谷氨酸棒杆菌蛋白Ncgl0717及其表面展示系统和构建方法与流程

谷氨酸棒杆菌蛋白ncgl0717及其表面展示系统和构建方法
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，特别涉及一种谷氨酸棒杆菌蛋白ncgl0717及其表面展示系统和构建方法。


背景技术：

2.微生物细胞表面展示技术是利用基因工程手段通过多肽片段(或蛋白质结构域)将目的片段以融合蛋白形式在微生物表面进行展示的新型基因工程技术，具体而言，是一种通过锚定蛋白将蛋白质或多肽固定在细胞表面的技术，被展示的多肽或蛋白可以保持相对独立的空间结构和生物活性。微生物细胞表面展示系统包括宿主菌、锚定蛋白和靶蛋白，有时在锚定蛋白和靶蛋白之间也添加一段连接(linker)序列。微生物细胞表面展示在多肽分离、全细胞催化剂、全细胞吸附剂、疫苗和抗体生产、蛋白文库筛选、生物传感器、生物修复等方面都有广阔的应用前景。
3.目前在微生物表面展示系统中应用比较多的宿主菌主要有噬菌体(bacteriophages)、酿酒酵母(saccharomy cescerevisiae)、革兰氏阴性菌(大肠杆菌(escherichia.coli)等)、和革兰氏阳性菌(谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)，枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)等)。表面展示使用的锚定蛋白一般具有以下特征：(1)较牢固地锚定在细胞表面；(2)可以与靶蛋白序列有效融合而不影响靶蛋白的结构和功能。革兰氏阳性菌展示系统的锚定蛋白主要有：(1)膜相关蛋白(具有跨膜结构域或脂蛋白)；(2)细胞壁相关蛋白(具有c末端leu
‑
pro
‑
x
‑
thr
‑
gly(lpxtg)基序或细胞壁结合结构域(cwbd))。
4.谷氨酸棒杆菌具有鲁棒性强、较低的细胞外蛋白酶活性、广泛的天然碳源底物等优点，在微生物细胞表面展示方面的应用具有非常广阔的前景。目前，谷氨酸棒杆菌的展示系统可用的锚定蛋白较少，仅具有三种类型：外源蛋白(pgsa)，霉菌酰化蛋白(ncgl1337，孔蛋白系列蛋白porb、porc)和膜蛋白(ncgl1221，又名机械通道蛋白msccg)。目前这些锚蛋白已将许多种酶蛋白，例如淀粉酶，葡聚糖酶，葡糖苷酶，纤维素酶复合物等成功地展示在谷氨酸棒杆菌表面。为增加谷氨酸棒杆菌细胞表面展示技术的多功能性，有必要开发新的和有效的锚定基序。
5.choi等(choi j w,yim s s,jeong k j.development of a potential protein display platform in corynebacterium glutamicum using mycolic acid layer protein,ncgl1337,as an anchoring motif[j].biotechnology journal,2017:1700509.)报道了利用谷氨酸棒杆菌霉菌酸层蛋白ncgl1337作为锚定蛋白进行外源蛋白的细胞表面展示。yao等(display of alpha
‑
amylase on the surface of corynebacterium glutamicum cells by using ncgl1221 as the anchoring protein,and production of glutamate from starch.archives of microbiology.2009)报道了利用谷氨酸棒杆菌膜蛋白ncgl1221作为锚定蛋白进行外源蛋白的细胞表面展示。但目前谷氨酸棒杆菌的锚定蛋白的种类和数量较少，展示体系较为单一。


技术实现要素：

[0006]
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种谷氨酸棒杆菌蛋白ncgl0717。
[0007]
本发明的另一目的在于提供编码所述谷氨酸棒杆菌蛋白ncgl0717的基因。
[0008]
本发明的又一目的在于提供一种谷氨酸棒杆菌细胞表面展示系统。
[0009]
本发明的再一目的在于提供所述谷氨酸棒杆菌细胞表面展示系统的构建方法。
[0010]
本发明的目的通过下述技术方案实现：
[0011]
