一种精氨加压素的纯化方法与流程

1.本发明涉及多肽合成中的纯化技术领域，特别涉及一种精氨加压素的纯化方法。


背景技术：

2.精氨加压素是由九个氨基酸组成的合成多肽，理论分子量为1084.24，是一种抗利尿激素。是中枢神经系统的一种重要的神经递质。是由下丘脑细胞分泌的这种物质，与机体的体液代谢、血容量、心血管功能、体温平衡、学习和记忆、促肾上腺皮质激素的分泌等功能密切相关。具有升高血压、抗利尿、参与记忆、限制发热和促进退热的作用。同时还拥有着广泛的心血管作用，如调节水钠潴留及血管收缩、直接调控心肌细胞，参与心肌肥大、心肌纤维化、心律失常等作用。已成功用于血管扩张性休克、心肺脑复苏、尿崩症及出血性疾病的治疗。抗利尿激素分泌不足会引起尿崩症，如果得不到及时治疗，容易引起头痛头晕、记忆力衰退的症状，严重的患者会出现水中毒，出现视力下降、昏迷甚至死亡，危害极大。因此，对精氨加压素纯化研究具有重要的意义。
3.专利“一种乙酸去氨加压素的纯化方法”，公告号：cn105131079b，使用一次纯化，纯度低，且转盐步骤中使用的有机试剂的比例较高，达到5％～18％，导致去杂效果欠佳；
4.专利“一种纯化乙酸特利加压素的方法”，公开号：cn102775475a，纯化效果差，不稳定。可知，现有技术中的精氨加压素的稳定性较差，纯度低，杂质含量多等缺点。


