一种对肿瘤组织CD47表达水平进行实时评估的标志物及其应用的制作方法

一种对肿瘤组织cd47表达水平进行实时评估的标志物及其应用
技术领域
1.本发明属于肿瘤免疫疗法评估领域，涉及一种对肿瘤组织cd47表达水平进行实时评估的标志物及其应用。


背景技术：

2.随着天然免疫检查点的深入研究，肿瘤免疫学领域迎来了治疗癌症的新时代，抑制性免疫检查点阻滞便是抗癌治疗中最重要的进展之一。cd47作为新型的免疫检查点分子，在免疫应答和肿瘤免疫逃逸中扮演着重要角色。cd47通过与巨噬细胞表面的信号调节蛋白α(sirpα)结合，启动“别吃我”抑制性信号，从而使肿瘤细胞躲避巨噬细胞的吞噬，并影响特异性杀瘤性t细胞活化，介导肿瘤进展。cd47
‑
sirpα轴免疫阻滞剂是近十年来肿瘤免疫学最有希望的新靶点之一，但这一免疫疗法并不适用于所有人，如何有效地筛选出cd47高表达的肿瘤患者并使其在该免疫疗法中获益显得尤为重要。目前检测cd47的方式主要是免疫组化法，但是存在以下问题：1.采用“免疫组化法”直观检测肿瘤组织中cd47蛋白表达，但不能实现实时检测；2.免疫组化抗体多样性，评估层次不均一。因此，如何高效实时准确地判断肿瘤组织cd47表达量对患者免疫疗法的评估至关重要。
3.液态活检是指以非侵入方式从体液中获得生物标记物并对其分析，从而反映其来源组织的相关信息的检测技术。随着社会的进步和医学技术的不断发展，对于恶性肿瘤精准诊治的要求不断提高。随着对肿瘤分子机制逐渐深入地研究，使得液态活检所涉及的研究内容从传统的肿瘤循环细胞(ctc)和肿瘤循环dna(ctdna)发展至肿瘤细胞来源的外泌体。
4.肿瘤细胞来源的外泌体(exosome)富含肿瘤细胞特征性物质，尤其是蛋白，并普遍存在于患者体液中，其能够将这些遗传信息或肿瘤信号通路转移至肿瘤微环境中，促进肿瘤进展，在应用于肿瘤的早期筛查和临床诊断中有显著优势。因此，寻找源于肿瘤组织且能够反映cd47表达量的外泌体，实现实时准确判断肿瘤组织中cd47的表达量，对于宫颈癌的免疫疗法评估具有重要意义。