一种谷氨酸棒杆菌蛋白ncgl0717，其氨基酸序列如seq id no:1所示。
[0012]
所述的谷氨酸棒杆菌壁蛋白由261个氨基酸组成，大小约为26.91kda。
[0013]
编码所述谷氨酸棒杆菌蛋白ncgl0717的基因，其核苷酸序列如seq id no:2所示。
[0014]
所述的谷氨酸棒杆菌蛋白ncgl0717作为锚定蛋白在表面展示系统中的应用。
[0015]
所述的表面展示系统为谷氨酸棒杆菌细胞表面展示系统。
[0016]
所述的谷氨酸棒杆菌蛋白ncgl0717作为锚定蛋白在表面展示系统中的应用，其中，所述的谷氨酸棒杆菌细胞表面展示系统是以所述谷氨酸棒杆菌壁蛋白ncgl0717为锚定蛋白将靶蛋白固定在谷氨酸棒杆菌细胞表面构成的。
[0017]
一种谷氨酸棒杆菌细胞表面展示系统，是以所述的谷氨酸棒杆菌壁蛋白ncgl0717为锚定蛋白，将靶蛋白固定在谷氨酸棒杆菌细胞表面构成的。
[0018]
所述的靶蛋白为荧光蛋白或淀粉酶中的任意一种；优选为增强绿色荧光蛋白(egfp)、红色荧光蛋白(mcherry)或α
‑
淀粉酶(α
‑
amylase)。
[0019]
所述的谷氨酸棒杆菌优选为谷氨酸棒杆菌atcc13032。
[0020]
所述的谷氨酸棒杆菌细胞表面展示系统的构建方法，包括如下步骤：
[0021]
(1)将编码所述谷氨酸棒杆菌蛋白ncgl0717的基因克隆到表达载体的表达盒中，得到以谷氨酸棒杆菌壁蛋白ncgl0717为锚定蛋白的表面展示表达载体；
[0022]
(2)将靶蛋白的基因序列克隆到步骤(1)中得到的表面展示表达载体的谷氨酸棒杆菌壁蛋白ncgl0717的基因序列的上游，与所述谷氨酸棒杆菌壁蛋白ncgl0717的基因形成融合基因；
[0023]
(3)转化谷氨酸棒杆菌，然后根据表达载体上的筛选标记筛选阳性转化子，即得到所述谷氨酸棒杆菌细胞表面展示系统。
[0024]
所述的谷氨酸棒杆菌细胞表面展示系统的构建方法，具体包括如下步骤：
[0025]
(i)将编码所述谷氨酸棒杆菌蛋白ncgl0717的基因、靶蛋白的基因和表达载体通过同源重组的方式，构建得到重组质粒；
[0026]
(ii)将步骤(i)中得到重组质粒转化谷氨酸棒杆菌，挑取阳性转化子，得到所述谷氨酸棒杆菌细胞表面展示系统。
[0027]
步骤(i)中所述的编码所述谷氨酸棒杆菌蛋白ncgl0717的基因序列如seq id no:2所示。
[0028]
步骤(i)中所述的靶蛋白为荧光蛋白或淀粉酶中的任意一种；优选为增强绿色荧光蛋白(egfp)、红色荧光蛋白(mcherry)或α
‑
淀粉酶(α
‑
amylase)；更优选为α
‑
淀粉酶。
[0029]
所述的增强绿色荧光蛋白(egfp)的核苷酸序列如seq id no:5所示。
[0030]
所述的红色荧光蛋白(mcherry)的核苷酸序列如seq id no:17所示。
[0031]
所述的α
‑
淀粉酶(amye基因)的核苷酸序列如seq id no:21所示。
[0032]
步骤(i)中所述的表达载体为本领域常规带有卡那霉素抗性的谷氨酸棒杆菌表达载体；优选为谷氨酸棒杆菌表达载体pec
‑
xk99e(表达载体为pec
‑
xk99e时，构建表面展示表达载体后，将靶蛋白的基因序列通过同源重组克隆连接到所述表面展示表达载体的谷氨酸棒杆菌壁蛋白基因序列下游)。
[0033]
步骤(ii)中所述的谷氨酸棒杆菌优选为谷氨酸棒杆菌atcc13032。
[0034]
所述的谷氨酸棒杆菌蛋白ncgl0717、编码所述谷氨酸棒杆菌蛋白ncgl0717的基因或谷氨酸棒杆菌细胞表面展示系统在制备淀粉酶中的应用。
[0035]
所述的淀粉酶优选为α
‑
淀粉酶。
[0036]
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0037]
(1)本发明提供了一种谷氨酸棒杆菌壁蛋白ncgl0717，是谷氨酸棒杆菌内源壁蛋白，且在谷氨酸棒杆菌中表达量较高，与现已用于谷氨酸棒杆菌表面展示系统的内源锚定蛋白ncgl1221蛋白相比，壁蛋白ncgl0717展示的效率更高，因此，可将其用于构建高展示效率的谷氨酸棒杆菌表面展示系统。
[0038]
(2)本发明中谷氨酸棒杆菌表面展示系统是以谷氨酸棒杆菌壁蛋白ncgl0717为锚定蛋白，将靶蛋白(如荧光蛋白或淀粉酶等)固定在谷氨酸棒杆菌细胞表面构成的，丰富了谷氨酸棒杆菌表面展示系统的内源锚定蛋白的表达种类。
