免疫耐受。

优选地，在施用给有需要的个体时，含有本发明的微粒或纳米颗粒(例如羧基化颗粒)的所述组合物或所述药物组合物改善炎性免疫应答。

11.功效试验

可以使用多个功效试验(包括合适的动物模型)测试本发明的微粒和纳米颗粒对可治疗的疾病和病症的有效性。

致耐受性活性的一个表征(proxy)是颗粒刺激在靶位点处产生合适细胞因子的能力。由靶位点处的抑制性t细胞释放的免疫调节细胞因子被认为是tgf-β(milleretal.,proc.natl.acad.sci.usa,89:421,1992)。在耐受期间可能产生的其他因子是细胞因子il-4和细胞因子il-10，以及介体pge。相反，经历主动免疫破坏的组织中的淋巴细胞分泌细胞因子，例如il-1、il-2、il-6和ifnγ。因此，可以通过测量颗粒刺激适当类型的细胞因子的能力来评估所述颗粒的功效。

例如，可使用动物模型系统对所述颗粒、有效粘膜结合成分、有效组合或粘膜施用的有效模式和时间表进行快速筛选试验。在粘膜表面使用测试颗粒组合物对动物进行治疗，并在一段时间内施用引起疾病的抗原或感染因子。分离脾细胞，并在引起疾病的抗原或来自感染因子的抗原存在下以约50μg/ml的浓度进行体外培养。细胞因子分泌到培养基中可以通过标准免疫测定来量化。

可以使用从用改性的颗粒免疫的动物中分离的细胞，或通过产生对引起疾病的抗原或病毒抗原靶抗原有响应的细胞系来确定所述颗粒抑制细胞活性的能力(ben-nunetal.,eur.j.immunol.,11195,1981)。在该实验的一个变体中，抑制细胞群被轻度照射(约1000至1250拉德)以防止增殖，抑制因子与应答细胞共培养，然后使用氚化胸苷掺入(或mtt)来量化应答细胞的增殖活性。在另一个变体中，在双室跨孔培养系统(克斯塔公司，剑桥，马萨诸塞州)的上层和下层中培养抑制细胞群和应答细胞群，该系统允许在彼此相距1mm的范围内共培养所述细胞群，由聚碳酸酯膜隔开(wo93/16724)。在该方法中，不需要照射抑制细胞群，因为可以单独测量应答细胞的增殖活性。

也可以在相应的动物疾病模型中详述用于治疗特定疾病的组合物和施用方式的有效性。在疾病的循环生化和免疫标志、受影响组织的免疫组织学以及适用于所用模型的总体临床特征的水平上监测治疗减少或延迟疾病症状的能力。可用于试验的动物模型的非限制性实例如下面所述。

例如，用于研究自身免疫疾病的动物模型是本领域已知的。与人类自身免疫疾病最相似的动物模型包括自发产生特定疾病的高发病率的动物品种。此类模型的实例包括但不限于非肥胖糖尿病(nod)小鼠(其发生类似于1型糖尿病的疾病)、以及狼疮样疾病易感动物，例如新西兰杂交小鼠、mrl-faslpr小鼠和bxsb小鼠。已经诱导自身免疫疾病的动物模型包括但不限于实验性自身免疫性脑脊髓炎(eae)(其是多发性硬化的模型)、胶原诱导的关节炎(cia)(其是类风湿性关节炎的模型)和实验性自身免疫性葡萄膜炎(eau)(其是葡萄膜炎的模型)。用于自身免疫疾病的动物模型也已通过遗传操作产生，并且包括例如针对炎性肠病的il-2/il-10敲除小鼠，针对sle的fas或fas配体敲除，以及针对类风湿性关节炎的il-1受体拮抗剂敲除。

