CD80变体蛋白及其应用的制作方法

cd80变体蛋白及其应用
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背景技术：

5.t细胞淋巴细胞通过提供对特定病原体的适应性反应，在细胞介导的免疫中起关键作用。t细胞的活化取决于至少两个信号通路的活化，一个是抗原特异性的，另一个是抗原非特异性的。t细胞的抗原特异性活化是由与特定t细胞抗原受体相互作用的抗原呈递细胞上的肽/主要组织相容性复合物介导的。在抗原呈递细胞上表达的b7相关分子(即cd80(b7
‑
1)和cd86(b7
‑
2))与t细胞上的cd28和/或ctla
‑
4的结合提供了重要的抗原非特异性共刺激信号，对最佳免疫反应至关重要。cd80与cd28和ctla
‑
4的t细胞同型二聚体的结合会在t细胞中产生共刺激和抑制信号，而cd80与pd
‑
l1的结合中断了pd
‑
1和pd
‑
l1之间的相互作用，从而消除了t细胞活化的抑制信号。因为这些信号传导途径决定了t细胞对抗原的反应以及对抗原的下游反应的强度，所以例如通过调节cd80和cd28和/或ctla4之间的一个或多个相互作用，特异性调节一个或多个共刺激信号的药物可以有效治疗由细胞介导的免疫反应失调引起的疾病。
6.cd80是免疫球蛋白超家族(igsf)的成员，其细胞外结构域由一个氨基末端ig可变样(igv)结构域和一个膜近端ig恒定样(igc)结构域组成。已经对cd80、ctla
‑
4、pd
‑
l1和cd28这三种靶蛋白的结合亲和力进行了努力调节。(peach等人，(1995)jbc，270(36)，21181
‑
21187)。
7.cd28有利于单体配体的结合，而ctla
‑
4有利于二聚体配体的结合，单体与多聚体形式的cd80的比例可影响随后的免疫反应。因此，需要提供对ctla
‑
4、pd
‑
l1和cd28各配体具有增加、降低、或增加和降低的组合的亲和力的改进的cd80变体，以选择性地调节t细胞活化来获得特定的治疗效果。本发明提供了与之相关的方法和成分。


技术实现要素：

8.本发明提供了变体cd80多肽。在一些实施例中，变体cd80多肽包含与seq id no：1具有至少80％相同氨基酸序列的氨基酸序列，其中，与seq id no：1相比，变体cd80多肽包含一个或多个氨基酸取代修饰，其中，一个或多个取代修饰位于seq id no：1的位置131、139、155、165或166处。在一些实施例中，与seq id no：1相比，变体cd80多肽包含两个或多个氨基酸取代修饰，且其中，两个或多个取代修饰位于seq id no：1的位置130、131、139、155、156、165或166处。在一些实施例中，与seq id no：1相比，变体cd80多肽包含三个或多
p01860(ighg3_human)，免疫球蛋白重常数γ3。
22.图5提供了人igg4 fc结构域的氨基酸序列(seq id no：5)，其部分得自uniprotkb p01861(ighg4_human)，免疫球蛋白重常数γ4。
23.图6提供了小鼠igg1 fc结构域的氨基酸序列(seq id no：6)，其部分得自uniprotkb p01868(ighg1_mouse)，分泌的是igγ
‑
1链c区。
24.图7提供了小鼠igg2a fc结构域的氨基酸序列(seq id no：7)，其部分得自uniprotkb p01863(gcaa_mouse)，igγ
‑
2a链c区，a等位基因。
25.图8提供了小鼠igg2b fc结构域的氨基酸序列(seq id no：8)，其部分得自uniprotkb p01867(igg2b_mouse)的igγ
‑
2b链c区。
26.图9提供了小鼠igg3 fc结构域的氨基酸序列(seq id no：9)，其部分得自uniprotkb p03987(ighg3_mouse)的igγ
‑
3链c区。
27.图10提供了人cd28的氨基酸序列(seq id no：10)，其得自uniprotkb p10747(cd28_human)，t细胞特异性表面糖蛋白cd28。
28.图11提供了人ctla
‑
4的氨基酸序列(seq id no：11)，其得自uniprotkb p16410(ctla4_human)，细胞毒性t淋巴细胞蛋白4。
29.图12提供了人pd
‑
l1的氨基酸序列(seq id no：12)，其得自uniprotkb q9nzq7(pd1l1_human)，程序性细胞死亡1配体1。
30.图13a描绘了从表达载体编码本发明中教导的(i)前导序列(图13b)，(ii)cd80(在本发明中教导的感兴趣的野生型人cd80或突变人cd80变体)和(iii)ig fc结构域的cd80
‑
fc表达盒的示意图。图13b提供了从人igg重链(genbank：qbk47409.1)获得的前导序列的氨基酸序列(seq id no：13)。图13c描绘了由两个经二硫键二聚和连接的cd80 fc融合多肽组成的cd80 fc融合蛋白的示意图。
31.图14a提供了从hcd80
‑
fc表达构建体表达的人cd80
‑
fc融合多肽的氨基酸序列(seq id no：14)。图14b提供了野生型小鼠cd80序列的氨基酸序列(seq id no：15)。
32.图15a描绘了在非还原条件下选择和纯化的cd80
‑
fc融合蛋白的sds
‑
page分析结果。图15b描述了在还原条件下选择和纯化的cd80
‑
fc融合多肽的sds
‑
page分析结果。图15a
‑
15b中载有纯化的cd80
‑
fc融合蛋白的样品如下；泳道1：分子量标记；泳道2：s131f，1.5ug/lane；泳道3：s131r，1.5ug/lane；泳道4：s131e，2.0ug/lane；泳道5：s131d，1.6ug/lane；泳道6：s131q，1.6ug/lane；泳道7：a165v，1.2ug/lane；泳道8：a165i，1.6ug/lane；泳道9：a165f，1.6ug/lane；泳道10：a165r，1.6ug/lane；泳道11：a165d，1.6ug/lane；泳道12：a165q，1.6ug/lane。
33.图15c描绘了在非还原条件下选择和纯化的cd80
‑
fc融合蛋白的sds
‑
page分析结果。图15d描绘了在还原条件下选择和纯化的cd80
‑
fc融合多肽的sds
‑
page分析结果。图15c
‑
15d中载有纯化的cd80
‑
fc融合蛋白的样品如下；泳道1：分子量标记；泳道2：v166a，10ug/lane；泳道3：v166t，10ug/lane；泳道4：v166l/l139v，10ug/lane；泳道5：s156a/v155a，10ug/lane；泳道6：s156a/v155i，10ug/lane；泳道7：s156a/v155t，10ug/lane；泳道8：s156a/t130a，10ug/lane；泳道9：s156a/v166a，10ug/lane；泳道10：s156a/v166l/l139v，10ug/lane。
34.图15e描述了在非还原条件下选择和纯化的cd80
‑
fc融合蛋白的sds
‑
page分析结
果。图15f描绘了在还原条件下选择和纯化的cd80
‑
fc融合多肽的sds
‑
page分析结果。图15e
‑
15f中载有纯化的cd80
‑
fc融合蛋白的样品如下；泳道1：分子量标记；泳道2：s131v，10ug/lane；泳道3：v155a，10ug/lane；泳道4：v155i，10ug/lane；泳道5：v155t，10ug/lane。
35.图16a描绘了通过elisa进行结合测定以测试变体cd80
‑
fc融合蛋白与固定化的结合配偶体ctla
‑
4的结合亲和力的结果。本文测试的变体cd80多肽的类型如下：两个位置(s156i/a165s、s156i/s131a和a165s/s131a
–
双重取代/突变)和三个位置(s156i/a165s/s131a
–
三重取代/突变)的氨基酸取代/突变。cd80
‑
wt蛋白用作阳性对照，而人igg1蛋白则是阴性对照。
36.图16b描绘了通过elisa进行结合测定以测试变体cd80
‑
fc融合蛋白与固定化的结合配偶体ctla
‑
4的结合亲和力的结果。本文测试的变体cd80多肽的类型如下：位置s156(s156f、s156r、s156e、s156d和s156q)的单个氨基酸取代/突变。cd80
‑
wt蛋白用作阳性对照。
37.图16c描绘了通过elisa进行结合测定以测试变体cd80
‑
fc融合蛋白与固定化的结合配偶体ctla
‑
4的结合亲和力的结果。本文测试的变体cd80多肽的类型如下：位置s131(s131v、s131i、s131f、s131r和s131e)的单个氨基酸取代/突变。cd80
‑
wt蛋白用作阳性对照。
38.图16d描绘了通过elisa进行结合测定以测试变体cd80
‑
fc融合蛋白与固定化的结合配偶体ctla
‑
4的结合亲和力的结果。本文测试的变体cd80多肽的类型如下：位置s131或a165(s131d、s131q、a165v、a165i和a165f)的单个氨基酸取代/突变。cd80
‑
wt蛋白用作阳性对照。
39.图16e描绘了通过elisa进行结合测定以测试变体cd80
‑
fc融合蛋白与固定化的结合配偶体ctla
‑
4的结合亲和力的结果。本文测试的变体cd80多肽的类型如下：位置a165(a165r、a165e、a165d和a165q)的单个氨基酸取代/突变。cd80
‑
wt蛋白用作阳性对照，而人igg1蛋白则是阴性对照。
40.图16f描绘了通过elisa进行结合测定以测试变体cd80
‑
fc融合蛋白与固定化的结合配偶体ctla
‑
4的结合亲和力的结果。本文测试的变体cd80多肽的类型如下：单个氨基酸取代/突变(t130a、s131v、l139v、v155a、v155i、v155t、s156a、v166a、v166l、v166t、v155a/s156a、v155i/s156a和v155t/s156a)。cd80
‑
wt蛋白用作阳性对照。
41.图17a描绘了通过elisa进行结合测定以测试变体cd80
‑
fc融合蛋白与固定化的结合配偶体cd28的结合亲和力的结果。本文测试的变体cd80多肽的类型如下：两个位置(s156i/a165s、s156i/s131a和a165s/s131a
–
双重取代/突变)和三个位置(s156i/a165s/s131a
–
三重取代/突变)的氨基酸取代/突变。cd80
‑
wt蛋白用作阳性对照，而人igg1蛋白则是阴性对照。
42.图17b描绘了通过elisa进行结合测定以测试变体cd80
‑
fc融合蛋白与固定化的结合配偶体cd28的结合亲和力的结果。本文测试的变体cd80多肽的类型如下：位置s156(s156f、s156r、s156e、s156d和s156q)的单个氨基酸取代/突变。cd80
‑
wt蛋白用作阳性对照。
43.图17c描绘了通过elisa进行结合测定以测试变体cd80
‑
fc融合蛋白与固定化的结合配偶体cd28的结合亲和力的结果。本文测试的变体cd80多肽的类型如下：位置s131
(s131v、s131i、s131f、s131r和s131e)的单个氨基酸取代/突变。cd80
‑
wt蛋白用作阳性对照。
44.图17d描绘了通过elisa进行结合测定以测试变体cd80
‑
fc融合蛋白与固定化的结合配偶体cd28的结合亲和力的结果。本文测试的变体cd80多肽的类型如下：位置s131或a165(s131d、s131q、a165v、a165i和a165f)的单个氨基酸取代/突变。cd80
‑
wt蛋白用作阳性对照，而人igg1蛋白则是阴性对照。
45.图17e描绘了通过elisa进行结合测定以测试变体cd80
‑
fc融合蛋白与固定化的结合配偶体cd28的结合亲和力的结果。本文测试的变体cd80多肽的类型如下：位置a165(a165r、a165e、a165d和a165q)的单个氨基酸取代/突变。cd80
‑
wt蛋白用作阳性对照。
46.图18a描绘了通过elisa进行结合测定以测试变体cd80
‑
fc融合蛋白与固定化的结合配偶体pd
‑
l1的结合亲和力的结果。本文测试的变体cd80多肽的类型如下：两个位置(s156i/a165s、s156i/s131a和a165s/s131a
–
双重取代/突变)和三个位置(s156i/a165s/s131a
–
三重取代/突变)的氨基酸取代/突变。cd80
‑
wt蛋白用作阳性对照，而人igg1蛋白则是阴性对照。
47.图18b描绘了通过elisa进行结合测定以测试变体cd80
‑
fc融合蛋白与固定化的结合配偶体pd
‑
l1的结合亲和力的结果。本文测试的变体cd80多肽的类型如下：位置s156(s156f、s156r、s156e、s156d和s156q)的单个氨基酸取代/突变。cd80
‑
wt蛋白用作阳性对照。
48.图18c描绘了通过elisa进行结合测定以测试变体cd80
‑
fc融合蛋白与固定化的结合配偶体pd
‑
l1的结合亲和力的结果。本文测试的变体cd80多肽的类型如下：位置s131(s131v、s131i、s131f、s131r和s131e)的单个氨基酸取代/突变。cd80
‑
wt蛋白用作阳性对照。
49.图18d描绘了通过elisa进行结合测定以测试变体cd80
‑
fc融合蛋白与固定化的结合配偶体pd
‑
l1的结合亲和力的结果。本文测试的变体cd80多肽的类型如下：位置s131或a165(s131d、s131q、a165v、a165i和a165f)的单个氨基酸取代/突变。cd80
‑
wt蛋白用作阳性对照。
50.图18e描绘了通过elisa进行结合测定以测试变体cd80
‑
fc融合蛋白与固定化的结合配偶体pd
‑
l1的结合亲和力的结果。本文测试的变体cd80多肽的类型如下：位置a165(a165r、a165e、a165d和a165q)的单个氨基酸取代/突变。cd80
‑
wt蛋白用作阳性对照，而人igg1蛋白则是阴性对照。
51.图19描述了使用biacore模型x100对包括单突变、双突变和三突变的每个变体cd80
‑
fc融合蛋白与结合配偶体人ctla
‑
4的结合测定的结果。
52.图20a描绘了通过facs进行的细胞表面结合测定以测试变体cd80
‑
fc融合蛋白与表达ctla
‑
4的flp
‑
in 293细胞的结合亲和力的结果。本文测试的变体cd80多肽的类型如下：两个位置(s156i/a165s、s156i/s131a和a165s/s131a
–
双重取代/突变)和三个位置(s156i/a165s/s131a
–
三重取代/突变)和一个位置(s156f，s156r和s156e)的氨基酸取代/突变。cd80
‑
wt蛋白用作阳性对照，而人igg1蛋白则是阴性对照。
53.图20b描绘了通过facs进行的细胞表面结合测定以测试变体cd80
‑
fc融合蛋白与表达ctla
‑
4的flp
‑
in 293细胞的结合亲和力的结果。本文测试的变体cd80多肽的类型如
下：在位置s156、s131或a165(s156d、s156q、s131v、s131i、s131f、s131r、s131e、s131d、s131q、a165v、a165i、a165f、a165r、a165e、a165d和a165q)的单个氨基酸取代/突变。cd80
‑
wt蛋白用作阳性对照，而人igg1蛋白则是阴性对照。
54.图21a描绘了通过facs进行的细胞表面结合测定以测试变体cd80
‑
fc融合蛋白与表达cd28的flp
‑
in 293细胞的结合亲和力的结果。本文测试的变体cd80多肽的类型如下：两个位置(s156i/a165s、s156i/s131a和a165s/s131a
–
双重取代/突变)，三个位置(s156i/a165s/s131a
–
三重取代/突变)和一个位置(s156f、s156r和s156e)的氨基酸取代/突变。cd80
‑
wt蛋白用作阳性对照，而人igg1蛋白则是阴性对照。
55.图21b描绘了通过facs进行的细胞表面结合测定以测试变体cd80
‑
fc融合蛋白与表达cd28的flp
‑
in 293细胞的结合亲和力的结果。本文测试的变体cd80多肽的类型如下：位置s156、s131或a165(s156d、s156q、s131v、s131i、s131f、s131r、s131e、s131d、s131q、a165v、a165i、a165f、a165r、a165e、a165d和a165q)的单个氨基酸取代/突变。cd80
‑
wt蛋白用作阳性对照，而人igg1蛋白则是阴性对照。
56.图22a描绘了通过facs进行的细胞表面结合测定以测试变体cd80
‑
fc融合蛋白与表达pd
‑
l1的flp
‑
in 293细胞的结合亲和力的结果。本文测试的变体cd80多肽的类型如下：两个位置(s156i/a165s、s156i/s131a和a165s/s131a
–
双重取代/突变)，三个位置(s156i/a165s/s131a
–
三重取代/突变)和一个位置(s156f，s156r和s156e)的氨基酸取代/突变。cd80
‑
wt蛋白用作阳性对照，而人igg1蛋白则是阴性对照。
57.图22b描绘了通过facs进行的细胞表面结合测定以测试变体cd80
‑
fc融合蛋白与表达pd
‑
l1的flp
‑
in 293细胞的结合亲和力的结果。本文测试的变体cd80多肽的类型如下：位置s156，s131或a165(s156d、s156q、s131v、s131i、s131f、s131r、s131e、s131d、s131q、a165v、a165i、a165f、a165r、a165e、a165d和a165q)的单个氨基酸取代/突变。cd80
‑
wt蛋白用作阳性对照，而人igg1蛋白则是阴性对照。
58.图23a描绘了il
‑
2释放的功能测定以测试变体cd80
