一种包含CD3ε胞内碱性氨基酸富集区基序的嵌合抗原受体及其用途的制作方法

一种包含cd3
ε
胞内碱性氨基酸富集区基序的嵌合抗原受体及其用途
技术领域
1.本发明涉及嵌合抗原受体领域，具体涉及一种包含cd3ε胞内碱性氨基酸富集区基序的嵌合抗原受体及其用途。


背景技术：

2.嵌合抗原受体简称car(chimeric antigen receptor)，搭载针对特定肿瘤抗原car的t细胞称为car-t细胞。car-t疗法在肿瘤的治疗中尤其是实体瘤免疫治疗的应用广泛，是一种治疗肿瘤的新型精准靶向疗法，近几年通过优化改良在临床肿瘤治疗上取得很好的效果，是一种非常有前景的，能够精准、快速、高效，且有可能治愈癌症的新型肿瘤免疫治疗方法。
3.但car-t疗法仍然存在诸多局限，例如在临床上治疗肿瘤所遇到的细胞因子风暴、神经毒性安全性、持续增殖能力较差的问题。2015年柳叶刀杂志发布一项一期临床试验(临床试验编号：nct01593696，2015.lacet.t cells expressing cd19 chimeric antigen receptors for acute lymphoblastic leukaemia in children and young adults-a phase 1dose-escalation trial)，其显示患有复发性或难治疗型急性淋巴性白血病或非霍金奇淋巴瘤患者(年龄1-30岁)，在接受kte-c19(anti-cd19 28z)car-t治疗后检测血液car-t细胞体内的数量，发现第14天car-t细胞数量到达高峰期，而后第28天、42天则显著递减，第68天全部患者血液中检测不到car-t细胞。还有2018年新英格兰杂志发布的一项一期临床试验(临床试验编号：nct01044069，2018.nej.long-term follow-up of cd19 car therapy in acute lymphoblastic leukemia)结果，也表明53位患有复发性急性淋巴性白血病患者，在接受anti-cd19 28z car-t治疗后检测血液car-t细胞体内的数量中位值出现在第14天。这两项研究均显示了28z car-t细胞的持续增殖存活能力比较差，疗效有待提高。


技术实现要素：

4.设计一款针对car结构本身的改造，可从提高car-t细胞持续存活能力这一角度考虑，从而提高抗肿瘤效果，延长疾病缓解时间，降低复发率，提高患者生存期。鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种包含cd3ε胞内碱性氨基酸富集区基序的嵌合抗原受体及其用途。
5.为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种包含cd3ε胞内碱性氨基酸富集区基序的嵌合抗原受体。包括：
6.依次连接的胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域；
7.所述胞外结构域包括抗原识别区和铰链区；
8.所述胞内结构域与跨膜结构域相连的一端连接有cd3ε胞内碱性氨基酸富集区基序。
9.本发明第二方面提供一种多核苷酸序列，该多核苷酸序列选自：
10.(1)编码权利要求前述的包含cd3ε胞内碱性氨基酸富集区基序的嵌合抗原受体的多核苷酸序列；和
11.(2)(1)所述多核苷酸序列的互补序列；
12.本发明第三方面提供一种核酸构建物，所述核酸构建物含有前述多核苷酸序列；
13.优选的，所述核酸构建物为载体；
14.更优选的，所述核酸构建物为慢病毒载体含有复制起始位点、3’ltr、5’ltr前述的多核苷酸序列。
15.本发明第四方面提供慢病毒载体系统，所述慢病毒载体系统含有前述的核酸构建物及慢病毒载体辅助成分。
16.本发明第五方面提供一种基因修饰的t细胞或含该基因修饰的t细胞的药物组合物，其特征在于，所述细胞含有前述多核苷酸序列，或含有前述核酸构建物，或感染了前述慢病毒载体系统。
17.本发明第六方面提供前述包含cd3ε胞内碱性氨基酸富集区基序的嵌合抗原受体、前述多核苷酸序列、前述核酸构建物或前述慢病毒载体系统在制备以下任一种或多种用途产品中的应用：(1)制备t细胞；(2)提高t细胞存活能力；(3)抑制t细胞凋亡；(4)增强t细胞增殖能力；(5)提高t细胞抗肿瘤能力；(6)抑制t细胞的细胞因子ifn-γ水平。
18.本发明第七方面提供前述包含cd3ε胞内碱性氨基酸富集区基序的嵌合抗原受体、前述多核苷酸序列、前述核酸构建物、前述慢病毒载体系统或前述基因修饰的t细胞在制备肿瘤治疗产品中的应用。
19.如上所述，本发明的包含cd3ε胞内碱性氨基酸富集区基序的嵌合抗原受体及其用途，具有以下有益效果：
20.本发明的包含cd3ε胞内碱性氨基酸富集区基序的嵌合抗原受体，其修饰的t细胞存活能力的提高、凋亡水平的下降、增殖能力的提高可以显著提高t细胞的持续性，从而显著提高t细胞的抗肿瘤能力。该优势在临床应用上可进一步提高肿瘤治疗果，延长疾病缓解时间，降低复发率，提高患者生存期。同时，其修饰的t细胞可下调表达细胞因子ifnγ的水平，降低巨噬细胞单核细胞活化产生炎性细胞因子如il-1β和il-6。
附图说明
21.图1a.anti-cd1928z car和anti-cd19 e
brs
28z car的结构示意图。其中fmc63为靶向cd19抗原的单链抗体，受体的铰链区(hinge region)和跨膜区(transmembrane region)来源于人cd28；cd3ε胞内碱性富集区基序插在cd28跨膜区后面，在cd28胞内区前面。
22.图1b.anti-cd19 28z car和anti-cd19 e
brs
28z car在t细胞表达后上膜水平的流式图。
23.图1c.anti-cd19 28z car-t细胞和anti-cd19 e
brs
28z car-t细胞中cd4