附图说明
[0039]
图1是重组菌cg/ncgl0717
‑
egfp与阴性对照菌cg/egfp以及阳性对照菌cg/ncgl1221
‑
egfp、cg/ncgl1337
‑
egfp的流式细胞仪检测结果图。
[0040]
图2是cg/ncgl0717
‑
egfp的激光共聚焦显微镜检测结果图。
[0041]
图3是重组菌cg/ncgl0717
‑
mcherry和阴性对照菌株atcc13032以及阳性对照菌cg/ncgl1221
‑
mcherry、cg/ncgl1337
‑
mcherry的流式细胞仪检测结果图。
[0042]
图4是cg/ncgl0717
‑
mcherry的激光共聚焦显微镜检测结果图。
[0043]
图5是重组菌的淀粉酶酶活情况图(图中，wt：谷氨酸棒杆菌atcc13032；nc：阴性对照菌株cg/pec
‑
xk99e；pc1：阳性对照菌株cg/ncgl1221
‑
amy；pc2：阳性对照菌株cg/ncgl1337
‑
amy；ncgl0717：重组菌株cg/ncgl0717
‑
amy)。
[0044]
图6是重组菌cg/ncgl0717
‑
amy以及对照菌株atcc13032、cg/pec
‑
xk99e的生长曲线图；其中，a为菌株在以葡萄糖为唯一碳源时的生长曲线；b为菌株在以淀粉为唯一碳源时的生长曲线。
具体实施方式
[0045]
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件。除非特别说明，本发明所用试剂和原材料均可通过市售获得。
[0046]
术语解释
[0047]
lb平板：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，nacl 5g/l，琼脂20g/l。
[0048]
lbh平板：酵母粉2.5g/l，蛋白胨5g/l，nacl 5g/l，脑心浸液(bactotm brain heart infusion)18.5g/l，山梨醇91g/l和20g/l琼脂。
[0049]
bhisg培养基：脑心浸液37g/l，山梨醇9.1g/l，葡萄糖10g/l。
[0050]
10
×
pbs(磷酸盐缓冲盐水)：40g nacl，1g kcl，7.1g na2hpo4、1.2g kh2po4，将上述试剂溶于400ml水中，将ph调节至7.4，定容至500ml)。
[0051]1×
pbs：10
×
pbs稀释10倍。
[0052]
mops缓冲液：10ml 0.5m 3
‑
(n
‑
吗啉基)丙磺酸(mops)(ph 6.9)，并稀释10倍。
[0053]
实施例1：谷氨酸棒杆菌壁蛋白ncgl0717表面展示载体pec
‑
egfp的构建
[0054]
(1)谷氨酸棒杆菌壁蛋白ncgl0717基因的克隆
[0055]
根据谷氨酸棒杆菌壁蛋白ncgl0717(氨基酸序列如seq id no:1所示)的基因序列(seq id no:2)，靶蛋白egfp基因以及谷氨酸棒杆菌质粒pec
‑
xk99e(购自novagen)上的序列特征，设计扩增引物：
[0056]
p1：5'
‑
atgaaaggaggcccttcagatgaaaacagaaactcgacgagccctc
‑
3'(seq id no:3)；
[0057]
p2：5'
‑
cttatcgtcatcatccttgtaatcgctcgtggcagttggttccac
‑
3'(seq id no:4)。
[0058]
以谷氨酸棒杆菌atcc13032的基因组dna为模板，以p1和p2为引物，通过pcr方法扩增出壁蛋白ncgl0717基因序列，扩增条件为：预变性94℃5分钟；再进行30个以下循环：94℃变性30秒、tm
‑
5℃(tm为解链温度；下同)退火30秒、68℃延伸1分钟；最后68℃延伸10分钟。
[0059]
(2)靶蛋白egfp基因的克隆
[0060]
根据靶蛋白egfp基因(seq id no:5)以及谷氨酸棒杆菌质粒pec
‑
xk99e上的序列特征，设计扩增引物：
[0061]
p3：5'
‑
gattacaaggatgatgacgataagatggtgagcaagggcgagga
‑
3'(seq id no:6)；
[0062]
p4：5'
‑
tcgtcatcatccttgtaatcttacttgtacagctcgtccatg
‑
3'(seq id no:7)。