‑
fc融合蛋白对t细胞活化的能力的结果。本文测试的变体cd80多肽的类型如下：两个位置(s156i/a165s、s156i/s131a和a165s/s131a
–
双重取代/突变)和三个位置(s156i/a165s/s131a
–
三重取代/突变)的氨基酸取代/突变。cd80
‑
wt蛋白用作阳性对照，而人igg1蛋白则是阴性对照。
59.图23b描绘了il
‑
2释放的功能测定以测试变体cd80
‑
fc融合蛋白对t细胞活化的能力的结果。本文测试的变体cd80多肽的类型如下：位置s131(s131v、s131i、s131f、s131r、s131e、s131d和s131q)的单个氨基酸取代/突变。cd80
‑
wt蛋白用作阳性对照，而人igg1蛋白则是阴性对照。
60.图23c描绘了il
‑
2释放的功能测定以测试变体cd80
‑
fc融合蛋白对t细胞活化的能力的结果。本文测试的变体cd80多肽的类型如下：位置s156(s156f、s156r、s156e、s156d和s156q)的单个氨基酸取代/突变。cd80
‑
wt蛋白用作阳性对照，而人igg1蛋白则是阴性对照。
61.图23d描绘了il
‑
2释放的功能测定以测试变体cd80
‑
fc融合蛋白对t细胞活化的能力的结果。本文测试的变体cd80多肽的类型如下：位置a165(a165v、a165i、a165f、a165r、a165e、a165d和a165q)的单个氨基酸取代/突变。cd80
‑
wt蛋白用作阳性对照，而人igg1蛋白则是阴性对照。
62.图24示出了与ctla
‑
4复合的cd80二聚体的晶体结构(由igc结构域、结构域间铰链
和igv结构域组成)。igc结构域中的突变位置如下所示：t130、s131、l139、v155、s156、a165和v166。
63.图25a描述了ctla
‑
4阻断测定以评估变体cd80
‑
fc融合蛋白阻断ctla
‑
4/cd28相互作用功能的能力的结果。本文测试的变体cd80多肽的类型如下：两个位置(s156i/a165s、s156i/s131a和a165s/s131a
–
双重取代/突变)的氨基酸取代/突变，cd80
‑
wt蛋白用作阳性对照。
64.图25b描述了ctla
‑
4阻断测定以评估变体cd80
‑
fc融合蛋白阻断ctla
‑
4/cd28相互作用功能的能力的结果。本文测试的变体cd80多肽的类型如下：三个位置(s156i/a165s/s131a
–
三重取代/突变)和一个位置s156(s156f，s156r和s156e)的氨基酸取代/突变。cd80
‑
wt蛋白用作阳性对照。
65.图25c描述了ctla
‑
4阻断测定以评估变体cd80
‑
fc融合蛋白阻断ctla
‑
4/cd28相互作用功能的能力的结果。本文测试的变体cd80多肽的类型如下：位置s156或s131(s156d、s156q、s131v和s131i)的单个氨基酸取代/突变。cd80
‑
wt蛋白用作阳性对照。
66.图25d描述了ctla
‑
4阻断测定以评估变体cd80
‑
fc融合蛋白阻断ctla
‑
4/cd28相互作用功能的能力的结果。本文测试的变体cd80多肽的类型如下：位置s131(s131f和s131r)的单个氨基酸取代/突变。cd80
‑
wt蛋白用作阳性对照。
67.图25e描述了ctla
‑
4阻断测定以评估变体cd80
‑
fc融合蛋白阻断ctla
‑
4/cd28相互作用功能的能力的结果。本文测试的变体cd80多肽的类型如下：位置s131(s131e和s131d)的单个氨基酸取代/突变。cd80
‑
wt蛋白用作阳性对照。
68.图25f描述了ctla
‑
4阻断测定以评估变体cd80
‑
fc融合蛋白阻断ctla
‑
4/cd28相互作用功能的能力的结果。本文测试的变体cd80多肽的类型如下：位置s131或a165(s131q、a165v、a165i和a165f)的单个氨基酸取代/突变。cd80
‑
wt蛋白用作阳性对照。
69.图25g描述了ctla
‑
4阻断测定以评估变体cd80
‑
fc融合蛋白阻断ctla
‑
4/cd28相互作用功能的能力的结果。本文测试的变体cd80多肽的类型如下：位置a165(a165r、a165e、a165d和a165q)的单个氨基酸取代/突变。cd80
‑
wt蛋白用作阳性对照。
70.图25h描述了ctla
‑
4阻断测定以评估变体cd80
‑
fc融合蛋白阻断ctla
‑
4/cd28相互作用功能的能力的结果。本文测试的变体cd80多肽的类型如下：位置v155(v155a、v155i和v155t)的单个氨基酸取代/突变。cd80
‑
wt蛋白用作阳性对照。
71.图25i描述了ctla
‑
4阻断测定以评估变体cd80
‑
fc融合蛋白阻断ctla
‑
4/cd28相互作用功能的能力的结果。本文测试的变体cd80多肽的类型如下：一个位置v166(v166a和v166t)和两个位置(v166l/l139v和s156a/v155a
–
双重取代/突变)的氨基酸取代/突变，cd80
‑
wt蛋白用作阳性对照。
72.图25j描述了ctla
‑
4阻断测定以评估变体cd80
‑
fc融合蛋白阻断ctla
‑
4/cd28相互作用功能的能力的结果。本文测试的变体cd80多肽的类型如下：两个位置(s156a/v155i、s156a/v155t、s156a/t130a和s156a/v166a
–
双重取代/突变)的氨基酸取代/突变，cd80
‑
wt蛋白被用作阳性对照。
73.图25k描述了ctla
‑
4阻断测定以评估变体cd80
‑
fc融合蛋白阻断ctla
‑
4/cd28相互作用功能的能力的结果。本文测试的变体cd80多肽的类型如下：三个位置(s156a/v166l/l139v
–
三重取代/突变)和一个位置s156或a165(s156i、s156a和a165s)的氨基酸取代/突
变。cd80
‑
wt蛋白用作阳性对照。
74.图25l描述了ctla
‑
4阻断测定以评估变体cd80
‑
fc融合蛋白阻断ctla
‑
4/cd28相互作用功能的能力的结果。本文测试的变体cd80多肽的类型如下：位置s131或s156(s131a、s156v、s156l和s156i)的单个氨基酸取代/突变。cd80
‑
wt蛋白用作阳性对照，而人igg1蛋白则是阴性对照。
75.图26a描绘了变体cd80
‑
fc融合蛋白的共刺激活性的结果。本文测试的变体cd80多肽的类型如下：两个位置(s156i/a165s、s156i/s131a和a165s/s131a
–
双重取代/突变)，三个位置(s156i/a165s/s131a
–
三重取代/突变)和一个位置s156(s156f)的氨基酸取代/突变。cd80
‑
wt蛋白用作阳性对照。
76.图26b描绘了变体cd80
‑
fc融合蛋白的共刺激活性的结果。本文测试的变体cd80多肽的类型如下：单个位置s156(s156r、s156e、s156d和s156q)的氨基酸取代/突变。人igg1蛋白用作阴性对照。
77.图26c描绘了变体cd80
‑
fc融合蛋白的共刺激活性的结果。本文测试的变体cd80多肽的类型如下：单个位置s131(s131v、s131i、s131f、s131r、s131e和s131d)的氨基酸取代/突变。
78.图26d描绘了变体cd80
‑
fc融合蛋白的共刺激活性的结果。本文测试的变体cd80多肽的类型如下：单个位置s131或a165(s131q、a165v、a165i、a165f、a165r、a165e、a165d和a165q)的氨基酸取代/突变。
79.图26e描绘了变体cd80
‑
fc融合蛋白的共刺激活性的结果。本文测试的变体cd80多肽的类型如下：单个位置s156、a165或s131(s156a、a165s、s131a和s156v)的氨基酸取代/突变。
80.图26f描绘了变体cd80
‑
fc融合蛋白的共刺激活性的结果。本文测试的变体cd80多肽的类型如下：单个位置v155或v166(v155a、v155i、v155t、v166a和v166t)的氨基酸取代/突变。
81.图26g描绘了变体cd80
‑
fc融合蛋白的共刺激活性的结果。本文测试的变体cd80多肽的类型如下：两个位置(v166l/l139v、s156a/v155a、s156a/v155i、s156a/v155t、s156a/t130a和s156a/v166a
–
双重取代/突变)的氨基酸取代/突变。
82.图26h描绘了变体cd80
‑
fc融合蛋白的共刺激活性的结果。本文测试的变体cd80多肽的类型如下：三个位置(s156a/v166l/l139v
–
三重取代/突变)和一个位置s156或a165(s156i和a165s)的氨基酸取代/突变。
83.图27描绘了变体cd80蛋白在ct26同系小鼠模型中的体内功效的结果。
84.图28描绘了变体cd80蛋白在mc
‑
38同系小鼠模型中的体内功效的结果。
85.图29a描绘了通过elisa的结合测定，以测试变体小鼠cd80
‑
fc融合蛋白化与固定的结合配偶体小鼠cd28的结合亲和力。本文测试的变体小鼠cd80多肽的类型如下：位置t165(t165e、t165q、t165r、t165a和t165s)的单个氨基酸取代/突变。小鼠cd80
‑
wt蛋白用作阳性对照。
86.图29b描绘了通过elisa的结合测定，以测试变体小鼠cd80
‑
fc融合蛋白与固定化的结合配偶体小鼠cd28的结合亲和力。本文测试的变体小鼠cd80多肽的类型如下：位置t165或s131(t165v、t165i、t165f、t165d和s131v)的单个氨基酸取代/突变。小鼠cd80
‑
wt蛋
白用作阳性对照。
87.图29c描绘了通过elisa的结合测定，以测试变体小鼠cd80
‑
fc融合蛋白与固定化的结合配偶体小鼠cd28的结合亲和力。本文测试的变体小鼠cd80多肽的类型如下：位置s131(s131i、s131f、s131r、s131e和s131q)的单个氨基酸取代/突变。小鼠cd80
‑
wt蛋白用作阳性对照。
88.图29d描绘了通过elisa的结合测定，以测试变体小鼠cd80
‑
fc融合蛋白与固定化的结合配偶体小鼠cd28的结合亲和力。本文测试的变体小鼠cd80多肽的类型如下：位置s131(s131a和s131p)的单个氨基酸取代/突变。小鼠cd80
‑
wt蛋白用作阳性对照。
89.图30a描绘了通过elisa的结合测定，以测试变体小鼠cd80
‑
fc融合蛋白与固定化的结合配偶体小鼠pd
‑
l1的结合亲和力。本文测试的变体小鼠cd80多肽的类型如下：位置t165(t165e、t165q、t165r、t165a和t165s)的单个氨基酸取代/突变。小鼠cd80
‑
wt蛋白用作阳性对照。
90.图30b描绘了通过elisa的结合测定，以测试变体小鼠cd80
‑
fc融合蛋白与固定化的结合配偶体小鼠pd
‑
l1的结合亲和力。本文测试的变体小鼠cd80多肽的类型如下：位置t165或s131(t165v、t165i、t165f、t165d和s131v)的单个氨基酸取代/突变。小鼠cd80
‑
wt蛋白用作阳性对照。
91.图30c描绘了通过elisa的结合测定，以测试变体小鼠cd80
‑
fc融合蛋白与固定化的结合配偶体小鼠pd
‑
l1的结合亲和力。本文测试的变体小鼠cd80多肽的类型如下：位置s131(s131i、s131f、s131r、s131e和s131q)的单个氨基酸取代/突变。小鼠cd80
‑
wt蛋白用作阳性对照。
92.图30d描绘了通过elisa的结合测定，以测试变体小鼠cd80
‑
fc融合蛋白与固定化的结合配偶体小鼠pd
‑
l1的结合亲和力。本文测试的变体小鼠cd80多肽的类型如下：位置s131(s131a和s131p)的单个氨基酸取代/突变。小鼠cd80
‑
wt蛋白用作阳性对照。
93.图31a描绘了通过elisa的结合测定，以测试变体小鼠cd80
‑
fc融合蛋白与固定化的结合配偶体小鼠ctla4的结合亲和力。本文测试的变体小鼠cd80多肽的类型如下：位置t165(t165e、t165q、t165r、t165a和t165s)的单个氨基酸取代/突变。小鼠cd80
‑
wt蛋白用作阳性对照。
94.图31b描绘了通过elisa的结合测定，以测试变体小鼠cd80
‑
fc融合蛋白与固定化的结合配偶体小鼠ctla4的结合亲和力。本文测试的变体小鼠cd80多肽的类型如下：位置t165或s131(t165v、t165i、t165f、t165d和s131v)的单个氨基酸取代/突变。小鼠cd80
‑
wt蛋白用作阳性对照。
95.图31c描绘了通过elisa的结合测定，以测试变体小鼠cd80
‑
fc融合蛋白与固定化的结合配偶体小鼠ctla4的结合亲和力。本文测试的变体小鼠cd80多肽的类型如下：位置s131(s131i、s131f、s131r、s131e和s131q)的单个氨基酸取代/突变。小鼠cd80
‑
wt蛋白用作阳性对照。
96.图31d描绘了通过elisa的结合测定，以测试变体小鼠cd80
‑
fc融合蛋白与固定化的结合配偶体小鼠ctla4的结合亲和力。本文测试的变体小鼠cd80多肽的类型如下：位置s131(s131a和s131p)的单个氨基酸取代/突变。小鼠cd80
‑
wt蛋白用作阳性对照。
具体实施方式
97.出于所有目的，所有出版物、专利和专利申请，包括其中的任何附图和附录均通过引用整体并入本文，其程度与具体地和单独地指出每个单独的出版物、专利或专利申请、附图或附录均出于所有目的通过引用整体并入本文的程度相同。
98.尽管本文描述了本发明的各种实施例，但是对于本领域技术人员而言显而易见的是，仅通过示例的方式提供了这样的实施例。在不背离本发明的情况下，本文描述的实施例的许多修饰和改变以及变化和取代对于本领域技术人员将是显而易见的。应当理解，在实践本发明中可以采用本文所述实施例的各种替代方案。还应理解，本发明的每个实施例可以任选地与本文描述的与该实施例一致的其他实施例中的任何一个或多个组合。
99.在以列表格式(例如，以马库什组)表示元素的情况下，应理解，还公开了元素的每个可能的子组，并且可以从列表或组中移除任何一个或多个元素。
100.还应理解，除非明确相反地指出，否则在本文描述或要求保护的任何方法中(包括一个以上的动作)，方法的动作顺序不必一定限于所述的方法的动作的叙述顺序，但本发明包含顺序如此限定的实施例。
101.还应理解的是，通常，在说明书或申请专利范围中的实施例被称为包括一个或多个特征的情况下，本发明还涵盖由这样的特征组成或基本上由这样的特征组成的实施例。
102.还应理解，可以在申请专利范围中明确地排除本发明的任何实施例，例如在先前技术内找到的任何实施例，而不管说明书中是否列举了特定的排除。
103.本文包括标题以供参考并帮助定位某些部分。标题无意限制在这些标题下的各部分中描述的实施例和概念的范围，并且那些实施例和概念可在整个公开中的其他部分中应用。
104.i.定义
105.虽然以下术语被本领域的普通技术人员很好地理解，但是提出以下定义以促进对当前公开的主题的解释。除非另有定义，否则本文使用的所有技术术语、符号以及其他技术和科学术语或术语旨在具有与所要求保护的主题所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。在某些情况下，为了清楚和/或易于参考，在此定义了具有通常理解的含义的术语，并且在本文中包括这样的定义不应该被解释为表示与本领域通常理解的实质性区别。
106.除非另外在特定情况下限制，否则贯穿本说明书使用的术语定义如下。如说明书和所附申请专利范围中所使用的，单数形式“一”，“一个”和“该”包括复数物件，除非上下文另外明确指出。除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语，首字母缩写词和缩写具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。除非另有说明，否则，化学和生物化学名称的缩写和符号根据iupac
‑
iub命名法。除非另有说明，否则所有数字范围均包括定义范围的值以及其间的所有整数值。
107.在免疫球蛋白超家族结构域的上下文中使用的术语“亲和力修饰的”表示具有改变的氨基酸序列(相对于相应的野生型亲本或未修饰的igsf结构域)的哺乳动物免疫球蛋白超家族(igsf)结构域，使得与亲本野生型或未修饰(即非亲和力修饰)的igsf对照结构域相比，其对其至少一个同源结合配偶体(或者是“反结构”)具有增加或降低的结合亲和力或亲合力。在此上下文中包括亲和力修饰的cd80igsf结构域。在一些实施例中，亲和力修饰的igsf结构域可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、
24、25、26、27、28、29、30或多个氨基酸差异，例如野生型或未修饰的igsf结构域中的氨基酸取代。结合亲和力或亲合力的增加或降低可以使用众所周知的结合测定法例如流式细胞术来确定。拉森等人的，《美国移植杂志》，第5卷：443
‑