技术实现要素：

5.针对现有技术中存在的问题，本发明旨在提供一种对肿瘤组织cd47表达水平进行实时评估的标志物及其应用。本技术筛选出与肿瘤组织cd47的表达水平密切相关的源于宫颈癌细胞的血浆外泌体蛋白，通过对血浆外泌体蛋白的表达水平进行实时检测，从而实时反映肿瘤组织中cd47的表达水平，有助于对宫颈癌患者是否适于cd47免疫疗法进行实时评估。
6.第一方面，本发明提供一种对肿瘤组织cd47的表达水平进行实时评估的标志物，该标志物为血浆外泌体zeb1，该血浆外泌体zeb1源于肿瘤细胞。
7.进一步地，血浆外泌体zeb1的表达水平与肿瘤组织cd47的表达水平呈正相关。
8.进一步地，上述肿瘤为宫颈癌。
9.本发明通过对常氧和缺氧状态下培养的宫颈癌细胞系中zeb1和cd47的表达水平进行检测，发现缺氧宫颈癌细胞较常氧宫颈癌细胞中高表达zeb1和cd47，利用慢病毒敲低或过表达宫颈癌细胞系zeb1的表达，cd47的表达也随之降低或升高，并通过双荧光素酶证实zeb1是cd47的上游转录因子，转录上调cd47的表达。
10.通过梯度超速离心法提取宫颈癌细胞系分泌的外泌体，发现zeb1蛋白在缺氧宫颈癌细胞系来源的外泌体中富集；进一步在宫颈癌临床样本中验证，结果表明相比于早期宫颈癌患者，晚期宫颈癌患者血浆外泌体zeb1的表达明显增高；患者血浆外泌体zeb1相对表达水平和肿瘤组织cd47相对表达水平呈正相关，故而，通过对宫颈癌患者的血浆外泌体中zeb1的表达水平进行实时检测，能够实现对肿瘤组织cd47的表达水平进行实时评估。
11.第二方面，本发明提供血浆外泌体zeb1在宫颈癌cd47免疫疗法评估中的应用。
12.根据上述应用，血浆外泌体zeb1的高表达提示宫颈癌患者适用于cd47免疫疗法。
13.由前述实验证实血浆外泌体zeb1的表达水平与宫颈癌组织cd47的表达水平呈正相关，通过对宫颈癌患者外泌体中zeb1的表达水平进行检测，间接实时反映宫颈癌组织中cd47的表达水平，进而能够用于对宫颈癌患者是否适于cd47免疫疗法进行评估。
14.第三方面，本发明提供利用血浆外泌体zeb1对宫颈癌cd47免疫疗法进行评估的方法，包括如下步骤：
15.通过检测血浆外泌体zeb1的表达水平间接反映肿瘤组织cd47的表达水平，从而评估宫颈癌患者是否适于cd47免疫疗法。
16.进一步地，血浆外泌体zeb1的表达水平与肿瘤组织cd47的表达水平之间的数值关系如下：
17.y＝0.2273x 0.7739(r2＝0.5191)，其中，y表示肿瘤组织cd47的表达水平，x表示血浆外泌体zeb1的表达水平。
18.进一步地，血浆外泌体zeb1的高表达提示宫颈癌患者适于cd47免疫疗法。
19.与现有技术相比，本技术的有益效果如下：
20.本技术基于体外实验研究发现zeb1是调控宫颈癌细胞cd47表达的重要转录因子，并首次发现zeb1在缺氧宫颈癌细胞中的外泌体中富集；进一步在宫颈癌临床样本中验证宫颈癌患者血浆外泌体zeb1的表达水平和肿瘤组织cd47的表达水平呈正相关。通过对宫颈癌患者血浆外泌体zeb1的表达水平进行实时检测，能够实时反映出宫颈癌组织中cd47表达量的高低，这对于宫颈癌cd47免疫疗法评估具有重要的指导意义。
21.另外，相对于现有免疫组化法评估宫颈癌组织中cd47表达量的方法，本技术通过血浆外泌体zeb1的表达水平间接反映宫颈癌组织cd47的表达水平，由于患者血浆外泌体获取时的微创性以及实时性，不仅患者的接受度高，而且能够实时反映宫颈癌组织中cd47的表达水平，具有实时性及准确度高的优势，且操作便捷，具有较高的推广应用价值。
附图说明
22.图1为zeb1和cd47在宫颈癌细胞中的表达分布及调控图；
23.图2为宫颈癌患者血浆外泌体zeb1的相对表达量与肿瘤组织cd47的表达量之间的关系图以及利用血浆外泌体的表达水平进行评估宫颈癌cd47免疫疗法的roc曲线图。
具体实施方式
24.为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。本领域技术人员应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
25.实施例中所用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