本发明考虑通过调节th1应答、th2应答、th17应答或这些应答的组合来调节耐受性。调节th1应答包括改变例如干扰素-γ的表达。调节th2应答包括改变例如il-4、il-5、il-10和il-13的任何组合的表达。通常，th2应答的增加(减少)包括il-4、il-5、il-10或il-13中至少一种的表达的增加(减少)；更典型地，th2应答的增加(减少)包括il-4、il-5、il-10或il-13中至少两种的表达的增加，最典型地，th2应答的增加(减少)包括il-4、il-5、il-10或il-13中至少三种的表达的增加，而理想情况下，th2应答的增加(减少)包括所有il-4、il-5、il-10和il-13的表达的增加(减少)。调节th17包括改变例如tgf-β、il-6、il-21和il-23的表达，并影响il-17、il-21和il-22的水平。

通过多种机制实现对自身抗原和自身免疫疾病的耐受，所述机制包括胸腺中自身反应性t细胞的阴性选择，以及那些逃避胸腺缺失并且在外周发现的自身反应性t细胞的外周耐受机制。提供外周t细胞耐受的机制的实例包括“忽视”自身抗原、对自身抗原的不应答或无反应、细胞因子免疫偏离和自身反应性t细胞的活化诱导的细胞死亡。此外，已证明调节性t细胞参与介导外周耐受。参见，例如，walkeretal.(2002)nat.rev.immunol.,2:11-19；shevachetal.(2001)immunol.rev.,182:58-67。在一些情况下，对自身抗原的外周耐受丧失(或破坏)并且随后发生自身免疫应答。例如，在eae的动物模型中，通过tlr先天免疫受体激活抗原提呈细胞(apc)显示出破坏自身耐受性并导致eae的诱导(waldneretal.(2004)j.clin.invest.,113:990-997).

优选地，本发明提供增加抗原呈递同时抑制或减少tlr7/8、tlr9和/或tlr7/8/9依赖性细胞刺激的方法。如本文所述，特定所述颗粒的施用导致树突状细胞(dc)或抗原呈递细胞(apc)的抗原呈递，同时抑制与免疫刺激性多核苷酸相关的tlr7/8、tlr9和/或tlr7/8/9依赖性细胞应答。这种抑制可包括降低一种或多种tlr相关细胞因子的水平。

本发明还提供了具有可用于治疗mac-1和lfa-1介导的疾病的生物学特性的新化合物。

12.药物组合物

本发明的一个方面提供药物组合物，该药物组合物包含所述微粒和纳米颗粒，并任选地包含药学上可接受的载体。优选地，这些组合物任选还包含一种或多种其他的治疗剂。或者，本发明的所述颗粒可以与一种或多种其他治疗剂组合施用给有需要的患者。例如，用于联合施用或包含在具有本发明化合物的药物组合物中的其他治疗剂可以是经批准的抗炎剂，或者所述其他治疗剂可以是经美国食品药品监督管理局批准的多种药剂中的任何一种，其最终获得批准治疗任何以不受控制的炎症免疫反应或细菌感染或病毒感染为特征的疾病。还应理解，本发明的某些所述颗粒可以以游离形式存在，或在适当情况下，以其药学上可接受的衍生物的形式存在，以用于治疗。

优选地，本发明的药物组合物另外包含药学上可接受的载体，如本文所用，所述载体包括适合于所需的特定剂型的任何和所有溶剂、稀释剂或其他液体载体、分散助剂或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、固体粘合剂、润滑剂等。用于配制药物组合物及其制备的已知技术的各种载体公开于remington’spharmaceuticalsciences,sixteenthedition,e.w.martin(mackpublishingco.,easton,pa.,1980)。除非任何常规载体介质与本发明的化合物不相容，例如通过产生任何不希望的生物效应或以有害方式与药物组合物的任何其他组分相互作用，否则其使用被认为是在本发明的范围内。

可用作药学上可接受的载体的物质的一些实例包括但不限于糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；粉末黄蓍胶；麦芽；明胶；滑石；赋形剂，例如可可脂和栓剂蜡；油，例如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二羟基醇，例如丙二醇；酯类，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原水；等渗盐水；林格氏液；乙醇、磷酸盐缓冲溶液以及其他无毒相容润滑剂(例如十二烷基硫酸钠和硬脂酸镁)以及着色剂、释放剂、涂层剂、甜味剂、调味剂和芳香剂，根据配方设计师的判断，防腐剂和抗氧化剂也可以包括在组合物中。