453(2005)。也参见林斯利等人的，免疫，1：7930801(1994)。蛋白质与其同源结合配偶体的结合亲和力或亲合力的增加值比野生型igsf结构域对照的增加值大至少10％，在某些实施例中，比野生型igsf结构域对照的增加值大至少20％、30％、40％、50％、100％、200％、300％、500％、1000％、5000％或10000％。蛋白质与其至少一个同源结合配偶体的结合亲和力或亲合力的降低是不大于对照的90％但不小于野生型igsf结构域对照值的10％，并且在一些实施例中，不大于野生型igsf结构域对照值的80％、70％、60％、50％、40％、30％或20％，但不少于10％。通过氨基酸残基的取代、添加或缺失，亲和力修饰的蛋白质在一级氨基酸序列中发生改变。术语“亲和力修饰的igsf结构域”不应解释为对创建亲和力修饰的igsf结构域的任何特定起始成分或方法施加任何条件。因此，本发明的亲和力修饰的igsf结构域不限于野生型igf结构域，然后通过任何特定的亲和力修饰方法将其转化为亲和力修饰的igsf结构域。亲和力修饰的igsf结构域多肽可以从例如野生型哺乳动物igsf结构域序列信息开始生成，然后在计算机类比中建模以与其同源结合配偶体结合，最后重组或化学合成以产生亲和力修饰的igsf结构域成分。在一个替代实例中，可以通过对野生型igsf结构域进行定点诱变来产生亲和力修饰的igsf结构域。因此，亲和力修饰的igsf结构域表示产物，而不一定是通过任何给定方法产生的产物。可以采用多种技术，包括重组方法、化学合成或其组合。
108.如本文所用(例如，参考本发明的t细胞调节性多聚多肽与t细胞上的多肽(例如，t细胞受体)的结合)，“结合”是指彼此之间非共价相互作用。结合相互作用的特征通常是解离常数(kd)小于10
‑6m、小于10
‑7m、小于10
‑8m、小于10
‑9m、小于10
‑
10
m、小于10
‑
11
m、小于10
‑
12
m、小于10
‑
13
m、小于10
‑
14
m或小于10
‑
15
m。“亲和力”是指结合强度，增加的结合亲和力与较低的kd相关。
109.如本文所用，术语“结合亲和力”和“结合亲合力”分别是指蛋白质在特定结合条件下针对其反结构的特异性结合亲和力和特异性结合亲合力。在生化动力学中，亲合力是指单个非共价结合相互作用(例如cd80及其反结构ctla
‑
4，pd
‑
l1和/或cd28之间)的多个亲和力的累积强度。因此，亲合力不同于亲和力，亲和力描述了单个相互作用的强度。相对于未修饰的cd80(例如含有天然或野生型igsf结构域(例如igv或igc结构域)的未修饰cd80)的结合亲和力，确定含有亲和力修饰的cd80igsf结构域的变体cd80与其反结构的结合亲和力的增加或减弱。确定结合亲和力或亲合力的方法是本领域已知的。参见例如拉森等人，美国移植杂志，第5卷：443
‑
453(2005)。在一些实施例中，本发明的变体cd80(即，含有亲和力修饰的igsf结构域的cd80
‑
fc融合蛋白)与ctla
‑
4、pd
‑
l1和/或cd28的特异性结合亲和力通过流式细胞仪进行测量，在结合测定中，结合亲和力产生的平均荧光强度(mfi)值比野生型cd80对照大至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。
110.关于多肽，例如关于变体cd80的igsf结构域，术语“同源结合配偶体”(与“反结构”互换使用)是指在特定结合条件下，所参照的多肽特异性结合的至少一个分子(通常是天然哺乳动物蛋白)。在一些方面，含有亲和力修饰的igsf结构域的变体cd80特异性结合相应的天然或野生型cd80的反结构，但是亲和力增加或减弱。在特定结合条件下识别并特异性结合其同源受体的配体是该受体的反结构或同源结合配偶体的一个实例。“同源细胞表面结
合配偶体”是在哺乳动物细胞表面上表达的同源结合配偶体。“细胞表面分子种类”是免疫突触(is)的配体的同源结合配偶体，其在形成细胞性突触的细胞例如哺乳动物细胞上表达并由细胞表达。
111.如本文所用，“缀合物”，“缀合”或其语法变化形式是指通过本领域已知的任何连接或连结方法，将两种或更多种化合物连接或连结在一起，从而导致另一种化合物的形成。它也可以指通过将两种或更多种化合物结合或连结在一起而产生的化合物。例如，直接或间接连结至一个或多个化学部分或多肽的变体cd80多肽是示例性缀合物。此类缀合物包括融合蛋白，通过化学缀合物产生的那些以及通过任何其他方法产生的那些。
112.如本文所用，术语“保守氨基酸取代”是指其中氨基酸残基被带有相似化学性质(例如，电荷或疏水性)的具有侧链r基团的另一个氨基酸残基取代的氨基酸取代。具有类似化学性质的侧链的氨基酸基团的示例包括：1)脂族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；2)脂族羟基侧链：丝氨酸和苏氨酸；3)含酰胺的侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；4)芳族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；5)基本侧链：赖氨酸、精氨酸和组氨酸；6)酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酸；7)含硫侧链：半胱氨酸和蛋氨酸。保守氨基酸取代基是：缬氨酸
‑
亮氨酸
‑
异亮氨酸、苯丙氨酸
‑
酪氨酸、赖氨酸
‑
精氨酸、丙氨酸
‑
缬氨酸、谷氨酸
‑
天冬氨酸、和天冬酰胺
‑
谷氨酰胺。
113.如本文所用，术语“共刺激多肽”包括抗原呈递细胞(apc)(例如，树突细胞、b细胞等)上的多肽，该多肽与t细胞上的同源共刺激多肽特异性结合，从而提供一种讯号，该讯号除了通过例如tcr/cd3复合物与载有肽的主要组织相容性复合物(mhc)多肽结合提供的主要讯号外，还介导t细胞反应，包括但不限于增殖、活化、分化等。
114.如本文所用，术语“降低”或“减弱”或“抑制”是指降低统计学上显著的量。降低可以是至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。
115.术语“衍生物”或“衍生化的”是指通过将蛋白质直接或间接地共价连接至某一成分来修饰蛋白质，以改变诸如生物半衰期、生物利用度、免疫原性、溶解度、毒性、效价或功效等特征，同时保留或增强其治疗益处的修饰。本发明内容的免疫调节多肽的衍生物在本发明内容的范围内，并且可以通过例如糖基化、聚乙二醇化、脂质化或fc融合来制备。
116.如本文所用，结构域(通常是三个或多个，通常是5或7个或多个氨基酸，例如10至200个氨基酸残基的序列)是指分子的一部分，例如蛋白质或编码核酸，其在结构和/或功能上与分子的其他部分不同，并且是可识别的。例如，结构域包括多肽链的那些部分，其可以在由一个或多个结构基序组成的蛋白质内形成独立折叠的结构和/或通过功能活性例如结合活性而被识别。蛋白质可以具有一个或多个不同的结构域。例如，可以通过一级序列或结构与相关家族成员的同源性，例如与基序的同源性来鉴定、定义或区分结构域。在另一个实例中，结构域可以通过其功能来区分，例如与生物分子例如同源结合配偶体相互作用的能力。结构域独立地可以表现出生物学功能或活性，使得该结构域可以独立地或与另一分子融合来执行活性，例如结合。结构域可以是氨基酸的线性序列或氨基酸的非线性序列。许多多肽包含多个结构域。这样的结构域是已知的，并且可以被本领域技术人员识别。为了本文的示例，提供了定义，但是应该理解，通过名称识别特定结构域在本领域技术范围内。如果需要，可以使用适当的软件来标识结构域。
117.术语“有效量”或“治疗有效量”是指本发明的治疗成分的量和/或浓度，包括蛋白
质成分或细胞成分，其在单独(即作为单一疗法)或与其他治疗剂联合进行离体给药(通过与患者细胞接触)或体内给药(通过对患者给药)时，例如通过改善或消除症状和/或病因，可使疾病进展在统计学上显著降低。有效量可以是解除、减轻或缓解与疾病或病症有关的至少一种症状或生物学反应或效应，预防疾病或病症的进展或改善患者的身体机能的量。在细胞疗法的情况下，有效量是通过过继细胞疗法施用给患者的细胞的有效剂量或数量。在一些实施例中，患者是哺乳动物，例如非人类灵长类动物或人类患者。
118.如本文所用，在增加哺乳动物淋巴细胞的免疫活性的情况下，术语“增强”或“增加”是指增加淋巴细胞的一个或多个活性。活性增加可以是细胞存活率、细胞增殖、细胞因子产生或t细胞细胞毒性增加的一个或多个，例如统计学上显著的量。在一些实施例中，提到增加的免疫活性是指诱导t细胞中il
‑
2的产生。在一些实施例中，可以通过检测il
‑
2释放来评估免疫活性。在一些实施例中，提及增加的免疫活性是指例如以统计学上显著的量增加干扰素γ(ifn
‑
γ)的产生。在一些实施例中，可以在混合淋巴细胞反应(mlr)测定中评估免疫活性。进行mlr测定的方法是本领域已知的。王等人的癌症免疫研究2014年9月：2(9)：846
‑
56。评估淋巴细胞活性的其他方法是本领域已知的，包括本文所述的任何测定法。在一些实施例中，增强可以比非零对照值增加至少10％、20％、30％、40％、50％、75％、100％、200％、300％、400％或500％。
119.如本文所用，术语“工程细胞”是指已经通过人为干预如重组dna方法或病毒转导进行了遗传修饰的哺乳动物细胞。在一些实施例中，细胞是免疫细胞，例如淋巴细胞(例如t细胞、b细胞、nk细胞)或抗原呈递细胞(例如树突细胞)。该细胞可以是来自患者的原代细胞或可以是细胞系。在一些实施例中，本发明的工程细胞包含本发明的变体cd80，其被改造的以调节表达(变体cd80特异性结合的)cd28、pd
‑
l1或ctla
‑
4的t细胞的免疫活性。在一些实施例中，变体cd80是跨膜免疫调节蛋白(以下称为“tip”)，其包含细胞外结构域或其部分，该部分包含连结至跨膜结构域和任选地细胞内讯号传导结构域的igv和/或igc结构域。在某些情况下，tip被格式化为包含异源胞质讯号结构域或内结构域的嵌合受体。在一些实施例中，工程细胞能够表达和分泌如本文所述的免疫调节蛋白。在所提供的工程细胞中，还包含进一步包含工程t细胞受体(tcr)或嵌合抗原受体(car)的细胞。
120.如本文所用，术语“工程t细胞”是指t细胞，例如t辅助细胞，细胞毒性t细胞(或者，细胞毒性t淋巴细胞或ctl)，天然杀伤性t细胞，调节性t细胞，记忆t细胞或γδt细胞，它们已通过人为干预(例如重组dna方法或病毒转导方法)进行了遗传修饰。术语“工程t细胞受体”或“工程tcr”是指工程改造为以期望的亲和力与主要组织相容性复合物(mhc)/肽靶抗原特异性结合的t细胞受体(tcr)，其被选择、复制和/或随后引入t细胞群，通常用于过继免疫疗法。与改造的tcr相比，car被改造成以mhc独立的方式结合靶抗原。
121.如本文所用，术语“免疫学突触”或“免疫突触”通常是指适应性免疫反应的两个相互作用的免疫细胞之间的天然介面，包括例如抗原呈递细胞(apc)或靶细胞与效应子细胞(例如淋巴细胞，效应子t细胞，天然杀伤细胞等)之间的介面。apc和t细胞之间的免疫突触通常由t细胞抗原受体和主要的组织相容性复合物分子的相互作用来引发，例如，如布罗姆利等人的，免疫学年鉴中2001年；19：375
‑
96中所述；通过引用将其公开内容整体并入本文。
122.免疫球蛋白分子(也称为fc多肽)的fc(片段可结晶的)区域或结构域在很大程度上对应于免疫球蛋白重链的恒定区，并且负责各种功能，包括抗体的效应子功能。fc结构域
包含免疫球蛋白分子的铰链结构域的一部分或全部，加上ch2和ch3结构域。fc结构域可形成通过一个或多个二硫键连接的两条多肽链的二聚体。在一些实施例中，fc是变体fc，其表现出减少的(例如减少的大于30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多)活性以促进效应子功能。在一些实施例中，通过eu编号系统提及fc区中的氨基酸取代，除非参考已知编号的特定的seq id no：eu描述，并且根据最近更新的imgtscientificchart(国际immunogenetics信息系统网址为imgt.org/imgtscientificchart/numbering/hu_ighgnber.html以及kabat，e.a.等人在第五版美国卫生与公共服务部，nih出版号91
‑
3242(1991)的“具有免疫学意义的蛋白质序列”中报导的eu索引)。
123.免疫球蛋白fc融合物(“fc
‑
融合物”)，例如免疫调节性fc融合蛋白，是包含与免疫球蛋白的fc区可操作连结的一个或多个多肽(或一个或多个小分子)的分子。fc融合物可包含例如抗体的fc区(促进效应子功能和药代动力学)和变体cd80。免疫球蛋白fc区可以间接或直接连结至一个或多个变体cd80或小分子(融合配偶体)。各种连结是本领域已知的，并且可以任选地用于将fc连结至融合配偶体以产生fc融合物。可以将相同种类的fc融合物二聚以形成fc融合同二聚体，或使用不同的物种来形成fc融合异二聚体。在一些实施例中，fc是哺乳动物fc，例如鼠或人fc。
124.当将这样的dna引入细胞内时，该细胞已经被外源dna例如重组表达载体“遗传修饰”或“转化”或“转染”。外源dna的存在导致永久或暂时的遗传改变。转化dna可以整合或不整合(共价连接)到细胞基因组中。例如，在原核生物、酵母和哺乳动物细胞中，转化dna可以保持在附加型元素如质粒上。对于真核细胞，稳定转化的细胞是这样一种细胞，其中，转化dna已经整合到染色体中，从而其子细胞通过染色体复制遗传。
125.如本文所用，“异源的”是指分别在天然核酸或蛋白质中未发现的核苷酸或多肽。
126.如本文所用，“宿主细胞”表示体内或体外的真核细胞或来自培养为单细胞实体的多细胞生物的细胞(例如，细胞系)，该真核细胞可以或已经用作核酸的受体(例如，表达载体，其包含编码本发明内容的多聚体多肽的核苷酸序列)并包括已被核酸遗传修饰的原始细胞的后代。应当理解，由于自然的、偶然的或故意的突变，单个细胞的后代在形态或基因组或总dna补体上不一定与原始亲本完全相同。术语“宿主细胞”是指可用于表达由重组表达载体编码的蛋白质的细胞。宿主细胞可以是原核生物，例如大肠杆菌，也可以是真核生物，例如单细胞真核生物(例如酵母或其他真菌)，植物细胞(例如烟草或西红柿植物细胞)，动物细胞(例如人细胞、猴子细胞、仓鼠细胞、大鼠细胞、小鼠细胞或昆虫细胞)或杂交瘤。宿主细胞的示例包括中国仓鼠卵巢(cho)细胞或它们的衍生物，例如veggiee cho和在无血清培养基或dhfr缺乏的cho菌株dx
‑
b11中生长的相关细胞系。在一些实施例中，宿主细胞是哺乳动物细胞(例如人细胞、猴细胞、仓鼠细胞、大鼠细胞、小鼠细胞或昆虫细胞)。
127.如本文所用，术语“免疫球蛋白”(缩写为“ig”)是指哺乳动物免疫球蛋白蛋白，其包括五种人类类别的抗体中的任何一种：iga(包括亚类iga1和iga2)、igd、ige、igg(包括亚类igg1、igg2、igg3和igg4)和igm。该术语还包括小于全长的免疫球蛋白，无论是全部或部分合成的(例如重组或化学合成)还是天然产生的，例如抗原结合片段(fab)、含有vh和vl的可变片段(fv)、包含一条链中连结在一起的vh和vl的单链可变片段(scfv)，以及其他抗体v区片段，例如fab'、f(ab)2、f(ab')2、dsfv双抗体、fc和fd多肽片段。同双特异性抗体和异双特异性双特异性抗体包括在该术语的含义内。
128.如本文所用，术语“免疫球蛋白超家族”或“igsf”是指与细胞的识别、结合或黏附过程有关的细胞表面和可溶性蛋白的组。根据与免疫球蛋白(即抗体)共有的结构特征，分子被归类为该超家族的成员；它们都具有称为免疫球蛋白结构域或折叠的结构域。igsf的成员包括免疫系统的细胞表面抗原受体、共受体和共刺激分子，涉及抗原向淋巴细胞呈递的分子、细胞黏附分子、某些细胞因子受体和细胞内肌肉蛋白。它们通常与免疫系统中的角色有关。免疫突触中的蛋白质通常是igsf的成员。igsf也可以基于共享的属性(例如功能)归类为“亚家族”。此类亚家族通常由4至30个igsf成员组成。
129.如本文所用，术语“igsf结构域”或“免疫球蛋白结构域”或“ig结构域”是指igsf蛋白的结构域。ig结构域以免疫球蛋白分子命名。它们包含约70
‑
110个氨基酸，并根据其大小和功能进行分类。ig结构域具有特征性的ig折叠，具有由两片反平行的β链形成的三明治状结构。三明治内侧的疏水氨基酸与b和f链中半胱氨酸残基之间形成的高度保守的二硫键之间的相互作用稳定了ig折叠。ig结构域的一端具有称为互补决定区的部分，这对于抗体对其配体的特异性很重要。类似于ig的结构域可以分类为(类)：igv、igc1、igc2或igi。大多数ig结构域是可变的(igv)或恒定的(igc)。具有9个β链的igv结构域通常比具有7个β链的igc结构域更长。igsf的一些成员的ig结构域在氨基酸序列上类似于igv结构域，但是大小与igc结构域相似。这些称为igc2结构域，而标准igc结构域称为igc1结构域。t细胞受体(tcr)链在细胞外部分包含两个ig结构域；在n末端有一个igv结构域，在细胞膜附近有一个igc1结构域。cd80包含两个ig结构域：igv和igc。
130.如本文所用，术语“igsf种类”是指具有相同或基本相同的一级氨基酸序列的igsf成员蛋白的集合。每个哺乳动物免疫球蛋白超家族(igsf)成员都定义了属于该igsf成员的所有igsf种类的唯一身份。因此，每个igsf家族成员与其他igsf家族成员都是唯一的，因此，特定igsf家族成员的每个种类与另一个igsf家族成员的种类相比是唯一的。然而，由于转译后修饰的差异，例如糖基化、磷酸化、泛素化、亚硝基化、甲基化、乙酰化和脂质化，同一种igsf分子之间可能发生变异。另外，由于基因多态性，单个igsf种类内的较小序列差异构成了单个igsf物种内的另一种变异形式，例如由于蛋白水解切割，野生型截短形式的igsf种类也是如此。“细胞表面igsf种类”是在细胞(通常是哺乳动物细胞)的表面上表达的igsf种类。
[0131]“免疫调节多肽”是调节免疫活性的多肽。“调节免疫反应”或“免疫反应的调节”是指免疫活性增加或降低。免疫调节多肽可以是单条多肽链或至少两条通过例如链间二硫键共价键合的多肽链的多聚体(二聚体或更高阶的多聚体)。因此，单体，二聚体和更高阶的多聚体多肽在所定义术语的范围内。多聚体多肽可以是(相同多肽链的)同源多聚体或(不同多肽链的)异源多聚体。本发明的免疫调节多肽包含变体cd80。
[0132]