[0063]
以谷氨酸棒杆菌atcc13032的基因组dna为模板，以p3和p4为引物，通过pcr方法扩增出靶蛋白egfp基因，扩增条件为：预变性94℃5分钟；再进行30个以下循环：94℃变性30秒、tm
‑
5℃退火30秒、68℃延伸1分钟；最后68℃延伸10分钟。
[0064]
(3)载体pec
‑
xk99e的克隆
[0065]
根据谷氨酸棒杆菌壁蛋白ncgl0717的基因序列(seq id no:2)，靶蛋白egfp基因以及谷氨酸棒杆菌质粒pec
‑
xk99e上的序列特征，设计扩增引物：
[0066]
p5：5'
‑
gattacaaggatgatgacgataagggctgttttggcg
‑
3'(seq id no:8)；
[0067]
p6：5'
‑
ctgaagggcctcctttcatggtctgtttcctgtgtg
‑
3'(seq id no:9)。
[0068]
以pec
‑
xk99e为模板，以p5和p6为引物，通过pcr方法扩增出载体pec
‑
xk99e的基因序列，扩增条件为：预变性94℃5分钟；再进行30个以下循环：94℃变性30秒、tm
‑
5℃退火30秒、68℃延伸2分钟；最后68℃延伸10分钟。
[0069]
(4)载体pec/ncgl0717
‑
flag
‑
egfp的构建
[0070]
将步骤(1)中得到的谷氨酸棒杆菌壁蛋白ncgl0717基因的pcr产物，步骤(2)中得到的egfp绿色荧光蛋白基因的pcr产物与步骤(3)中得到的谷氨酸棒杆菌表达质粒pec
‑
xk99e的pcr产物经过gibson同源重组(该步骤使用seamless assembly克隆试剂盒)连接，将连接体系转化大肠杆菌宿主top10(购自novagen)。用含50mg/l卡那霉素的lb平板筛选转化子，使用鉴定引物p7和p8挑取阳性的转化子，提取质粒，鉴定并测序，结果表明壁蛋白
ncgl0717基因序列正确转化，且flag标签在所述壁蛋白ncgl0717基因的上游。
[0071]
其中涉及的引物序列如下：
[0072]
p7：5'
‑
cactgcataattcgtgtcgctcaaggcgcactcc
‑
3'(seq id no:10)；
[0073]
p8：5'
‑
gtcgccgtccagctcgaccaggatg
‑
3'(seq id no:11)。
[0074]
(5)重组谷氨酸棒杆菌表面展示体系cg/ncgl0717
‑
egfp的构建和鉴定
[0075]
用电转法将步骤(4)中得到的质粒pec/ncgl0717
‑
flag
‑
egfp转化谷氨酸棒杆菌atcc13032，在lbh平板上挑取阳性转化子，以p7、p8为引物，进行pcr扩增，结果证明质粒pec/ncgl0717
‑
flag
‑
egfp的基因序列转化到了谷氨酸棒杆菌atcc13032中，得到的重组菌命名为cg/ncgl0717
‑
egfp。
[0076]
(6)重组谷氨酸棒杆菌表面展示体系cg/ncgl0717
‑
egfp的阴性对照菌株cg/egfp和阳性对照菌株cg/ncgl1221
‑
egfp、cg/ncgl1337
‑
egfp的构建和鉴定
[0077]
①
阴性对照菌株cg/egfp的构建：以egfp(seq id no:5)为模板，以p9和p4为引物，通过pcr方法扩增出egfp的基因序列；以谷氨酸棒杆菌质粒pec
‑
xk99e为模板，以p5和p6为引物，通过pcr方法扩增出pec
‑
xk99e的基因序列；然后将egfp基因的pcr产物与谷氨酸棒杆菌表达质粒pec
‑
xk99e的pcr产物经过gibson同源重组连接，最后构建阴性对照菌株cg/egfp，具体制备与鉴定方法参见上述步骤(1)～(5)；
[0078]
②
阳性对照菌株cg/ncgl1221
‑
egfp的构建：以谷氨酸棒杆菌atcc13032基因组dna为模板，以p10和p11为引物，通过pcr方法扩增出ncgl1221的基因序列；然后将ncgl1221基因的pcr产物、步骤(2)中得到的egfp基因的pcr产物与步骤(3)中得到的谷氨酸棒杆菌表达质粒pec
‑
xk99e的pcr产物经过gibson同源重组连接，最后构建阳性对照菌株cg/ncgl1221
‑
egfp，鉴定方法参见上述步骤(1)～(5)；
[0079]
③
阳性对照菌株cg/ncgl1337
‑