用于口服给药的液体剂型包括但不限于药学上可接受的乳液、微乳液、溶液、悬浮液、糖浆和酏剂。除活性化合物外，液体剂型可含有本领域常用的惰性稀释剂，例如水或其它溶剂、增溶剂和乳化剂，例如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄基醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油(特别是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和脱水山梨糖醇脂肪酸酯及它们的混合物。除惰性稀释剂外，口服组合物还可包括佐剂，例如润湿剂、乳化剂和悬浮剂，甜味剂，调味剂和芳香剂。

可以使用合适的分散剂或湿润剂和悬浮剂根据已知技术配制可注射制剂，例如无菌可注射水性悬浮液或油性悬浮液。无菌可注射制剂还可以是存在于无毒的非肠道可接受稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液、悬浮液或乳液(例如1,3-丁二醇的溶液)。可以使用的可接受的载体和溶剂包括水、林格氏溶液，u.s.p.和等渗氯化钠溶液。此外，无菌的固定油通常用作溶剂或悬浮介质。为此目的，可以使用任何温和的固定油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。此外，脂肪酸(例如油酸)用于制备注射剂。

可注射制剂可以通过以下方式被灭菌处理，例如，通过细菌截留过滤器过滤，或通过掺入无菌固体组合物形式的灭菌剂，可以在使用前将该灭菌剂溶解或分散在无菌水或其它无菌可注射介质中。

为了延长药物的作用，通常需要减缓经皮下注射或肌内注射的药物的吸收。这可以通过使用液体悬浮液或水溶性差的结晶或无定形物质来实现。

然而，药物的吸收速率取决于其溶解速率，而溶解速率又取决于晶体大小和晶形。或者，通过将药物溶解或悬浮在油性载体中来实现非肠道给药的药物形式的延迟吸收。通过在可生物降解的聚合物(例如聚丙交酯-聚乙交酯)中形成药物的微胶囊基质来制备可注射的储库形式。取决于药物与聚合物的比例和所用特定聚合物的性质，可以控制药物释放的速率。其他可生物降解的聚合物的实例包括聚原酸酯和聚酸酐。还通过将药物包埋在与身体组织相容的脂质体或微乳液中来制备储库可注射制剂。

用于口服给药的固体剂型包括胶囊、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在这种固体剂型中，将改性的颗粒与至少一种惰性的药学上可接受的赋形剂或载体(例如柠檬酸钠或磷酸二钙)和/或以下物质混合：a)填充剂或增量剂，例如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；b)粘合剂，例如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；c)保湿剂，例如甘油；d)崩解剂，例如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠；e)溶液缓凝剂，例如石蜡；f)吸收促进剂，例如季铵化合物；g)润湿剂，例如鲸蜡醇和甘油单硬脂酸酯；h)吸收剂，例如高岭土和膨润土；和i)润滑剂，例如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠、以及它们的混合物。在胶囊、片剂和丸剂的情况下，剂型还可包含缓冲剂。

类似类型的固体组合物也可用作使用诸如乳糖以及高分子量聚乙二醇等赋形剂的软填充明胶胶囊和硬填充明胶胶囊中的填充剂。片剂、糖衣丸、胶囊、丸剂和颗粒剂的固体剂型可以用包衣和外壳(例如药物配制领域熟知的肠溶包衣和其它包衣)来制备。它们可以任选地含有遮光剂，并且还可以是这样的组合物，其中它们仅在肠道的某一部分或优选地在肠道的某一部分任选地以延迟的方式释放活性成分的组合物。可以使用的包埋组合物的实例包括聚合物质和蜡。类似类型的固体组合物也可用作使用诸如乳糖以及高分子量聚乙二醇等赋形剂的软填充明胶胶囊和硬填充明胶胶囊中的填充剂。