术语“个体”、“受试者”、“宿主”和“患者”在本文可互换使用，并且是指需要对其进行诊断、诊治或治疗的任何哺乳动物受试者。哺乳动物包括例如人类、非人类灵长类动物、啮齿动物(例如大鼠、小鼠)、兔形动物(例如兔子)、有蹄类动物(例如牛，绵羊、猪、马、山羊等)等。
[0133]
如本文所用，术语“淋巴细胞”是指哺乳动物免疫系统中白细胞的三种亚型中的任一种。它们包括天然杀伤细胞(nk细胞)(在细胞介导的细胞毒性先天免疫中起作用)，t细胞(用于细胞介导的细胞毒性适应性免疫)和b细胞(用于体液，抗体驱动的适应性免疫)。t细
胞包括：t辅助细胞、细胞毒性t细胞、自然杀伤性t细胞、记忆性t细胞、调节性t细胞或γδt细胞。先天性淋巴细胞(ilc)也包括在淋巴细胞的定义内。
[0134]
术语“哺乳动物”或“患者”具体包括对以下各项中的至少一种的提及：人、黑猩猩、恒河猴、食蟹猴、狗、猫、小鼠或大鼠。本发明的t细胞调节性多聚体多肽的“调节结构域”或“免疫调节结构域”包含共刺激多肽。
[0135]
如本文所用，在免疫反应例如哺乳动物免疫反应的上下文中，术语“调节”是指由于施用包含本发明的变体cd80的免疫调节多肽的结果，或者施用工程化细胞表达免疫调节蛋白(例如本发明的变体cd80跨膜免疫调节蛋白)的结果，已发生的或潜在的免疫反应的任何改变，例如增加或降低。因此，它是指与不施用包含变体cd80的免疫调节蛋白或表达这种免疫调节多肽的细胞而发生或存在的免疫反应相比，免疫反应的改变，例如增加或降低。这种调节包括免疫细胞的免疫活性的程度或范围的任何诱导、活化、抑制或改变。免疫细胞包括b细胞、t细胞、nk(自然杀伤细胞)细胞、nkt细胞、专业抗原呈递细胞(apc)和非专业抗原呈递细胞，以及炎症细胞(嗜中性粒细胞、巨噬细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞)。调节包括赋予现有免疫反应、正在发展的免疫反应、潜在的免疫反应或诱导、调节、影响或回应免疫反应的能力的任何变化。调节包括作为免疫反应的一部分的免疫细胞中基因、蛋白质和/或其他分子的表达和/或功能的任何改变。免疫反应的调节或免疫活性的调节包括例如以下：免疫细胞的消除，缺失或隔离；诱导或生成可调节其他细胞(例如自体反应性淋巴细胞、抗原呈递细胞或炎症细胞)功能的免疫细胞；在免疫细胞中诱导无反应状态(即无反应)；增强或抑制免疫细胞的活性或功能，包括但不限于改变由这些细胞表达的蛋白质的模式。示例包括某些类别的分子(例如细胞因子，趋化因子，生长因子，转录因子，激酶，共刺激分子或其他细胞表面受体)的产生和/或分泌改变，或这些调节事件的任意组合。调节可例如通过改变变体cd80与反结构ctla
‑
4、pd
‑
l1或cd28的结合亲和力和/或亲合力来评估。例如，可以通过相对于野生型cd80对照通过il
‑
2表达的改变或在t细胞中的释放来评估调节。例如，可以通过在主要t细胞测定中相对于野生型cd80对照的ifn
‑
γ(干扰素γ)表达的改变来评估调节(参见zhao和ji，实验细胞研究.2016jan.1；340(1)132
‑
138)。例如，相对于用野生型cd80跨膜蛋白工程改造的细胞，可以通过工程改造的细胞的免疫活性的改变，例如工程改造细胞的细胞毒性活性的改变或工程改造细胞的细胞因子分泌的改变来评估调节。
[0136]
本文可互换使用的术语“多核苷酸”和“核酸”是指任何长度的核苷酸的聚合形式，包括核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。因此，该术语包括但不限于单链、双链或多链dna或rna，基因组dna、cdna、dna
‑
rna杂种，或包含嘌呤和嘧啶碱基的聚合物或其他天然、化学或生物化学修饰的，非天然或衍生的核苷酸碱基。除非特别限制，否则该术语包括含有已知的天然核苷酸类似物的核酸，它们具有类似的结合特性，并且以类似于天然核苷酸的方式代谢。除非另有说明，否则特定核酸序列还隐含地涵盖其保守修饰的变体(例如简并密码子取代)和互补核苷酸序列以及明确指出的序列(“参考序列”)。具体地，简并的密码子取代可以通过产生序列来实现，其中一个或多个选择的(或全部)密码子的第三位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代。术语核酸或多核苷酸涵盖由基因编码的cdna或mrna。
[0137]
术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，并且是指任何长度的氨基酸的聚合形式，其可以包括化学或生物化学修饰的编码和非编码氨基酸或衍生氨基酸，以及
具有修饰的肽主链的多肽。该术语包括多肽的转译后修饰，例如糖基化、乙酰化、唾液酸化、磷酸化等。这些术语还包括其中一个或多个氨基酸类似物或非典型或非天然氨基酸可被合成，或使用已知的蛋白质工程技术重组表达的分子。另外，蛋白质可以被衍生化。
[0138]
多核苷酸或多肽与另一多核苷酸或多肽具有一定百分比的“序列同一性”，这意味着比对时，比较两个序列时碱基或氨基酸的百分比相同且相对位置相同。序列同一性可以以多种不同方式确定。为了确定序列同一性，可以使用各种方便的方法和计算机程序(例如blast，t
‑
coffee，muscle，mafft等)对序列进行比对，这些程序可以在包括ncbi.nlm.nili.gov/blast，ebi.ac.uk/tools/msa/tcoffee/，ebi.ac.uk/tools/msa/muscle/，mafft.cbrc.jp/alignment/software/在内的万维网上找到，参见，例如，阿尔舒尔等人的(1990)，j.mol.biol.215：403
‑
10。
[0139]
如本文所用，“重组”是指特定的核酸(dna或rna)是通过复制、限制、聚合酶链反应(pcr)和/或连接等步骤的各种组合的产物，从而导致构建体具有结构编码或不同于天然系统中发现的内源核酸的结构编码或非编码序列。可以从cdna片段或一系列合成的寡核苷酸组装编码多肽的dna序列，以提供能够从细胞或无细胞转录和转译系统中包含的重组转录单位表达的合成核酸。例如，“重组核酸”是通过例如在复制、亲和力修饰、dna改组或其他众所周知的分子生物学程序之间重组核酸而制成的。“重组dna分子”由通过这种分子生物学技术连接在一起的dna片段组成。如本文所用，术语“重组蛋白”或“重组多肽”是指使用重组dna分子表达的蛋白质分子。“重组宿主细胞”是包含和/或表达重组核酸的细胞，或者是通过遗传工程改变的细胞，例如通过将编码重组蛋白例如本文提供的跨膜免疫调节蛋白的核酸分子引入细胞中来改变。例如，通过将合适的异源核酸(例如真核生物宿主细胞的外源核酸)或重组核酸(在真核细胞中通常找不到这种细胞)引入到合适的真核宿主细胞中来对遗传修饰的真核宿主细胞进行遗传修饰。真核生物中的转录控制讯号包含“启动子”和“增强子”元件。启动子和增强子由短序列的dna序列组成，这些序列与参与转录的细胞蛋白发生特异性相互作用。已经从多种真核来源分离了启动子和增强子元件，包括酵母、昆虫、哺乳动物细胞和病毒中的基因(在原核生物中也发现了类似的控制元件，即启动子)。特定启动子和增强子的选择取决于表达感兴趣蛋白质的细胞类型。如本文所用，术语“可操作组合”、“可操作顺序”和“可操作连结”是指以这样的方式或方向的核酸序列的连接，使得产生能够指导给定基因的转录和/或所需蛋白质分子的合成的核酸分子。
[0140]
术语“重组表达载体”或“dna构建体”在本文可互换使用，是指包含载体和一个插入物的dna分子。重组表达载体通常是出于表达和/或繁殖插入物和/或表达盒的目的，或用于构建其他重组核苷酸序列的目的而产生的。重组表达载体是指dna分子，其包含所需的编码序列和在特定的宿主细胞中表达可操作连接的编码序列所需的合适的核酸序列。在原核生物中表达所必需的核酸序列包括启动子、任选的操纵子序列、核糖体结合位点和可能的其他序列。已知真核细胞利用启动子、增强子以及终止和聚腺苷酸化讯号。分泌讯号肽序列也可以任选地由重组表达载体编码，可操作地连接至重组蛋白，例如连接至重组融合蛋白的编码序列，使得重组的宿主细胞可以分泌表达的融合蛋白，并能够在必要时更容易从细胞中分离出融合蛋白。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体，以及掺入已引入其的宿主细胞基因组中的载体。在载体中是病毒载体，例如慢病毒载体。
[0141]“t细胞”包括表达cd3的所有类型的免疫细胞，包括t辅助细胞(cd4 细胞)、细胞毒
性t细胞(cd8 细胞)、t调节细胞(treg)和nk
‑
t细胞。
[0142]
术语“诊治”，“治疗”等在本文中通常用来表示获得期望的药理和/或生理作用。就完全或部分预防疾病或其症状而言，该效果可以是预防性的，和/或就部分或完全治愈疾病和/或归因于该疾病的不良影响而言，该效果可以是治疗性的。如本文所用，“治疗”涵盖哺乳动物中疾病或症状的任何治疗，并且包括：(a)防止可能易患该疾病或症状但尚未被诊断为患有该疾病或症状的受试者中发生该疾病或症状；(b)抑制疾病或症状，即阻止其发展；或(c)减轻疾病，即引起疾病消退。可以在疾病或损伤发作之前，期间或之后施用治疗剂。特别令人感兴趣的是进行中的疾病的治疗，其中该治疗稳定或减轻了患者的不良临床症状。期望在受影响的组织完全丧失功能之前进行这种治疗。理想地，可以在疾病的症状阶段期间以及在某些情况下在疾病的症状阶段之后施用受试者疗法。“治疗”，“诊治”或“疗法”还表示在急性或慢性疾病或病症中症状的严重程度降低或复发率降低，例如在自体免疫疾病的复发或缓解过程中，或者在自体免疫疾病的炎症方面，炎症降低。如本文在癌症的上下文中所使用的，术语“诊治”或“抑制”，“阻止”或“压制”是指以下至少一项：根据标准判断(例如但不限于实体瘤反应评估标准(recist))，肿瘤的生长速率在统计学上的显著降低、肿瘤的生长停止或肿瘤的大小、质量、代谢活性或肿瘤体积的降低、或者无进展生存期(pfs)或总体生存期(os)的统计显著增加。在本发明的上下文中使用的疾病或病症的“预防”，“防治”或“防止”是指单独或与另一种化合物组合给予本发明的免疫调节多肽或工程细胞，以防止疾病或病症的发生或发作，或防止疾病或病症的某些或全部症状的发生或发作，或降低疾病或病症发作的可能性。
[0143]
如关于变体cd80使用的术语“变体”(也为“突变”，“突变的”或“修饰的”)是指通过人为干预产生的cd80，例如哺乳动物(例如人或鼠)cd80。变体cd80是相对于未修饰或野生型cd80具有改变的氨基酸序列的多肽。变体cd80是一种多肽，其与野生型cd80同工型序列的区别在于一个或多个氨基酸取代、缺失、添加或其组合。为了本文的目的，变体cd80包含至少一个亲和力修饰的结构域，由此一个或多个氨基酸差异出现在igsf结构域(例如igc结构域和/或igv结构域)中。变体cd80可以包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多的氨基酸差异，例如氨基酸取代。变体cd80多肽通常与野生型或未修饰的cd80细胞外结构域(seq id no：1)具有至少50％、60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性。非天然存在的氨基酸以及天然存在的氨基酸都包括在允许的取代或添加的范围内。变体cd80不限于任何特定的制备方法，并且包括例如从头化学合成、从头重组dna技术或其组合。本发明的变体cd80特异性结合哺乳动物物种的至少一个或多个：cd28、pd
‑
l1或ctla
‑
4。在一些实施例中，与野生型cd80蛋白相比，改变的氨基酸序列导致与cd28、pd
‑
l1或ctla
‑
4的结合亲和力或亲合力改变(即增加或降低)。结合亲和力或亲合力的增加或降低可以使用众所周知的结合测定法例如流式细胞术来确定。拉森等人的美国移植杂志，第5卷：443
‑
453(2005)。也参见林斯利等人的，免疫，1：7930801(1994)。与野生型cd80对照值相比，变体cd80对cd28、pd
‑
l1或ctla
‑
4的亲和力或亲合力增加的值至少大5％，在某些实施例中，比野生型cd80对照值至少大10％、15％、20％、30％、40％、50％、100％。cd80对cd28、pd
‑
l1或ctla
‑
4的亲和力或亲合力的降低值不超过野生型cd80对照值的95％，在某些实施例中不大于野生型cd80对照值的80％、70％、60％、50％、40％、30％、
20％、10％、5％或没有可检测的结合亲和力或亲合力。通过取代、添加或缺失氨基酸残基，在一级氨基酸序列中改变了变体cd80。在变体cd80的上下文中，术语“变体”不解释为对产生变体cd80的任何特定起始成分或方法施加任何条件。变体cd80可以例如从野生型哺乳动物cd80序列信息开始生成，然后在计算机上建模以与cd28、pd
‑
l1或ctla
‑
4结合，最后重组或化学合成以产生本发明的变体cd80。在替代实施例中，变体cd80可通过野生型cd80的定点诱变来产生。因此，变体cd80表示成分，而不一定表示通过任何给定方法生产的产物。可以采用多种技术，包括重组方法、化学合成或其组合。
[0144]
在进一步描述本发明之前，应理解，本发明不限于所描述的特定实施例，因为这样当然可以变化。还应理解，本文中使用的术语仅出于描述特定实施例的目的，而无意于进行限制，因为本发明的范围将仅由所附申请专利范围限制。
[0145]
在提供数值范围的情况下，应理解的是除非上下文另外明确指出，否则在该范围的上限和下限与该规定范围内的任何其他所述值或中间值之间的每个中间值均达到下限的十分之一。这些较小范围的上限和下限可以独立地包含在较小范围中，并且也应包括在本发明内容之内，但受制于所述范围中任何明确排除的限制。在所述范围包括一个或两个极限的情况下，除了那些包括的限制中的一个或两个之外的范围也包括在本发明中。
[0146]
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。尽管类似于或等同于本文描述的那些方法和材料的任何方法和材料也可以用于本发明的实践或测试中，但是现在描述较佳的方法和材料。本文提及的所有出版物均通过引用并入本文，以公开和描述与引用出版物相关的方法和/或材料。
[0147]
必须注意的是，如本文和所附申请权利要求范围中所使用的，单数形式的“一”，“一个”和“该”包括复数物件，除非上下文另外明确指出。因此，例如，提及“多聚体多肽”包括多个这样的多聚体多肽，并且提及“调节结构域”包括提及本领域技术人员已知的一个或多个调节结构域及其等同物，等。还应注意，本技术权利要求范围可以被草拟为排除任何可选要素。因此，本声明旨在作为在陈述权利要求要素或使用“否定”限制时使用“仅”、“仅”等专有术语的先行依据。
[0148]
应当理解，为清楚起见在单独的实施例的上下文中描述的本发明的某些特征也可以在单个实施例中组合提供。相反，为简洁起见，在单个实施例的上下文中描述的本发明的各种特征也可以单独地或以任何合适的子组合来提供。与本发明有关的实施例的所有组合都被本发明明确地涵盖，并且在本文中公开，就好像每个和每个组合都被单独地并且明确地公开一样。另外，本发明还明确地涵盖了各种实施例及其元素的所有子组合，并且在本文中进行公开，就像每个和每个这样的子组合在本文中被单独地并且明确地公开一样。
[0149]
本文所讨论的出版物仅出于其在本技术的提交日期之前的公开而提供。本文中的任何内容均不应解释为承认本发明由于先前的公开而无权早于该出版物。此外，提供的发布日期可能与实际发布日期有所不同，实际发布日期可能需要独立确认。
[0150]
ii.变体cd80多肽
[0151]
本发明提供了变体cd80多肽，其对一个或多个cd80同源结合配偶体表现出改变的(增加的或降低的)结合活性或亲和力。在一些实施例中，cd80同源结合配偶体是cd28、pd
‑
l1或ctla
‑
4。在一些实施例中，相对于野生型或未修饰的cd80多肽或包含免疫球蛋白超家
族(igsf)结构域或其特异性结合片段的野生型或未修饰的cd80的一部分，变体cd80多肽在免疫球蛋白超家族(igsf)结构域(igd)中包含一个或多个氨基酸修饰，例如一个或多个取代(或者“突变”或“替换”)、缺失或添加。因此，提供的变体cd80多肽是或包含变体igd(在下文中称为“vigd”)，其中一个或多个氨基酸修饰(例如取代)在igd中。
[0152]
在一些实施例中，igd包含igc结构域或igv结构域或igc结构域或igv结构域的特异性结合片段，或其组合。在一些实施例中，igd可以仅是igc，igc和igv的组合，包括整个细胞外结构域(ecd)，或cd80的ig结构域的任何组合。表1提供了对应于cd80的igc结构域的示例性残基。
[0153]
cd80的igc结构域不与cd80的结合配偶体直接相互作用。本发明人采用基于结构的合理设计来选择cd80的igc结构域内的位置以进行诱变。这些选择的位置位于igv和igc之间的结构域间附近，并且位于柔性铰链区域附近。该区域的突变可能会迫使igc的三级结构发生变化，从而影响cd80二聚体的结构。
[0154]
本发明人选择突变在结合后不与靶蛋白直接相互作用的igc结构域中的氨基酸残基。他们合理地设计了igc结构域中的突变，这些突变将改变整个突变蛋白的构象和/或动力学，然后，通过与靶蛋白相互作用来调节其对靶蛋白的结合亲和力和/或其生物学功能，例如，调节突变蛋白对cd28活化的功能。通过这种方法，本发明人实现了选择性地改变cd80蛋白与所选靶蛋白的结合亲和力或功能，同时使与另一种目标蛋白质之一或其他两种目标蛋白质的相互作用受到的影响最小。例如，通过合理的设计，本发明者已获得对cd28活化具有一系列活性，同时保持对ctla
‑
4的类似结合亲和力的突变。例如，与野生型cd80相比，a165f突变的cd80对cd28活性非常低，但其对ctla
‑
