一种用于dPCR法核酸检测的光响应性凝胶微球及其在大肠杆菌检测中的应用的制作方法

一种用于dpcr法核酸检测的光响应性凝胶微球及其在大肠杆菌检测中的应用
技术领域：
1.本发明属于分子生物学及微流控技术领域，具体涉及一种用于dpcr法核酸检测的光响应性凝胶微球及其在大肠杆菌检测中的应用。


背景技术：

2.大肠杆菌是最常见的感染机体引起疾病的病原体之一，能感染进血液、尿路、皮肤等多个器官和部位。数字聚合酶链式反应(dpcr)因高灵敏度和绝对定量的特点给检测现状带来转机，基于它的核酸检测是分子生物学领域的前沿热点。目前该技术需要依赖复杂的温控模块，这成为限制其推广的壁垒；除了热传导外，其它产热或热传递方式驱动的热循环模式鲜有报道。
3.纳米材料通常具有优越的物理化学特性，为生物分析提供了新的可能性。mxene为过渡金属碳氮化物，具有光热、两亲特性，也易于与其他材料耦合。纳米微球是另一种重要的纳米材料，具有高的比表面积、良好的生物相容性，能融入传感器或分散到生物标本中，可用于各种生物应用。
4.因此，基于复合纳米材料的智能响应，本发明将光热材料和纳米微球引入水凝胶网状结构，赋予它热和光学等优势，打破水凝胶作为微滴载体在传统dpcr的范式束缚，探索这种优势在dpcr领域的应用价值。