微粒和纳米颗粒也可以是具有一种或多种上述赋形剂的微胶囊形式。片剂、糖衣丸、胶囊、丸剂和颗粒剂的固体剂型可以用包衣和外壳(例如药物配制领域熟知的肠溶包衣、释放控制包衣和其它包衣)来制备。在这种固体剂型中，活性化合物可以与至少一种惰性稀释剂例如(蔗糖、乳糖和淀粉)混合。正常情况下，这些剂型还可包含除惰性稀释剂以外的其它物质，例如压片润滑剂和其它压片助剂，例如硬脂酸镁和微晶纤维素。在胶囊、片剂和丸剂的情况下，剂型还可包含缓冲剂。它们可以任选地含有遮光剂，并且还可以是这样的组合物，其中它们仅在肠道的某一部分或优选地在肠道的某一部分任选地以延迟的方式释放改性的颗粒。可以使用的包埋组合物的实例包括聚合物质和蜡。

本发明包括羧基化微粒和纳米颗粒的药学上可接受的外用制剂。如本文所用，术语“药学上可接受的外用制剂”是指通过将制剂施加于表皮而皮内施用所述微粒/纳米颗粒的任何药学上可接受的制剂。优选地，本发明的外用制剂包含载体系统。药学上有效的载体包括但不限于溶剂(例如，醇、多元醇、水)、乳膏、洗液、软膏、油、膏药、脂质体、散剂、乳液、微乳液和缓冲溶液(例如，低渗盐水或缓冲盐水)或本领域已知的用于外部施用药物的任何其他载体。本领域标准的参考文献提供了更完整的本领域已知的载体的列表，例如，remington’spharmaceuticalsciences,16thedition,1980and17thedition,1985,bothpublishedbymackpublishingcompany,easton,pa.，其公开内容通过引用整体并入本文。优选地，本发明的外用制剂可包含赋形剂。本领域已知的任何药学上可接受的赋形剂可用于制备本发明的药学上可接受的外用制剂。

可包括在本发明的外用制剂中的赋形剂的实例包括但不限于防腐剂、抗氧化剂、保湿剂、润肤剂、缓冲剂、增溶剂、其他渗透剂、皮肤保护剂、表面活性剂和推进剂、和/或其他的与改性颗粒组合使用的治疗剂。合适的防腐剂包括但不限于醇、季胺、有机酸、对羟基苯甲酸酯和酚。合适的抗氧化剂包括但不限于抗坏血酸及其酯、亚硫酸氢钠、丁基化羟基甲苯、丁基化羟基苯甲醚、生育酚和螯合剂(例如edta和柠檬酸)。合适的保湿剂包括但不限于甘油、山梨糖醇、聚乙二醇、尿素和丙二醇。适用于本发明的缓冲剂包括但不限于柠檬酸、盐酸和乳酸缓冲剂。合适的增溶剂包括但不限于季铵氯化物、环糊精、苯甲酸苄酯、卵磷脂和聚山梨醇酯。可用于本发明外用制剂的合适的皮肤保护剂包括但不限于维生素e油、尿囊素、聚二甲基硅氧烷、甘油、凡士林和氧化锌。

优选地，本发明的药学上可接受的外用制剂至少包含羧基化微粒和纳米颗粒以及渗透增强剂。外用制剂的选择取决于几个因素，包括待治疗的病症、颗粒和其它存在的赋形剂的物理化学特性、它们在制剂中的稳定性、可用的制造设备和成本限制。如本文所用，术语“渗透增强剂”是指能够输送药理活性化合物通过角质层并进入表皮或真皮的并且优选很少或没有全身吸收的试剂。已经评估了多种化合物在提高药物通过皮肤的渗透速率方面的有效性。参见，例如，percutaneouspenetrationenhancers,maibachh.i.andsmithh.e.(eds.),crcpress,inc.,bocaraton,fla.(1995)，该文献考察了各种皮肤渗透促进剂的使用和测试，以及buyuktimkinetal.,chemicalmeansoftransdermaldrugpermeationenhancementintransdermalandtopicaldrugdeliverysystems,gosht.k.,pfisterw.r.,yums.i.(eds.),interpharmpressinc.,buffalogrove,111(1997)。优选地，用于本发明的渗透剂包括但不限于甘油三酯(例如大豆油)、芦荟组合物(例如芦荟凝胶)、乙醇、异丙醇、辛基苯基聚乙二醇、油酸、聚乙二醇400、丙二醇、n-癸基甲基亚砜、脂肪酸酯(例如肉豆蔻酸异丙酯、月桂酸甲酯、单油酸甘油酯和单油酸丙二醇酯)和n-甲基吡咯烷酮。