4(通过facs进行的结合测定，ec
50
＝0.046um vs ec
50
＝0.014um野生型cd80)和pd
‑
l1(elisa测定，ec
50
＝0.38um vs ec
50
＝0.98um野生型cd80)的结合亲和力相似；与野生型cd80相比，s131i突变的cd80对ctla
‑
4(通过facs的结合测定，ec
50
＝0.028um vs ec
50
＝0.014um野生型cd80)具有类似的cd28活性(il
‑
2释放测定，ec
50
＝1.13um vs ec
50
＝0.94um野生型cd80)和相似的对ctla
‑
4(通过facs的结合测定，ec
50
＝0.028um vs ec
50
＝0.014um野生型cd80)的结合亲和力，其对pd
‑
l1的结合亲和力比野生型cd80高四倍(elisa测定，ec
50
＝0.24um vs ec
50
＝0.98um野生型cd80)。
[0155]
在一些实施方案中，相对于未修饰的cd80序列的序列，在一个或多个igsf结构域中修饰了变体。在一些实施例中，未修饰的cd80序列是野生型cd80。在一些实施例中，未修饰的或野生型cd80具有天然cd80或其直系同源物的序列。在一些实施例中，未修饰的cd80为或包含cd80细胞外结构域(ecd)或其包含的一个或多个igsf结构域的部分。在一些实施例中，未修饰的或野生型cd80多肽的细胞外结构域包含igc结构域和/或igv结构域。然而，变体cd80多肽不必同时包含igc结构域和igv结构域。在一些实施例中，变体cd80多肽包含或基本上由igc结构域或其特异性结合片段组成。在一些实施例中，变体cd80多肽包含或基本上由igv结构域或其特异性结合片段组成。在一些实施例中，变体cd80是可溶的并且缺乏跨膜结构域。在一些实施例中，变体cd80还包含跨膜结构域，并且在某些情况下还包含细胞质结构域。
[0156]
在一些实施例中，野生型或未修饰的cd80序列是哺乳动物cd80序列。在一些实施例中，野生型或未修饰的cd80序列可以是哺乳动物cd80，其包括但不限于人、小鼠、食蟹猴或大鼠。在一些实施例中，野生型或未修饰的cd80序列是人的。
[0157]
在一些实施例中，变体cd80多肽包含与seq id no：1具有至少80％相同氨基酸序列的氨基酸序列，其中，与seq id no：1相比，变体cd80多肽包含一个或多个氨基酸取代修饰，其中，一个或多个取代修饰位于seq id no：1的位置131、139、155、165或166处。在一些实施方案中，氨基酸取代修饰是除seq id no：1中的相应野生型氨基酸之外的20个氨基酸中的任何一个。
[0158]
变体cd80多肽通常与相应的野生型或未修饰的cd80、其成熟序列或其包含seq id no：1所述细胞外结构域或其igsf结构域的部分具有至少50％、60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列一致性。在一些实施例中，变体cd80多肽与包含seq id no：1所示序列的相应野生型或未修饰的cd80表现出至少50％、60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性。
[0159]
在一些实施例中，igc结构域的特异性结合片段含有与相应的野生型或未修饰的igc结构域具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、或99.9％序列同一性的氨基酸序列。
[0160]
在一些实施例中，igv结构域的特异性结合片段含有与相应的野生型或未修饰的igv结构域具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、或99.9％序列同一性的氨基酸序列。
[0161]
在任何这样的实施例中，变体cd80多肽的一个或多个氨基酸修饰(例如取代)可位于任何一个或多个cd80多肽结构域中。例如，在一些实施例中，一个或多个氨基酸取代位于变体cd80多肽的细胞外结构域中。在一些实施例中，一个或多个氨基酸取代位于igc结构域或igc结构域的特异性结合片段中。在一些实施例中，一个或多个氨基酸修饰(例如取代)位于igv结构域或igv结构域的特异性结合片段中。
[0162]
在其他实施例中，变体cd80多肽还包含能够二聚的第二多肽。在一些实施例中，第二多肽是免疫球蛋白fc结构域。在一些实施例中，免疫球蛋白fc结构域是人igg1 fc结构域、人igg2 fc结构域、人igg3 fc结构域或人igg4 fc结构域。在一些实施例中，免疫球蛋白fc结构域是小鼠igg1 fc结构域、小鼠igg2a fc结构域、小鼠igg2b fc结构域或小鼠igg3 fc结构域。在一些实施例中，变体cd80多肽进一步包含治疗活性部分。
[0163]
在一些实施例中，本文提供了编码本发明的变体cd80多肽的多核苷酸。在一些实施例中，多核苷酸是合成核酸。在一些实施例中，多核苷酸是cdna。在一些实施例中，多核苷酸可操作地连接至转录控制元件。在一些实施例中，转录控制元件是在真核细胞中起作用的启动子。
[0164]
在其他实施例中，本文提供了包含本发明的多核苷酸的载体。在一些实施例中，载体是表达载体。在一些实施例中，载体是哺乳动物载体或病毒载体。
[0165]
通常，多肽的各种属性中的每一个在下面分别公开(例如，可溶性、可分泌和可与膜结合的多肽、cd80对cd28、pd
‑
l1和ctla
‑
4的亲和力，每个多肽链的变异数，连接的多肽链的数目，每个变体cd80的氨基酸改变的数目和性质等)。然而，如本领域技术人员将清楚的是，任何特定的多肽可包含这些独立属性的组合。应当理解，提及氨基酸，包括表示为用于
描述igsf结构域的结构域组织的seq id no所示的特定序列，是出于说明性目的，并不意味着限制所提供实施例的范围。应当理解，多肽及其结构域的描述是基于同源性分析和与相似分子的比对从理论上汇出的。因此，确切的基因座可以变化，并且每种蛋白质不一定相同。因此，特定的igsf结构域，例如特定的igc结构域或igv结构域，可以是更长或更短的几个氨基酸(例如一个、两个、三个或四个)。
[0166]
此外，经常在如上所述的定义的术语的含义内提供如下所述的本发明的各种实施例。因此，当将定义的术语用于讨论本文描述的各个方面和属性时，以特定定义描述的实施例应解释为通过引用并入。因此，标题，各个方面和实施例的呈现顺序以及每个独立属性的单独公开并不意味着对本发明范围的限制。
[0167]
示范性修饰
[0168]
在一些实施例中，在seq id no：1的位置131处的氨基酸取代修饰是s131a、s131v、s131i、s131f、s131r、s131e、s131d或s131q。在一些实施例中，在seq id no：1的位置139处的氨基酸取代修饰是l139v。在一些实施例中，在seq id no：1的位置155处的氨基酸取代修饰是v155a、v155i或v155t。在一些实施例中，在seq id no：1的位置165处的氨基酸取代修饰是a165s、a165v、a165i、a165f、a165r、a165e、a165d或a165q。在一些实施例中，在seq id no：1的位置166处的氨基酸取代修饰是v166a、v166l或v166t。
[0169]
在一些实施例中，与seq id no：1相比，变体cd80多肽包含两个或多个氨基酸取代修饰，且其中，两个或多个取代修饰位于seq id no：1的位置130、131、139、155、156、165或166处。在一些实施例中，变体cd80多肽包含两个氨基酸取代修饰v166l和l139v。在一些实施例中，变体cd80多肽包含两个氨基酸取代修饰s156a和v155a。在一些实施例中，变体cd80多肽包含两个氨基酸取代修饰s156a和v155i。在一些实施例中，变体cd80多肽包含两个氨基酸取代修饰s156a和v155t。在一些实施例中，变体cd80多肽包含两个氨基酸取代修饰s156a和t130a。在一些实施例中，变体cd80多肽包含两个氨基酸取代修饰s156a和v166a。在一些实施例中，变体cd80多肽包含两个氨基酸取代修饰s156i和a165s。在一些实施例中，变体cd80多肽包含两个氨基酸取代修饰s156i和s131a。在一些实施例中，变体cd80多肽包含两个氨基酸取代修饰a165s和s131a。
[0170]
在一些实施例中，与seq id no：1相比，变体cd80多肽包含三个或多个氨基酸取代修饰，并且其中，三个或多个取代修饰位于seq id no：1的位置131、139、155、156、165或166处。在一些实施例中，变体cd80多肽包含三个氨基酸取代修饰s156a、v166l和l139v。在一些实施例中，变体cd80多肽包含三个氨基酸取代修饰s156i、a165s和s131a。
[0171]
在一些实施例中，与seq id no：1相比，变体cd80多肽包含四个或多个氨基酸取代修饰，并且其中，四个或多个取代修饰位于seq id no：1的位置131、139、155、156、165或166处。在一些实施例中，与seq id no：1相比，变体cd80多肽包含五个或多个氨基酸取代修饰，并且其中，五个或多个取代修饰位于seq id no：1的位置131、139、155、156、165或166处。
[0172]
在一些实施例中，与seq id no：1相比，变体cd80多肽对ctla
‑
4具有增加或降低的结合亲和力。在一些实施例中，与seq id no：1相比，变体cd80多肽对cd28具有增加或降低的结合亲和力。在一些实施例中，与seq id no：1相比，变体cd80多肽对pd
‑
l1的结合亲和力增加或降低。
[0173]
在一些实施例中，本发明的变体cd80多肽被唾液酸化。
[0174]
本文提供了在野生型或未修饰的cd80多肽中包含的igsf结构域中包含至少一个亲和力修饰的igsf结构域(例如，igc或igv)或其特异性结合片段的变体cd80多肽，使得与野生型或未修饰的cd80多肽相比，变体cd80多肽对一个或多个配体cd28、pd
‑
l1或ctla
‑
4表现出改变的(增加的或降低的)结合活性或亲和力。在一些实施例中，如通过例如固相elisa免疫测定、流式细胞术或biacore测定所确定的，变体cd80多肽对cd28、pd
‑
l1和/或ctla
‑
4具有不同于野生型或未修饰的cd80多肽控制序列对上述配体的结合亲和力。在一些实施例中，变体cd80多肽对cd28、pd
‑
l1和/或ctla
‑
4具有增加的结合亲和力。在一些实施例中，相对于野生型或未修饰的cd80多肽，变体cd80多肽对cd28、pd
‑
l1和/或ctla
‑
4具有降低的结合亲和力。cd28、pd
‑
l1和/或ctla
‑
4可以是哺乳动物蛋白，例如人蛋白或鼠蛋白。
[0175]
每个同源结合配偶体的结合亲和力通常是独立的；也就是说，在一些实施例中，相对于野生型或未修饰的cd80多肽，变体cd80多肽对cd28、pd
‑
l1和/或ctla
‑
4中的一个、两个或三个具有增加的结合亲和力，并且对cd28、pd
‑
l1和/或ctla
‑
4中的一个、两个或三个具有降低的结合亲和力。
[0176]
在一些实施例中，相对于野生型或未修饰的cd80多肽，变体cd80多肽对cd28具有增加的结合亲和力。在一些实施例中，相对于野生型或未修饰的cd80多肽，变体cd80多肽对pd
‑
l1具有增加的结合亲和力。在一些实施例中，相对于野生型或未修饰的cd80多肽，变体cd80多肽对ctla
‑
4具有增加的结合亲和力。在一些实施例中，相对于野生型或未修饰的cd80多肽，变体cd80多肽对cd28具有降低的结合亲和力。在一些实施例中，相对于野生型或未修饰的cd80多肽，变体cd80多肽对pd
‑
l1具有降低的结合亲和力。在一些实施例中，相对于野生型或未修饰的cd80多肽，变体cd80多肽对ctla
‑
4具有降低的结合亲和力。
[0177]
在一些实施例中，相对于野生型或未修饰的cd80多肽，变体cd80多肽对cd28和pd
‑
l1具有增加的结合亲和力。在一些实施例中，相对于野生型或未修饰的cd80多肽，变体cd80多肽对cd28具有增加的结合亲和力而对pd
‑
l1具有降低的结合亲和力。在一些实施例中，相对于野生型或未修饰的cd80多肽，变体cd80多肽对cd28和pd
‑
l1具有降低的结合亲和力。在一些实施例中，相对于野生型或未修饰的cd80多肽，变体cd80多肽对cd28具有降低结合亲和力，具有对pd
‑
l1增加的结合亲和力。
[0178]
在一些实施例中，相对于野生型或未修饰的cd80多肽，变体cd80多肽对cd28和ctla
‑
4具有的增加的结合亲和力。在一些实施例中，相对于野生型或未修饰的cd80多肽，变体cd80多肽对cd28具有增加的结合亲和力而对ctla
‑
4具有降低的结合亲和力。在一些实施例中，相对于野生型或未修饰的cd80多肽，变体cd80多肽对cd28和ctla
‑
4具有降低的结合亲和力。在一些实施例中，相对于野生型或未修饰的cd80多肽，变体cd80多肽对cd28具有降低的结合亲和力，而对ctla
‑
4具有增加的结合亲和力。
[0179]
在一些实施例中，相对于野生型或未修饰的cd80多肽，变体cd80多肽对pd
‑
l1和ctla
‑
4具有增加的结合亲和力。在一些实施例中，相对于野生型或未修饰的cd80多肽，变体cd80多肽对pd
‑
l1具有增加的结合亲和力而对ctla
‑
4具有降低的结合亲和力。在一些实施例中，相对于野生型或未修饰的cd80多肽，变体cd80多肽对pd
‑
l1和ctla
‑
4具有降低的结合亲和力。在一些实施例中，相对于野生型或未修饰的cd80多肽，变体cd80多肽对pd
‑
l1具有降低的结合亲和力，而对ctla
‑
4具有增加的结合亲和力。
[0180]
在一些实施例中，相对于野生型或未修饰的cd80多肽，变体cd80多肽对cd28、pd
‑
l1和ctla
‑
4具有增加的结合亲和力。在一些实施例中，相对于野生型或未修饰的cd80多肽，变体cd80多肽对cd28、pd
‑
l1和ctla
‑
4具有降低的结合亲和力。
[0181]
在一些实施例中，相对于野生型或未修饰的cd80多肽，变体cd80多肽对cd28和pd
‑
l1具有增加的结合亲和力而对ctla
‑
4具有降低的结合亲和力。在一些实施例中，相对于野生型或未修饰的cd80多肽，变体cd80多肽对cd28和pd
‑
l1具有降低的结合亲和力，而对ctla
‑
4具有增加的结合亲和力。在一些实施例中，相对于野生型或未修饰的cd80多肽，变体cd80多肽对cd28和ctla
‑
4具有增加的结合亲和力，而对pd
‑
l1具有降低的结合亲和力。在一些实施例中，相对于野生型或未修饰的cd80多肽，变体cd80多肽对cd28和ctla
‑
4具有降低的结合亲和力，而对pd
‑
l1具有增加的结合亲和力。在一些实施例中，相对于野生型或未修饰的cd80多肽，变体cd80多肽对pd
‑
l1和ctla
‑
4具有增加的结合亲和力而对cd28具有降低的结合亲和力。在一些实施例中，相对于野生型或未修饰的cd80多肽，变体cd80多肽对pd
‑
l1和ctla
‑
4具有降低的结合亲和力低，而对cd28具有增加的结合亲和力。
[0182]
在一些实施例中，与野生型或未修饰的cd80多肽对照相比，对cd28、pd
‑
l1和/或ctla
‑
4具有增加的或更大的结合亲和力的变体cd80多肽的结合亲和力增加至少约5％，例如对cd28、pd
‑
l1和/或ctla
‑
4的结合亲和力增加至少约10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。在一些实施例中，相对于野生型或未修饰的cd80多肽，结合亲和力的增加大于1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍或50倍。在此类实例中，除了它不包含一个或多个氨基酸修饰(例如取代)外，野生型或未修饰的cd80多肽具有与变体cd80多肽相同的序列。
[0183]
在一些实施例中，与野生型或未修饰的cd80多肽对照相比，对cd28、pd
‑
l1和/或ctla
‑
4具有减少或降低的结合亲和力的变体cd80多肽的结合亲和力降低至少5％，例如对cd28、pd
‑
l1和/或ctla
‑
4的结合亲和力降低至少约10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。在一些实施例中，相对于野生型或未修饰的cd80多肽，结合亲和力的降低大于1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍或50倍。在此类实例中，除了它不包含一个或多个氨基酸修饰(例如取代)外，野生型或未修饰的cd80多肽具有与变体cd80多肽相同的序列。
[0184]
在一些实施例中，前述实施例中任一项对cd28，pd
‑
ll和/或ctla
‑
4的平衡解离常数(kd)可以小于1
×
10
‑5m、1
×
10
‑6m、1
×
10
‑7m、1
×
10
‑8m、1
×
10
‑9m、1
×
10
‑
10
m或1
×
10
‑
11
m或1
×
10
‑
12
m。
[0185]
在一些实施例中，变体cd80多肽对cd28具有增加的或更大的结合亲和力。在一些实施例中，与野生型或未修饰的cd80多肽对照相比，对cd28具有增加或更大的结合亲和力的变体cd80多肽的结合亲和力增加至少5％，例如对cd28的结合亲和力增加至少约10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。在一些实施例中，对cd28具有增加或更大的结合亲和力的变体cd80多肽具有对于cd28小于200pm、300pm、400pm、500pm或600pm的平衡解离常数(kd)。在一些实施例中，与未修饰的cd80相比，变体多肽以增加的选择性特异性结合cd28之一的细胞外结构域。在一些实施例中，增加的选择性是对cd28的。