egfp的构建：以谷氨酸棒杆菌atcc13032基因组dna为模板，以p12和p13为引物，通过pcr方法扩增出ncgl1337的基因序列；然后将将ncgl1337基因的pcr产物、步骤(2)中得到的egfp基因的pcr产物与步骤(3)中得到的谷氨酸棒杆菌表达质粒pec
‑
xk99e的pcr产物经过gibson同源重组连接，最后构建阳性对照菌株cg/ncgl1337
‑
egfp，鉴定方法参见上述步骤(1)～(5)；
[0080]
其中涉及的引物序列如下：
[0081]
p9：5'
‑
catgaaaggaggcccttcagatggattacaaggatgatgacgataagatggtgagcaagggcgag
‑
3'(seq id no:12)；
[0082]
p10：5'
‑
catgaaaggaggcccttcagatgattttaggcgtacccattcaatatttg
‑
3'(seq id no:13)；
[0083]
p11：5'
‑
cttatcgtcatcatccttgtaatcaggggtggacgtcggcgcaactgtc
‑
3'(seq id no:14)；
[0084]
p12：5'
‑
catgaaaggaggcccttcagatggctcagcgaaaactggcctc
‑
3'(seq id no:15)；
[0085]
p13：5'
‑
cttatcgtcatcatccttgtaatcggcgtttactcgatctcgcaggatc
‑
3'(seq id no:16)。
[0086]
(7)重组谷氨酸棒杆菌表面展示体系cg/ncgl0717
‑
egfp的流式细胞仪分析与共聚焦显微镜分析
[0087]
将重组菌cg/ncgl0717
‑
egfp接种于5ml、含0.5mm iptg(异丙基β
‑
d
‑1‑
硫代半乳糖
苷)的bhisg培养基中，在30℃、220rpm条件下诱导和培养24小时，离心后重悬，添加抗flag单克隆抗体和alexa fluor 647标记的山羊抗鼠igg抗体(抗体均购自碧云天)孵育后重悬。最后，使用c6 plus流式细胞仪测量荧光强度。同时，以cg/egfp为阴性对照，cg/ncgl1221
‑
egfp和cg/ncgl1337
‑
egfp为阳性对照。
[0088]
流式细胞仪检测结果如图1(图1中的m表示comp
‑
fl
‑
a::apc
‑
a_area的平均值)所示：结果显示与阴性对照菌株cg/egfp、阳性对照菌cg/ncgl1221
‑
egfp、cg/ncgl1337
‑
egfp相比，重组菌cg/ncgl0717
‑
egfp的荧光发生较大偏移，表明在重组菌cg/ncgl0717
‑
egfp的细胞表面成功地表达了壁蛋白ncgl0717
‑
egfp融合蛋白。
[0089]
随后，对样品进行离心和再悬浮，然后将其涂覆在显微镜载玻片上，最后通过共聚焦显微镜进行观察，结果显示二抗的红色荧光显示在重组菌cg/ncgl0717
‑
egfp的表面(图2)(图2中：egfp表示egfp荧光蛋白激发出的荧光；alexa fluor647表示alexa fluor647抗体激发出的荧光)，再次验证了重组菌cg/ncgl0717
‑
egfp的细胞表面成功地表达了谷氨酸棒杆菌壁蛋白ncgl0717
‑
egfp的融合蛋白。
[0090]
实施例2：谷氨酸棒杆菌壁蛋白ncgl0717表面展示载体pec
‑
ncgl0717
‑
mcherry的构建
[0091]
(1)谷氨酸棒杆菌壁蛋白ncgl0717基因的克隆
[0092]
根据谷氨酸棒杆菌壁蛋白ncgl0717的基因序列(seq id no:2)，靶蛋白mcherry基因以及谷氨酸棒杆菌质粒pec
‑
xk99e上的序列特征，设计扩增引物p1和p2，通过pcr方法扩增得到谷氨酸棒杆菌壁蛋白ncgl0717基因序列，具体制备方法参见实施例1步骤(1)。
[0093]
(2)靶蛋白mcherry基因的克隆
[0094]
根据谷氨酸棒杆菌壁蛋白ncgl0717的基因序列(seq id no:2)，靶蛋白mcherry基因(seq id no:17)以及谷氨酸棒杆菌质粒pec
‑
xk99e上的序列特征，设计扩增引物p14和p15，通过pcr方法扩增得到靶蛋白mcherry基因，制备方法参见实施例1。
[0095]
p14：5'
‑
gattacaaggatgatgacgataagatggtttccaagggcgaggaggac
