莫奈太尔砜的半抗原、人工抗原及其制备方法与应用与流程

1.本发明涉及一种莫奈太尔砜的半抗原、人工抗原及其制备方法与应用，属于食品安全检测领域。


背景技术：

2.莫奈太尔(monepantel)是一种新合成的氨基乙腈衍生物类抗虫药，对治疗和控制绵羊胃肠道中成虫期的线虫，包括捻转血矛线虫、环束背带线虫、蛇形毛圆线虫、艾氏毛圆线虫和短古柏线虫等具有高活性，并且对市售的广谱类抗寄生虫药的耐药菌株有效。莫奈太尔具有快速、高效和渗透性神经肌肉效应，通过引起体壁肌肉过度收缩导致咽前部麻痹、痉挛性收缩并最终死亡，可以有效杀灭耐受其他类别药物的线虫。欧盟394/2013规定，莫奈太尔的标志残留物为莫奈太尔砜，其在羊奶中的最大残留限量为0.17mg/kg。
3.目前报到的用于莫奈太尔砜的测定方法主要为液相色谱-串联质谱法(hplc-ms/ms)法，其他方法较为缺乏。仪器分析方法虽然灵敏度高、特异性强，但是需要复杂的前处理过程和专业的操作人员，并且仪器昂贵，不适用于大量样品的快速筛查。免疫分析方法在抗原抗体特异性识别的基础上具有特异性强、灵敏度高、成本低、操作简便以及适用于大批量样品的同时检测等优点，弥补了仪器检测的不足。因此，建立免疫学检测方法十分必要。
4.半抗原的分子设计与抗原合成是获得高特异性和亲和力抗体的关键性步骤。根据半抗原的活性基团，选择相应的生物偶联方法，将半抗原和载体蛋白偶联，获得人工抗原，免疫动物获得抗体，为建立莫奈太尔砜的免疫分析方法奠定基础。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种莫奈太尔砜半抗原及人工抗原，所制备的产品用于莫奈太尔砜免疫分析方法的研究，为今后的研究提供必需的人工抗原。
6.本发明所提供的莫奈太尔砜半抗原，其结构式如式ⅰ所示：
[0007][0008]
所述莫奈太尔砜半抗原可按照下述制备方法制备：
[0009]
在冰醋酸中，采用氧化氢氧氧化对三氟甲硫基苯甲酸即得。
[0010]
具体地，所述对三氟甲硫基苯甲酸、所述冰醋酸与所述过氧化氢的配比为100mg：10～20ml：20～30ml；
[0011]
所述反应的温度为20～25℃，所述反应的时间为20～24h；
[0012]
所述反应结束后，采用纯水稀释后用二氯甲烷萃取，萃取液旋干后用纯水洗涤，洗涤后经抽滤得到白色固体，即为所述莫奈太尔砜半抗原。
[0013]
本发明还提供了一种莫奈太尔砜人工抗原，由所述莫奈太尔砜半抗原与载体蛋白偶联后得到；
[0014]
所述载体蛋白选自牛血清白蛋白、卵清蛋白和钥孔血蓝蛋白中任一种。
[0015]
所述莫奈太尔砜半抗原与所述载体蛋白的偶联摩尔比为5～30：1，优选8.8：1；
[0016]
所述莫奈太尔砜人工抗原可以作为免疫原也可以作为包被原。
[0017]
可采用活泼酯法将所述载体蛋白偶联于所述半抗原的羧基碳上得到所述莫奈太尔砜人工抗原，具体步骤为：将所述莫奈太尔砜半抗原、n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)，溶于n，n-二甲基甲酰胺(dmf)中，室温搅拌过夜，得到a液；取所述载体蛋白溶于碳酸盐缓冲液中，得到b液；逐滴将所述a液滴入所述b液中，室温搅拌反应过夜，得到偶联物的混合液；混合液在pbs中透析三天，得到所述莫奈太尔砜人工抗原。
[0018]
所述莫奈太尔砜半抗原或所述莫奈太尔砜人工抗原具有下述应用：
[0019]
1)制备抗莫奈太尔砜抗体；
[0020]
2)检测食品中莫奈太尔砜的残留。
[0021]
本发明还提供了一种莫奈太尔砜的单克隆抗体，通过所述莫奈太尔砜人工抗原免疫实验动物(雌性balb/c小鼠)，经过细胞融合、筛选和体外诱生得到。
[0022]
所述莫奈太尔砜的单克隆抗体可用于制备莫奈太尔砜检测试剂或试剂盒。
[0023]
所述莫奈太尔砜的单克隆抗体具有下述应用：
[0024]
1)莫奈太尔砜的免疫检测；
[0025]
2)莫奈太尔砜免疫层析试纸条的制备；
[0026]
3)莫奈太尔砜胶体金检测试纸条的制备。