[0186]
在一些实施例中，变体cd80多肽对pd
‑
l1具有增加的或更大的结合亲和力。在一些实施例中，与野生型或未修饰的cd80多肽对照相比，对pd
‑
l1具有增加或更大的结合亲和力的变体cd80多肽的结合亲和力增加至少5％，例如对pd
‑
l1的结合亲和力增加至少约10％、
15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。在一些实施例中，对pd
‑
l1具有增加或更大的结合亲和力的变体cd80多肽具有对于pd
‑
l1小于200pm、300pm、400pm、500pm或600pm的平衡解离常数(kd)。在一些实施例中，与未修饰的cd80相比，变体多肽以增加的选择性特异性结合pd
‑
l1之一的细胞外结构域。在一些实施例中，增加的选择性是对pd
‑
l1的。
[0187]
在一些实施例中，变体cd80多肽对ctla
‑
4具有增加的或更大的结合亲和力。在一些实施例中，与野生型或未修饰的cd80多肽对照相比，对ctla
‑
4具有增加或更大的结合亲和力的变体cd80多肽的结合亲和力增加至少5％，例如对ctla
‑
4的结合亲和力增加至少约10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。在一些实施例中，对ctla
‑
4具有增加或更大的结合亲和力的变体cd80多肽具有对于ctla
‑
4小于200pm、300pm、400pm、500pm或600pm的平衡解离常数(kd)。在一些实施例中，与未修饰的cd80相比，变体多肽以增加的选择性特异性结合ctla
‑
4之一的细胞外结构域。在一些实施例中，增加的选择性是对ctla
‑
4的。
[0188]
在一些实施例中，与未修饰的cd80多肽对一个同源结合配偶体与另一个同源结合配偶体的结合率相比，选择性的提高包括变体cd80多肽与选自pd
‑
l1，cd28和ctla4的一个同源结合配偶体相对于另一个同源结合配偶体的更大比例结合。在一些实施例中，该比率至少为或至少约为1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍或更多。
[0189]
野生型或未修饰的cd80序列不一定必须用作产生本文所述的变体cd80多肽的起始成分。因此，使用术语“修饰”，例如“取代”并不意味着本发明的实施例限于制备变体cd80多肽的特定方法。变体cd80多肽可以例如通过从头肽合成来制备，因此在改变密码子以编码该修饰(例如取代)的意义上，不一定需要修饰，例如“取代”。该原理还扩展到氨基酸残基的术语“添加”和“缺失”，它们同样并不暗示特定的制备方法。设计或产生变体cd80多肽的方法不限于任何特定方法。然而，在一些实施例中，从野生型或未修饰的cd80遗传材料诱变野生型或未修饰的cd80编码核酸，并筛选所需的特异性结合亲和力和/或il
‑
2表达的诱导或其他功能活性。在一些实施例中，利用在任何数量的公众可获得的数据库中可获得的蛋白质或核酸序列从头合成变体cd80多肽，然后进行筛选。国家生物技术信息中心提供了此类信息，如前所述，其网站可以通过网际网络公开访问，uniprotkb数据库也是如此。
[0190]
除非另有说明，否则如本发明全文中所指出的，氨基酸取代由对应于seq id no：1所示的未修饰的ecd序列的位置编号的氨基酸位置编号表示。
[0191]
鉴定cd80多肽中修饰(例如氨基酸取代)的相应位置在技术人员的能力范围内，包括其包含igsf结构域(例如igc或igv)的部分，例如通过将参考序列与seq id no：1进行比对。在整个本发明内容的修饰清单中，氨基酸位置在中间，相应的未修饰的(例如野生型)氨基酸在数位之前列出，并且鉴定的变体氨基酸取代在数位之后列出。如果修饰是删除位置，则表示“del”，如果修饰是插入位置，则表示“ins”。
[0192]
在一些实施例中，变体cd80多肽在野生型或未修饰的cd80序列中具有一个或多个氨基酸修饰(例如取代)。一个或多个氨基酸修饰(例如取代)可以在野生型或未修饰的cd80序列的细胞外结构域(细胞外结构域)中。在一些实施例中，一个或多个氨基酸修饰(例如取代)是在igc结构域或其特异性结合片段中。在一些实施例中，一个或多个氨基酸修饰(例如取代)是在igv结构域或其特异性结合片段中。在变体cd80多肽的一些实施例中，一个或多
个氨基酸修饰(例如取代)中的一些在igc结构域或其特异性结合片段中，而另一个或多个氨基酸修饰(例如取代)中的一些在igv结构域或其特异性结合片段中。
[0193]
在一些实施例中，变体cd80多肽具有多达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸修饰(例如取代)。修饰(例如取代)可以在igc结构域或igv结构域中。在一些实施例中，变体cd80多肽在igc结构域或其特异性结合片段中具有多达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸取代。在一些实施例中，变体cd80多肽在igv结构域或其特异性结合片段中具有多达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸取代。在一些实施例中，变体cd80多肽与野生型或未修饰的cd80多肽或其特异性结合片段，例如与seq id no：1的氨基酸序列具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、86％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的序列同一性。。
[0194]
在一些实施例中，变体cd80多肽参考seq id no：1的编号，在未修饰的cd80或其特异性结合片段中具有一个或多个氨基酸修饰(例如取代)，其对应于位置130、131、139、155、156、165或166。在一些实施例中，与野生型或未修饰的cd80多肽相比，此类变体cd80多肽对cd28、pd
‑
l1和/或ctla
‑
4中的一种或多种表现出改变的结合亲和力。例如，在一些实施例中，与野生型或未修饰的cd80多肽相比，变体cd80多肽对cd28、pd
‑
l1和/或ctla
‑
4的结合亲和力增加。在一些实施例中，与野生型或未修饰的cd80多肽相比，变体cd80多肽对cd28、pd
‑
l1或ctla
‑
4表现出降低的结合亲和力。
[0195]
在一些实施例中，变体cd80多肽具有一个或多个选自t130a、s131a、s131v、s131i、s131f、s131r、s131e、s131d、s131q、l139v、v155a、v155i、或v155t、a165s、a165v、a165i、a165f、a165r、a165e、a165d、或a165q、v166a、v166l或v166t或保守的氨基酸修饰(例如取代)的氨基酸修饰(例如取代)。保守的氨基酸修饰(例如取代)是除野生型或未修饰的氨基酸外，与取代的氨基酸属于同一类氨基酸的任何氨基酸。氨基酸类别包括脂肪族(甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸)，羟基或含硫(丝氨酸、半胱氨酸、苏氨酸和蛋氨酸)，环状(脯氨酸)，芳香族(苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸)，碱性(组氨酸、赖氨酸和精氨酸)和酸性/酰胺(天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺)。
[0196]
在一些实施例中，变体cd80多肽具有一个或多个选自t130a、s131a、s131v、s131i、s131f、s131r、s131e、s131d、s131q、l139v、v155a、v155i、或v155t、a165s、a165v、a165i、a165f、a165r、a165e、a165d、或a165q、v166a、v166l或v166t的氨基酸修饰(例如取代)。
[0197]
在一些实施例中，一个或多个氨基酸修饰(例如取代)是t130a、s131a、s131v、s131i、s131f、s131r、s131e、s131d、s131q、l139v、v155a、v155i、或v155t、a165s、a165v、a165i、a165f、a165r、a165e、a165d、或a165q、v166a、v166l、v166t。
[0198]
在一些实施例中，变体cd80多肽包含表1中列出的任何突变。如所指出的，对应于给定结构域的确切基因座或残基可以变化，例如取决于用于鉴定或分类结构域的方法。同样，在某些情况下，给定结构域(例如igv)的相邻n
‑
和/或c
‑
末端氨基酸也可以包含在变体igsf多肽的序列中，以确保表达时结构域的正确折叠。
[0199]
在一些实施例中，相对于人cd80蛋白，或在非人蛋白版本中的相应位置，变体cd80多肽包含表1中列出的任何突变。在一些实施例中，变体cd80多肽包含表1中提供的细胞外结构域(ecd)或igv序列的突变。
[0200]
表1.示例性的变体cd80多肽
[0201][0202][0203]
为了提供用于体内研究的替代模型，可以基于野生型小鼠cd80序列t165e、t165q、t165r、t165a、t165s、t165v、t165i、t165f、t165d、s131v、s131i、s131f、s131r、s131e、s131q、s131a和s131p制备和测试以下小鼠cd80变体多肽。野生型小鼠序列在图14b中提供，并以seq id no：15提供。
[0204]
iii.药物成分
[0205]
本发明提供了包含本发明的变体cd80多肽的药物成分。在一些实施例中，药物成分还包含药学上可接受的赋形剂。在一些实施例中，药物成分是无菌的。在一些实施例中，试剂盒包含本发明的药物成分和使用说明书。
[0206]
在其他实施例中，制品包含在小瓶中的本发明的药物成分。在一些实施例中，小瓶是密封的。在一些实施例中，试剂盒包括本发明的制品和使用说明书。
[0207]
除了本发明内容的多聚体多肽之外，本发明内容的药物成分还可包含一个或多
个：盐，例如nacl、mgcl2、kcl、mgso4等；缓冲剂，例如tris缓冲剂，n
‑
(2
‑
羟乙基)呱嗪
‑
n'
‑
(2
‑
乙磺酸)(hepes)、2
‑
(n
‑
morpholino)乙磺酸(mes)、2
‑
(n
‑
morpholino)乙磺酸钠盐(mes)、3
‑
(n
‑
morpholino)丙烷磺酸(mops)、n
‑
三[羟甲基]甲基
‑3‑
胺基丙烷磺酸(taps)等；增溶剂；去污剂，例如非离子去污剂如tween
‑
20等；蛋白酶抑制剂；甘油；等。
[0208]
药物成分可以包含药学上可接受的赋形剂，其多种在本领域中是已知的，并且在本文中不需要详细讨论。药学上可接受的赋形剂已在各种出版物中充分描述，包括，例如，“雷明顿：药学的科学与实践”，第19版(1995)，或最新版本，麦克出版社；a.根纳罗(2000)，“雷明顿：药学的科学与实践”，第20版，利平科特，威廉姆斯和威尔金斯；药物剂型和药物递送系统(1999)，h.c.安塞尔等人，第7版，利平科特，威廉姆斯和威尔金斯；以及药物赋形剂手册(2000)a.h.基贝等，编辑，第三版，阿米尔，制药协会。
[0209]
药物成分可以包含本发明的多聚多肽和药学上可接受的赋形剂。在某些情况下，受试者药物成分适合于例如无菌施用给受试者。例如，在一些实施例中，受试者药物成分适合于施用于人类受试者，例如，其中成分是无菌的并且不含可检测的热原和/或其他毒素。
[0210]
蛋白质成分可以包含其他组分，例如药用级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石粉、纤维素、葡萄糖、蔗糖、镁、碳酸盐等。成分可包含近似生理条件所需的药学上可接受的辅助物质，例如ph调节剂和缓冲剂、毒性调节剂等，例如，乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠、盐酸盐、硫酸盐、溶剂化物(例如混合离子盐、水、有机物)、水合物(例如水)等。
[0211]
例如，成分可包括水溶液、粉末形式、颗粒剂、片剂、丸剂、栓剂、胶囊剂、混悬剂、喷雾剂等。可以根据下述各种给药途径配制成分。
[0212]
当将本发明内容的多肽或多聚体或二聚体蛋白以可注射方式(例如皮下、腹膜内、肌内和/或静脉内)注射施用至组织中时，制剂可以以即用剂型或非水形式(例如可重构的储存稳定的粉末)或水性形式提供，例如由药学上可接受的载体和赋形剂组成的液体。还可以提供含蛋白质的制剂，以提高给药后受试者蛋白质的血清半衰期。例如，可以以脂质体制剂形式、以胶体形式或其他常规技术提供蛋白质，以延长血清半衰期。如在例如szoka等人的，1980年，生物物理学报，生恩，9：467美国专利4,235,871、4,501,728和4,837,028所述，有多种方法可用于制备脂质体。制剂也能够以受控释放或缓慢释放形式提供。
[0213]
适用于肠胃外给药的制剂的其他实例包括等渗无菌注射溶液、抗氧化剂、抑菌剂和溶质、使制剂与预期受体的血液等渗、悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。例如，受试者药物成分可以存在于容器例如无菌容器如注射器中。制剂可以存在于单位剂量或多剂量密封的容器中，例如安瓿和小瓶，并且可以在使用前立即以冻干(冻干的)状态保存，在使用前只需添加无菌液体赋形剂(例如水)即可立即进行注射。临时注射溶液和混悬液可以由无菌粉剂、颗粒剂和片剂制备。
[0214]
本发明内容的多肽或多聚体或二聚体蛋白在制剂中的浓度可以广泛地变化(例如，按重量计小于约0.1％，通常为或至少约2％至高达20％至50％或更多)，并且通常将根据所选择的特定给药方式和患者的需求，主要根据体液量，黏度和基于患者的因素来选择浓度。
[0215]
本发明提供了容器，其包含本发明的成分，例如液体成分。容器可以是例如注射器、安瓿瓶等。在某些情况下，容器是无菌的。在某些情况下，容器和成分都是无菌的。
[0216]
iv.使用方法
[0217]
在一些实施例中，本文提供了在受试者中调节免疫反应的方法，其包括向受试者施用本发明的药物成分。在一些实施例中，调节免疫反应治疗受试者的疾病或病症。在一些实施例中，免疫反应增加。在一些实施例中，免疫反应降低。
[0218]
在一些实施例中，疾病或病症是肿瘤或癌症。在一些实施例中，疾病或病症选自黑素瘤、肺癌、膀胱癌、血液恶性肿瘤、肝癌、脑癌、肾癌、乳腺癌、胰腺癌、结肠直肠癌、脾癌、前列腺癌、睾丸癌、卵巢癌、子宫癌、胃癌、肌肉骨骼癌、头颈癌、胃肠道癌、生殖细胞癌或内分泌和神经内分泌癌。在一些实施例中，疾病或病症是炎性或自体免疫性疾病或病症。在一些实施例中，疾病或病症是抗中性粒细胞胞浆抗体(anca)相关的血管炎、血管炎、自体免疫性皮肤病、移植、风湿性疾病、炎性胃肠疾病、炎性眼病、炎性神经疾病、炎性肺疾病、炎性内分泌疾病或自体免疫性血液病。在一些实施例中，疾病或病症选自炎性肠病、移植、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、多发性硬化症、哮喘、类风湿性关节炎或牛皮癣。
[0219]
在一些实施例中，本文提供了治疗受试者的疾病或病症的方法，其包括向受试者施用本发明的药物成分。
[0220]
在一些实施例中，疾病或病症是肿瘤或癌症。在一些实施例中，本文提供的疾病或病症选自黑素瘤、肺癌、膀胱癌、血液恶性肿瘤、肝癌、脑癌、肾癌、乳腺癌、胰腺癌、结肠直肠癌、脾癌、前列腺癌、睾丸癌、卵巢癌、子宫癌、胃癌、肌肉骨骼癌、头颈癌、胃肠道癌、生殖细胞癌或内分泌和神经内分泌癌。
[0221]
在一些实施例中，疾病或病症是感染。在一些实施例中，疾病或病症是炎性或自体免疫性疾病或病症。在一些实施例中，本文提供的疾病或病症是抗中性粒细胞胞浆抗体(anca)相关的血管炎、血管炎、自体免疫性皮肤病、移植、风湿性疾病、炎性胃肠疾病、炎性眼病、炎性神经疾病、炎性肺疾病、炎性内分泌疾病或自体免疫性血液病。在一些实施例中，本文提供的疾病或病症选自炎性肠病、移植、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、多发性硬化症、哮喘、类风湿性关节炎或牛皮癣。
[0222]
在一些实施例中，给患者施用第二治疗剂。
[0223]
示例
[0224]
提出以下实施例以向本领域普通技术人员提供关于如何制作和使用本发明的完整公开和描述，并且既不意图限制发明人认为其公开的范围，也不意图代表以下实验是全部或唯一进行的实验。
[0225]
示例1
[0226]
用于生产突变型cd80
‑
fc融合蛋白的表达载体的构建以及突变型cd80
‑
fc融合蛋白的表达/纯化(cd80变体)
[0227]
通过从头基因合成产生野生型人cd80
‑
人igg1 fc表达盒(hcd80
‑
fc，图13a)，并将其复制到pcdna3.4载体(赛默飞世尔科技)中。根据提供商手册/协定，通过quikchange lightning定向诱变试剂盒(agilent)进行定点诱变或通过dna合成(genscript)直接引入位置s131、v155、a165和v166的cd80 igc结构域突变。表2和表3列出了用于定点诱变的引子，并用于单定点诱变。quikchange lightening多定点诱变试剂盒用于多定点诱变。
[0228]
