本发明涉及用于调控细胞竞争的新型调控剂。
背景技术
细胞竞争原本是于1975年在果蝇中发现的(非专利文献1)，由果蝇研究者进行了研究。关于在哺乳类细胞中是否也存在同样的竞争现象，直至最近也未明确，但在2009年本发明人的小组在世界上首次报道了哺乳类中也会产生细胞竞争(非专利文献2)，目前已明确了：细胞竞争是在各种生理/病理过程中产生的、维持细胞社会的恒定性(homeostasis)所必需且普遍的现象。另外，根据最近的研究，关于在细胞竞争中成为败者的细胞是如何从组织中清除、或其分子机理，逐渐积累了见解(非专利文献3)。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Morata, G.等人, Dev. Biol., 1975; 42: 211-221；
非专利文献2：Hogan, C.等人, Nat Cell Biol. 2009 Apr; 11(4): 460-7；
非专利文献3：Maruyama T.等人, Curr Opin Cell Biol. 2017; 48: 106-112。
技术实现要素：
发明所要解决的课题
然而，关于“基于抗原呈递的上皮细胞清除能力的引发机制”这种细胞间的识别机制、或细胞间通讯分子，迄今为止尚未完全明确。因此，本发明的课题在于：阐明参与哺乳类的细胞竞争的、担负“基于抗原呈递的上皮细胞清除能力的引发机制”的分子实体，提供利用该机制的细胞竞争调控剂、或使用了该调控剂的细胞竞争的调控方法。
如上所述，人体内(我们的体内)产生的癌症的80%以上来自上皮细胞。因此，产生了以下的想法：通过将“基于抗原呈递的上皮细胞清除能力的引发机制”应用于医疗，能否发展为以“在致癌前去除突变细胞”的超早期癌症治疗为对象的预防性医疗；另外，即使对于晚期癌症，通过利用上述机制去除癌细胞，能否也适用于癌症的治疗。为了阐明上述机制，本发明人首先着眼于癌基因RasV12，已知通过将其导入至上皮细胞而促进细胞竞争。将该基因导入至来自人皮肤的细胞株并使RasV12在该细胞内表达时，发现了主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex) (以下，称为“MHC”。) I类的细胞膜表达得到促进。从该见解出发，本发明人考虑MHC I类(MHC class I)与细胞竞争是否相关，使RasV12在已知抑制MHC-I的表达的TAP1缺失细胞中表达时，显示出细胞竞争没有得到促进、即MHC I类的细胞膜表达对细胞竞争是必要的。接下来，着眼于狗的MHC-I即DLA，在使RasV12导入株缺损各DLA时，显示出作为MHC-Ia的DLA88在细胞竞争中起到必须的作用。因此，即使对细胞给予DLA88的全长肽，细胞竞争也未得到促进，但对细胞给予由构成胞外结构域的3个结构域中的α3结构域构成的肽片段时，意外地发现了细胞竞争得到促进、即MHC-Ia的α3结构域对细胞竞争较为重要的新见解。
从上述见解出发，在MHC I类与其受体的相互作用和细胞竞争是否相关的推测下，尝试确定MHC I类的受体时，发现了免疫球蛋白样受体LILRB3 (白细胞免疫球蛋白样受体(leukocyte immunoglobulin-like receptor), 亚家族B, 成员3)作为MHC I类的受体起作用。因此，着眼于LILRB3进行研究时发现了：(i) 若敲除上皮细胞膜上的免疫球蛋白样受体LILRB3 (白细胞免疫球蛋白样受体, 亚家族B, 成员3)，则异常细胞清除能力下降；另外，(ii) 包含LILRB3的D1～D4这4个免疫球蛋白结构域中的D1-D2结构域的重组蛋白与包含MHC 1a类的α3结构域的重组蛋白结合；以及(iii) 包含LILRB3的D1-D2结构域的重组蛋白对基于细胞竞争的异常细胞显示抑制效果。根据这些见解进一步进行研究，结果完成了本发明。
用于解决课题的手段
即，本发明涉及以下内容。
[1] 细胞竞争调控剂，该调控剂含有：包含MHC Ia类的α3结构域的蛋白或抗LILRB3的激动剂抗体、或抑制MHC Ia类与LILRB3的结合的物质。
[2] [1]所述的调控剂，该调控剂含有包含MHC Ia类的α3结构域的蛋白，细胞竞争的调控为细胞竞争的促进。
[3] [2]所述的调控剂，其中，MHC Ia类为HLA-B或DLA-88。
[4] [2]或[3]所述的调控剂，其中，包含MHC Ia类的α3结构域的蛋白含有选自下述a)～d)的至少1种蛋白：
a) 蛋白，其具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列；
b) 蛋白，其是具有在SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列中有1个～多个氨基酸被缺失、取代或添加而得的氨基酸序列的蛋白，与包含LILRB3的D1和D2结构域的蛋白特异性地结合；
c) 蛋白，其是具有与SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列具有至少90%的相似性的氨基酸序列的蛋白，与包含LILRB3的D1和D2结构域的蛋白特异性地结合；以及
d) 蛋白，其包含DLA-88的直向同源物的α3结构域。
[5] [4]所述的调控剂，其中，包含LILRB3的D1和D2结构域的蛋白是具有SEQ ID NO: 8所示的氨基酸序列的蛋白。
[6] [2]～[5]中任一项所述的调控剂，其中，该细胞竞争为通过非免疫系统的正常细胞进行的异常细胞的清除。
[7] [6]所述的调控剂，其中，非免疫系统的正常细胞为上皮细胞。
[8] [6]或[7]所述的调控剂，其中，异常细胞为突变细胞、癌细胞、或病毒感染细胞。
[9] [8]所述的调控剂，其中，细胞竞争调控剂为癌症或病毒感染症的预防或治疗药。
[10] [1]所述的调控剂，该调控剂包含抑制MHC Ia类与LILRB3的结合的物质，细胞竞争的调控为细胞竞争的抑制。
[11] [10]所述的调控剂，其中，抑制MHC Ia类与LILRB3的结合的物质为选自包含LILRB3的D1和D2结构域的蛋白、抗LILRB3的D1和D2结构域的抗体、适体、LILRB3的表达抑制剂的至少1种物质。
[12] [11]所述的调控剂，其中，包含LILRB3的D1和D2结构域的蛋白含有选自下述e)～h)的至少1种蛋白：
e) 蛋白，其具有SEQ ID NO: 8所示的氨基酸序列；
f) 蛋白，其是具有在SEQ ID NO: 8所示的氨基酸序列中有1个～多个氨基酸被缺失、取代或添加而得的氨基酸序列的蛋白，与包含MHC Ia类的α3结构域的蛋白特异性地结合；以及
g) 蛋白，其是具有与SEQ ID NO: 8所示的氨基酸序列具有至少80%的相似性的氨基酸序列的蛋白，与包含MHC Ia类的α3结构域的蛋白特异性地结合；
h) 蛋白，其包含ENSCAFG00000028453的直向同源物的D1和D2结构域。
[13] [10]～[12]中任一项所述的调控剂，其中，该细胞竞争为通过非免疫系统的正常细胞进行的移植细胞的清除。
[14] [10]～[12]中任一项所述的调控剂，其中，细胞竞争的抑制是改善器官移植、组织移植或细胞移植的植入失败(engraftment failure)、或者抑制神经变性疾病、肌肉变性疾病等其他各种变性疾病的症状进展。
[15] [14]所述的调控剂，其中，器官移植是选自肝脏、肾脏、心脏、肺、胰腺、甲状腺、甲状旁腺、胸腺、包含肾上腺皮质和肾上腺髓质的内分泌器官、以及包含干细胞的器官的至少1种器官的移植。
[16] [14]所述的调控剂，其中，组织移植是选自皮肤、包含干细胞的组织、包含免疫细胞的组织的至少1种组织的移植。
[17] [14]所述的调控剂，其中，细胞移植是选自骨髄细胞、非粘附性骨髄细胞、外周血细胞、脐带血细胞、来自脐带胶质的细胞、来自胎盘的细胞、来自毛根的细胞、来自脂肪组织的细胞、淋巴细胞、单核细胞和巨噬细胞的至少1种细胞的移植。
[18] [14]所述的调控剂，其中，各种变性疾病为脊髓型颈椎病和/或腰椎管狭窄症。
[19] [14]所述的调控剂，其中，神经变性疾病为选自阿尔茨海默病、轻度认知障碍、帕金森病、亨廷顿舞蹈病、脊髓小脑失调症、克-雅氏病、外伤诱发性神经变性、高压神经综合征、肌张力障碍、橄榄体脑桥小脑萎缩症、肌萎缩性侧索硬化症、多发性硬化症、癫痫、痴呆症、老年痴呆症、艾滋病痴呆综合征和艾滋病诱发性脑病的至少1种神经变性疾病。
[20] [14]所述的调控剂，其中，肌肉变性疾病为选自肌肉萎缩症、远端型肌病、先天性肌病、甲状腺毒性肌病、糖原病、线粒体肌病、类固醇肌病、酒精中毒性肌病、炎症性肌病、内分泌性肌病、脂质沉积性肌病、HIV这样的感染症所伴随的肌病、玻璃体肌病和重症肌无力症这样的自身免疫疾病所伴随的肌病的至少1种肌肉变性疾病。
[21] [14]所述的调控剂，该调控剂是器官移植、组织移植或细胞移植的植入失败的改善剂、或者神经变性疾病、肌肉变性疾病等其他各种变性疾病的症状进展的抑制剂。
[22] [1]～[21]中任一项所述的调控剂，该调控剂与其他药剂和/或其他治疗方法并用。
[23] [22]所述的调控剂，其中，其他药剂为抗癌药或抗病毒药。
[24] [23]所述的调控剂，其中，抗癌药为选自烷基化剂、细胞毒性抗生素、铂制剂、代谢拮抗剂、激酶抑制剂、血管生成抑制剂、激素药物、DNA修饰酶抑制剂、蛋白酶体抑制剂、生物碱制剂、I型和II型拓扑异构酶抑制剂、组蛋白去乙酰化酶抑制剂、细胞因子制剂、激素药物、免疫检查点抑制剂、自然杀伤细胞活化剂、吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)抑制剂、单克隆抗体、以及其他的分子靶向治疗药的至少1种抗癌药。
[25] [23]所述的调控剂，其中，抗病毒药为选自干扰素、核苷类和核苷酸类逆转录酶抑制剂、非核苷类逆转录酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、整合酶抑制剂、融合抑制剂、成熟抑制剂、鸟嘌呤核苷类似物、pridin类似物、嘧啶类似物、以及不包括于上述任一类的本技术领域所识别的其他“未分类的”抗病毒药(例如，膦甲酸和米替福新)的至少1种抗病毒药。
[26] [22]所述的调控剂，其中，其他治疗方法为选自癌症的外科疗法、放射线疗法、激光照射疗法和温热疗法的至少1种方法。
[27] [22]所述的调控剂，其中，其他药剂为选自免疫抑制剂、移植器官的排斥反应抑制剂、和移植后的植入促进剂的至少1种药剂。
[28] [27]所述的调控剂，其中，免疫抑制剂为选自类固醇、环孢素、环孢素类似物、环磷酰胺、甲泼尼龙、泼尼松、硫唑嘌呤、他克莫司水合物、15-脱氧精胍菌素、那他珠单抗、雷帕霉素和依那西普的至少1种免疫抑制剂。
[29] [1]～[28]中任一项所述的调控剂，其中，上述制剂为药物组合物。
[30] 细胞竞争的调控方法，该调控方法包括：将治疗有效量的包含MHC Ia类的α3结构域的蛋白或抗LILRB3的激动剂抗体、或抑制MHC Ia类与LILRB3的结合的物质给予至需要其的对象。