[0027]
本发明提供了莫奈太尔砜半抗原及人工抗原，为高灵敏度抗莫奈太尔砜抗体的制备奠定基础；最终，筛选获得性质最优抗体，效价最高可达4
×
104，灵敏度为2.6μg/l。本发明所提供的莫奈太尔砜半抗原及人工抗原的合成方法简单高效，所需化学试剂价格低廉，获得的抗体灵敏度高，完全可用于免疫分析中，在兽药残留检测中具有重要意义。
附图说明
[0028]
图1为莫奈太尔砜半抗原的质谱鉴定图。
[0029]
图2为bsa的maldi-tof鉴定图。
[0030]
图3为莫奈太尔砜人工抗原的maldi-tof鉴定图。
[0031]
图4为利用单克隆抗体检测莫奈太尔砜的标准曲线图。
具体实施方式
[0032]
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0033]
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0034]
实施例1、莫奈太尔砜半抗原的制备和表征
[0035]
称取对三氟甲硫基苯甲酸100mg溶解于10ml冰醋酸中，边搅拌边逐滴加入37％过氧化氢20ml，在室温25℃下反应24小时。反应液用纯水稀释后用二氯甲烷萃取，萃取液旋干后用纯水洗涤，洗涤后经抽滤得到白色固体86mg，为莫奈太尔砜半抗原，采用质谱鉴定。
[0036]
反应方程式如下：
[0037][0038]
质谱鉴定结果如图1所示，4-((三氟甲基)磺酰基)苯甲酸分子量为254.18，在负离子模式下得到的母离子碎片是m/z＝253.18，质谱图中存在m/z＝253.0的特征母离子碎片，表明成功合成了莫奈太尔砜半抗原。
[0039]
实施例2、莫奈太尔砜人工抗原的制备和表征
[0040]
免疫原与包被原的制备方法中，其区别在于载体蛋白的使用类型，免疫原载体蛋白主要采用klh，包被原载体蛋白主要采用bsa和ova，所用偶联方法为活泼酯法。
[0041]
称取制得的莫奈太尔砜半抗原(mops)20mg、n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)26.2mg，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)43.6mg，溶于1.5ml n,n-二甲基甲酰胺(dmf)中，室温搅拌反应6小时，得到a液；取50mg bsa(50mg ova或20mg klh)用0.05m cb溶解，得b液；再逐滴将a液缓慢滴入b液中，室温搅拌反应过夜，得到偶联物的混合液；混合液在0.01m pbs中透析三天，最终得到莫奈太尔砜人工抗原。
[0042]
采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass specrtsmetry,maldi-tof-ms)法测定bsa与半抗原的结合比。结果如图2和图3所示。
[0043]
结合比＝{m(偶联物)-m(蛋白质)}/m(半抗原)。
[0044]
bsa的分子量为64771.06，式i所示半抗原的分子量为254.18，由质谱最高峰值分析偶联物的分子量为68674.30，经计算得出bsa与半抗原的结合比为8.8：1，即莫奈太尔砜人工抗原中一个bsa分子上平均偶联8.8个半抗原。
[0045]
实施例3、莫奈太尔砜单克隆抗体的制备
[0046]
将实施例2制备的人工抗原mops-klh免疫6只6～8周龄balb/c雌性小鼠。使用0.01m pbs将各免疫原用稀释至1mg/ml，与等量的弗氏佐剂乳化，形成油包水结构。除首免采用弗氏完全佐剂外，其余加强免疫一律采用弗氏不完全佐剂，免疫剂量为100μg/只，注射剂量为0.2ml/只，小鼠颈背部多点接种。4周后进行加强免疫并且每隔3周加免1次，共加免2次，改为颈背部皮下多点注射。之后每隔三周进行一次加强免疫，加强免疫时将弗氏完全佐剂更换为弗氏不完全佐剂，免疫剂量与首次免疫剂量相同，加强免疫次数为2次。两次加强免疫后的7～10天采每只小鼠的眼眶血离心取上清进行测定，选择抗血清效价与抑制均良好的小鼠，取脾细胞与骨髓瘤细胞融合，经过三次单细胞团亚克隆后，进行定株及扩大培养，采取体内诱生的方式获得抗体，并使用protein a免疫亲和柱进行纯化，最后保存于-20℃备用。