使用expifectamine 293转染试剂(赛默飞世尔科技)将含有编码表1以及图13a和24中所述的野生型cd80或突变的cd80变体的多核苷酸的构建的pcdna3.4表达载体转染到
expi 293f细胞中。转染20小时后，将expifectamine 293转染增强剂1和增强剂2加入孔中。将培养物在加有5％co2的75％湿度的潮湿培养箱中于37℃培养。转染后6天收获转染的培养物。通过在室温下培养上清液和树脂4分钟，使用ge healthcare protein a hp spintrap柱纯化了从转染的expi293f细胞表达的cd80
‑
fc融合蛋白。用ph7.2的磷酸钠缓冲液洗涤柱，并用ph3.0的100mm甘氨酸
‑
hcl洗脱。使用1.0mtris
‑
hcl，ph9.0中和洗脱液。将纯化的蛋白在ph7.2的pbs缓冲液中透析，并通过0.2μm膜进行无菌过滤。进行sds
‑
page分析，并且来自分析的突变cd80
‑
fc融合蛋白的结果总结在图15a
‑
15f中。将所有cd80
‑
fc融合蛋白纯化至接近95％的纯度。在两种条件下，在sds
‑
page凝胶上测试纯化的蛋白质；(i)不还原靶融合蛋白中二硫键的非还原条件，和(ii)还原靶融合蛋白中二硫键的还原条件。载有每种纯化的变体cd80
‑
fc融合蛋白的未还原样品(图15a)和还原样品(图15b)如下：泳道1：分子量标记；泳道2：s131f，1.5ug/lane；泳道3：s131r，1.5ug/lane；泳道4：s131e，2.0ug/lane；泳道5：s131d，1.6ug/lane；泳道6：s131q，1.6ug/lane；泳道7：a165v，1.2ug/lane；泳道8：a165i，1.6ug/lane；泳道9：a165f，1.6ug/lane；泳道10：a165r，1.6ug/lane；泳道11：a165d，1.6ug/lane；泳道12：a165q，1.6ug/lane。载有每种纯化的变体cd80
‑
fc融合蛋白的未还原样品(图15c)和还原样品(图15d)如下：泳道1：分子量标记；泳道2：v166a，10/lane；泳道3：v166t，10ug/lane；泳道4：v166l/l139v，10ug/lane；泳道5：s156a/v155a，10ug/lane；泳道6：s156a/v155i，10ug/lane；泳道7：s156a/v155t，10ug/lane；泳道8：s156a/t130a，10ug/lane；泳道9：s156a/v166a，10ug/lane；泳道10：s156a/v166l/l139v，10ug/lane。载有每种纯化的变体cd80
‑
fc融合蛋白的未还原样品(图15e)和还原样品(图15f)如下：泳道1：分子量标记；泳道2：s131v，10ug/lane；泳道3：v155a，10ug/lane；泳道4：v155i，10ug/lane；泳道5：v155t，10ug/lane。
[0229]
表2.定点诱变引物
[0230]
[0231]
[0232][0233]
表3.定点诱变引物
[0234]
[0235]
[0236][0237]
示例2
[0238]
通过elisa和biacore评估cd80变体对ctla
‑
4，pd
‑
l1和cd28的结合亲和力
[0239]
(1)通过elisa的cd80突变结合亲和力：
[0240]
为了通过elisa测试结合亲和力，首先在4℃下用1ug/mlhctla
‑
4(来自义翘神州的重组his标签)包被elisa板过夜。第二天，除去hctla
‑
4溶液，并将板在室温下用1％bsa封闭1小时。除去1％bsa溶液后，将板用pbst(含0.05％tween
‑
20的磷酸盐缓冲盐水)洗涤3次。用于该结合测定的纯化的cd80变体样品以100μl/孔一式两份添加，以4ug/ml的浓度开始以1：3的系列稀释液稀释，并在室温下搅拌培养2小时。用pbst洗涤3次后，加入100ul/孔的hrp
‑
抗
‑
higg的1：10,000稀释度的二抗，并在室温下搅拌培养1小时。将板用pbst洗涤3次，并添加100ul/孔的tmb底物。将板培养直至显色。加入终止溶液以终止反应。在od450处读取板。
[0241]
分别对cd28和pd
‑
l1重组蛋白进行了类似的elisa实验，不同的是，平板用2ug/ml的重组cd28和pd
‑
l1蛋白(来自义翘神州的重组his标签)包被，并且cd80变体的稀释液从20ug/ml开始。
[0242]
通过与每个平板上的野生型cd80的ec
50
相比较来确定与ctla
‑
4、cd28或pd
‑
l1结合的cd80变体的ec
50
值。
[0243]
通过elisa的结合亲和力测定的结果显示在图16a
‑
16f中(cd80变体对ctla
‑
4的结合亲和力)。表4总结了图16a
‑
16e中给出的结合测定的结果，其中每个测试的cd80
‑
fc融合蛋白的最高od450值包括单突变、双突变和三突变(例如s156i/a165s、s156i/s131a、a165s/s131a、s156i/a165s/s131a、s156f、s156r、s156e、s156d、s156q、s131v、s131i、s131f、s131r、s131e、s131d、s131q、a165v、a165i、a165f、a165r、a165e、a165d和a165q)，以及ec
50
(ug/ml)值。ec
50
(ug/ml)是在结合测定中给出最大回应一半的蛋白质的浓度或值。表5总结了图16f中所示的结合测定结果，其中包含每个测试的cd80
‑
fc融合蛋白(例如t130a、s131v、l139v、v155a、v155i、v155t、s156a、v166a、v166l、v166t、v155a/s156a、v155i/s156a、v155t/s156a和cd80
‑
wt)的最高od450值，以及ec
50
(ug/ml)值。ec
50
(ug/ml)是在结合测定中给出最大回应一半的蛋白质的浓度或值。
[0244]
通过elisa的结合亲和力测定的结果显示在图17a
‑
17e中(cd80变体对cd28的结合亲和力)。表6总结了图17a
‑
17e中给出的结合测定的结果，其中每个测试的cd80
‑
fc融合蛋白的最高od450值包括单突变、双突变和三突变(例如s156i/a165s、s156i/s131a、a165s/s131a、s156i/a165s/s131a、s156f、s156r、s156e、s156d、s156q、s131v、s131i、s131f、s131r、s131e、s131d、s131q、a165v、a165i、a165f、a165r、a165e、a165d和a165q)，以及ec
50
(ug/ml)值。ec
50
(ug/ml)是在结合测定中给出最大回应一半的蛋白质的浓度或值。
[0245]
通过elisa的结合亲和力测定的结果显示在图18a
‑
18e中(cd80变体对pd
‑
l1的结合亲和力)。表7总结了图18a
‑
18e中给出的结合测定的结果，其中每个测试的cd80
‑
fc融合蛋白的最高od450值包括单突变、双突变和三突变(例如s156i/a165s、s156i/s131a、a165s/s131a、s156i/a165s/s131a、s156f、s156r、s156e、s156d、s156q、s131v、s131i、s131f、s131r、s131e、s131d、s131q、a165v、a165i、a165f、a165r、a165e、a165d和a165q)，以及ec
50
(ug/ml)值。ec
50
(ug/ml)是在结合测定中给出最大回应一半的蛋白质的浓度或值。
[0246]
表4
[0247]
ctla4
‑
cd80topodec50(ug/mcd80
‑
wt1.500.0110s156i/a165s1.410.0120s156i/s131a1.590.0100a165s/s131a1.470.0120s156i/a165s/s131a1.500.0130s156f1.580.0090s156r1.570.0140s156e1.340.0110s156d1.550.0150s156q1.680.0120s131v1.480.0200s13111.600.0150s131f1.680.0141s131r1.600.0058s131e1.500.0130s131d1.300.0260s131q1.460.0130a165v1.440.0370a165i1.320.0890a165f0.900.0310a165r1.010.0210a165e1.040.0090a165d0.870.0180a165q0.820.0120
[0248]
表5
[0249] topec50cd80
‑
wt1.110.04846t130a1.1980.01983s131v1.0530.0321l139v1.3140.0268v155a1.0950.02888
v155i0.96230.08108v155t0.88030.06053s156a1.1590.04707v166a0.95120.06625v166l1.1620.02897v166t0.96390.01365v155a/s156a1.1510.02742v155i/s156a1.0950.1835v155t/s156a0.83860.05937
[0250]
表6
[0251]
cd28
‑
cd80top odec50(ug/ml)cd80
‑
wt2.512.42s156i/a165s2.222.42s156i/s131a2.204.36a165s/s131a2.335.02s156i/a165s/s131a2.264.85s156f2.192.20s156r1.837.66s156e2.124.18s156d2.124.29s156q2.144.05s131v1.2732.46s131i1.7610.75s131f1.22....s131r1.7523.26s131e1.72....s131d1.31....s131q1.6313.60a165v1.02135.30a165i0.672.10a165f0.7414.86a165r1.10....a165e1.7834.07a165d1.36....a165q1.76157.10
[0252]
表7
[0253]
pd
‑
l1
‑
cd80top odec50(ug/mlcd80
‑
wt1.070.98s1561/a165s0.701.17
s156i/s131a0.740.52a165s/s131a0.831.23s156i/a165s/s131a0.711.96s156f0.940.37s156r0.910.49s156e0.720.67s156d0.830.57s156q0.920.55s131v0.940.40s13110.870.24s131f0.960.21s131r0.790.58s131e0.830.51s131d0.890.28s131q0.760.48a165v0.810.14a165i0.810.19a165f0.940.38a165r0.970.26a165e0.800.32a165d0.820.30a165q0.920.29
[0254]
(2)通过biacore测量的cd80突变结合亲和力：
[0255]
为了通过biacore测量结合亲和力，在biacorex 100型(biacore/gehealthcare，piscataway，nj)上于25℃进行亲和力测量，使用pbst缓冲液(20mm pb 150mm nacl 0.05％tween20，ph7.4)作为运行缓冲液。在一个流通池中以10ul/min的流速将nta传感器芯片(目录br
‑
1000
‑
07；ge healthcare)与镍离子(0.5mm nicl2)螯合1分钟，以捕获在c端含有多组氨酸标签的hctla
‑
4(目录11159
‑
h08h；信和生物)。将hctla
‑
4溶液以10ul/min的流速注入2分钟，然后稳定3分钟。然后将hcd80
‑
fc融合突变以2倍梯度稀释从亚nm到数百nm，以30ul/min的流速注入3分钟，并监测解离12分钟。通过以30ul/min的流速注入350mm edta缓冲液3分钟以去除镍和任何螯合的蛋白质，从而执行再生程序。通过使用制造商提供的biaevaluation软件(biacore)中的1：1langmuir结合模型同时拟合传感图的缔合和解离相，进行动力学分析。在每个分析中都应用了双重参照，以消除来自参照表面和仅缓冲液对照的背景响应。图19描绘了使用biacore模型x100，与野生型和未修饰的cd80
‑
fc融合蛋白(例如hcd80
‑
hlgg1(fctm，无效应子fc的fc三重突变)和hcd80
‑
higg1)作对照相比，对包含单突变、双突变和三突变(例如hcd80(s156a)
‑
higg1、hcd80(s156a)
‑
higg1(fctm)、hcd80(a165s)
‑
higg1、hcd80(s131a)
‑
higg1、hcd80(s156v)
‑
higg1、hcd80(s156l)
‑
higg1、hcd80(s156i)
‑
higg1、hcd80(s131v)
‑
higg1、hcd80(v155a)
‑
higg1、hcd80(v155i)
‑
higg1、hcd80(v155t)
‑
higg1、hcd80(v166a)
‑
higg1、hcd80(v166t)
‑
higg1、hcd80(v166l/l139v)
‑
higg1、
hcd80(s156a/v155a)
‑
higg1、hcd80(s156a/v155i)
‑
higg1、hcd80(s156a/v166t)
‑
higg1、hcd80(s156a/t130a)
‑
higg1、hcd80(s156a/v166a)
‑
higg1、hcd80(s156a/v166l/l139v)
‑
higg1)的每个变体人cd80
‑
igg1 fc融合蛋白与结合配偶体人ctla
‑
4的结合测定的结果。
[0256]
如图19所示，所有cd80变体(突变型hcd80
‑
fc融合蛋白)对ctla
‑
4的结合亲和力均高于野生型cd80
‑
fc融合蛋白。
[0257]
(3)通过生物层干涉法(bli)生物传感器测量的cd80突变结合亲和力。
[0258]
通过fortebio的octet red384系统分析了cd80变体对pd
‑
l1或cd28的动力学亲和力。通过捕获法(传感器类型：his1k
‑
anti
‑
penta
‑
his)将hpd
‑
l1
‑
his或hcd28
‑
his固定在生物传感器的表面。在基线步骤之后，将生物传感器浸入含有不同浓度cd80变体的溶液中。实验温度为30℃，转速为1000rpm/min。运行缓冲液为20mm pb，150mm nacl，0.05％tween20，ph7.4，而再生溶液为10mm甘氨酸
‑
hcl，ph1.5。表8总结了cd80变体对hpd
‑
l1的动力学亲和力的结果。表9总结了cd80变体对cd28的动力学亲和力的结果。
[0259]
表8.cd80变体对hpd
‑
l1的动力学亲和力
[0260]
[0261]
[0262][0263]
表9.cd80变体对cd28的动力学亲和力
[0264]
[0265][0266]
示例3
[0267]
流式细胞仪评估cd80变体的细胞表面结合亲和力
[0268]
(1)使用flp
‑
intm细胞系进行facs测定产生过表达目的靶标的稳定细胞(hctla
‑
4、hcd28和hpd
‑
l1)
[0269]
将含有编码hcd28、hctla
‑
4或hpd
‑
l1的多核苷酸的表达载体用9：1的pog44：pcdna
tm
5/frt质粒共转染到哺乳动物的flp
‑
in
tm
293宿主细胞中(invitrogen)。转染后二十四小时，洗涤细胞并将新鲜培养基加入细胞中。转染后48小时，将潮霉素b(终浓度为200ug/ml)加入到转染的细胞中。每5天更换含有200ug/ml潮霉素b的培养基，直到选择单个殖株。通过facs结合测定分析所有单个殖株。分别将hcd28、hctla
‑
4和hpd
‑
l1的最佳表达单殖株扩增，并保存在含有d
‑
mem(高葡萄糖)、10％fbs、2mml
‑
谷氨酰胺和1％pen
‑
液态氮中的链球菌。如下所述通过facs结合测定来表征三种稳定的细胞系。
[0270]
(2)通过facs的细胞表面结合测定
[0271]
分别通过facs确定cd80变体与过表达cd28的flp
‑
in 293细胞，过表达ctla4的flp
‑
in 293细胞和过表达pd
‑
l1的flp
‑
in 293细胞的结合亲和力(ec
50
)。facs结合测定如下进行：用连续稀释的突变cd80
‑
fc融合蛋白在冰上将过表达cd28的flp
‑
in 293细胞，过表达
ctla4的flp
‑
in 293细胞和过表达pd
‑
l1的flp
‑
in 293细胞染色1小时，(i)对于过表达cd28的flp
‑
in 293细胞或过表达pd
‑
l1的flp
‑
in 293细胞的浓度为100μg/ml、30μg/ml、10μg/ml、3μg/ml、1μg/ml、0.3μg/ml、0.1μg/ml、和0.03μg/ml，以及对于过表达ctla4的flp
‑
in293细胞的浓度为3μg/ml、1μg/ml、0.3μg/ml、0.1μg/ml、0.03μg/ml、0.01μg/ml、0.03μg/ml、和0.001μg/ml。用染色缓冲液(pbs 2％胎牛血清)洗涤细胞以除去游离的cd80
‑
fc融合蛋白，然后用alexfluor488缀合的抗人igg抗体在冰上染色30分钟。洗涤细胞并通过facs分析。
[0272]
通过facs进行的细胞表面结合亲和力测定的结果显示在图20a
‑