[31] [30]所述的方法，该方法是给予包含MHC Ia类的α3结构域的蛋白或抗LILRB3的激动剂抗体，细胞竞争的调控为细胞竞争的促进。
[32] [31]所述的方法，其中，MHC Ia类为HLA-B或DLA-88。
[33] [31]或[32]所述的方法，其中，包含MHC Ia类的α3结构域的蛋白含有选自下述a)～d)的至少1种蛋白：
a) 蛋白，其具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列；
b) 蛋白，其是具有在SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列中有1个～多个氨基酸被缺失、取代或添加而得的氨基酸序列的蛋白，与包含LILRB3的D1和D2结构域的蛋白特异性地结合；
c) 蛋白，其具有与SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列具有至少90%的相似性的氨基酸序列的蛋白，与包含LILRB3的D1和D2结构域的蛋白特异性地结合；以及
d) 蛋白，其包含DLA-88的直向同源物的α3结构域。
[34] [33]所述的方法，其中，包含LILRB3的D1和D2结构域的蛋白为具有SEQ ID NO: 8所示的氨基酸序列的蛋白。
[35] [31]～[34]中任一项所述的方法，其中，该细胞竞争为通过非免疫系统的正常细胞进行的异常细胞的清除。
[36] [35]所述的方法，其中，非免疫系统的正常细胞为上皮细胞。
[37] [35]或[36]所述的方法，其中，异常细胞为突变细胞、癌细胞、或病毒感染细胞。
[38] [37]所述的方法，其中，细胞竞争的调控为癌症或病毒感染症的预防或治疗。
[39] [30]所述的方法，该方法是给予抑制MHC Ia类与LILRB3的结合的物质，细胞竞争的调控为细胞竞争的抑制。
[40] [39]所述的方法，其中，抑制MHC Ia类与LILRB3的结合的物质为选自包含LILRB3的D1和D2结构域的蛋白、抗LILRB3的D1和D2结构域的抗体、适体、LILRB3的表达抑制剂的至少1种物质。
[41] [39]或[40]所述的方法，其中，包含LILRB3的D1和D2结构域的蛋白含有选自下述e)～h)的至少1种蛋白：
e) 蛋白，其具有SEQ ID NO: 8所示的氨基酸序列；
f) 蛋白，其是具有在SEQ ID NO: 8所示的氨基酸序列中有1个～多个氨基酸被缺失、取代或添加而得的氨基酸序列的蛋白，与包含MHC Ia类的α3结构域的蛋白特异性地结合；
g) 蛋白，其是具有与SEQ ID NO: 8所示的氨基酸序列具有至少80%的相似性的氨基酸序列的蛋白，与包含MHC Ia类的α3结构域的蛋白特异性地结合；以及
h) 蛋白，其包含ENSCAFG00000028453的直向同源物的D1和D2结构域。
[42] [39]～[41]中任一项所述的方法，其中，该细胞竞争为通过非免疫系统的正常细胞进行的移植细胞的清除。
[43] [39]～[42]中任一项所述的方法，其中，细胞竞争的抑制为改善器官移植、组织移植或细胞移植的植入失败、或者抑制神经变性疾病、肌肉变性疾病、其他各种变性疾病的症状进展。
[44] [43]所述的方法，其中，器官移植为选自肝脏、肾脏、心脏、肺、胰腺、甲状腺、甲状旁腺、胸腺、包含肾上腺皮质和肾上腺髓质的内分泌器官、以及包含干细胞的器官的至少1种器官的移植。
[45] [43]所述的方法，其中，组织移植为选自皮肤、包含干细胞的组织、包含免疫细胞的组织的至少1种组织的移植。
[46] [43]所述的方法，其中，细胞移植为选自骨髄细胞、非粘附性骨髄细胞、外周血细胞、脐带血细胞、来自脐带胶质的细胞、来自胎盘的细胞、来自毛根的细胞、来自脂肪组织的细胞、淋巴细胞、单核细胞和巨噬细胞的至少1种细胞的移植。
[47] [43]所述的方法，其中，各种变性疾病为脊髓型颈椎病和/或腰椎管狭窄症。
[48] [43]所述的方法，其中，神经变性疾病为选自阿尔茨海默病、轻度认知障碍、帕金森病、亨廷顿舞蹈病、脊髓小脑失调症、克-雅氏病、外伤诱发性神经变性、高压神经综合征、肌张力障碍、橄榄体脑桥小脑萎缩症、肌萎缩性侧索硬化症、多发性硬化症、癫痫、痴呆症、老年痴呆症、艾滋病痴呆综合征和艾滋病诱发性脑病的至少1种神经变性疾病。
[49] [43]所述的方法，其中，肌肉变性疾病为选自肌肉萎缩症、远端型肌病、先天性肌病、甲状腺中毒性肌病、糖原病、线粒体肌病、类固醇肌病、酒精中毒性肌病、炎症性肌病、内分泌性肌病、脂质沉积性肌病、HIV这样的感染症所伴随的肌病、玻璃体肌病和重症肌无力症这样的自身免疫疾病所伴随的肌病的至少1种肌肉变性疾病。
[50] [30]～[49]所述的方法，该方法与其他药剂的给药和/或其他治疗方法并用。
[51] [50]所述的方法，其中，其他药剂为抗癌药或抗病毒药。
[52] [51]所述的方法，其中，抗癌药为选自烷基化剂、细胞毒性抗生素、铂制剂、代谢拮抗剂、激酶抑制剂、血管生成抑制剂、激素药物、DNA修饰酶抑制剂、蛋白酶体抑制剂、生物碱制剂、I型和II型拓扑异构酶抑制剂、组蛋白去乙酰化酶抑制剂、细胞因子制剂、激素药物、免疫检查点抑制剂、自然杀伤细胞活化剂、吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)抑制剂、单克隆抗体、以及其他的分子靶向治疗药的至少1种抗癌药。
[53] [51]所述的方法，其中，抗病毒药为选自干扰素、核苷类和核苷酸类逆转录酶抑制剂、非核苷类逆转录酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、整合酶抑制剂、融合抑制剂、成熟抑制剂、鸟嘌呤核苷类似物、pridin类似物、嘧啶类似物、以及不包含于上述任一类的该技术领域所识别的其他“未分类的”抗病毒药(例如，膦甲酸和米替福新)的至少1种抗病毒药。
[54] [50]所述的方法，其中，其他治疗方法为选自癌症的外科疗法、放射线疗法、激光照射疗法和温热疗法的至少1种方法。
[55] [50]所述的方法，其中，其他药剂为选自免疫抑制剂、移植器官的排斥反应抑制剂、和移植后的植入促进剂的至少1种药剂。
[56] [55]所述的方法，其中，免疫抑制剂为选自类固醇、环孢素、环孢素类似物、环磷酰胺、甲泼尼龙、泼尼松、硫唑嘌呤、他克莫司水合物、15-脱氧精胍菌素、那他珠单抗、雷帕霉素和依那西普的至少1种免疫抑制剂。
[57] 用于调控细胞竞争的包含MHC Ia类的α3结构域的蛋白、或包含LILRB3的D1和D2结构域的蛋白。
[58] [57]所述的蛋白，该蛋白是包含MHC Ia类的α3结构域的蛋白，细胞竞争的调控为细胞竞争的促进。
[59] [58]所述的蛋白，其中，MHC Ia类为HLA-B或DLA-88。
[60] [57]所述的蛋白，该蛋白为包含LILRB3的D1和D2结构域的蛋白，细胞竞争的调控为细胞竞争的抑制。
[61] 包含MHC Ia类的α3结构域的蛋白或抗LILRB3的激动剂抗体、或抑制MHC Ia类与LILRB3的结合的物质在制造用于调控细胞竞争的药物中的应用。
[62] [61]所述的应用，其中，使用包含MHC Ia类的α3结构域的蛋白或抗LILRB3的激动剂抗体，细胞竞争的调控为细胞竞争的促进。
[63] [60]所述的蛋白，其中，MHC Ia类为HLA-B或DLA-88。
[64] [61]所述的蛋白的应用，其中，使用抑制MHC Ia类与LILRB3的结合的物质，细胞竞争的调控为细胞竞争的抑制。
[65] [64]所述的方法，其中，抑制MHC Ia类与LILRB3的结合的物质为选自包含LILRB3的D1和D2结构域的蛋白、抗LILRB3的D1和D2结构域的抗体、适体、LILRB3的表达抑制剂的至少1种物质。
发明效果
根据本发明，可提供细胞竞争调控剂、调控细胞竞争的方法、调控细胞竞争的方法中使用的蛋白、和蛋白在制造调控细胞竞争的药物中的应用等。本发明的调控剂通过调控MHC Ia类与作为其受体的LILRB3的相互作用来调控细胞竞争，其结果，可预防或治疗神经变性疾病(例：肌肉委縮性侧索硬化症、阿尔茨海默病等)、肌肉变性疾病(例：肌肉萎缩症)、癌症(还包括癌前状态) (例：胰腺癌、肺癌、皮肤癌、子宫癌等)、细菌感染或病毒感染(例：人乳头状瘤病毒(HPV)等)、细胞移植植入失败(例：人工多能性干细胞(iPS细胞)移植、心肌细胞移植、角膜移植、皮肤移植等)。
附图说明
[图1A]是观察由正常细胞引起的细丝蛋白累积的荧光显微镜照片的图，其研究了RasV12表达细胞的TAP1缺陷突变是否促进通过正常细胞(MDCK)进行的清除。上段(TAP-WT)：使用了具有野生型TAP1的RasV12表达细胞的情况。中段(TAP1-KO#1)和下段(TAP1-KO#2)：使用了TAP1缺陷型RasV12表达细胞的情况。*表示RasV12表达细胞。
[图1B]是测量细丝蛋白累积并进行比较的图。数据用平均值±SD表示(n=3)。**：p<0.01 (Student的t检验)。
[图1C]显示表示细胞清除能力的顶端挤压的比例。数据用平均值±SD表示(n=3)。*：p<0.05、***：p<0.001 (Student的t检验)。
[图1D]将MDCK-RasV12-WT或-TAPKO细胞和正常MDCK细胞在胶原蛋白凝胶上混合，形成单层后，用多西环素处理24小时。固定细胞，用鬼笔环肽和Hoechst染色。正常和RasV12细胞的代表性的XZ图像。比例尺：10μm。
[图2A]是表示在使RasV12表达细胞缺失各种DLA家族的情况下正常细胞(MDCK)对RasV12表达细胞的清除的影响的评价结果的图。***：表示p＜0.001、****：表示p<0.0001、ns.：表示无显著差别(Student的t检验)。
[图2B]是使用共聚焦显微镜分析RasV12表达细胞的行为的图像。
[图3A]是表示DLA-88的全长蛋白(FL)与仅包含DLA88的α1和α2结构域的蛋白(DLA88-α1/2)和仅包含DLA88的α3结构域的蛋白(DLA88-α3)的结构的示意图。
[图3B]是表示以MDCK正常细胞：RasV12表达MDCK细胞=50:1的细胞比混合形成单一细胞层后，同时添加多西环素和重组蛋白DLA88-α3进行处理的情况下RasV12表达细胞的清除的观察结果的图。**：表示p<0.01、***：表示p<0.01 (Student的t检验)。
[图3C]是表示在正常细胞：DLA88缺陷RasV12表达细胞=50:1的条件下，同时添加多西环素和重组蛋白DLA88-α3进行处理的情况下DLA88缺陷RasV12表达细胞的清除的观察结果的图。*：表示p<0.05、**：表示p<0.01 (Student的t检验)。