优选地，组合物可以是软膏、糊剂、乳膏、洗液、凝胶、散剂、溶液、喷雾剂、吸入剂或贴剂的形式。优选地，根据本发明的组合物的制剂是乳膏，该乳膏可以进一步含有饱和脂肪酸或不饱和脂肪酸，例如硬脂酸、棕榈酸、油酸、棕榈油酸、鲸蜡醇或油醇，特别优选硬脂酸。本发明的乳膏还可含有非离子表面活性剂，例如聚氧硬脂酸酯。优选地，活性成分在无菌条件下与药学上可接受的载体和任何所需的防腐剂或缓冲剂混合。眼科制剂、滴耳剂和滴眼剂也包括在本发明的范围内。此外，本发明考虑使用透皮贴剂，其具有提供化合物控制递送至身体的附加优点。通过将化合物溶解或分配在适当的介质中来制备这种剂型。如上所述，渗透增强剂也可用于增加化合物通过皮肤的通量。可以通过提供速率控制膜或通过将化合物分散在聚合物基质或凝胶中来控制速率。

羧基化微粒和纳米颗粒可以通过气溶胶施用。这通过制备含有改性颗粒的含水气溶胶、脂质体制剂或固体颗粒来实现。可以使用非水(例如碳氟化合物推进剂)悬浮液。

通常，通过将药剂的水溶液或悬浮液与常规的药学上可接受的载体和稳定剂一起配制来制备含水气溶胶。载体和稳定剂随特定化合物的要求而变化，但通常包括非离子表面活性剂(吐温、普朗尼克或聚乙二醇)、无害蛋白(例如血清白蛋白)、脱水山梨糖醇酯、油酸、卵磷脂、氨基酸(例如甘氨酸)、缓冲剂、盐、糖或糖醇。气溶胶通常由等渗溶液制备。

还应理解，本发明的羧基化纳米颗粒和微粒和药物组合物可以配制并用于联合治疗，即，所述化合物和药物组合物可以与一种或多种其他所需的治疗剂或医疗程序一起配制或同时施用，或在一种或多种其他所需的治疗剂或医疗程序之前或之后施用。在组合方案中使用的特定疗法组合(治疗剂或程序)将考虑所需治疗剂和/或程序的相容性以及要实现的所需治疗效果。还应当理解，所采用的疗法可以对相同的病症实现期望的效果(例如，本发明的化合物可以与另一种抗炎剂同时施用)，或者它们可以实现不同的效果(例如，控制任何不利的效果)。

优选地，含有本发明的羧基化颗粒的药物组合物还包含一种或多种其他的治疗活性成分(例如，抗炎和/或姑息治疗)。出于本发明的目的，术语“姑息治疗”(“palliative”)是指集中于缓解疾病症状和/或治疗方案的副作用的治疗，但不是治愈性的。例如，姑息治疗包括止痛药、抗恶心药物和抗病药物。

给出以下实施例以说明本发明。然而，应该理解，本发明不限于这些实施例中描述的具体条件或细节。在整个说明书中，对公开可用文献的任何和所有引用，包括任何美国专利或专利申请公开，都通过引用具体地并入本文。

实施例

实施例1高度带负电的plga纳米颗粒的制备

将0.9005gplga溶解在18ml乙酸乙酯中以形成聚合物溶液。将聚合物溶液与含有0.2340克聚丙烯酸的80ml0.5％聚乙烯醇(pva)溶液混合，并使用digitalt25均化器以18000rpm均化1分钟。将所得乳液倒入玻璃容器中，以400rpm磁力搅拌4小时，使溶剂蒸发。然后，在冻干之前，将纳米颗粒用蒸馏水洗涤三次。用马尔文粒度分析仪(伍斯特郡，英国)测定粒径和δ电位。测得冻干颗粒的平均粒径为541.5nm，δ电位为-40.5mv。