20b中(cd80变体与ctla
‑
4过表达的flp
‑
in 293细胞的结合亲和力)。表10和11总结了图20a
‑
20b中呈现的细胞表面结合亲和力测定的结果，每个测试的cd80
‑
fc融合蛋白的最高mfi(平均荧光强度)值包括单突变、双突变和三突变(例如s156i/a165s、s156i/s131a、a165s/s131a、s156i/a165s/s131a、s156f、s156r、s156e、s156d、s156q、s131v、s131i、s131f、s131r、s131e、s131d、s131q、a165v、a165i、a165f、a165r、a165e、a165d和a165q)，以及ec
50
(ug/ml)值。ec
50
(ug/ml)是在结合测定中给出最大回应一半的蛋白质的浓度或值。
[0273]
通过facs进行的细胞表面结合亲和力测定的结果显示在图21a
‑
21b中(cd80变体与cd28过表达的flp
‑
in 293细胞的结合亲和力)。表12和13总结了图21a
‑
21b中呈现的细胞表面结合亲和力测定的结果，每个测试的cd80
‑
fc融合蛋白的最高mfi(平均荧光强度)值包括单突变、双突变和三突变(例如s156i/a165s、s156i/s131a、a165s/s131a、s156i/a165s/s131a、s156f、s156r、s156e、s156d、s156q、s131v、s131i、s131f、s131r、s131e、s131d、s131q、a165v、a165i、a165f、a165r、a165e、a165d和a165q)，以及ec
50
(ug/ml)值。ec
50
(ug/ml)是在结合测定中给出最大回应一半的蛋白质的浓度或值。
[0274]
表10
[0275][0276]
表11
[0277][0278][0279]
通过facs进行的细胞表面结合亲和力测定的结果显示在图22a
‑
22b中(cd80变体与pd
‑
l1过表达的flp
‑
in 293细胞的结合亲和力)。表14和15总结了图22a
‑
22b中呈现的细胞表面结合亲和力测定的结果，每个测试的cd80
‑
fc融合蛋白的最高mfi(平均荧光强度)值包括单突变、双突变和三突变(例如s156i/a165s、s156i/s131a、a165s/s131a、s156i/a165s/s131a、s156f、s156r、s156e、s156d、s156q、s131v、s131i、s131f、s131r、s131e、s131d、s131q、a165v、a165i、a165f、a165r、a165e、a165d和a165q)，以及ec
50
(ug/ml)值。ec
50
(ug/ml)是在结合测定中给出最大回应一半的蛋白质的浓度或值。
[0280]
如图25
‑
27所示，突变cd80
‑
fc融合蛋白的facs结合ec
50
显示出对ctla
‑
4、cd28和pd
‑
l1的结合亲和力的差异。
[0281]
表12
[0282][0283]
表13
[0284][0285][0286]
表14
[0287][0288]
表15
[0289][0290][0291]
示例4
[0292]
cd80变体对t细胞活化的功能研究
[0293]
(1)il
‑
2释放测定
[0294]
为了测试jurkat t细胞中cd80诱导的il
‑
2产生，按如下方式进行il
‑
2释放测定：将3.2x105/孔的jurkat细胞接种在96孔板中。将每种cd80突变蛋白的连续稀释液添加至30μg/ml、10μg/ml、3μg/ml、1μg/ml、0.3μg/ml、0.1μg/ml、0.03μg/ml以及0.01μg/ml的终浓度。将pha(植物血凝素)添加到每个孔中，最终浓度为10μg/ml。将细胞在37℃下培养24小时，并收集上清液用于elisa测定。使用人il
‑
2未包被的elisa试剂盒(invitrogen#88
‑
7025)定量上清液中的il
‑
2。elisa平板在4℃下用50μl/孔的捕获抗体覆盖过夜。洗涤板并在室温下封闭1小时。洗涤后，将50μl/孔的上述上清液加入适当的孔中，并在室温下培养2小时。然后洗涤板，并加入50μl/孔的检测抗体，并在室温下培养1小时。洗涤后，加入50μl/孔的抗生物素蛋白
‑
hrp，并在室温下培养30分钟。将该板洗涤七次，并向每个孔中加入50μltmb底物，并通过添加25μl终止溶液终止反应。使用酶标仪测量od450。
[0295]
图23a
‑
23d呈现了il
‑
2释放的功能测定的结果，以测试变体cd80
‑
fc融合蛋白对t细胞活化的能力。表16总结了通过图23a
‑
23d中呈现的il2释放测量的t细胞活化测定的结果，其中每个测试的cd80
‑
fc融合蛋白的最高od450值包括单突变、双突变和三突变(例如s156i/a165s、s156i/s131a、a165s/s131a、s156i/a165s/s131a、s156f、s156r、s156e、s156d、s156q、s131v、s131i、s131f、s131r、s131e、s131d、s131q、a165v、a165i、a165f、a165r、a165e、a165d和a165q)，以及ec
50
(ug/ml)值。ec
50
(ug/ml)是在结合测定中给出最大回应一半的蛋白质的浓度或值。
[0296]
来自jurkat细胞il
‑
2释放测定的结果如图23a
‑
23d所示并示于表16中，其表明igc结构域的突变可影响cd80活化t细胞的能力。
[0297]
表16
[0298][0299][0300]
(2)检查点阻断报告员测定：
[0301]
使用promega的测定试剂盒通过检查点阻断报告测定评估了cd80变体。对于ctla
‑
4阻断测定，将ctla
‑
4/jurkat效应子细胞和aapc/raji细胞在室温下融化。将bio
‑
glo
tm
荧光素酶测定缓冲液平衡至环境温度，避光。然后将所有bio
‑
glo
tm
荧光素酶测定缓冲液转移到装有bio
‑
glo
tm
荧光素酶测定底物的琥珀色瓶中，并颠倒混合直至底物完全溶解。如果设置
16小时测定，应在无菌细胞培养柜中使用无菌技术进行ctla
‑
4效应子细胞的制备和接种。对于6小时的测定，可以在工作台上进行设置。
[0302]
将3.2ml预热的(37℃)测定缓冲液添加到15ml锥形管中。从储存中取出一小瓶ctla
‑
4效应子细胞，并在干冰上转移至工作台。将细胞在37℃水浴中加热直至融化(约2
‑
3分钟)。轻轻混合细胞悬液，并将细胞(0.8ml)转移到装有3.2ml测定缓冲液的15ml锥形管中。通过轻轻倒置或移液1
‑
2次使其充分混合后，将细胞悬液转移至无菌试剂容器中。使用多通道移液器，将25μl细胞悬浮液立即分配到两个96孔、固态、白色、平底测定板的60个内部孔中。将75μl测定缓冲液添加至测定板的每个外部孔中。将测定板盖上盖子并保持在环境温度(22
‑
25℃)下。
[0303]
使用多通道移液器，根据板将25μl适当的抗体稀释液添加至平板ctla
‑
4效应子细胞。将测定板盖上盖子，并在制备aapc/raji细胞时保持在环境温度(22
‑
25℃)下。
[0304]
准备和平板接种aapc/raji细胞
[0305]
该试剂盒中包括的解冻和使用的aapc/raji细胞是敏感的，应严格按照所述方法进行细胞解冻和平板接种程序。细胞试剂不应过度混合或过度加热。将7.2ml预热(37℃)的测定缓冲液添加到15ml锥形管中。从
–
140℃下的存储中取出一小瓶aapc/raji细胞，并在干冰上转移到工作台。将细胞在37℃水浴中融化，直至融化(约2
‑
3分钟)。将细胞(0.8ml)转移至含有7.2ml测定缓冲液的15ml锥形管中。通过轻轻倒置或移液1
‑
2次使其充分混合后，将细胞悬液转移至无菌试剂容器中。使用多通道移液器，将25μl细胞悬液立即分配至预铺板的ctla
‑
4效应子细胞和抗ctla
‑
4对照抗体。最终测定体积为75μl。将测定板盖上盖子，并在37℃，5％co2的培养箱中培养6小时。
[0306]
注意：优化了6小时的测定时间以获取最大的发光讯号。建议最佳测定时间(6
‑
16小时)以实现最佳测定回应。如图所示，电镀ctla
‑
4效应子细胞和aapc/raji细胞将导致效应子：靶细胞的比例为2：1。如果需要更高的发光讯号，可以将aapc/raji细胞的稀释体积减半，以达到效应子：靶细胞的比例为1：1。
[0307]
添加bio
‑
glo
tm
试剂
[0308]
当添加到测定板上时，bio
‑
glo
tm
试剂应处于环境温度(22
‑
25℃)下。从培养箱中取出测定板，并平衡至环境温度10
‑
15分钟。使用手动多通道移液器，将75μl bio
‑
glo
tm
试剂添加到测定板的内部60个孔中，注意不要产生气泡。将75μl bio
‑
glo
tm
试剂添加到每个测定板的b1、c1和d1孔中以测量背景讯号，并在环境温度下培养5
‑
15分钟。使用发光计发光板读取器测量发光。
[0309]
图25a
‑
25l呈现了ctla
‑
4阻断测定的结果，以评估变体cd80
‑
fc融合蛋白阻断ctla
‑
4/cd28相互作用功能的能力。表17总结了图25a
‑
25l中呈现的具有ec
50
(ug/ml)值的ctla
‑
4阻断测定的结果。ec
50
(ug/ml)是在结合测定中给出最大回应一半的蛋白质的浓度或值。
[0310]
表17
[0311]
[0312][0313]
示例5
[0314]
cd80变体的共刺激活性
[0315]
tcr/cd3效应子细胞(il
‑
2)(promega)用于评估cd80变体的共刺激活性。
[0316]
简要地，在测定设置之前，新鲜扩增tcr/cd3效应子(il
‑
2)细胞。在含10％fbs的rpmi
‑
1640中以2x106细胞/ml的浓度制备tcr/cd3效应子细胞(il
‑
2)。对于一个96孔板，在5ml细胞悬液中加入1ug/ml小鼠抗人cd3抗体(okt3，bioleged cat#317326)和150ul山羊抗huigg珠(abramag：cat#pn544060)。细胞、抗体和珠子的混合物以50ul/孔分布在不透明的96孔板上。为了制备测试化合物，以30ug/ml的浓度制备了cd80
‑
fc野生型(wt)和cd80
‑
fc变体，并重复1：3连续稀释。将25μl测试化合物转移至每个孔中，板上的最终体积为75μl/孔。在空白孔中加入75微升培养基，以测量背景读数。将板在37℃，5％co2的培养箱中培养6小时。培养后，将75μl bio
‑
glo
tm
试剂(promega)添加到测定板的每个孔中，在环境温度下培养3分钟。相对发光单位(rlu)读数是使用发光读板仪(clariostar，bmglabtech)测量的。
[0317]
使用graphpad软件绘制相对发光单位(rlu)读数，并使用[激动剂]vs.回应程序进行分析
‑
可变斜率(四个参数)
‑
最小二乘法拟合以确定ec
50
值。
[0318]
图26a
‑
26h显示了变体cd80
‑
fc融合蛋白的共刺激活性的结果。表18总结了图26a
‑
26h中呈现的具有ec
50
(ug/ml)值的结果。ec
50
(ug/ml)是在结合测定中给出最大回应一半的蛋白质的浓度或值。
[0319]
表18
[0320]
[0321][0322]
示例6
[0323]
突变cd80在肿瘤生长中的体内功效评价
[0324]
(1)在ct26同系小鼠模型中的抑制
[0325]
在ct26同系小鼠模型中测试了cd80变体在肿瘤生长抑制中的功效评估。将ct26细胞以1.0x106细胞/小鼠皮下接种到7只balb/c小鼠中。每周对小鼠进行三次肿瘤生长监测。
[0326]
当平均肿瘤体积达到约60
‑
100mm3时，将小鼠随机分配至不同组(每实验组n＝7只小鼠)。这些荷瘤小鼠在第0天、第3天和第7天用1mg/kg的cd80变体通过静脉内注射治疗。每周测量三次肿瘤和体重，以监测疗效和毒性。
[0327]
图27呈现了在ct26同基因小鼠模型中cd80变体的抗肿瘤活性的结果。
[0328]
(2)mc
‑
38同系小鼠模型的抑制作用
[0329]
在mc
‑
38同基因小鼠模型中测试了cd80变体在肿瘤生长抑制中的功效评估。将mc
‑
38细胞以1.0
×
106细胞/小鼠皮下接种到七只c57bl/6小鼠中。每周两次监测小鼠的肿瘤生
长。
[0330]
当平均肿瘤体积达到约90mm3时，将小鼠随机分配至不同组(每实验组n＝7只小鼠)。这些荷瘤小鼠在第1天、第4天和第8天用cd80变体以150μg/小鼠的剂量进行静脉注射治疗。每周两次测量肿瘤和体重，以监测疗效和毒性。
[0331]
图28呈现了在mc
‑
38同基因小鼠模型中cd80变体的抗肿瘤活性的结果。
[0332]
示例7
[0333]
通过elisa评估小鼠cd80变体对小鼠cd28、小鼠pd
‑
l1和小鼠ctla
‑
4的结合亲和力
[0334]
以野生型mcd80为对照品，在同一elisa板上检测小鼠cd80变体对小鼠cd28、小鼠pd
‑
l1和小鼠ctla
‑
4的结合情况。这项研究是对人类研究的替代。制成了小鼠cd80的变体，野生型小鼠cd80在图14b中示出。
[0335]
通过elisa的结合亲和力测定的结果显示在图29a
‑
29d中(小鼠cd80变体对小鼠cd28的结合亲和力)。表19总结了图29a
‑
29d中呈现的结合测定的结果，以及每个受试小鼠cd80
‑
fc融合蛋白(包括，t165e、t165q、t165r、t165a、t165s、t165v、t165i、t165f、t165d、s131v、s131i、s131f、s131r、s131e、s131q、s131a和s131p)的ec
50
(ug/ml)值。ec
50
(ug/ml)是在结合测定中给出最大回应一半的蛋白质的浓度或值。
[0336]
通过elisa的结合亲和力测定的结果显示在图30a
‑
30d中(小鼠cd80变体对小鼠pd
‑
l1的结合亲和力)。表20总结了图30a
‑
30d中呈现的结合测定的结果，以及每个受试小鼠cd80
‑
fc融合蛋白(包括，t165e、t165q、t165r、t165a、t165s、t165v、t165i、t165f、t165d、s131v、s131i、s131f、s131r、s131e、s131q、s131a和s131p)的ec
50
(ug/ml)值。ec
50
(ug/ml)是在结合测定中给出最大回应一半的蛋白质的浓度或值。
[0337]
通过elisa的结合亲和力测定的结果显示在图31a
‑
31d中(小鼠cd80变体对小鼠ctla4的结合亲和力)。表21总结了图31a
‑
31d中呈现的结合测定的结果，以及每个受试小鼠cd80
‑
fc融合蛋白(包括，t165e、t165q、t165r、t165a、t165s、t165v、t165i、t165f、t165d、s131v、s131i、s131f、s131r、s131e、s131q、s131a和s131p)的ec
50
(ug/ml)值。ec
50
(ug/ml)是在结合测定中给出最大回应一半的蛋白质的浓度或值。
[0338]
表19
[0339] ec
50
a.mcd80(wt)3.606mcd80(t165e)10.59mcd80(t165q)3.462mcd80(t165r)6.914mcd80(t165a)5.705mcd80(t165s)1.603b.mcd80(wt)3.499mcd80(t165v)17.56mcd80(t165i)17.69mcd80(t165f)18.27mcd80(t165d10.37mcd80(s131v)11.19
c.mcd80(wt)5.467mcd80(s131i)19.25mcd80(s131f)3.485mcd80(s131r)5.127mcd80(s131e)3.755mcd80(s131q)2.879d.mcd80(wt)4.343mcd80(s131a)3.709mcd80(s131p)15.3
[0340]
表20
[0341] ec
50
a.mcd80(wt)8.987mcd80(t165e)3.865mcd80(t165q)4.261mcd80(t165r)4.97mcd80(t165a)4.795mcd80(t165s)6.856b.mcd80(wt)9.688mcd80(t165v)5.873mcd80(t165i)7.567mcd80(t165f)17.13mcd80(t165d5.879mcd80(s131v)6.079c.mcd80(wt)9.914mcd80(s131i)8.58mcd80(s131f)7.044mcd80(s131r)4.661mcd80(s131e)9.23mcd80(s131q)8.217d.mcd80(wt)8.698mcd80(s131a)8.801mcd80(s131p)6.098
[0342]
表21
[0343][0344][0345]
示例8
[0346]
小鼠cd80变体在肿瘤生长中的体内功效评估
[0347]
可以在ct26或mc
‑
38同系小鼠模型中测试cd80变体对肿瘤生长抑制的功效评估。为了进行测试，使用了小鼠cd80蛋白作为人类蛋白的替代物。为了测试，将ct26或mc
‑
38细胞以1.0x106细胞/小鼠皮下接种到小鼠中。每周三次监测小鼠肿瘤生长。
[0348]
当平均肿瘤体积达到约100mm3时，将小鼠随机分配至不同组(例如，每个实验组n＝7只小鼠)。在第0天、第3天和第7天通过静脉内注射用1mg/kg的小鼠cd80变体治疗这些荷瘤小鼠。每周测量三次肿瘤和体重、以监测疗效和毒性。
[0349]
通过引用合并
[0350]
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