‑
3'
[0096]
(seq id no:18)；
[0097]
p15：5'
‑
cagcccttatcgtcatcatccttgtaatcttacttgtagagttcgtccatg
‑
3'(seq id no:19)。
[0098]
(3)载体pec
‑
xk99e的克隆
[0099]
根据谷氨酸棒杆菌壁蛋白ncgl0717的基因序列(seq id no:2)，靶蛋白mcherry基因以及谷氨酸棒杆菌质粒pec
‑
xk99e上的序列特征，设计扩增引物p5和p6，通过pcr方法扩增出载体pec
‑
xk99e的基因序列，具体制备方法参见实施例1步骤(3)。
[0100]
(4)载体pec/ncgl0717
‑
mcherry的构建
[0101]
将步骤(1)中得到的谷氨酸棒杆菌壁蛋白ncgl0717基因的pcr产物，步骤(2)中得到的mcherry基因的pcr产物与步骤(3)中得到的谷氨酸棒杆菌表达质粒pec
‑
xk99e的pcr产物经过gibson同源重组连接(方法同实施例1)，将连接后的体系转化大肠杆菌宿主top10。用含50mg/l卡那霉素的lb平板筛选转化子，使用鉴定引物p7和p16挑取阳性的转化子，提取质粒，鉴定并测序，得到重组谷氨酸棒杆菌表面展示表达质粒pec/ncgl0717
‑
mcherry，且flag标签在所述壁蛋白ncgl0717基因的上游。其中涉及的引物序列如下：
[0102]
p16：5'
‑
cttgtaggtggtcttaacctcagcgtcgtagtgaccg
‑
3'(seq id no:20)。
[0103]
(5)重组谷氨酸棒杆菌表面展示体系pec/ncgl0717
‑
mcherry的构建和鉴定
[0104]
用电转法将步骤(4)中得到的质粒pec/ncgl0717
‑
mcherry转化谷氨酸棒杆菌atcc13032，在lbh平板上挑取阳性转化子，以p7、p11为引物，进行pcr扩增，结果证明质粒pec/ncgl0717
‑
mcherry的基因序列转化到了谷氨酸棒杆菌atcc13032中，得到的重组菌命名为cg/ncgl0717
‑
mcherry。
[0105]
(6)重组谷氨酸棒杆菌表面展示体系cg/ncgl0717
‑
mcherry的阴性对照菌株cg/pec
‑
xk99e和阳性对照菌株cg/ncgl1221
‑
mcherry、cg/ncgl1337
‑
mcherry的构建和鉴定
[0106]
①
阳性对照菌株cg/ncgl1221
‑
mcherry的构建：以谷氨酸棒杆菌atcc13032基因组dna为模板，以p10和p11为引物，通过pcr方法扩增出ncgl1221的基因序列；然后将ncgl1221基因的pcr产物、步骤(2)中得到的mcherry基因的pcr产物与步骤(3)中得到的谷氨酸棒杆菌表达质粒pec
‑
xk99e的pcr产物经过gibson同源重组连接，最后构建阳性对照菌株cg/ncgl1221
‑
mcherry，鉴定方法参见实施例1。
[0107]
②
阳性对照菌株cg/ncgl1337
‑
mcherry的构建：以谷氨酸棒杆菌atcc13032基因组dna为模板，以p12和p13为引物，通过pcr方法扩增出ncgl1337的基因序列；然后将ncgl1337基因的pcr产物、步骤(2)中得到的mcherry基因的pcr产物与步骤(3)中得到的谷氨酸棒杆菌表达质粒pec
‑
xk99e的pcr产物经过gibson同源重组连接，最后构建阳性对照菌株cg/ncgl1337
‑
mcherry，鉴定方法参见实施例1。
[0108]
(7)重组谷氨酸棒杆菌cg/ncgl0717
‑
mcherry和对照菌株的流式细胞仪分析与共聚焦显微镜分析
[0109]
将重组菌cg/ncgl0717
‑
mcherry和对照菌株接种于5ml、含0.5mm iptg的bhisg培养基中，在30℃、220rpm条件下诱导和培养24小时，离心后重悬，添加抗flag单克隆抗体和alexa fluor488标记的山羊抗鼠igg抗体(抗体均购自碧云天)孵育后重悬。最后，使用c6 plus流式细胞仪测量荧光强度。同时，以菌株atcc13032为阴性对照，cg/ncgl1221
‑
mcherry和cg/ncgl1337
‑
mcherry为阳性对照。
[0110]
结果如图3(图3中的m表示comp
‑