[图3D]是表示以MDCK正常细胞：RasV12表达MDCK细胞=50:1的细胞比混合形成单一细胞层后，仅添加多西环素、同时添加多西环素和重组蛋白DLA88-α1/2、或者多西环素和重组蛋白DLA88-α3进行处理的情况下RasV12表达细胞的清除的观察结果的图。**：表示p<0.01 (Student的t检验)。
[图4A]是表示与MHC I类结合的细胞膜蛋白LILRB3 (ENACAFG000028453)的基因缺陷RasV12表达细胞的清除效率的图。
[图4B]是表示LILRB3 (ENACAFG000028453)的全长蛋白(28453-FL)与用于实验的仅D1和D2结构域的重组蛋白(28453-D1/2)的结构的示意图。
[图4C]是表示包含LILRB3的D1/D2结构域的重组蛋白(28453-D1/2)与包含DLA88-α3结构域的重组蛋白(DLA88-α3)在试管内结合的流程图。
[图4D]是表示添加包含LILRB3的D1/D2结构域的重组蛋白(28453-D1/2)的重组蛋白对于正常MDCK细胞对RasV12表达MDCK细胞的清除效果的影响的评价结果的图。
[图5]是采用了生物膜层干涉法的DLA88与LILRB3之间的动力学分析。将(b)中使用的重组蛋白DLA88-α3和LILRB3-D1/D2在37℃下分开培养2小时。以DLA88-α3为配体在BLI传感器上固定5分钟。LILRB3-D1/2D以所示浓度作为样品加载。Kd=6.54±0.28μM。
[图6A] 上图：显示独自分离的HaCaT细胞中的突变细胞的清除的情况。左下图：将HaCaT-RasV12细胞与HaCaT-WT或HaCaT-LILRB3KO混合，使用多西环素根据α3的有/无进行处理。实时成像分析是在8小时～56小时的时间点以每5分钟1个图像的比例执行。以所示时间计数挤出的细胞，用图表示顶端挤压的效率。在该实验条件下，n≥538个细胞。数据是来自3次独立实验的平均±SEM。*P<0.05、**P<0.01 (Student的oneway anova)。右下图：RasV12细胞中的HLA的敲除使顶端挤压的效率消失。将HaCaT-RasV12-WT或-HLA三倍敲除(HLAtKO)细胞与胶原蛋白凝胶上的正常HaCaT细胞混合形成单层后，用多西环素处理16小时。固定细胞，用鬼笔环肽和Hoechst染色。正常细胞和RasV12细胞的代表性的XZ图像。比例尺：10μm。
[图6B]是表示在人HaCaT正常细胞：无LILRB3WT基因缺陷的RasV12表达人HaCat细胞(LILRB3WT-RasV12)=30:1的条件下，同时添加多西环素和重组蛋白28453-D1/2进行处理的情况(LILRB3WT 28453-D1/2)下和仅添加多西环素进行处理的情况(LILRB3WT)下通过正常HaCat细胞进行的RasV12表达HaCat细胞的清除的观察结果的图。****：表示p<0.01。
[图7A] 左上图：皮下注入的位置。左下图：注入的条件。中央图：肿瘤的图像。将肿瘤放置在分割成1cm×1cm的正方形的板上。右图：测定2周后所形成的肿瘤块的总重量或总体积的结果。ns.：表示无显著差异、*：表示p<0.05、**：表示p<0.01和***：表示p<0.005 (Student的t检验)。
[图7B]是将在人HaCat正常细胞(HaCat)：RasV12表达人HaCat细胞(RasV12)=3:1、10:1或30:1的条件下、在DLA88-α3的存在下或不存在下与基质胶混合的细胞的颗粒移植到裸鼠的腹部，测定2周后所形成的肿瘤块的总体积的结果。
[图7C]是将在人HaCat正常细胞(HaCat)：RasV12表达人HaCat细胞(RasV12)=3:1、10:1或30:1的条件下与基质胶混合的细胞的颗粒移植到裸鼠的腹部，测定2周后所形成的肿瘤块的重量的结果。ns.：表示无显著差异、*：表示p<0.05、**：表示p<0.01和***：表示p<0.005 (Student的t检验)。
[图7D] 左图：肿瘤的组织切片。固定肿瘤，制备冷冻切片。切片用鬼笔环肽和Hoechst染色。比例尺：200μm。右图：肿瘤切片中的GFP阳性率。使用图像分析软件定量GFP阳性区，使用各肿瘤的整个区域计算区域的比例。ns.：表示无显著差异、*：表示p<0.05 (Student的t检验)。
[图7E] 左图：肿瘤的图像。将肿瘤放置在分割成1cm×1cm的正方形的板上。中央图和右图：测定2周后所形成的肿瘤块的总重量或总体积的结果。**：表示p<0.01和***：表示p<0.005 (Student的t检验)。
[图8] 左上图：HaCaT-RasV12细胞的荧光图像。左下图：粒子图像流速测定(PIV)的图像。将正常HaCaT和RasV12细胞以30：1的比例接种在薄的胶原蛋白凝胶上。细胞形成单层后，用多西环素培养细胞。培养8小时后，进行48小时的实时成像分析。PIV参数由各比色皿的移动来计算。箭头是指目标细胞的最大(5像素/秒)移动度和最小(0像素/秒)移动度。显示28小时的动态图像和PIV的代表性的图像。右图：在添加了α3结构域的情况下为( )，显示在已清除的细胞中诱导细胞凋亡。
[图9] 左图：已知人乳头状瘤病毒(HPV)在感染细胞后，通过降解作为抑癌基因的Scribble而引起癌变。另一方面，已知Scribble的表达抑制细胞边被周边正常细胞边诱导细胞凋亡边被清除。右图：经由α3 (ECA-1-ex3)ECAR促进Scribble击倒细胞的清除。将四环素诱导性Scribble击倒MDCK细胞(GFP阳性细胞)与正常细胞或28453 (ECAR)以1:10 (MDCK:SCRBKD=10:1)的比例混合接种。在形成单相后，添加四环素和α3，算出其24小时后的显微镜视野中的GFP阳性细胞(Scribble击倒细胞)与细胞数的比例。ns.：不显著、**P< 0.01。
[图10] HPV全基因组稳定细胞MCF10A细胞的清除通过α3处理而促进。稳定地保持HPV的全基因组(HPV18基因组)的MCF10A (HPV18)细胞通过CMFDA (绿荧光染色)在混合培养后可识别，之后以10:1的比例(正常MCF10A : HPV18=10:1)与正常MCF10A混合后接种。算出其24小时后的显微镜视野中的GFP阳性细胞(HPV18细胞)与细胞数的比例。Cont：HPV18在上皮细胞层中的残留率，a3：α3处理时的HPV18细胞的残留率。ns.：不显著、**P<0.01。
[图11] 左上图：LILRB3在定量PCR分析的混合条件下被上调。单独(单一)接种正常MDCK或MDCK-RasV12细胞、或者将MDCK-RasV12细胞与正常MDCK细胞以1：1 (混合)的比例在有机硅板(弹性模量：0.5 kPa)上混合，形成单层后，用多西环素处理8小时。溶解细胞，将样品供于定量PCR分析。将混合条件下的表达水平与正常条件和RasV12单一条件下的平均值做比较。数据是来自5次独立实验的平均±SD。**P<0.01 (Student的t检验)。左下图：LILRB3诱导的定量化数据。数据是来自3次独立实验的平均值±SD。在各实验条件下，n=60细胞。*P<0.05 (Student的t检验)。右图：单独(单一)的正常MDCK或MDCK-RasV12细胞、或者将MDCK-RasV12细胞与正常MDCK细胞在胶原蛋白凝胶上混合。用多西环素处理24小时后，无需渗透处理而固定细胞，用抗LILRB3抗体和抗HLA-B抗体染色。正常细胞和RasV12细胞的代表性的XY图像。比例尺：10μm。
[图12] 左上图：来自正常MDCK细胞的LILRB3的缺失会减弱顶端清除。将MDCK-RasV12细胞与普通的MDCK-WT或-LILRB3KO-OE在胶原蛋白凝胶上混合，形成单层后，用多西环素培养24小时。固定细胞，用鬼笔环肽和Hoechst染色。正常细胞和RasV12细胞的代表性的XZ图像。比例尺：10μm。左下图：RasV12的顶端挤压的定量化数据。在各实验条件下，n≥100细胞。数据是来自4次独立实验的平均值±SD。*P<0.05、**P<0.01 (Student的t检验)。右上图：普通的HaCaT细胞中的LILRB3的敲除会抑制顶端挤压。将HaCaT -RasV12细胞与正常的HaCat-WT、-LILRB3KO或-LILRB5KO细胞在胶原蛋白凝胶上混合，形成单层后，用多西环素培养16小时。固定细胞，用鬼笔环肽和Hoechst染色。正常细胞和RasV12细胞的代表性的XZ图像。比例尺：10μm。右下图：RasV12的顶端挤压的定量化数据。在各实验条件下，n≥100细胞。数据是来自3次独立实验的平均值±SD。**P<0.01 (Student的t-检验)。
具体实施方式
(1) 本发明的调控剂
本发明的实施方式为细胞竞争调控剂，更具体而言为细胞竞争促进剂或细胞竞争抑制剂。该促进剂含有包含MHC Ia类的α3结构域的蛋白或抗LILRB3的激动剂抗体，该抑制剂含有抑制MHC Ia类与LILRB3的结合、更具体而言是MHC Ia类的α3结构域与LILRB3的D1和D2结构域的结合的物质。
本说明书中，“细胞竞争”是指当组织中适应度(状态)不同的2种细胞接近时，适应度更高的细胞存活、而适应度更低的细胞被清除的现象。已知淋巴细胞等免疫系统的细胞会清除突变细胞，但已判明：利用除免疫系统细胞以外的上皮细胞等正常细胞，通过细胞竞争也可清除突变细胞。
已判明了：由肌动球蛋白或细丝蛋白、波形蛋白这样的细胞骨架系分子介导的机械力作为通过细胞竞争对突变细胞进行细胞清除的驱动力而起作用。在利用上皮细胞进行的突变细胞的细胞竞争中，这些细胞骨架形成因子累积在包围突变细胞的正常上皮细胞侧，从而将突变细胞挤出到正常上皮细胞的头顶侧(管腔侧)而脱离。在突变细胞的浸润/转移中，细胞需要脱离到与头顶侧相反的基底侧，因此认为该突变细胞向头顶侧的逸出是抑制由正常上皮细胞引起的转移的抗肿瘤现象(梶田美穂子等人, 日本药理学杂志, 2012; 140: 76-80)。另外还已知：在该细胞竞争过程中被挤出的细胞尚未开始细胞凋亡的情况下，因附着的丧失而引起被称为失巢凋亡(anoikis)的程序性细胞死亡(VanHook M. A., Sci. Signal. 2017; 10卷, Issue 478, eaan5866 DOI: 10.1126/scisignal. aan5866)。
本说明书中，“被清除细胞”是指，在作为细胞竞争的对象的适应度不同的2种细胞中，在细胞竞争中落败而被清除的细胞，“正常细胞”是指，在作为细胞竞争的对象的适应度不同的2种细胞中，在细胞竞争中胜出而清除被清除细胞的细胞。另外，本说明书中，在被清除细胞所含的细胞中，将通过器官移植、组织移植或细胞移植等移植的细胞(以下，称为“移植细胞”。)以外的细胞称为“异常细胞”。异常细胞除了包括通过内源基因的突变或外来基因的表达而导致适应度不同于正常细胞的突变细胞以外，还包括因基因表达的外遗传改变(epigenetic change)而导致适应度不同于正常细胞的细胞。另外，异常细胞还包括：癌细胞和癌化进行中的细胞(包括癌前状态的细胞)；感染了病毒等其他病原体的细胞；该病原体感染进行中的细胞；具有疾病特异性蛋白表达突变的细胞；遭受物理性损伤的细胞；神经、肌肉、脊椎等其他变性疾病中的已变性的细胞和变性进行中的细胞，但不限于这些。本发明中，在细胞竞争的调控为促进性调控的情况下，非清除细胞是异常细胞。另外，本发明中，在细胞竞争的调控为抑制性调控的情况下，非清除细胞为移植细胞。