技术实现要素：

5.鉴以此，本发明提出一种精氨加压素的纯化方法，来解决上述问题。
6.本发明的技术方案是这样实现的：一种精氨加压素的纯化方法，包括以下步骤：
7.s1、制备环肽粗品溶液：取精氨加压素线性态粗品溶于5～10％(v/v)的乙腈水溶液中，所述精氨加压素线性态粗品和乙腈水溶液的质量体积比g/l为3～22:1.5～11，再使用碱性调节剂调节ph值为6.0～9.0，优选ph值为7.0～8.0，加入氧化剂氧化，用0.22μm有机微米膜过滤，滤液为环肽粗品溶液；
8.s2、第一步纯化：将环肽粗品溶液进行第一步纯化：
9.色谱柱直径和长度为：30*250mm、50*250mm、80*250mm中的一种。
10.固定相：十八烷基硅烷键合硅胶填料，
11.流动相a：质量分数为0.05～1.0％磷酸水溶液，优选0.5％(m/v)，调节ph为2.0～4.5，优选ph为2.5～4.0，
12.流动相b：有机试剂混合液或有机试剂，
13.流速：20～100ml/min，
14.梯度洗脱：10～50wt％的流动相b，优选30wt％，洗脱30～80min，优选60min，检测波长为220nm，分段收集目的峰值的肽溶液a；
15.s3、第二步纯化：将s2收集到的肽溶液a用纯化水稀释，进行第二步纯化：
16.固定相：十八烷基硅烷键合硅胶填料，
17.流动相a：10～100mmol/l乙酸盐缓冲液，调节ph为4.0～6.0，
18.流动相b：有机试剂混合液或有机试剂，
19.流速：20～100ml/min，
20.梯度洗脱：15～60wt％流动相b，洗脱30～80min，优选60min，检测波长为220nm，分段收集肽溶液b，调节ph值为2.5～4.5，优选ph 3.0～4.0，得到高纯度肽溶液；
21.s4、乙酸转盐：将s3得到的高纯度肽溶液采用乙酸方法进行转盐：
22.固定相：十八烷基硅烷键合硅胶填料，
23.流动相a：质量分数为0.1～1.0％的乙酸水溶液，优选0.5％(m/v)，
24.流动相b：乙酸
‑
乙腈溶液，
25.流速：50～100ml/min，
26.等度洗脱：流动相b洗脱25～40min，优选30min，冻干，得到精氨加压素冻干纯品。
27.进一步的，所述s1中氧化剂选自双氧水、二甲基亚砜、单质碘以及金属离子氧化剂的一种或者几种，所述金属离子氧化剂为铁离子氧化剂、铜离子氧化剂或银离子氧化剂。
28.进一步的，所述s2、s3中流动相b的有机试剂混合液为有机试剂
‑
水溶液或有机试剂
‑
流动相a的混合液或有机试剂。
29.进一步的，所述有机试剂
‑
水溶液中有机试剂与水溶液的体积比为50～100:0～50；所述有机试剂
‑
流动相a的混合液中，有机试剂与流动相a的体积比为50～100:0～50。
30.进一步的，所述有机试剂为乙腈、甲醇、异丙醇、乙醇、四氢呋喃中的一种或多种混合，优选乙腈或甲醇中的一种或两种混合。
31.进一步的，所述s2、s3中梯度洗脱中流动相b的质量百分比为10～60％。
32.进一步的，所述s3中肽溶液a与水的体积比为1:1。
33.进一步的，所述s3中乙酸盐缓冲液为乙酸铵、乙酸钠、乙酸钾中的一种或者多种混合物。
34.进一步的，所述s4中的流动相b为体积比为0.5：99.5的乙酸和乙腈制得，等度洗脱为15wt％流动相b。
35.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
36.(1)本发明仅需一种反相填料，两步纯化，一种转盐方法即可得到高纯度、高质量、高稳定性的精氨加压素原料药，纯化方法操作简单易行，一步纯化纯度可达98％，二步纯化即可获得纯度大于99.5％，单杂≤0.10％的高纯产品，试剂使用成本低，纯化轮数少，提高了生产效率，又有效地解决了精氨加压素稳定性差、纯度低、杂质含量多的问题。
37.(2)本发明通过优化纯化方法，控制纯化过程中产品组分液的ph值为2.5～4.5，以及优化转盐过程中的乙酸比例、降低有机试剂比例进行等度洗脱，即可将产品中易降解的杂质：dimer、ac
‑
[1
‑
9]、trisulfide、glu4、gly9
‑
oh等的含量稳定在≤0.10％范围内，最终可以获得稳定性好且纯度高的纯品。乙酸转盐方法优势在于，使用低比例的有机试剂等度洗脱，有效减少有机试剂的使用成本。
附图说明
[0038]
图1是实施例3中精氨加压素环肽粗品的hplc图；
[0039]
图2是实施例3中精氨加压素第一步纯化后的产品hplc图；
[0040]
图3是实施例3中精氨加压素第二步纯化后的产品hplc图；
[0041]
图4是实施例3中精氨加压素产品的ms图。
具体实施方式
[0042]
为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。
[0043]
本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0044]
本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0045]
实施例1
[0046]
一种精氨加压素的纯化方法，包括以下步骤：
[0047]
s1、制备环肽粗品溶液：
[0048]
取3克精氨加压素线性肽粗品溶于1.5l的5％(v/v)乙腈水溶液中，用氢氧化钠调节线性肽粗品的ph至7.0，用0.3％(v/v)双氧水进行氧化，待氧化完成后用0.22微米膜过滤，收集过滤后的粗品溶液备用；
[0049]
s2、第一步纯化：
[0050]
色谱柱：固定相：十八烷基硅烷键合硅胶填料，色谱柱直径和长度为：30*250mm。
[0051]
流动相a：质量分数为0.5％磷酸水溶液，用氢氧化钠调ph值为4.0，
[0052]
流动相b：体积比为80％：20％的乙腈
‑
流动相a溶液，
[0053]
流速：20ml/min，波长：220nm，上样量3克，
[0054]
梯度洗脱：10wt％流动相b，洗脱60min，分段收集该梯度段目的峰值肽溶液a，得到纯度大于98％的目的峰值溶液，第一步纯化收率大于85％。
[0055]
s3、第二步纯化：
[0056]
将第一步纯化收集的肽溶液a用纯化水按体积1:1比例稀释，进行第二步纯化：
[0057]
固定相：十八烷基硅烷键合硅胶填料
[0058]
流动相a：80mmol/l乙酸铵(用磷酸调ph至6.0)，
