一种基于适配体的大肠杆菌O157:H7快速检测方法

本发明属于大肠杆菌o157:h7检测，具体涉及一种基于适配体的大肠杆菌o157:h7快速检测方法。

背景技术：

1、大肠杆菌o157:h7是一种产志贺样毒素的致病性大肠杆菌，人类食用被大肠杆菌o157:h7污染的食物可能引起腹痛、腹泻以及出血性肠炎等疾病，甚至引起永久性的器官衰竭，对食品安全和公共健康构成了巨大威胁。

2、快速准确检测大肠杆菌o157:h7是预防和控制由该菌引起的食物中毒及相关疾病的关键。大肠杆菌o157:h7的主要检测方法有传统培养法和聚合酶链式反应、环介导等温扩增技术、酶联免疫吸附技术等快速检测法。传统培养法通常需要较长的时间才能获得检测结果；聚合酶链式反应容易受到污染导致假阳性结果，且需要严格的温度控制措施、熟练的技术人员；环介导等温扩增技术需要高质量的引物，而且其引物设计复杂，对未测序的目标不能够进行检测；酶联免疫吸附方法对试剂的选择性高，易出现交叉反应，并且仍相当费时费力。因此，开发更加快速、准确且操作简单的大肠杆菌o157:h7检测方法是迫切需要的。

技术实现思路

1、为了解决现有大肠杆菌o157:h7的检测方法存在的步骤多、操作繁琐以及耗时长等问题，本发明提供了一种基于适配体的大肠杆菌o157:h7快速检测方法，该检测方法采用适配体作为识别元件，可简化检测步骤，且适配体具有优异的稳定性、生产成本低、存储和运输简单、无批间差异，以及质控简单等优势。

2、本发明通过如下技术方案实现：

3、一种基于适配体的大肠杆菌o157:h7快速检测方法，具体包括如下步骤：

4、步骤一：传感器平衡：将链霉亲和素传感器末端浸入含吐温-20的pbs磷酸盐缓冲溶液中平衡；

5、步骤二：适配体固定化：将平衡后的链霉亲和素传感器浸入生物素化的适配体溶液中孵育；

6、步骤三：生物素封闭：将固定适配体后的链霉亲和素传感器浸入d-生物素溶液中封闭；

7、步骤四：传感器二次平衡：将生物素封闭后的链霉亲和素传感器末端浸入含吐温-20的pbs磷酸盐缓冲溶液中平衡，进行基线调零；

8、步骤五：样品检测及结果分析：将二次平衡后的链霉亲和素传感器末端浸入样品中进行大肠杆菌o157:h7的检测，实时读取结合信号；根据读取出的结合信号定性或定量分析，判定样品中是否含有大肠杆菌o157:h7及所含浓度。

9、进一步地，步骤一中，将链霉亲和素传感器末端浸入含0.02％吐温-20的pbs磷酸盐缓冲溶液中平衡30-90秒。

10、进一步地，步骤二中，所述生物素化的适配体溶液是将生物素化的适配体溶解在含0.02％吐温-20的pbs磷酸盐缓冲溶液中得到；将平衡后的链霉亲和素传感器浸入浓度为50-200nm的生物素化的适配体溶液中孵育30-600秒。

11、进一步地，步骤三中，将固定了适配体的链霉亲和素传感器浸入10μg/ml d-生物素溶液中封闭60-180秒，从而减少检测环节非特异性吸附的产生。

12、进一步地，步骤四中，将生物素封闭后的链霉亲和素传感器末端浸入含0.02％吐温-20的pbs磷酸盐缓冲溶液中平衡30-90秒，进行基线调零。

13、进一步地，步骤五中，将二次平衡后的链霉亲和素传感器末端浸入样品中进行大肠杆菌o157:h7的检测，实时读取结合信号；根据读取出的结合信号定性分析，当结合信号值大于或等于仪器的有效信号值0.0075nm时，即可判定样品中含有大肠杆菌o157:h7；定量分析时，将结合时间为300秒、600秒、900秒、1200秒时的结合信号y分别代入下述菌浓度和结合信号间的数学公式(1)、(2)、(3)、(4)：

14、c300＝(3.90795×109)y^0.1423479(1)

15、c600＝(6.00405×109)y^0.1598103(2)

16、c900＝(1.25055×1010)y^0.1832284(3)

17、c1200＝(2.52432×1010)y^0.2031542(4)。

18、求解所得数值c即为样品中大肠杆菌o157:h7的具体浓度，所述c300表示结合时间为300秒时求得的菌浓度，对应的大肠杆菌o157:h7的最低检出限是6.03×104cfu/ml；所述c600表示结合时间为600秒时求得的菌浓度，对应的大肠杆菌o157:h7的最低检出限是2.98×104cfu/ml；所述c900表示结合时间为900秒时求得的菌浓度，对应的大肠杆菌o157:h7的最低检出限是1.32×104cfu/ml；所述c1200表示结合时间为1200秒时求得的菌浓度，对应的大肠杆菌o157:h7的最低检出限是7.08×103cfu/ml。

19、与现有技术相比，本发明的优点如下：

20、本发明提供的一种基于适配体的大肠杆菌o157:h7快速检测方法，操作简便易学，无需专业人员，可降低人为误差，提高检测结果的准确性和严谨性；检测过程可实时呈现，反应快速，检测时间短；样品无需标记，可做到样品随到随检；可实现高通量检测，检测效率高。

技术特征：

1.一种基于适配体的大肠杆菌o157:h7快速检测方法，其特征在于，包括：

技术总结本发明公开了一种基于适配体的大肠杆菌O157:H7快速检测方法，属于大肠杆菌O157:H7检测技术领域，包括：步骤一、传感器平衡；步骤二、适配体固定化；步骤三、生物素封闭；步骤四、传感器二次平衡；步骤五、样品检测及结果分析。本发明的检测方法操作简便易学，无需专业人员，可降低人为误差，提高检测结果的准确性和严谨性；检测过程可实时呈现，反应快速，检测时间短；样品无需标记，可做到样品随到随检；可实现高通量检测，检测效率高。技术研发人员：张晓光,邓龙雪,褚泽敬,冷雨薇,程子轩受保护的技术使用者：吉林大学技术研发日：技术公布日：2024/7/23