本发明中的细胞竞争的促进性调控例如可列举：癌症或病毒感染症的预防或治疗、或者它们的促进或强化。另外，本发明中的细胞竞争的抑制性调控例如可列举：抑制或减轻非免疫系统的正常细胞对通过器官移植、组织移植或细胞移植而移植的细胞的清除。
本说明书中的细胞竞争并不限于通过免疫系统细胞进行的异常细胞或移植细胞的清除，还可以是通过非免疫系统的正常细胞进行的异常细胞或移植细胞的清除。
本说明书中，“免疫系统细胞”是指T细胞、B细胞和NK (自然杀伤)细胞等淋巴细胞、以及树状细胞和巨噬细胞等与免疫功能相关的细胞。
本说明书中，作为要移植的器官，例如可列举：肝脏、肾脏、心脏、肺、胰腺、或甲状腺、甲状旁腺、胸腺、包含肾上腺皮质或肾上腺髓质的内分泌器官、包含干细胞的器官等。
本说明书中，作为要移植的组织，例如可列举：皮肤、包含干细胞的组织、包含免疫细胞的组织等。
本说明书中，作为要移植的细胞，例如可列举：骨髄细胞、非粘附性骨髄细胞、外周血细胞、脐带血细胞、来自脐带胶质的细胞、来自胎盘的细胞、来自毛根的细胞、来自脂肪组织的细胞、淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞等。或者，可列举选自下述的细胞：包含选自骨髄细胞、非粘附性骨髄细胞、外周血细胞、脐带血细胞、来自脐带胶质的细胞、来自胎盘的细胞、来自毛根的细胞和来自脂肪组织的细胞的1种或多种的细胞；以及包含选自淋巴细胞、单核细胞和巨噬细胞的1种或多种的细胞。
本说明书中，作为神经变性疾病，例如可列举：阿尔茨海默病、轻度认知障碍、帕金森病、亨廷顿舞蹈病、脊髓小脑失调症、克-雅氏病、外伤诱发性神经变性、高压神经综合征、肌张力障碍、橄榄体脑桥小脑萎缩症、肌萎缩性侧索硬化症、多发性硬化症、癫痫、痴呆症、老年痴呆症、艾滋病痴呆综合征、艾滋病诱发性脑病等。
本说明书中，作为肌肉变性疾病，例如可列举：肌肉萎缩症、远端型肌病、先天性肌病、甲状腺中毒性肌病、糖原病、线粒体肌病、类固醇肌病、酒精中毒性肌病、炎症性肌病、内分泌性肌病、脂质沉积性肌病、HIV这样的感染症所伴随的肌病、玻璃体肌病、和重症肌无力症这样的自身免疫疾病所伴随的肌病等。
MHC是由高等动物的染色体上的主要组织相容性抗原复合物(MHC)区域编码的、免疫反应所必需的多个多态性蛋白的基因家族。该MHC家族的蛋白通过进行抗原呈递，参与细菌或病毒等感染病原体的清除、或癌细胞的排斥、器官移植时的排斥反应等，对免疫起到非常重要的作用。此外，参与肽的输送的TAP (抗原加工相关转运体：transporter associated with antigen processing)这样的参与免疫的各种蛋白组也由该MHC区编码。
MHC I类蛋白在有核的所有细胞中存在/表达。而且，MHC I类蛋白结合细胞内的内源性抗原。即，对于像病毒这样在感染的细胞内增殖的病原体、或者对于在癌细胞内产生的癌抗原，通过由MHC I类介导的抗原呈递引起免疫反应。MHC I类蛋白进一步分为典型的I类蛋白(Ia类)和非典型的I类蛋白(Ib类)。MHC I类蛋白是由添加了糖链的分子量45kDa的重链(α链)和分子量12kDa的β2微球蛋白轻链这两者进行非共价键合而得的二聚体，肽抗原与其结合形成三聚体而在细胞表面表达。I类重链由α1～α3这3个胞外结构域、跨膜结构域、胞内结构域构成。在α1区与α2区之间有大的沟状结构，在这里结合抗原并呈递。
像病毒这样在感染的细胞内增殖的病原体、或者在癌细胞内产生的蛋白等细胞质内的蛋白被泛素化后，被蛋白酶体降解成5～15个氨基酸左右的肽。已降解的肽通过位于内质网(ER)膜上的TAP (抗原加工相关转运体：transporter associated with antigen processing)这种ATP驱动型转运体输送至内质网(ER)内部。需要说明的是，TAP的结构为跨膜型，是由TAP1和TAP2构成的异源二聚体。MHC I类α链和β2微球蛋白在内质网(ER)内合成，在内质网(ER)内MHC I类α链、β2微球蛋白、以及肽这3者结合，制备MHC-肽复合物。之后，MHC-肽复合物被置于更小的内质网的内部，在通过囊泡输送运往细胞膜的途中通过高尔基体，接受糖链修饰后，到达细胞膜上进行表达。
本发明中，作为参与细胞竞争的调控的包含MHC Ia类的α3结构域的蛋白的例子，可列举：MHC I类的α3结构域、MHC I类的α3结构域的片段。MHC I类的α3结构域的片段可以是除MHC I类的α3结构域的全长以外的任何片段。本说明书中，术语“蛋白”和术语“肽”可互换使用。
本发明中，作为上述MHC Ia类的例子，还可列举：HLA-A、HLA-B、HLA-C或DLA-88，优选为HLA-B或DLA-88。
另外，本发明中的上述包含MHC Ia类的α3结构域的蛋白(MHC Ia类的α3结构域片段蛋白)的例子为选自下述a)～d)的至少1种蛋白：
a) 蛋白，其具有SEQ ID NO: 1 (DLA88的α3结构域的氨基酸序列)所示的氨基酸序列；
b) 蛋白，其是具有在SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列中有1个～多个氨基酸被缺失、取代或添加而得的氨基酸序列的蛋白，与包含LILRB3的D1和D2结构域的蛋白特异性地结合；
c) 蛋白，其是具有与SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列具有至少90%的相似性的氨基酸序列的蛋白，与包含LILRB3的D1和D2结构域的蛋白特异性地结合；以及
d) 蛋白，其包含DLA-88的直向同源物的α3结构域。
本说明书中，“相似性”是指，在利用该技术领域中已知的数学算法比对2个氨基酸序列的情况下，最佳比对(优选该算法可考虑向序列的一方或双方导入缺口以用于最佳比对。)下的同一氨基酸和相似氨基酸残基与重叠的总氨基酸残基的比例(%)。
本说明书中的氨基酸序列的同一性/相似性可采用同源性计算算法NCBI BLAST (National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool)，利用以下的条件(期待值=10；允许缺口；矩阵=BLOSUM62；过滤=OFF)进行计算。作为用于确定氨基酸序列的同源性的其他算法，例如可列举：Karlin等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA，90：5873-5877 (1993)中记载的算法[该算法被整合到NBLAST和XBLAST程序中(2.0版) (Altschul等人，Nucleic Acids Res., 25：3389-3402 (1997))]、Needleman等人, J. Mol. Biol., 48: 444-453 (1970)中记载的算法[该算法被整合到GCG软件包中的GAP程序中]、Myers和Miller, CABIOS, 4：11-17 (1988)中记载的算法[该算法被整合到CGC序列比对软件包的一部分即ALIGN程序中(2.0版)]、Pearson等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85：2444-2448 (1988)中记载的算法[该算法被整合到GCG软件包中的FASTA程序中]等，这些也可同样地优选使用。
另外，本发明的包含Ia类的α3结构域的蛋白只要与包含ILRB3的D1和D2结构域的蛋白特异性地结合即可，可以是包含下述的氨基酸序列或由其构成的蛋白：该包含α3结构域的蛋白的氨基酸序列(例：SEQ ID NO: 1所示的DLA88的α3结构域的氨基酸序列)中的1个～20个、优选1个～10个、更优选1个～数(5、4、3或2)个氨基酸缺失而得的氨基酸序列；在该包含α3结构域的蛋白的氨基酸序列(例：SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列)中添加了1个～20个、优选1个～10个、更优选1个～数(5、4、3或2)个氨基酸而得的氨基酸序列；该包含α3结构域的蛋白的氨基酸序列(例：SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列)中的1个～20个、优选1个～10个、更优选1个～数(5、4、3或2)个氨基酸被其他氨基酸取代而得的氨基酸序列；或者将它们组合而得的氨基酸序列。如果是性质相似的氨基酸(例：甘氨酸和丙氨酸、缬氨酸和亮氨酸和异亮氨酸、丝氨酸和苏氨酸、天冬氨酸和谷氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺、赖氨酸和精氨酸、半胱氨酸和蛋氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸等)之间的取代等，则可存在更多个数的取代等。
本发明的包含Ia类的α3结构域的蛋白只要与包含ILRB3的D1和D2结构域的蛋白特异性地结合即可，可以是包含下述的氨基酸序列或由其构成的蛋白：与该包含Ia类的α3结构域的蛋白的氨基酸序列(例：SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列)的相似性为80%以上的氨基酸序列，优选85%以上(86%、87%、88%或89%以上)、更优选90%以上(91%、92%、93%或94%以上)、进一步优选95%以上(96%、97%或98%以上)、更进一步优选99%以上。
本发明中，抗LILRB3的激动剂抗体只要是与LILRB3 (更具体而言为LILRB3的D1和D2结构域)结合、且可调控细胞竞争(更具体而言是促进细胞竞争)的抗体即可，没有特别限定。该抗体例如可根据国际公开第2003/091424号、国际公开第2005/056602等中记载的方法，由本领域技术人员适当筛选而获取。
作为MHC Ia类的受体起作用的LILRB3也被称为ENSCAFG00000028453、CD85a、ILT5或LIR3。LILRB3是免疫球蛋白样受体之一，具有D1～D4的胞外免疫球蛋白结构域、跨膜结构域和胞内结构域，在专职免疫细胞中的表达为人所熟知，但在上皮细胞中也会表达。关于其功能还未必谈得上已被充分阐明。
本说明书中，作为包含LILRB3的D1和D2结构域的蛋白的例子，可列举：LILRB3的D1和D2结构域、LILRB3的D1和D2结构域的片段。LILRB3的D1和D2结构域的片段可以是除LILRB3的D1和D2结构域的全长以外的任何片段。