实施例2高度羧基化的plga纳米颗粒的制备

将5.0860gplga溶解在100ml乙酸乙酯中以形成plga溶液。制备由280ml1％聚乙烯醇溶液、20ml乙酸乙酯和1.3g聚丙烯酸组成的含水溶液。然后将plga溶液与聚乙烯醇溶液混合，并使用digitalt25均化器以24000rpm均化1分钟。将所得乳液倒入2l玻璃烧瓶中，搅拌过夜除去有机溶剂。在冻干之前，将硬化的纳米颗粒用蒸馏水洗涤三次。测得冻干颗粒的平均粒径为529.9nm，δ电位为-40.6mv。

实施例3通过双乳化法制备负载有牛血清白蛋白(bsa)的高度带负电的plga纳米颗粒

将0.9084gplga溶解在18ml乙酸乙酯中以形成plga溶液。制备由80ml0.5％聚乙烯醇溶液(在水中)、6.5ml乙酸乙酯和0.2340g聚丙烯酸组成的含水溶液。将20mg牛血清白蛋白溶解在2.0ml水性缓冲液中以形成蛋白溶液。将1.8ml的牛血清白蛋白溶液与plga溶液混合，并使用均化器以24000rpm均化45秒。将所得乳液与聚乙烯醇溶液混合，并使用另一个均化器以18000rpm均化1分钟。将得到的最终乳液倒入1l玻璃烧瓶中，通过旋转蒸发在50毫巴的真空下除去溶剂。在冻干之前，将负载有牛血清白蛋白的颗粒用蒸馏水洗涤三次。测得冻干颗粒的平均粒径为528.2nm，δ电位为-40.4mv。通过uv光谱仪在280nm处测得牛血清白蛋白的负载量为1.7％，包封率为约85％。

实施例4通过双乳化法制备负载有牛血清白蛋白的高度带负电的plga纳米颗粒

将0.9064gplga溶解在18ml乙酸乙酯中以形成plga溶液。制备由80ml0.5％聚乙烯醇(在水中)、6.5ml乙酸乙酯和0.2340g聚丙烯酸组成的含水溶液。将40mg牛血清白蛋白溶解在1.0ml水性缓冲液中以形成蛋白溶液。将0.45ml的牛血清白蛋白溶液与plga溶液混合，并使用均化器以24000rpm均化45秒。将所得乳液与聚乙烯醇溶液混合，并使用另一个均化器以18000rpm均化1分钟。将得到的最终乳液倒入1l玻璃烧瓶中，通过旋转蒸发在50毫巴的真空下除去溶剂。在冻干之前，将负载有牛血清白蛋白的颗粒用蒸馏水洗涤三次。测得冻干颗粒的平均粒径为587.4nm，ζ电位为-41.4mv。通过uv光谱仪在280nm处测得牛血清白蛋白的负载量为1.4％，包封率为70％。

实施例5通过双乳化法制备负载有紫杉醇的高度带负电的plga纳米颗粒

将0.9gplga和18mg紫杉醇溶解在18ml乙酸乙酯中以形成plga-紫杉醇溶液。将plga-紫杉醇溶液与含有0.2340克聚丙烯酸的80ml0.5％聚乙烯醇溶液混合，并使用digitalt25均化器以18000rpm均化1分钟。将所得乳液倒入玻璃容器中，并以400rpm磁力搅拌5小时以使溶剂蒸发。在冻干之前，将负载有紫杉醇的纳米颗粒用蒸馏水洗涤三次。测得冻干颗粒的平均粒径为574.6nm，δ电位为-43.8mv。通过hplc测得紫杉醇的负载量为2％，包封率为约100％。