和cd8

细胞比例的流式图。
24.图1d.anti-cd19 28z car-t细胞和anti-cd19 e
brs
28z car-t细胞经raji细胞(cd19抗原)刺激后的il-2细胞因子水平比较。
25.图1e.anti-cd19 28z car-t细胞和anti-cd19 e
brs
28z car-t细胞经raji细胞
(cd19抗原)刺激后的ifn-γ细胞因子水平比较。
26.图1f.anti-cd19 28z car-t细胞和anti-cd19 e
brs
28z car-t细胞经raji细胞(cd19抗原)刺激后的tnf-α细胞因子水平比较。
27.图1g.anti-cd19 28z car-t细胞和anti-cd19 e
brs
28z car-t细胞经raji细胞(cd19抗原)刺激后增殖情况。
28.图1h.anti-cd19 28z car-t细胞和anti-cd19 e
brs
28z car-t细胞经raji细胞(cd19抗原)刺激后凋亡情况。
29.图1i.anti-cd19 28z car-t细胞和anti-cd19 e
brs
28z car-t细胞经raji细胞(cd19抗原)刺激后的存活数量。
30.图1j.anti-cd19 28z car-t细胞和anti-cd19 e
brs
28z car-t细胞经raji细胞(cd19抗原)刺激后的促进细胞增殖存活抗凋亡的信号分子丝氨酸/苏氨酸激酶akt
s473
磷酸化水平。
31.图1k.anti-cd19 28z car-t细胞和anti-cd19 e
brs
28z car-t细胞经raji细胞(cd19抗原)刺激后的标记细胞生长增殖的信号分子核糖体蛋白s6
s235/236
磷酸化水平。
32.图1l.anti-cd19 28z car-t细胞和anti-cd19 e
brs
28z car-t细胞对cd19