本发明中，DLA-88 (由SEQ ID NO: 13所示的DLA-88的全长氨基酸序列构成的蛋白)的直向同源物和狗LILRB3 (ENSCAFG00000028453) (由SEQ ID NO: 14所示的ENSCAFG00000028453的全长氨基酸序列构成的蛋白)的直向同源物例如是除狗以外的哺乳动物中的直向同源物，优选为灵长类(例：类人猿、人等)，更优选为人(例：SEQ ID NO: 11是人MHC Ib的α3结构域的氨基酸序列、SEQ ID NO: 15是人MHC B的全长氨基酸序列、SEQ ID NO: 12是人LILRB3的D1和D2结构域的氨基酸序列、SEQ ID NO: 16是人LILRB3的全长氨基酸序列)。
本发明中，上述包含LILRB3的D1和D2结构域的蛋白的例子为选自下述e)～h)的至少1种蛋白：
e) 蛋白，其具有SEQ ID NO: 8 (ENSCAFG00000028453的D1和D2结构域的氨基酸序列)所示的氨基酸序列；
f) 蛋白，其是具有在SEQ ID NO: 8所示的氨基酸序列中有1个～多个氨基酸被缺失、取代或添加而得的氨基酸序列的蛋白，与包含MHC Ia类的α3结构域的蛋白特异性地结合；
g) 蛋白，其是具有与SEQ ID NO: 8所示的氨基酸序列具有至少80%的相似性的氨基酸序列的蛋白，与包含MHC Ia类的α3结构域的蛋白特异性地结合；以及
h) 蛋白，其包含ENSCAFG00000028453的直向同源物的D1和D2结构域。
另外，本发明的包含LILRB3的D1和D2结构域的蛋白只要与包含MHC Ia类的α3结构域的蛋白特异性地结合即可，可以是包含下述的氨基酸序列或由其构成的蛋白：该包含D1和D2结构域的蛋白的氨基酸序列(例：SEQ ID NO: 8所示的、ENSCAFG00000028453的D1和D2结构域的氨基酸序列)中的1个～20个、优选1个～10个、更优选1个～数(5、4、3或2)个氨基酸缺失而得的氨基酸序列；在该包含D1和D2结构域的蛋白的氨基酸序列(例：SEQ ID NO: 8所示的氨基酸序列)中添加了1个～20个、优选1个～10个、更优选1个～数(5、4、3或2)个氨基酸而得的氨基酸序列；该包含D1和D2结构域的蛋白的氨基酸序列(例：SEQ ID NO: 8所示的氨基酸序列)中的1个～20个、优选1个～10个、更优选1个～数(5、4、3或2)个氨基酸被其他氨基酸取代而得的氨基酸序列；或者将它们组合而得的氨基酸序列。如果是性质相似的氨基酸(例：甘氨酸和丙氨酸、缬氨酸和亮氨酸和异亮氨酸、丝氨酸和苏氨酸、天冬氨酸和谷氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺、赖氨酸和精氨酸、半胱氨酸和蛋氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸等)之间的取代等，则可存在更多个数的取代等。
本发明的包含LILRB3的D1和D2结构域的蛋白只要与包含MHC Ia类的α3结构域的蛋白特异性地结合即可，可以是包含下述的氨基酸序列或由其构成的蛋白：与该包含LILRB3的D1和D2结构域的蛋白的氨基酸序列(例：SEQ ID NO: 8所示的氨基酸序列)的相似性为80%以上的氨基酸序列，优选85%以上(86%、87%、88%或89%以上)、更优选90%以上(91%、92%、93%或94%以上)、进一步优选95%以上(96%、97%或98%以上)、更进一步优选99%以上。
本发明中使用的包含MHC Ia类的α3结构域的蛋白或包含LILRB3的D1和D2结构域的蛋白可以是它们的盐、水合物、溶剂合物等。
本发明中使用的“抑制MHC Ia类与LILRB3的结合的物质” (以下，有时简记为“本发明的物质”。)只要抑制MHC Ia类与LILRB3的结合、更具体而言是包含MHC Ia类的α3结构域的蛋白与(在细胞中表达的) LILRB3的D1和D2结构域的结合即可，没有特别限定。具体而言，例如可列举：包含LILRB3的D1和D2结构域的蛋白(包括显性失活突变体等)、抗LILRB3的D1和D2结构域的抗体(包括中和抗体等)、适体、LILRB3的表达抑制剂等。
本发明中使用的抗LILRB3的D1和D2结构域的抗体可利用自身已知的方法以多克隆或单克隆抗体的形式获得。或者，可使用市售品。对本发明中使用的抗体的来源没有特别限定，优选来自哺乳动物，更优选为来自人的抗体。作为来自哺乳动物的单克隆抗体，可以是在杂交瘤中产生的单克隆抗体、和在利用基因工程学方法用包含抗体基因的表达载体转化的宿主中产生的单克隆抗体中的任一种。产生抗体的杂交瘤可利用自身已知的方法制备，例如可使用LILRB3的D1和D2结构域或其一部分作为抗原，按照普通的免疫方法对该抗原进行免疫，将所得的免疫细胞通过普通的细胞融合法与已知的亲本细胞融合，再利用普通的筛选方法筛选产生单克隆抗体的细胞，从而制备杂交瘤。
本发明中使用的适体可以是核酸适体，也可以是肽适体。在核酸适体的情况下，该核酸可以是DNA也可以是RNA，或者可以是DNA/RNA嵌合物。另外，还可以是对核糖、磷酸骨架、核酸碱基、氨基酸残基、两末端部分施以修饰而得的核酸或肽。核酸适体可以是双链也可以是单链，但优选为单链。本发明的适体可利用本领域技术人员已知的方法进行筛选。没有特别限定，例如可利用SELEX法(指数富集配体的系统进化：Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) (Tuerk, C.和Gold, L., 1990, Science, 249: 505-510)或酵母的双杂交法进行筛选。
本发明中使用的LILRB3的表达抑制剂可在编码LILRB3的基因的转录水平、转录后调节的水平、翻译成蛋白的水平、翻译后修饰的水平等任何阶段起作用。因此，作为LILRB3的表达抑制剂，例如包括：抑制编码LILRB3的基因的转录的核酸(例：反义基因)、抑制从初期转录产物加工成mRNA的核酸、抑制从mRNA到蛋白的翻译(例：反义核酸、miRNA)或者降解mRNA (例：siRNA、核酶、微RNA (miRNA))的核酸等。
siRNA可根据LILRB3基因的cDNA序列信息，例如按照Elbashir等人(Genes Dev., 15, 188-200 (2001))提倡的规则进行设计。另外，作为siRNA的前体的短发夹RNA (shRNA)可通过适当选择可形成环结构的任意的接头序列(例如，5个～25个碱基左右)，经由该接头序列连接siRNA的有义链和反义链来设计。
siRNA和/或shRNA的序列可使用各种网站上免费提供的检索软件进行检索。作为这样的网站，例如可列举：Dharmacon提供的siDESIGN Center (http://dharmacon.horizondiscovery.com/jp/design-center/rdr=true&LangType=1041&pageid=17179928204)、GenScript提供的siRNA Target Finder (https://www.genscript.com/tools/sirna-target-finder)等，但不限于这些。
miRNA可使用各种网站上免费提供的目标预测软件进行检索。作为这样的网站，例如可列举：美国Whitehead研究所公开的TargetScan (http://www.targetscan.org/vert_72/)、希腊的Alexander Fleming生物医学科学研究中心公开的DIANA-micro-T-CDS (http://diana.imis.athena-innovation.gr/DianaTools/index.phpr=microT_CDS/index)等，但不限于这些。或者，还可使用Thessaly大学/Pasteur研究所等公开的、经实验证明与目标mRNA作用的miRNA的相关数据库即TarBase (http://carolina.imis.athena-innovation.gr/diana_tools/web/ index.phpr=tarbasev8/index)，检索以编码ILRB3的mRNA为目标的miRNA。
siRNA可通过利用DNA/RNA自动合成仪分别合成mRNA上的目标序列的有义链和反义链，在适当的退火缓冲液中、在约90～约95℃下变性约1分钟左右，之后在约30～约70℃下退火约1～约8小时来调制。另外，还可通过合成作为siRNA的前体的shRNA，并用切丁酶(dicer)切割该shRNA来调制。miRNA和pre-miRNA可根据它们的序列信息，使用DNA/RNA自动合成仪进行合成。
反义核酸可以是DNA也可以是RNA，或者可以是DNA/RNA嵌合物。在反义核酸为DNA的情况下，由目标RNA和反义DNA形成的RNA:DNA杂交物可被内源性RNase H识别，引起目标RNA的选择性降解。反义核酸的目标区域只要是该反义核酸发生杂交、其结果抑制向蛋白的翻译的区域即可，对其长度没有特别限定，可以是编码蛋白的mRNA的整个序列也可以是部分序列，短的区域可列举约10个碱基左右，长的区域可列举mRNA或初期转录产物的整个序列。另外，反义核酸还可以是不仅与目标mRNA或初期转录产物杂交以抑制向蛋白的翻译、而且还与作为双链DNA的这些基因结合以形成三链(三股螺旋)而能够抑制向RNA的转录的反义核酸(反义基因)。
反义核酸可通过根据目标基因的cDNA序列或基因组DNA序列确定mRNA或初期转录产物的目标序列，使用市售的DNA/RNA自动合成仪合成与其互补的序列来调制。
本发明的调控剂以胃肠外(例：静脉内、动脉内、肌肉内、皮下、皮内、腹腔内、阴道内、肌肉内、经鼻、直肠内、口腔内、眼内、耳内、舌下等)用制剂、或者口服用制剂的形式调制、使用。在口服给药的情况下，饭前、饭后、饭中均可。本发明的调控剂例如以使用生理盐水等溶剂稀释至规定的浓度和剂量、并加入药学上可接受的添加剂的制剂的形式调制、使用。本发明的调控剂可作为药物组合物来调制。
作为本发明的调控剂的剂型，例如可使用：将有效量的包含MHC Ia类的α3结构域的蛋白、或者抑制MHC Ia类与LILRB3的结合的物质在水、生理盐水等稀释液或分散介质中溶解、分散、乳化而得的注射剂、乳膏剂、软膏、饮料剂、气溶胶、皮肤凝胶、滴眼剂、滴鼻剂等液体制剂；片剂、胶囊剂、散剂、粉末制剂、颗粒剂、片剂、缓释制剂、栓剂等固体制剂等，这些可以是将有效成分密封至脂质体或缓释性材料等而得的密封体或担载于载体而得的担载体等形式。本发明的调控剂的剂型可以是单位剂量形式的制剂，也可以是多次给药形式的制剂。
作为口服制剂，可列举：片剂、散剂、粉末制剂、颗粒剂、细粒剂、丸剂、胶囊剂、锭剂、咀嚼剂、液体制剂、乳剂、微囊剂、悬浮剂、酏剂、糖浆剂、缓释制剂等，这些可以是将有效成分密封至脂质体或缓释材料等而得的密封体或担载于载体而得的担载体等形式。
作为胃肠外制剂，可列举：将有效量的肾上腺髓质素或其修饰物、或它们的衍生物、或者它们的盐在水、生理盐水等稀释液或分散介质中溶解、分散、乳化而得的注射剂、输液、乳膏剂、软膏、气溶胶、皮肤凝胶、滴眼剂、滴鼻剂等液体制剂。或者，可以是粉末制剂、透皮贴剂、洗剂、软膏剂、巴布剂(cataplasm)或栓剂的形式。