26.实施例1
27.本实施例将从如下两部分探寻外泌体zeb1与宫颈癌组织cd47之间的关系。
28.第一部分：缺氧宫颈癌细胞高表达zeb1并促进cd47的转录调控。
29.利用免疫荧光、western blot、荧光定量pcr分别检测常氧和缺氧条件下培养的宫颈癌细胞系(siha和c33a)中zeb1和cd47的表达水平，结果提示缺氧宫颈癌细胞较常氧宫颈癌细胞高表达zeb1和cd47(图1a)。
30.利用慢病毒敲低或过表达宫颈癌细胞系zeb1的表达水平，cd47的表达水平也随之降低或升高(图1b和图1c)。双荧光素酶结果证实zeb1是cd47的上游转录因子，转录上调cd47的表达(图1d)。
31.第二部分：宫颈癌患者血浆外泌体zeb1的相对表达量有效评估肿瘤组织cd47表达，并用于对宫颈癌患者是否适于cd47免疫疗进行评估。
32.利用梯度超速离心法提取常氧和缺氧宫颈癌细胞系分泌的外泌体，以透射电镜鉴定外泌体的形态(图2a)，以western blot鉴定外泌体标记性蛋白cd63、tsg101、hsp70及zeb1的表达，发现zeb1蛋白在缺氧宫颈癌细胞系来源的外泌体中富集(图2c)。进一步在宫颈癌临床样本中验证，分别收集早期宫颈癌(figo 2018，i和ii期)和晚期宫颈癌患者(figo 2018，iii和iv期)的外周血样各20例，利用血浆外泌体提取试剂盒(ex5022
‑
03)提取临床宫颈癌患者血浆外泌体(图2b)并检测zeb1的表达(图2c
‑
d)，结果表明相比于早期宫颈癌患者，晚期宫颈癌患者血浆外泌体zeb1的表达明显增高。同时在和临床血样相匹配的宫颈组织病理切片上通过免疫组化检测cd47表达，采用h
‑
score评分：h
‑
score＝σpi(i 1)，式中pi表示阳性细胞数量占切片中所有细胞数量的百分数；i代表染色强度。结果表明，相比于早期宫颈癌患者，晚期宫颈癌患者肿瘤组织cd47表达明显增高(图2d)。进一步通过spearman相关性分析发现，宫颈癌患者血浆外泌体zeb1的表达量和肿瘤组织cd47的表达量呈显著正相关(r＝0.5191,p<0.001)(图2e)。血浆外泌体zeb1的表达量与宫颈癌组织cd47的表达量之间的数值关系为：y＝0.2273x 0.7739(r2＝0.5191)，其中，y表示肿瘤组织cd47的表达水平，x表示血浆外泌体zeb1的表达水平。
33.根据肿瘤组织cd47表达的h
‑
score评分，定义h
‑
score≥8为cd47高表达；定义h
‑
score<8为cd47低表达。结合roc曲线进一步发现，宫颈癌患者血浆外泌体zeb1相对表达量能够有效评估肿瘤组织cd47表达(roc曲线下面积：0.901,p<0.001)，youden’s指标表明宫颈癌患者血浆外泌体zeb1评估肿瘤组织cd47表达量的最优界值为2.350，即宫颈癌患者血浆外泌体zeb1相对表达量≥2.350，肿瘤组织cd47呈高表达，提示宫颈癌患者适于cd47免疫疗法；宫颈癌患者血浆外泌体zeb1相对表达量<2.350，肿瘤组织cd47呈低表达，提示宫颈癌患者不适于cd47免疫疗法(图2f)。
34.因此，通过检测血浆外泌体中zeb1的表达能够反映宫颈癌患者组织中cd47的表达
水平；故而，通过对宫颈癌患者血浆外泌体中zeb1的表达量进行实时取样检测，能够实现对肿瘤组织cd47表达水平的实时评估，这对于评估宫颈癌患者是否适于cd47免疫疗法具有极为重要的意义。由于外泌体检测的实时性、操作便利性，使得本发明具有较高的推广应用价值。
35.综上，本实施例通过体外实验研究发现zeb1是调控宫颈癌细胞cd47表达的重要转录因子，并首次发现zeb1在缺氧宫颈癌细胞中的外泌体中富集，进一步在宫颈癌临床样本中验证，宫颈癌患者血浆外泌体zeb1的表达量和宫颈癌肿瘤组织cd47的表达量呈正相关。通过对宫颈癌患者血浆外泌体zeb1表达水平的检测，能够反映出宫颈癌组织中cd47表达量的高低，进而通过对血浆外泌体zeb1的实时检测，从而实时反映出肿瘤组织中cd47的实时表达量，这对于宫颈癌cd47免疫疗法评估具有重要的指导意义。
36.最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。