技术实现要素：

5.本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种用于dpcr法核酸检测的光响应性凝胶微球及其在大肠杆菌检测中的应用，通过制备载mxene水凝胶微滴(过渡金属碳氮化物)，以实现光响应性凝胶到溶胶态可控的转化和快速升温控制，最终用它构建光响应pcr定量检测大肠杆菌dna分子。
6.为实现上述技术目的，本发明采用以下技术方案：
7.一种用于dpcr法核酸检测的光响应性可相变复合凝胶微球的制备方法，包括以下步骤：
8.步骤一、制备sio2@mxene@sio2复合纳米材料
9.将超纯水、无水乙醇、氨水、晶种混合并搅拌均匀，为母液；在母液中同时滴加a液和b液，其中，a液为无水乙醇和正硅酸四乙酯的混合液，b液为超纯水、无水乙醇和氨水的混合液；滴加完成后离心清洗，得到二氧化硅纳米粒子；将二氧化硅纳米粒子进行盐酸多巴胺氧化反应，若干粒子粘附在一起，并在表面修饰聚多巴胺层；将修饰聚多巴胺层的二氧化硅纳米粒子置于mxene水溶液中机械搅拌6小时，即获得表面裹有mxene层的二氧化硅纳米粒子；最后，在碱性环境中，与正硅酸乙酯搅拌1小时以包裹二氧化硅涂层，得到sio2@mxene@sio2复合纳米材料。
10.步骤二、制备光响应性可相变凝胶微球
11.制备微流控芯片，将步骤一所制备的sio2@mxene@sio2复合纳米材料、微滴原材料溶液、pcr试剂和待测样品混合作为内相，以含有含氟界面活性剂的hfe7500油相为外相；通过注射泵分别将内相和外相注入芯片，内相在芯片内被外相切割，得到微滴，即为光响应性可相变凝胶微球。
12.进一步的，步骤一中，母液、a液和b液的体积比为1：3.56：3.56；母液中超纯水、无水乙醇、氨水、晶种的体积比为12.5：80：7.5：1；a液中无水乙醇与正硅酸四乙酯的体积比为5：4；b液中超纯水、无水乙醇、氨水的体积比为3：13：2。
13.进一步的，步骤一中，在母液中滴加a液的速率为3～6秒/滴，在母液中滴加b液的速率为2～4秒/滴。
14.进一步的，步骤一中，二氧化硅纳米粒子表面修饰聚多巴胺层和mxene层的过程可以选择磁力搅拌或者机械搅拌。
15.进一步的，步骤一中，光热响应材料mxene可以替换为黑磷片层溶液、碳纳米管溶液以及氧化石墨烯溶液中的一种。
16.进一步的，步骤一中，mxene水溶液浓度可为0.2、0.5、1、1.5、2mg/ml。
17.进一步的，步骤二中，微流控芯片内相通道深度为50μm，内、外相交汇处通道的宽度为75μm。
18.进一步的，步骤二中，内相和外相注入芯片的速度分别为70μl/h和110μl/h。
19.进一步的，步骤二中，外相中，hfe7500油相内含氟界面活性剂的含量为2％；内相中，sio2@mxene@sio2复合纳米材料含量大于1μg/μl，以保证加热效率。
20.进一步的，步骤二中，pcr试剂包括：10um的标记c3686基因的引物：f：5
’‑
catgatccaccaacgcaaat，r：5
’‑
ctgtaccgcaggaacatcat；100nm的荧光taqman探针：5'
‑
cgggcggttcattaggtcgt。
21.进一步的，步骤二中，微滴原材料溶液选自琼脂糖溶液、明胶溶液、壳聚糖溶液中的一种或多种。
22.进一步的，微滴原材料溶液为琼脂糖溶液时，其浓度可为0.5、1、1.5、2％，避免高浓度阻碍分子的反应扩散。
23.进一步的，所述sio2@mxene@sio2复合纳米材料当量粒径可以为800～2000纳米；所制备的光响应性可相变凝胶微球直径可以为80～300微米。
24.本发明还提供以上所述的光响应性可相变复合凝胶微球在检测大肠杆菌中的应用，检测方法为：将含有pcr反应液的光响应性可相变复合凝胶微球施加程序化近红外光照，进行凝胶微球的温度调节，最终通过荧光显微镜读取凝胶微球的荧光信号，统计荧光比例，从而估算初始大肠杆菌核酸分子的含量。
25.进一步的，程序化近红外光照过程为：95℃1min，(95℃30s，55℃60s，68℃60s)*34个循环，68℃3min。
26.本发明的有益效果：
27.1)本发明制备的光响应性可相变复合凝胶微球可用于dpcr法核酸检测，不需要依赖复杂、昂贵的设备，仅靠近红外光源就能实现热循环，过程简单，可靠。
28.2)本发明制备的光响应性可相变复合凝胶微球具有良好的生物相容性和分散性，实现光热功能的同时，不会干扰微球群的荧光信号。
29.3)本发明制备的光响应性可相变复合凝胶微球具有优良的的保水性，克服了水微滴易蒸发的局限。
附图说明：
30.图1为本发明所制备的复合纳米材料结构示意图；
31.图2为光响应性可相变凝胶微球生成示意图；
32.图3为本发明实施例光响应性可相变凝胶微球及表面细节的sem图，比例尺分别为150、5μm；
33.图4(a)本发明实施例1所制备的光响应性可相变凝胶微球群，(b)光热dpcr后微球的荧光信号结果图，其中大肠杆菌dna模板浓度为0.5拷贝数/微滴；
34.图5本发明实施例1对大肠杆菌检测的dpcr扩增产物测序结果；
35.附图标记为：
36.1、sio2@mxene@sio2复合纳米材料；1
‑
1、二氧化硅纳米粒子；1
‑
2、表面裹有聚多巴胺层的二氧化硅纳米粒子；1
‑
3、表面裹有mxene层的二氧化硅纳米粒子；2、复合凝胶微球；2
‑
1、pcr反应液与混有复合纳米材料的琼脂糖预混液；2
‑
2、含有2％含氟界面活性剂的hfe7500油相；3