[0047]
实施例4、莫奈太尔砜抗血清的测定
[0048]
一、采用间接elisa法检测抗血清效价
[0049]
具体步骤如下：
[0050]
(1)包被：用0.05m的碳酸盐缓冲液将包被原稀释成0.1μg/ml，并加入96孔透明酶标板中(100μl/孔)，4℃过夜孵育16小时，用pbst缓冲液洗板3次。
[0051]
(2)封闭：加入封闭液2％脱脂乳(150μl/孔)，37℃温箱孵育1.5小时，弃封闭液，pbst缓冲液洗涤1遍，拍干。
[0052]
(3)加待测抗体：各孔加入50μl 0.01m pbs，再加入50μl稀释后的抗血清，抗血清从1：5000开始，以2为梯度用0.01m pbs开始稀释，一共稀释4个梯度。37℃温箱反应30分钟，pbst缓冲液洗涤3次，拍干。同时设置未经免疫的小鼠抗血清作为阴性对照。
[0053]
(4)加酶标二抗：加入用酶标二抗稀释液按照体积比1:5000稀释的hrp标记的羊抗鼠igg抗体，100μl/孔，37℃温箱反应30分钟，pbst缓冲液洗涤3次，拍干。
[0054]
(5)显色：将辣根过氧化物酶底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液和质量分数为30％的过氧化氢按照1:1的体积比混合，加入微孔中(100μl/孔)，37℃温箱显色15分钟。
[0055]
(6)终止：加入2m浓硫酸(50μl/孔)。
[0056]
(7)读数：以od
450nm
波长测定个孔od值，以阴性od值不大于0.15，最大od值在1.5-2.0之间对应的抗体稀释度为抗体效价。测得免疫小鼠的效价均在0.5
×
104以上，最高为4
×
104。说明用合成的半抗原偶联载体蛋白去免疫小鼠，可以较好的获得免疫效果。
[0057]
二、最低检测限、半数抑制以及特异性的检测
[0058]
具体操作步骤如下：
[0059]
(1)用上述间接elisa方法确定以mops-ova作为包被原，以mops-klh免疫小鼠进行细胞融合生产抗体，以od
450
值在1.5左右时所对应的抗原和抗体浓度为最适工作浓度。
[0060]
(2)包被：将包被原用包被缓冲液稀释80000倍，100μl/孔，置于37℃恒温培养箱孵育2h。
[0061]
(3)洗涤和封闭：方法操作同上述间接elisa法。
[0062]
(4)配置标准溶液：将莫奈太尔砜标准品用乙腈溶液配制成2mg/ml的母液，然后，在加样前，再用0.01mol/l，ph7.4的pbs溶液倍比稀释成梯度为0、0.1、0.3、0.9、2.7、8.1、24.3、72.9μg/l莫奈太尔砜标准溶液。
[0063]
(5)加样：每孔加入50μl倍比稀释的各浓度标准品，然后再加入50μl/孔最适稀释倍数的抗体，37℃反应30min。充分洗涤后，加入1：5000稀释的hrp-羊抗鼠igg，100μl/孔，37℃反应30min。
[0064]
(6)显色反应：将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100μl的tmb显色液，37℃避光反应15min。
[0065]
7)终止和测定：每孔加入50μl终止液以终止反应，然后用酶标仪测定各孔的od
450
值。
[0066]
8)数据处理：以各标准品浓度为横坐标，以各浓度对应的od
450nm
值为纵坐标，使用origin软件，按照四参数对数拟合绘制标准曲线，如图4所示，通过计算ic
50
值(半数抑制浓度)判定抗体对莫奈太尔砜是否具有识别。
[0067]
结果显示，所获得单克隆抗体对莫奈太尔砜的检测灵敏度为2.6μg/l。
[0068]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。