上述药学上可接受的药品添加剂可添加本领域技术人员所已知的稳定剂、抗氧化剂、pH调节剂、缓冲剂、悬浮剂、乳化剂、表面活性剂等添加物来调制。这些药品添加剂的种类及其用法/剂量记载于药品添加物事典2007 (日本药品添加剂协会编、药事日报社、2007年7月)等中，可按照这些记载进行调制、使用。
具体而言，作为稳定剂，例如可使用：酒石酸、枸橼酸、琥珀酸、富马酸等有机酸，作为抗氧化剂，例如可使用：抗坏血酸、二丁基羟基甲苯或没食子酸丙酯等，作为pH调节剂，例如可使用：稀盐酸或氢氧化钠水溶液等，作为缓冲剂，例如可使用：枸橼酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸或抗坏血酸或其盐类、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、天冬氨酸、丙氨酸或精氨酸或其盐类、氧化镁、氧化锌、氢氧化镁、磷酸或硼酸或其盐类，作为悬浮剂或乳化剂，例如可使用：卵磷脂、蔗糖脂肪酸酯、聚甘油脂肪酸酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油、聚山梨醇酯或聚氧乙烯/聚氧丙烯共聚物等，作为表面活性剂，例如可使用：聚山梨醇酯80、月桂基硫酸钠或聚氧乙烯氢化蓖麻油等，但不限于这些。
作为本发明的调控剂的给药对象，可列举：人、人以外的哺乳动物(例如，小鼠、大鼠、仓鼠、兔、猫、狗、牛、羊、猴等)等。需要说明的是，在应用于人以外的哺乳动物的情况下，本发明的调控剂的给药量可根据动物的体重或大小适当增减。
关于本发明的调控剂，作为有效成分的包含MHC Ia类的α3结构域的蛋白或抗LILRB3的激动剂抗体、或者抑制MHC Ia类与LILRB3的结合的物质的成人每日给药量可根据性别、年龄、体重、其症状、给药途径、剂型等适当调整。例如，在有效成分为蛋白的情况下，通常可在约0.0001mg/kg～约1,000mg/kg的范围内选择。或者，每个对象(患者)例如可在约0.001mg/个体～约1,00000mg/个体的范围内选择。然而，本发明的调控剂并不受上述给药量的限制。
本发明的调控剂可将上述每日的给药量通过一次或分几次进行给药。另外，作为给药时间，可以是饭前、饭后、饭中。另外，对给药间隔没有特别限定，可以是每天、隔天、间歇给药。对给药期间没有特别限定，可长期给药。
在本发明的细胞竞争调控剂为促进细胞竞争的促进剂的情况下，通过该细胞竞争清除的细胞(例：突变细胞等)，如后述的实施例中所示，成为胱天蛋白酶(caspase)阳性细胞，可被诱导细胞死亡(例：细胞凋亡)。因此，该调控剂单独可适合于癌症(也包括癌前状态)的预防或治疗。另外，在癌症的治疗(例：外科治疗)后，也可利用该调控剂清除与该癌症的转移或复发相关的细胞，该被清除的细胞与上述同样地成为胱天蛋白酶阳性细胞，可被诱导细胞死亡(例：细胞凋亡)。因此，该调控剂单独也适合于预防或治疗癌症的转移或复发。
而且，如上所述，通过本发明的细胞竞争调控剂清除的细胞被诱导细胞死亡(例：细胞凋亡)的可能性高，例如，即使在对免疫检查点抑制剂(例：抗PD-1抗体等)具有抗性的这样的癌症中，通过并用本发明的细胞竞争调控剂和如后所述的药剂，也可期待更优异的癌症的预防或治疗效果。
在本发明的细胞竞争调控剂为抑制细胞竞争的抑制剂的情况下，如由后述的实施例所理解，例如，适合于将移植细胞维持在所期望的部位等。另外，例如为了进一步提高细胞移植的效率，可与如后所述的药剂并用。
如上所述，本发明的调控剂可与其他药剂和/或其他治疗方法并用(并用剂)、即组合使用。在并用时，本发明的调控剂和其他药剂可作为单一的药物形式提供，也可作为包含分别制成制剂的多种制剂的药物组合或试剂盒的形式提供。对本发明的调控剂和并用的药剂的给药时期没有限定，可对给药对象同时给予本发明的调控剂和并用的药剂，也可分别(例：连续、相隔一定时间等)给药。并用的药剂的给药量可遵照临床上使用的给药量，可根据给药对象、给药途径、疾病、组合等适当选择。
在本发明的调控剂为细胞竞争促进剂的情况下，上述的其他药剂例如有时是抗癌药或抗病毒药。在本发明的调控剂为细胞竞争抑制剂的情况下，上述的其他药剂有时是免疫抑制剂、移植器官的排斥反应抑制剂、和/或移植后的植入促进剂。
本发明的细胞竞争促进剂中，作为上述的其他药剂的抗癌药包括：烷基化剂、细胞毒性抗生素、铂制剂、代谢拮抗剂、激酶抑制剂、血管生成抑制剂、激素药物、DNA修饰酶抑制剂、蛋白酶体抑制剂、生物碱制剂、I型和II型拓扑异构酶抑制剂、组蛋白去乙酰化酶抑制剂、细胞因子制剂、激素药物、免疫检查点抑制剂、自然杀伤细胞活化剂、吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)抑制剂、单克隆抗体、以及其他的分子靶向治疗药，但不限于这些。
更具体而言，上述抗癌药包括：多柔比星、柔红霉素、顺铂、奥沙利铂、卡铂、紫杉醇、伊立替康、SN-38、放线菌素D、长春新碱、长春碱、甲氨蝶呤、硫唑嘌呤、氟尿嘧啶、丝裂霉素C、多西他赛、环磷酰胺、卡培他滨、表柔比星、吉西他滨、米托蒽醌、甲酰四氢叶酸、长春瑞滨、曲妥珠单抗、依托泊苷、雌莫司汀、泼尼松、干扰素α、白细胞介素-2、博莱霉素、异环磷酰胺、美司钠、六甲蜜胺、拓扑替康、阿糖胞苷、甲泼尼龙、地塞米松、巯嘌呤、硫鸟嘌呤、氟达拉滨、吉妥珠单抗、伊达比星、米托蒽醌、维甲酸、阿仑珠单抗、苯丁酸氮芥、克拉屈滨、伊马替尼、表柔比星、达卡巴嗪、丙卡巴肼、氮芥、利妥昔单抗、地尼白介素、甲氧苄啶/磺胺甲噁唑、别嘌呤醇、卡莫司汀、他莫昔芬、非格司亭、替莫唑胺、美法仑、长春瑞滨、阿扎胞苷、沙利度胺、丝裂霉素、瑞戈非尼、西妥昔单抗、帕尼单抗、雷莫芦单抗、吉非替尼、厄洛替尼、阿法替尼、克唑替尼、艾乐替尼、色瑞替尼、乐伐替尼、拉帕替尼、帕妥珠单抗、舒尼替尼、索拉非尼、阿昔替尼、帕唑帕尼、纳武单抗、帕博利珠单抗、伊匹单抗、威罗菲尼、依维莫司、替西罗莫司、贝伐珠单抗、格尔德霉素等，但不限于这些。
本发明的细胞竞争促进剂中，作为上述其他药剂的抗病毒药包括：干扰素、核苷类和核苷酸类逆转录酶抑制剂、非核苷类逆转录酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、整合酶抑制剂、融合抑制剂、成熟抑制剂、鸟嘌呤核苷类似物、pridin类似物、嘧啶类似物、以及不包含于上述任一类的本技术领域所识别的其他“未分类的”抗病毒药(例如，膦甲酸和米替福新)，但不限于这些。
更具体而言，上述抗病毒药包括：阿巴卡韦、阿昔洛韦、阿德福韦、金刚烷胺、氨多索韦、安普那韦、阿普拉维洛克、阿立他滨、阿比多尔、阿扎那韦、贝韦立马、BMS-488043、波西普韦、溴夫定、西多福韦、DCM205、二十二烷醇、地拉韦啶、地达诺辛、达芦那韦、依非韦伦、艾维雷韦、艾夫他滨、恩曲他滨、恩夫韦肽、 表没食子儿茶素没食子酸酯、依曲韦林、泛昔洛韦、福沙那韦、更昔洛韦、globoidnan A、格瑞弗森(griffithsin)、伊巴利珠单抗、碘苷、茚地那韦、拉米夫定、洛匹那韦、洛韦胺、马拉韦罗、奈非那韦、奈韦拉平、奥司他韦、聚乙二醇干扰素α-2a、聚乙二醇干扰素α-2b、喷昔洛韦、帕拉米韦、普乐沙福、PRO 140、拉西韦、拉替拉韦、利托那韦、利巴韦林、金刚乙胺、利匹韦林、沙奎那韦、斯坦匹定、司他夫定、泰诺福韦、替拉那韦、TNX-355、三氟胸苷、曲金刚胺、伐昔洛韦、缬更昔洛韦、维立韦罗、 阿糖腺苷、维拉米定、威维康(vivecon)、扎西他滨、扎那米韦和齐多夫定等，但不限于这些。
本发明的细胞竞争抑制剂中，作为上述其他药剂的免疫抑制剂包括：类固醇、环孢素、环孢素类似物、环磷酰胺、甲泼尼龙、泼尼松、硫唑嘌呤、他克莫司水合物、15-脱氧精胍菌素、那他珠单抗、雷帕霉素、依那西普，但不限于这些。
在本发明中，上述并用药的给药量也可在副作用不成为问题的范围内设定为任何的量。并用的药剂的每日给药量根据症状的程度、给药对象的年龄、性别、体重、敏感性的差异、给药的时期、间隔、药物制剂的性质、配药、种类、有效成分的种类等而不同，没有特别限定。
(2) 本发明的调控方法等
本发明的另一实施方式为细胞竞争的调控方法，包括将治疗有效量的包含MHC Ia类的α3结构域的蛋白或抗LILRB3的激动剂抗体、或者抑制MHC Ia类与LILRB3的结合(更具体而言是MHC Ia类的α3结构域与LILRB3的D1和D2结构域的结合)的物质给予至需要其的对象。
另外，在该细胞竞争的调控方法中，在给予包含MHC Ia类的α3结构域的蛋白或抗LILRB3的激动剂抗体的情况下，该调控方法可以是癌症或病毒感染症的预防或治疗。
而且，在细胞竞争的调控方法中，在给予抑制MHC Ia类与LILRB3的结合的物质的情况下，该调控方法可以是：改善器官移植、组织移植或细胞移植的植入失败；或者，抑制神经变性疾病、肌肉变性疾病等其他各种变性疾病的症状进展。
另外，本发明的又一实施方式为：包含MHC Ia类的α3结构域的蛋白或抗LILRB3的激动剂抗体、或者抑制MHC Ia类与LILRB3的结合的物质在制造用于调控细胞竞争的药物中的应用。
关于上述本发明的调控方法等，可引用上述(1)本发明的调控剂的全部内容。
本说明书中提及的所有文献均通过引用而将其整体纳入本说明书。本说明书的详细的说明和实施例是用于示例本发明的实施方式，不应解释为限定本发明的权利范围。
实施例1
本说明书的实施例中的克隆、基因组编辑、细胞培养、显微镜观察、或蛋白的表达、诱导和纯化等是使用可在市面上买得到的载体、试剂和试剂盒等按照制造商的说明书来进行。
＜通过抑制RasV12表达细胞中的抗原呈递来抑制MDCK正常细胞对异常细胞的清除能力＞
1. 实验方法
RasV12表达细胞的建立
通过核转染(Nucleofection)向来自狗的肾小管上皮细胞的细胞株的MDCK细胞中基因导入pTRE3G-GFP-RasV12和Hyper PiggyBac转座酶表达载体。使用杀稻瘟菌素筛选进行了基因导入的MDCK细胞，分离存活的细胞集落，从而得到了单克隆pTRE3G-GFP-RasV12表达MDCK稳定细胞株。进一步添加多西环素(200ng/mL)，之后于24小时后使用荧光显微镜，以是否存在GFP的荧光为指标，最终得到了在所有细胞中GFP-RasV12都更均匀地表达的RasV12表达MDCK细胞作为可使用的稳定细胞株。在以下的实施例中，以上述RasV12表达MDCK细胞作为异常细胞，研究了其与正常MDCK细胞之间的细胞竞争。
TAPl基因缺陷型RasV12表达细胞的建立
向四环素诱导性Cas9稳定MDCK细胞株(pCW-Cas9-MDCK)中基因导入了插入有SEQ ID NO: 3的引导序列(目标序列(gRNA))的pCDH-QC-sgRNA (Maruyama等人, Nat. Biotechnol. 2015)。