fl
‑
a::fitc
‑
a_area的平均值)所示：结果显示与阴性对照菌株atcc13032、阳性对照菌cg/ncgl1221
‑
mcherry、cg/ncgl1337
‑
mcherry相比，重组菌cg/ncgl0717
‑
mcherry的荧光发生较大偏移，表明在重组菌cg/ncgl0717
‑
mcherry的细胞表面成功地表达了谷氨酸棒杆菌壁蛋白ncgl0717
‑
mcherry融合蛋白。
[0111]
随后，对样品进行离心和再悬浮，然后将其涂覆在显微镜载玻片上，最后通过共聚焦显微镜进行观察，结果显示二抗的绿色荧光显示在重组菌cg/ncgl0717
‑
mcherry的表面(图4)(图4中：mcherry表示mcherry荧光蛋白激发出的荧光；alexa fluor647表示alexa fluor647抗体激发出的荧光)，再次验证了重组菌cg/ncgl0717
‑
mcherry的细胞表面成功地表达了谷氨酸棒杆菌壁蛋白ncgl0717
‑
mcherry的融合蛋白。
[0112]
实施例3：谷氨酸棒杆菌壁蛋白ncgl0717表面展示载体pec
‑
amy的构建
[0113]
(1)谷氨酸棒杆菌壁蛋白ncgl0717基因的克隆
[0114]
根据谷氨酸棒杆菌壁蛋白ncgl0717的基因序列(seq id no:2)，设计扩增引物，通过pcr方法扩增得到谷氨酸棒杆菌壁蛋白ncgl0717基因序列，具体制备方法参见实施例1步骤(1)。
[0115]
(2)靶蛋白α
‑
amylase基因的克隆
[0116]
根据靶蛋白α
‑
淀粉酶(α
‑
amylase ec 3.2.1.1)的基因amye(amye基因来源于枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)168；序列如seq id no:21所示)设计扩增引物p17和p18，以枯草芽孢杆菌168的基因组为模板，通过pcr方法扩增得到靶蛋白α
‑
淀粉酶的基因序列，制备方法参见实施例1：
[0117]
p17：5'
‑
gattacaaggatgatgacgataagatgtttgcaaaacgattcaaaacctctttactgcc
‑
3'(seq id no:22)；
[0118]
p18：5'
‑
cttatcgtcatcatccttgtaatctcaatggggaagagaaccgcttaagcccg
‑
3'(seq id no:23)。
[0119]
(3)载体pec
‑
xk99e的克隆
[0120]
根据谷氨酸棒杆菌质粒pec
‑
xk99e上的序列特征，设计扩增引物p5和p6，通过pcr方法扩增出载体pec
‑
xk99e的基因序列，具体制备方法参见实施例1步骤(3)。
[0121]
(4)载体pec/ncgl0717
‑
amy的构建
[0122]
将步骤(1)中得到的谷氨酸棒杆菌壁蛋白ncgl0717基因的pcr产物，步骤(2)中得到的α
‑
淀粉酶基因的pcr产物与步骤(3)中得到的谷氨酸棒杆菌表达质粒pec
‑
xk99e的pcr产物经过gibson同源重组连接(方法同实施例1)，得到重组谷氨酸棒杆菌表面展示表达质粒pec/ncgl0717
‑
amy，将得到的pec/ncgl0717
‑
amy质粒转化大肠杆菌宿主top10。用含50mg/l卡那霉素的lb平板筛选转化子，挑取阳性的转化子，提取质粒，使用鉴定引物p7和p19鉴定并测序，结果表明壁蛋白ncgl0717基因序列正确转化，且flag标签在所述壁蛋白ncgl0717基因的上游。其中涉及的引物序列如下：
[0123]
p19：5'
‑
gaacgaccaattccatgcatgaagaatggttccgc
‑
3'(seq id no:24)。
[0124]
(5)重组谷氨酸棒杆菌表面展示体系cg/ncgl0717
‑
amy的构建
[0125]
用电转法将步骤(4)中得到的质粒pec/ncgl0717
‑
amy转化谷氨酸棒杆菌atcc13032，在lbh平板上挑取阳性转化子，以p7、p14为引物，进行pcr扩增，结果证明质粒pec/ncgl0717
‑
amy的基因序列转化到了谷氨酸棒杆菌atcc13032中，得到的重组菌命名为cg/ncgl0717
‑
amy。
[0126]
(6)重组谷氨酸棒杆菌表面展示体系ncgl0717
‑
amy的阳性对照菌株cg/ncgl1221