[0059]
流动相b：体积比为80％：20％的乙腈水溶液，
[0060]
流速：20ml/min，波长：220nm。
[0061]
梯度洗脱：15wt％流动相b，洗脱60min。
[0062]
分段收集该梯度段目的峰值的肽溶液b，用磷酸调节ph至3.0～4.0，得到纯度≥99.5％，单杂≤0.10％的目的峰值肽溶液，第二步纯化收率大于85％，两步纯化收率大于72％。
[0063]
s4、乙酸转盐：
[0064]
将s3得到的高纯度肽溶液采用乙酸方法进行转盐：
[0065]
固定相：十八烷基硅烷键合硅胶填料，
[0066]
流动相a：质量分数0.5％的乙酸水溶液，
[0067]
流动相b：质量分数0.5％的乙酸
‑
乙腈溶液，
[0068]
流速：20ml/min，波长：220nm。
[0069]
洗脱：15wt％的流动相b等度洗脱30min，即可得到转盐后的肽溶液。
[0070]
将转盐后的肽溶液放进冻干盘，进行冷冻干燥，即可得到纯度≥99.5％，单杂≤0.10％的高纯度、高稳定性的精氨加压素冻干粉，纯化总收率为78％。
[0071]
实施例2
[0072]
一种精氨加压素的纯化方法，包括以下步骤：
[0073]
s1、制备环肽粗品溶液：
[0074]
取8克精氨加压素线性肽粗品溶于4l的10％(v/v)的乙腈水溶液中，用氢氧化钠调节线性肽粗品的ph至7.0，用0.3％(v/v)双氧水进行氧化，待氧化完成后用0.22微米膜过滤，收集过滤后的粗品溶液备用。
[0075]
s2、第一步纯化：
[0076]
色谱柱：固定相：十八烷基硅烷键合硅胶填料，色谱柱直径和长度为：50*250mm。
[0077]
流动相a：质量分数0.5％磷酸水溶液，用氢氧化钠调ph值为4.0，
[0078]
流动相b：体积比为80％：20％的乙腈
‑
流动相a溶液，
[0079]
流速：50ml/min，波长：220nm，上样量8克，
[0080]
梯度洗脱：50wt％流动相b，洗脱60min，分段收集该梯度段目的峰值肽溶液a，得到纯度大于98％的目的峰值溶液，第一步纯化收率大于85％。
[0081]
s3、第二步纯化：
[0082]
将第一步纯化收集的肽溶液a用纯化水按体积1:1比例稀释，进行第二步纯化：
[0083]
固定相：十八烷基硅烷键合硅胶填料
[0084]
流动相a：80mmol/l乙酸铵(用磷酸调ph至6.0)，
[0085]
流动相b：体积比为80％：20％的乙腈水溶液。
[0086]
流速：50ml/min，波长：220nm。
[0087]
梯度洗脱：60wt％流动相b，洗脱60min。
[0088]
分段收集该梯度段目的峰值肽溶液b，用磷酸调ph至3.0～4.0，得到纯度≥99.5％，单杂≤0.10％的目的峰值肽溶液，第二步纯化收率大于85％。两步纯化收率大于72％。
[0089]
s4、乙酸转盐：
[0090]
将s3得到的高纯度肽溶液采用乙酸方法进行转盐：
[0091]
固定相：十八烷基硅烷键合硅胶填料，
[0092]
流动相a：0.5％(m/v)的乙酸水溶液，
[0093]
流动相b：质量分数0.5％乙酸
‑
乙腈溶液，
[0094]
流速：50ml/min，波长：220nm。
[0095]
洗脱：15wt％流动相b等度洗脱30min，即可得到转盐后的肽溶液。
[0096]
将转盐后的肽溶液放进冻干盘，进行冷冻干燥，即可得到纯度≥99.5％，单杂≤0.10％的高纯度、高稳定性的精氨加压素冻干粉，纯化总收率为75％。
[0097]
实施例3
[0098]
一种精氨加压素的纯化方法，包括以下步骤：
[0099]
s1、制备环肽粗品溶液：
[0100]
取22克精氨加压素线性肽粗品溶于11l的7％(v/v)的乙腈水溶液中，用氢氧化钠调节线性肽粗品的ph至7.0，用0.3％(v/v)双氧水进行氧化，待氧化完成后用0.22微米膜过滤，收集过滤后的粗品溶液备用。精氨加压素环肽粗品的色谱图参照图1，纯度为75.2％
[0101]
s2、第一步纯化：
[0102]
色谱柱：固定相：十八烷基硅烷键合硅胶填料，色谱柱直径和长度为：80*250mm。
[0103]
流动相a：质量分数0.5％磷酸水溶液，用氢氧化钠调ph值为4.0，
[0104]
流动相b：体积比为80％：20％的乙腈
‑
流动相a溶液，
[0105]
流速：100ml/min，波长：220nm，上样量22克，
[0106]
梯度洗脱：30wt％的流动相b，洗脱60min，分段收集该梯度段目的峰值肽溶液a，得到纯度大于98％的目的峰值溶液，作为第二步纯化的肽溶液，第一步纯化收率大于85％。第一步纯化后的产品的色谱图参照图2，纯度为98.5％。
[0107]
s3、第二步纯化：
[0108]
将第一步纯化收集的肽溶液a用纯化水按体积1:1比例稀释，进行第二步纯化：
[0109]
固定相：十八烷基硅烷键合硅胶填料，
[0110]
流动相a：80mmol/l乙酸铵(用磷酸调ph至6.0)，
[0111]
流动相b：体积比为80％：20％的乙腈水溶液，
[0112]
流速：100ml/min，波长：220nm。
[0113]
梯度洗脱：40wt％流动相b，洗脱60min。
[0114]
分段收集该梯度段目的峰值的肽溶液b，用磷酸调节目ph至3.0～4.0，得到纯度≥99.5％，单杂≤0.10％的目的峰值肽溶液，第二步纯化收率大于80％。两步纯化收率大于68％。第二步纯化后的产品的色谱图参照图3，纯度为99.8，单杂≤0.04％。
[0115]
s4、乙酸转盐：
[0116]
将s3得到的高纯度肽溶液采用乙酸方法进行转盐：
[0117]
固定相：十八烷基硅烷键合硅胶填料，
[0118]
流动相a：质量分数0.5％乙酸水溶液，
[0119]
流动相b：质量分数0.5％乙酸
‑
乙腈溶液。
[0120]
流速：100ml/min，波长：220nm。
[0121]
洗脱：15wt％流动相b等度洗脱30min，即可得到转盐后的肽溶液。
[0122]
将转盐后的肽溶液放进冻干盘，进行冷冻干燥，即可得到纯度≥99.5％，单杂≤0.10％的高纯度、高稳定性的精氨加压素冻干粉，纯化总收率为72％。最终冻干产品的ms图参照图4。
[0123]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。