基因导入后，利用多西环素(200ng/mL)诱导Cas9。在潮霉素(400μg/mL)的存在下再培养7天，从而仅选择具有pCDH-QC-sgRNA的细胞。所选择的细胞被有限稀释至0.5个细胞/孔的浓度，从而得到了单一克隆。之后，通过序列分析将带有基因缺陷的克隆作为TAPl基因的KO细胞。为了消除克隆效应，选择2个克隆的细胞(TAP-KO#1和TAP-KO#2)，通过与上述RasV12表达细胞的建立同样的操作，使用PB-pTRE3G-RasV12载体建立了TAPl基因缺陷型RasV12表达MDCK细胞。
在正常细胞与异常细胞之间的细胞非自主性效果的评价
将I-A型胶原蛋白、5× DMEM溶液和pH调节缓冲溶液以7:2:1的比例在冰上混合，制备胶原蛋白凝胶溶液。在12孔板上放置15mm的盖玻片，在其上加入500μL胶原蛋白凝胶溶液，在37℃下静置30分钟使其凝固。
将1×106个MDCK正常细胞和2×104个RasV12表达MDCK细胞(TAPl基因野生型细胞(TAP-WT-RasV12)或TAPl基因缺陷型细胞(TAP-KO#1-RasV12或TAP-KO#2-RasV12))混合使达到50:1的比例，接种在胶原蛋白凝胶上，在37℃下培养8-12小时直至形成单层，之后进行24小时的多西环素处理(200ng/mL)。
进行了24小时的多西环素处理后，加入4%多聚甲醛/PBS，在避光下、室温下培养15分钟，固定细胞。固定后，加入0.1%Triton X-100/PBS，在避光下、室温下培养15分钟，进行膜渗透处理。在1%BSA/PBS中于避光下、室温下静置1小时，从而进行封闭。然后，在室温下与用1%BSA/PBS稀释至200倍的Alexa-Fluor-568-缀合鬼笔环肽反应1小时。再进行5分钟×3次的PBS洗涤，之后在室温下与用PBS稀释至4,000倍的Hoechst 33342反应10分钟。最后，用Mowiol密封在载玻片上。
使用开源ImageJ对细丝蛋白的累积进行统计处理(图1B)。关于由细丝蛋白的累积产生的RasV12表达细胞(TAP-WT-RasV12、TAP-KO#1-RasV12和TAP-KO#2-RasV12)的清除效率，在共聚焦显微镜下找出由2～8个细胞构成的GFP荧光阳性细胞的集落，计数其中逃逸到头顶侧的数量，最终以逃逸的细胞数量与RasV12表达细胞的总数的比例表示清除效率。
为了研究RasV12表达MDCK细胞的抗原呈递是否会促进MDCK正常细胞的清除能力，比较了MDCK正常细胞对TAPl基因野生型RasV12表达细胞(TAP-WT-RasV12)的清除效率和MDCK正常细胞对TAPl基因缺陷型RasV12表达细胞(TAP-KO#1-RasV12和TAP-KO#2-RasV12)的清除效率。
2. 实验结果
若对RasV12表达细胞(TAP-WT-RasV12、TAP-KO#1或TAP-KO#2)和MDCK正常细胞进行共培养，则根据在正常细胞与异常细胞之间的细胞非自主性效果确认到细丝蛋白在MDCK正常细胞侧累积(图1A)。另一方面，与包围TAPl基因野生型RasV12表达细胞(TAP-WT-RasV12)的MDCK正常细胞中的细丝蛋白的累积相比，包围TAPl基因缺陷型RasV12表达细胞(TAP-KO#1和TAP-KO#2)的MDCK正常细胞中的细丝蛋白的累积在统计学上被显著抑制(图1B)。另外，在研究由细丝蛋白的累积产生的RasV12表达细胞的清除效率时，与RasV12表达细胞(TAP-WT-RasV12)中的清除效率相比，确认到TAPl基因缺陷型RasV12表达细胞(TAP-KO#1-RasV12和TAP-KO#2-RasV12)中的清除效率被抑制(图1C、1D)。
实施例2
＜利用DLA家族的DLA88进行的异常细胞的清除促进的正向调控＞
1. 实验方法
DLA88-KO细胞、DLA79-KO细胞、DLA64-KO细胞和DLA12-KO细胞的建立
作为参与抗原呈递的蛋白，着眼于MHC I类蛋白的狗中的直向同源物即DLA家族的DLA12、DLA64、DLA79和DLA88。向四环素诱导性Cas9稳定MDCK细胞株(pCW-Cas9-MDCK)中基因导入了插入有SEQ ID NO: 4～7 (分别为DLA88、DLA79、DLA64和DLA 12)的引导序列(目标序列(gRNA))的pCDH-QC-sgRNA (Maruyama等人, Nat. Biotechnol. 2015)。
基因导入后，利用多西环素(200ng/mL)诱导Cas9。在潮霉素(400μg/mL)的存在下再培养7天，从而仅选择具有pCDH-QC-sgRNA的细胞。所选择的细胞被有限稀释至0.5个细胞/孔的浓度，从而得到了单一克隆。之后，通过序列分析，以具有基因缺陷的克隆作为各基因的KO细胞。以下，将DLA88基因缺陷型RasV12表达细胞、DLA79基因缺陷型RasV12表达细胞、DLA64基因缺陷型RasV12表达细胞和DLA12基因缺陷型RasV12表达细胞分别称为DLA88-KO-RasV12、DLA79-KO-RasV12、DLA64-KO-RasV12和DLA12-KO-RasV12。
为了消除克隆效应，针对各基因缺陷型RasV12表达细胞选择2个克隆的细胞，通过与上述RasV12表达细胞的建立同样的操作，使用PB-pTRE3G-RasV12载体建立了基因缺陷型RasV12表达细胞。
与实施例1同样地测定细丝蛋白的累积，算出由细丝蛋白的累积产生的异常细胞(DLA88-KO-RasV12、DLA79-KO-RasV12、DLA64-KO-RasV12和DLA12-KO-RasV12)的清除效率。另外，与实施例1同样地固定细胞，之后在荧光显微镜下观察。
2. 实验结果
通过CRISPR/Cas9系统使DLA12、DLA64、DLA79和DLA88发生基因缺陷的结果，仅在DLA88的基因缺陷RasV12表达细胞(DLA88-KO-RasV12)中抑制了MDCK正常细胞所产生的清除效率(图2A)。由此显示：DLA88正向调控RasV12表达细胞的清除。进一步使用共聚焦显微镜分析异常细胞(DLA88-KO-RasV12、DLA79-KO-RasV12、DLA64-KO-RasV12和DLA12-KO-RasV12)的行为时，DLA88的基因缺陷RasV12表达细胞(DLA88-KO-RasV12)显示出了潜入基底侧的基底突出、而不是在DLA88基因未缺陷的RasV12表达细胞(DLA-WT-RasV12、DLA79-KO-RasV12、DLA64-KO-RasV12和DLA12-KO-RasV12)中发现的顶端挤压(图2B)。
实施例3
＜利用DLA88的胞外结构域蛋白促进异常细胞的清除＞
1. 实验方法
重组蛋白的制备
DLA88 α (α)3
DLA88的胞外结构域由3个α结构域构成(图3A)。因此，制备了α1和α2结构域的重组蛋白(DLA88-α1/2)、以及α3结构域的重组蛋白(DLA88-α3)。为了制备DLA88-α3的重组蛋白(SEQ ID NO: 1)和DLA88-α1/2的重组蛋白，将编码DLA88-α3的DNA片段(SEQ ID NO: 2)和编码DLA88-α1/2的DNA片段插入到pGEX-6p-1的EcoRI/XhoI限制酶位点，从而制备了表达用质粒pGEX-6p-1-DLA88-α3和pGEX-6p-1-DLA88-α1/2。
在由pGEX-6p-1-DLA88-α3或DLA88-α1/2转化的BL21的培养液中加入IPTG (终浓度为0.1 mM)，在25℃下用2小时诱导重组蛋白的表达。将已集菌的大肠杆菌增溶，使用谷胱甘肽-琼脂糖凝胶4B从提取液中纯化DLA88-α3 (SEQ ID NO: 1)和DLA88-α1/2的重组蛋白。
在正常细胞与异常细胞之间的细胞非自主性效果的评价
除多西环素处理以外，还进行了重组蛋白处理(30nM或300nM)，除此之外，与实施例1同样地评价了细胞非自主性效果。
2. 实验结果
DLA88的胞外结构域由3个α结构域构成。因此，制备了α3结构域的重组蛋白。另外，以正常细胞:突变细胞=50:1的细胞比混合形成单一细胞层后，利用多西环素使GFP-RasV12蛋白表达。若与多西环素同时处理重组蛋白DLA88-α3，则浓度依赖性地促进突变细胞的清除(图3A和图3B)。另外，即使在正常细胞:DLA88缺陷突变细胞=50:1的条件下，在同重组蛋白的存在下也促进了异常细胞的清除。由此可知：DLA88促进了异常细胞的清除，胞外结构域的重组蛋白会促进异常细胞的清除(图3C、图3D)。
实施例4
LILRB3的敲除
1. 实验方法
为了敲除狗LILRB3 (ENSCAFG00000028453、以下也记作“28453”)基因，按照与实施例2同样的方法，使用SEQ ID NO: 10所记载的LILRB3的引导序列(目标序列)进行基因组编辑。
2. 实验结果
通过敲除LILRB3 (ENSCAFG00000028453、以下也记作“28453”)，正常细胞(MDCK细胞)对异常细胞(LILRB3基因缺陷型RasV12表达MDCK细胞、28453-KO-RasV12)的清除效率在统计学上显著降低(图4A)。
实施例5
28453的胞外结构域D1-D2重组蛋白的制造
1. 实验方法
28453 D1-D2
为了制备28453 D1-D2的重组蛋白(SEQ ID NO: 8)，将编码28453 D1-D2的DNA片段(SEQ ID NO: 9)插入到pGEX-6p-1的EcoRI/XhoI限制酶位点，从而制备了表达用质粒pGEX-6p-1-28453 D1-D2 (图4B)。
在由pGEX-6p-1-DLA88-α3转化的BL21的培养液中加入IPTG (终浓度为0.1mM)，在25℃下用2小时诱导重组蛋白的表达。将已集菌的大肠杆菌增溶，使用谷胱甘肽-琼脂糖凝胶4B从提取液中纯化28453 D1-D2 (SEQ ID NO: 8)的重组蛋白。
2. 实验结果
得到了目标的“28453-D1/2” (SEQ ID NO: 8)的重组蛋白。
实施例6
28453-D1/2与DLA88-α3的结合性评价
1. 实验方法
在含有0.1%TritonX-100的PBS (0.1%TritonX-100-PBS)中以1:1混合GST-28453-D1/2-HA和GST-DLA88-α3-Flag。之后，在37℃下静置2小时，加入担载有抗Flag抗体的珠粒(以下，称为“Flag珠粒”。)，在4℃下颠倒混合30分钟。用0.1%TritonX-100-PBS洗涤Flag珠粒3次后，用SDS-PAGE展开分离。免疫沉淀的GST-DLA88-α3-Flag通过抗Flag抗体来检测，而共沉淀的GST-28453-D1/2-HA通过抗HA抗体来检测。
2. 实验结果
混合用HA标记的28453-D1/2和用FLAG标记的DLA88-α3后，若使其免疫沉淀，则观察到了HA和FLAG这两个标记。由该结果显示出：28453-D1/2和DLA88-α3具有结合活性(图4C)。
实施例7
在正常细胞与突变细胞之间的细胞非自主性效果的评价
1. 实验方法
除多西环素处理以外，还进行了重组蛋白处理(300nM或1,000nM)，除此之外，与实施例1和3同样地评价了细胞非自主性效果。