‑
amy、cg/ncgl1337
‑
amy和阴性对照菌株cg/pec
‑
xk99e的构建和鉴定
[0127]
①
阳性对照菌株cg/ncgl1221
‑
amy(pc1)的构建：以谷氨酸棒杆菌atcc13032基因组dna为模板，以p10和p11为引物，通过pcr方法扩增出ncgl1221的基因序列；然后将ncgl1221基因的pcr产物、步骤(2)中得到的amy基因的pcr产物与步骤(3)中得到的谷氨酸棒杆菌表达质粒pec
‑
xk99e的pcr产物经过gibson同源重组连接，最后构建阳性对照菌株cg/ncgl1221
‑
amy，鉴定方法参见实施例1。
[0128]
②
阳性对照菌株cg/ncgl1337
‑
amy(pc2)的构建：以谷氨酸棒杆菌atcc13032基因组dna为模板，以p12和p13为引物，通过pcr方法扩增出ncgl1337的基因序列；然后将ncgl1337基因的pcr产物、步骤(2)中得到的amy基因的pcr产物与步骤(3)中得到的谷氨酸棒杆菌表达质粒pec
‑
xk99e的pcr产物经过gibson同源重组连接，最后构建阳性对照菌株cg/ncgl1337
‑
amy，鉴定方法参见实施例1。
[0129]
③
阴性对照菌株cg/pec
‑
xk99e的构建：将载体pec
‑
xk99e直接转化谷氨酸棒杆菌atcc13032，最后构建阴性对照菌株cg/pec
‑
xk99e，鉴定方法参见实施例1。
[0130]
(7)重组谷氨酸棒杆菌cg/ncgl0717
‑
amy的发酵与淀粉酶酶活性的测定
[0131]
将cg/ncgl0717
‑
amy接种于5ml的bhisg培养基中过夜培养后，再转接于30ml、含0.5mm iptg的bhisg培养基(抗性菌株添加终浓度为25μg/ml的卡那霉素)中在30℃、220rpm下诱导和培养24小时，获得细胞发酵液。淀粉酶活性的测定方法采用enzchek
tm
淀粉酶检测试剂盒(货号e33651)。反应底物包括细胞悬浮液、上清液和细胞发酵液，上清液和细胞悬浮液由细胞发酵液离心获得，细胞悬浮液需由mops缓冲液洗涤3次后重悬，离心条件为6000rpm。酶活性的一个单位(u/ml)定义为在20℃、ph值6.9、3分钟内从淀粉中释放1毫克麦芽糖所需的酶量。以谷氨酸棒杆菌atcc13032、(wt)、cg/pec
‑
xk99e(nc)为阴性对照，以cg/ncgl1221
‑
amy(pc1)、cg/ncgl1337
‑
amy(pc2)为阳性对照。
[0132]
淀粉酶酶活性测定结果如图5所示：结果显示，cg/ncgl0717
‑
amy(ncgl0717)的细胞悬液在24h发酵后酶活达到了的0.16u/ml，高于阳性对照菌cg/ncgl1221
‑
amy(0.13u/ml)。表明α
‑
淀粉酶被ncgl0717蛋白以活性形式成功地展示在谷氨酸棒杆菌细胞表面。
[0133]
(6)重组谷氨酸棒杆菌cg/ncgl0717
‑
amy的生长曲线的测定
[0134]
将从平板上挑选的重组菌株cg/ncgl0717
‑
amy接种到bhis(抗性菌株添加终浓度为25μg/ml的卡那霉素)培养基中，并在30℃和220rpm下培养过夜。取适当体积的细菌，以葡萄糖或可溶性淀粉((天津市大茂化学试剂厂；cas no:9005
‑
84
‑
9))(4％，w/w)溶液作为唯一碳源接种培养基，然后在12孔板中培养(抗性菌株添加终浓度为25μg/ml的卡那霉素)。初始od600nm的细胞密度为0.3左右，培养条件为30℃和280rpm。od600光密度每4小时测量一次，持续32小时。
[0135]
atcc13032、cg/pec
‑
xk99e和cg/ncgl0717
‑
amy菌株在葡萄糖培养基中具有相似的生长曲线(图6)。阴性对照atcc13032和cg/pec
‑
xk99e的细胞在淀粉培养基中生长效果不佳，因为它们不能利用淀粉。相比之下，重组菌cg/ncgl0717
‑
amy在淀粉培养基中生长效果较好，并且在淀粉和葡萄糖培养基中的生长趋势相似，包括进入稳定期的时间点和最大od600值。这表明cg/ncgl0717
‑
amy中的α
‑
淀粉酶被以活性形式成功地展示在谷氨酸棒杆菌细胞表面，并且对淀粉有很好的利用能力。
[0136]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。