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1、正向测序获得的产物序列；3
‑
2、反向测序获得的产物序列。
具体实施方式：
37.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
38.实施例1
39.本实施例提供一种用于dpcr法核酸检测的光响应性可相变复合凝胶微球，按照如下方法制备：
40.(1)制备sio2@mxene@sio2复合纳米材料
41.将母液(75ml超纯水、无水乙醇480ml、氨水45ml、晶种6ml)混于三口烧瓶中机械搅拌，由注射泵以6秒/滴、4秒/滴的速率分别地、同时地添加a液(无水乙醇1200ml、正硅酸四乙酯960ml)和b液(超纯水360ml、无水乙醇1560ml、氨水240ml)，最终离心清洗，得到二氧化硅纳米粒子；
42.接着如图1所示，通过盐酸多巴胺氧化反应，将若干粒子粘附在一起，并在表面修饰聚多巴胺层；随后置于1mg/ml的mxene水溶液中机械搅拌6小时，即获得表面裹有mxene层的二氧化硅纳米粒子；最后，在碱性环境中，与正硅酸乙酯搅拌1小时以包裹二氧化硅涂层，得到sio2@mxene@sio2复合纳米材料。
43.(2)制备光响应性可相变复合凝胶微球：
44.基于光刻法加工图2所示的pdms材质的芯片装置来制备油包水微滴，图2通道的深度均为50μm，水、油相交汇处通道的宽度均为75μm。
45.选用琼脂糖作为水凝胶基底，将步骤(1)所制备的sio2@mxene@sio2复合纳米材料(1μg/μl)、琼脂糖溶液(0.5％)、pcr试剂和待测样品(已知dna浓度)混合作为内相，以含有
2％含氟界面活性剂的hfe7500油相为外相。其中，pcr试剂有：10um的标记c3686基因的引物：f：5
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catgatccaccaacgcaaat，r：5
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ctgtaccgcaggaacatcat；100nm的荧光taqman探针：5'
‑
cgggcggttcattaggtcgt。
46.通过注射泵分别以110μl/h和70μl/h的流量将外相和内相注入芯片，内相在芯片内被外相切割，制得尺寸在110微米的光响应性可相变复合凝胶微球，如图3所示，证明了复合纳米材料和的复合凝胶微球存在。
47.实施例2
48.本实施例提供一种用于dpcr法核酸检测的光响应性可相变复合凝胶微球，按照如下方法制备：
49.(1)制备sio2@mxene@sio2复合纳米材料
50.将母液(75ml超纯水、无水乙醇480ml、氨水45ml、晶种6ml)混于三口烧瓶中机械搅拌，由注射泵以3秒/滴、2秒/滴的速率分别地、同时地添加a液(无水乙醇1200ml、正硅酸四乙酯960ml)和b液(超纯水360ml、无水乙醇1560ml、氨水240ml)，最终离心清洗获得二氧化硅纳米粒子。
51.接着如图1所示，通过盐酸多巴胺氧化反应，将若干粒子粘附在一起，并在表面修饰聚多巴胺层；再将它置于1mg/ml的mxene水溶液中机械搅拌6小时，即获得表面裹有mxene层的二氧化硅纳米粒子。最后，在碱性环境中，与正硅酸乙酯搅拌1小时以包裹二氧化硅涂层。
52.(2)制备光响应性可相变凝胶微球：
53.基于光刻法加工pdms材质的芯片装置来制备油包水微滴，通道的深度为50μm，水、油相交汇处通道的宽度均为75μm。
54.选用琼脂糖作为水凝胶基底，将步骤(1)所制备的sio2@mxene@sio2复合纳米材料(1μg/μl)、琼脂糖溶液(0.5％)、pcr试剂和待测样品混合作为内相，以含有2％含氟界面活性剂的hfe7500油相为外相。其中，pcr试剂有：10um的标记c3686基因的引物：f：5
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catgatccaccaacgcaaat，r：5
’‑
ctgtaccgcaggaacatcat；100nm的荧光taqman探针：5'
‑
cgggcggttcattaggtcgt。
55.通过注射泵分别以110μl/h和70μl/h的流量将外相和内相注入芯片，内相在芯片内被外相切割，制得尺寸在110微米的光响应性可相变复合凝胶微球。
56.实施例3
57.将实施例1所制备的光响应性可相变复合凝胶微球进行大肠杆菌的检测。
58.通过程序化光照实现95℃1min，(95℃30s，55℃60s，68℃60s)*35个循环，68℃3min的过程，最终由荧光显微镜读取微球的荧光信号，统计荧光比例，从而估算初始大肠杆菌核酸分子的含量。
59.图4(a)本发明实施例1所制备的光响应性可相变凝胶微球群，图4(b)是光热dpcr后微球的荧光信号结果图，其中大肠杆菌dna模板浓度为0.5拷贝数/微滴(与待测样品的dna理论浓度一致)，并且复合纳米材料在溶胶中汇聚成簇。图5扩增产物的sanger测序结果验证了实验设计，确认了微滴中含有大肠杆菌核酸分子。
60.以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围，应当指出，对于本技术领域的
普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，应视为本发明的保护范围。