2. 实验结果
若在正常细胞(MDCK细胞)与异常细胞(RasV12表达细胞)的混合培养中添加300nM和1,000nM的28453-D1/2，则在1,000nM添加组中发现了突变细胞的清除率在统计学上显著降低(图4D)。
实施例8
仅包含DLA88的α3结构域的重组蛋白与LILRB3的D1/D2结构域的重组蛋白的结合的化学反应理论分析
1. 实验方法
使用BLItzTM (PRIMETECH)分析DLA88-α3与LILRB3-D1/D2之间的动力学。使用GST传感器、抗GST抗体固定化传感器(PRIMETECH)。将GST-DLA88-α3和GST-LILRB3-D1/D2在37℃下分开培养2小时。以GST-DLA88-α3作为配体分子，在GST传感器上固定5分钟，用GST传感器完全覆盖。用PBS-T (5%Tween-PBS)洗涤30秒，之后边使GST-LILRB3 D1/D2振动2分钟边作为样本加载。在PBS-T缓冲液中，除缔合动力学(association kinetics)以外还对解离动力学(dissociation kinetics)评价2分钟。使用重组蛋白GST-GFP作为对照。
2. 实验结果
上述测定的结果，结合常数Kd确定为6.54±0.28μＭ。
实施例9
人细胞中的细胞竞争实验
1. 实验方法
在之前的实施例中，使用来自狗肾小管上皮细胞的细胞株的MDCK细胞作为上皮细胞的竞争现象的模型实验系统。在本实施例中，考虑到在人中的应用，使用人表皮角化细胞的细胞株的HaCaT细胞进行研究。
与MDCK细胞中的实施例同样地，通过基因导入制备表达GFP-RasV12的RasV12表达HaCaT细胞(LILRB3WT-RasV12)。将正常HaCaT细胞和RasV12表达HaCaT细胞(LILRB3WT-RasV12)以30:1的比例混合，与实施例1同样地，以逃逸的细胞的数量与RasV12表达细胞的总数的比例表示RasV12表达HaCaT细胞作为异常细胞通过细胞竞争被清除到头顶侧的效率，在接种20小时后添加多西环素，之后每隔2小时进行测定。
2. 实验结果
结果见图6。在同时添加多西环素和重组蛋白28453-D1/2进行处理的情况下(LILRB3WT 28453-D1/2)，正常HaCat细胞对RasV12表达HaCat细胞的清除效率，在添加多西环素后单调增加，在接种44小时后达到40%。相对于此，在仅添加多西环素的情况下(LILRB3WT)，正常HaCat细胞对RasV12表达HaCat细胞的清除效率仅略有增加。由该结果显示出：狗的LILRB3的D1/D2结构域的重组蛋白会促进人HaCat细胞中的细胞竞争。另外，在LILRB3-KO细胞中，通过α3处理，清除效率并没有得到挽救。
实施例10
移植到裸鼠中的人HaCat细胞和RasV12表达HaCat细胞的肿瘤形成
1. 实验方法
将人HaCat正常细胞(HaCat)：RasV12表达人HaCat细胞(RasV12)以3:1、10:1或30:1的条件在DLA88-α3的存在下或不存在下与基质胶混合，将所得细胞颗粒移植到裸鼠的腹部，测定2周后所形成的肿瘤块的总体积和重量。
2. 实验结果
结果见图7。正常细胞率的增加抑制了肿瘤增殖，这显示正常细胞对肿瘤形成起到阻碍作用。而且，α3重组蛋白的同时注入在混合条件下实质上特异性地抑制了肿瘤形成。在混合比例30:1下没有观察到α3的抑制效果，但在10:1的比例下最明确地观察到该效果。在10:1的比例下，RasV12细胞主要占据冷冻切片的肿瘤区域，而正常细胞支配性地占据描绘α3的马赛克状的区域。进一步就α3对HLA-tKO的抑制效果进行了试验。与RasV12 WT细胞相比，RasV12 HLA6tKO细胞的肿瘤尺寸略小，但RasV12细胞优先占据肿瘤区域。α3处理在统计学上显示了显著的抑制。由这些结果暗示：围绕正常细胞的LILRB3经α3刺激可促进清除力(eliminating force)。
通过HLA-B/LILRB3相互作用进行的、围绕正常细胞的相邻正常细胞的极移动(polar migration)的诱导
1. 实验方法
实时成像和粒子图像速度测定
在胶原蛋白包被的底皿上以30：1的比例混合正常的HaCaT和HaCaT-RasV12细胞，在37℃下培养16小时直至细胞形成单层。在多西环素的存在下培养细胞。培养8小时后，使用JuLITM Stage (NanoEntek)历时48小时每5分钟获取一个实时成像视频(live imaging movies)。在粒子图像速度测定(PIV)分析的情况下，每2小时的动态图像通过ImageJ插件的PIV进行分析。PIV参数设定如下：NMT的经标准化的中央值检验参数噪音(0.3)和NMT的阈值(0.8)、DMT的力学平均值检验(Dynamics mean test)参数C1 (0.5)、参数C2 (0.3)。
胱天蛋白酶-3活性的评价
将正常HaCaT细胞和HaCaT-RasV12细胞以50:1混合，接种在胶原蛋白凝胶上。在形成单相后，添加四环素和α3。将16小时后的细胞固定，用鬼笔环肽对识别切割型胱天蛋白酶-3的抗体和肌动蛋白进行染色。在共聚焦显微镜下观察样品。显示此时的XZ图像。(-)：未处理、( )：α3处理。
2. 实验结果
结果见图8。由于RasV12细胞在16小时～36小时之间基本被去除，所以将16小时～36小时的图像供于PIV分析。有趣的是，一部分正常细胞在32小时的顶端挤压之前，在28小时向RasV12细胞移动，4小时后RasV12细胞被从上皮单层挤出。RasV12细胞附近的正常细胞的该极移动通过α3处理而增加，但极性正常细胞的数量因LILRB3敲除而基本消失(左图)。由这些结果可知：MHC-I与LILRB3的相互作用诱导相邻正常细胞的极移动，暗示清除RasV12细胞。另外，在通过添加α3结构域而被清除的细胞中，被证实诱导了细胞凋亡(右图)。
利用可检测胱天蛋白酶-3的活化依赖性切割的抗体检测α3处理时的被正常细胞包围的突变细胞的细胞凋亡。通过α3处理，在共培养时被清除的细胞增加，同时在被清除的细胞中被切割的胱天蛋白酶-3阳性细胞增加(图8右图)。
实施例11
已知人乳头状瘤病毒(HPV)在感染细胞后通过降解作为抑癌基因的Scribble而引起癌变。另一方面，已知Scribble的表达抑制细胞边被周边正常细胞诱导细胞凋亡边被清除(图9左图)。
1. 实验方法
α3 (ECA-1-ex3) ECAR介导的Scribble击倒细胞的清除
经由α3 (ECA-1-ex3) ECAR促进Scribble击倒细胞的清除。将四环素诱导性Scribble击倒MDCK细胞(GFP阳性细胞)与正常细胞或28453 (ECAR)以1:10 (MDCK:SCRBKD = 10:1)的比例混合接种。在形成单相后，添加四环素和α3，算出其24小时后的显微镜视野中的GFP阳性细胞(Scribble击倒细胞)与细胞数的比例。ns.：不显著、**P< 0.01。
2. 实验结果
结果见图9。SCRBKD细胞的残留率为35%左右，但通过α3处理达到了20%左右的残留率。这是由于：通过α3的效果，促进了SCRBKD细胞的清除。另外，在ECAR的敲除细胞中，无论是否存在α3，残留率均增加。这些结果暗示：α3经由ECAR促进SCRBKD细胞的清除。
实施例12
1. 实验方法
HPV全基因组稳定细胞MCF10A细胞的清除因α3处理而促进。稳定地保持HPV的全基因组(HPV18基因组)的MCF10A (HPV18)细胞通过CMFDA (绿荧光染色)在混合培养后可识别，之后与正常MCF10A以10:1的比例(正常MCF10A: HPV18 = 10:1)混合后进行接种。算出其24小时后的显微镜视野中的GFP阳性细胞(HPV18细胞)与细胞数的比例。Cont：HPV18在上皮细胞层中的残留率、a3：α3处理时的HPV18细胞的残留率。ns.：不显著、**P< 0.01。
2. 实验结果
结果见图10。稳定地保持HPV的全基因组的细胞(HPV18)的残留率因α3处理而下降。这意味着：具有HPV的全基因组的细胞也因α3而促进清除。
实施例13
作为细胞竞争调节因子的新型细胞膜蛋白的鉴定
1. 实验方法
LILRB3的诱导水平和细胞的去除效率的验证
LILRB3在共培养下被特异性地诱导。将正常细胞和RasV12细胞以1:1的比例在0.5kPa硬度的有机硅板上进行共培养，形成单相后，用四环素处理8小时。回收细胞，通过定量PCR测定LILRB3的诱导水平，用图的形式表示。通过Student’s t-检验，*P<0.05、**P<0.01、****P<0.001 (图11左上图)。
LILR3在共培养条件下以蛋白水平在正常细胞侧被诱导。在胶原蛋白凝胶上接种单独的正常细胞、单独的RasV12细胞、以及正常-突变细胞的混合物，之后在形成单相的时间点加入四环素。之后，用24小时固定细胞，且未经膜渗透处理而将细胞染色。抗LILRB3抗体染色、HLA-B。代表性的XY成像(图11左图)、LILRB3的蛋白诱导水平的定量(图11左下图)。比例尺：10μm。通过Student’s t-检验，*P<0.05、**P<0.01、****P<0.001。
MDCK中的LILRB3的缺陷会抑制突变细胞的清除。将MDCK的RasV12细胞分别与MDCK-WT、-AltR-KO或-AltR-KO-OE细胞混合，在胶原蛋白上形成单相后加入四环素。之后，算出在24小时的细胞清除效率。细胞用鬼笔环肽、Hoechst染色。显示代表性的XZ图像(图12左上图)和清除效率定量化的结果(图12左下图)。比例尺：10μm。通过Student’s t-检验，*P<0.05、**P<0.01、****P<0.001。
HaCaT正常细胞中的LILRB3的敲除会抑制突变细胞的清除。将RasV12 HaCaT细胞与正常的HaCaT-WT、-LILRB3-KO (LILRB3KO)或-LILRB5-KO (LILRB5KO)细胞混合，在胶原蛋白上形成单相后添加四环素。之后，用16小时固定细胞，用鬼笔环肽和Hoechst染色。显示代表性的XZ图像(图12右上图)。另外，清除效率的定量数据以图的形式显示(图12右下图)。比例尺：10μm。通过Student’s t-检验，*P<0.05、**P<0.01、****P<0.001。
2. 实验结果
结果见图11和图12。确认到：混合条件下的LILRB3 mRNA的非细胞自主性诱导、和在围绕RasV12细胞的正常细胞中最相同的LILRB3蛋白水平。正常细胞中的LILRB3-KO抑制了顶端挤压。
本发明以在日本申请的特愿2019-063594 (申请日：2019年3月28日)和特愿2019-069777 (申请日：2019年4月1日)为基础，其内容全部包含在本说明书中。
产业实用性
本发明可用作用于针对癌症或病毒感染的预防或治疗的药物。另外，本发明还可用作用于改善器官移植、组织移植或细胞移植的植入失败、或者抑制神经变性疾病的症状进展的药物。
本文用于企业家、创业者技术爱好者查询，结果仅供参考。