实施例6通过双乳化法制备负载有艾塞那肽的高度带负电的plga纳米颗粒

将0.9gplga溶解在18ml乙酸乙酯中以形成plga溶液。制备由80ml0.5％聚乙烯醇溶液(在水中)、6.5ml乙酸乙酯和0.2340g聚丙烯酸组成的水溶液。将20mg醋酸艾塞那肽(exendin-4)溶解在2.0ml水性缓冲液中以形成活性药物成分(api)溶液。将1.8ml的api溶液与plga溶液混合，并使用均化器以24000rpm均化45秒。将所得乳液与聚乙烯醇溶液混合，并使用另一个均化器以18000rpm均化1分钟。将得到的最终乳液倒入1l玻璃烧瓶中，通过旋转蒸发在50毫巴的真空下除去溶剂。在冻干之前，将负载有醋酸艾塞那肽的颗粒用蒸馏水洗涤三次。通过hplc测得冻干颗粒的平均粒径为579.7nm，δ电位为-47.0mv，艾塞那肽的负载量为约2％，包封率接近100％。

实施例7用荧光染料制备高度带负电的plga纳米颗粒

将0.9gplga和9mg香豆素-6溶解在18ml乙酸乙酯中以形成plga溶液。将plga/香豆素溶液与含有0.2340克聚丙烯酸的80ml0.5％聚乙烯醇溶液混合，并使用digitalt25均化器以18000rpm均化1分钟。将所得乳液倒入玻璃容器中，并以400rpm磁力搅拌5小时以使溶剂蒸发。然后，在冻干之前，将负载有香豆素-6的纳米颗粒用蒸馏水洗涤三次。通过uv光谱仪在444nm波长处测得冻干颗粒的平均粒径为479.4nm，δ电位为-44.1mv，香豆素-6的负载量为约1％，包封率接近100％。

实施例8用透明质酸制备高度带负电的plga纳米颗粒

将0.2078gplga溶于8ml乙酸乙酯中。将plga溶液与40ml含有0.0404克透明质酸钠和3.25ml乙酸乙酯的0.5％聚乙烯醇溶液混合。使用均化器将混合物在25000rpm下均化1分钟。将所得乳液倒入1l玻璃烧瓶中，通过旋转蒸发在50毫巴的真空下除去乙酸乙酯。在冻干之前，将得到的纳米颗粒用蒸馏水洗涤三次。测得冻干颗粒的平均粒径为753.2.0nm，δ电位为-43.1mv。

实施例9用透明质酸制备高度带负电的plga纳米颗粒

将0.9014gplga溶于18ml乙酸乙酯中。将plga溶液与含有0.0819克透明质酸钠和6.5毫升乙酸乙酯的80毫升0.5％聚乙烯醇溶液混合。使用均化器将混合物在18000rpm下均化1分钟。将所得乳液倒入玻璃容器中，并以400rpm磁力搅拌5小时以使溶剂蒸发。在冻干之前，将得到的纳米颗粒用蒸馏水洗涤三次。测得冻干颗粒的平均粒径为424.0nm，δ电位为-41.1mv。

实施例10洗涤试验

将如实施例9中所述制备的300mg负载有牛血清白蛋白的plga纳米颗粒在30ml去离子水中重构。在短暂的超声处理后，颗粒被很好地悬浮。取样用于测定δ电位。测得δ电位为-42.7mv。

然后向这种纳米颗粒悬浮液中加入300ml去离子水。使用切向流过滤(tff)装置将所得混合物浓缩至30ml，测得δ电位为-44.5mv。该洗涤步骤重复两次，每次洗涤后得到的δ电位分别为-43.0mv和-40.1mv。

实施例1-9的参考文献

·layne,e.spectrophotometricandturbidimetricmethodsformeasuringproteins.methodsinenzymology3:447-455.1957。

·stoscheck,cm.quantitationofprotein.methodsinenzymology182:50-69.1990。

虽然已经参考优选实施方案具体说明和描述了本发明，但是本领域的技术人员将理解，在不脱离所附权利要求所包含的本发明的范围的情况下，可以在形式上和细节上进行各种改变。