肿瘤细胞毒性反应。
具体实施方式
33.本发明所述的包含cd3ε胞内碱性氨基酸富集区基序的嵌合抗原受体，包括：
34.依次连接的胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域；
35.所述胞外结构域包括抗原识别区和铰链区；
36.所述胞内结构域与跨膜结构域相连的一端连接有cd3ε胞内碱性氨基酸富集区基序(basic residue rich sequence)，简称brs基序。
37.进一步的，所述cd3ε胞内碱性氨基酸富集区基序的氨基酸序列如seq id no：1所示；具体的：knrkakak。
38.所述胞内结构域包括依次连接的cd3ε胞内碱性氨基酸富集区基序、共刺激信号传导区和cd3ζ胞内段。
39.在一种实施方式中，所述共刺激信号传导区选自cd27、cd28、cd134、4-1bb、ox40或icos中的一种或多种的胞内段。
40.在进一步优选的实施方式中，所述共刺激信号传导区选自cd28的胞内段。杀伤能力更强。
41.cd28的胞内段氨基酸序列如seq id no：2所示，具体的，rskrsrllhsdymnmtprrpgptrkhyqpyapprdfaayrs。
42.在一种实施方式中，所述cd3ζ胞内段的氨基酸序列如seq id no：3所示。具体为：rvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr。
43.在一种实施方式中，所述抗原识别区选自针对肿瘤表面抗原的单链抗体，所述肿瘤表面抗原选自cd19、间皮素(mesothelin)、cd20、cd22、cd123、cd30、cd33、cd38、cd138、bcma、fibroblast activation protein(fap)、glypican-3、cea、egfrviii、psma、her2、
il13rα2、cd171和gd2中的一种或多种。
44.优选的，所述肿瘤表面抗原选自cd19或间皮素，其靶向特异性好。
45.进一步的，所述跨膜结构域选自cd28、cd4、cd8α、ox40或h2-kb中一种或多种的跨膜区。
46.优选的，所述跨膜结构域选自cd28的跨膜区。具体的，所述cd28的跨膜区的氨基酸序列如seq id no：4所示。具体的，fwvlvvvggvlacysllvtvafiifwv。
47.所述铰链区选自cd28铰链区、cd8α铰链区、cd4铰链区、免疫球抗体igg的铰链区或免疫球抗体igg的铰链区偶联ch2ch3区域的一种或多种。即可以为igg1 hinge或igg1 hinge-ch2ch3。
48.可选的，所述铰链区序列为cd28铰链区(cd28 hinge)。氨基酸结构如seq id no：7所示。具体的，ievmypppyldneksngtiihvkgkhlcpsplfpgpskp。
49.在一种实施方式中，所述单链抗体含有轻链可变区和重链可变区。
50.在一种实施方式中，所述轻链可变区与所述重链可变区通过接头序列相连。
51.在一种实施方式中，所述单链抗体选自fmc63。
52.fmc63可采用市售产品。
53.在一种实施方式中，所述单链抗体含有单克隆抗体fmc63的轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区和重链可变区任选地通过接头相连。
54.所述包含cd3ε胞内碱性氨基酸富集区基序的嵌合抗原受体的抗原识别区选自fmc63、铰链区选自cd28铰链区；所述跨膜结构域选自cd28跨膜区；胞内结构域包括依次连接的cd3ε胞内碱性氨基酸富集区基序、cd28的胞内段和cd3ζ胞内段。
55.在一种实施方式中，包含cd3ε胞内碱性氨基酸富集区基序的嵌合抗原受体(anti-cd19 e
brs
28z car)包括：fmc63 scfv、cd28铰链区、cd28的跨膜区、cd3εbrs基序和cd3ζ胞内区。
56.在一种实施方式中，包含cd3ε胞内碱性氨基酸富集区基序的嵌合抗原受体(anti-cd19 e
brs
28z car)的氨基酸序列如seq id no：5所示，具体的：
57.seq id no：5(anti-cd19 e
brs
28z car氨基酸序列)：(5
’→3’
)从fmc63 scfv开始，连接为依次cd28铰链区、cd28的跨膜区、cd3εbrs基序和cd3ζ胞内区：
58.diqmtqttsslsaslgdrvtiscrasqdiskylnwyqqkpdgtvklliyhtsrlhsgvpsrfsgsgsgtdysltisnleqediatyfcqqgntlpytfgggtkleitgstsgsgkpgsgegstkgevklqesgpglvapsqslsvtctvsgvslpdygvswirqpprkglewlgviwgsettyynsalksrltiikdnsksqvflkmnslqtddtaiyycakhyyyggsyamdywgqgtsvtvssaaaievmypppyldneksngtiihvkgkhlcpsplfpgpskpfwvlvvvggvlacysllvtvafiifwvknrkakakrskrsrllhsdymnmtprrpgptrkhyqpyapprdfaayrsrvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr。
59.anti-cd19 e
brs
28z car氨基酸序列对应的核苷酸序列为seq id no：6(anti-cd19 e
brs
28z car核苷酸序列)，seq id no：6如下：(5
’→3’
)
60.gacatccagatgacacagactacatcctccctgtctgcctctctgggagacagagtcaccatcagttgcagggcaagtcaggacattagtaaatatttaaattggtatcagcagaaaccagatggaactgttaaactcctgatctaccatacatcaagattacactcaggagtcccatcaaggttcagtggcagtgggtctggaacagattattctctca
ccattagcaacctggagcaagaagatattgccacttacttttgccaacagggtaatacgcttccgtacacgttcggaggggggactaagttggaaataacaggctccacctctggatccggcaagcccggatctggcgagggatccaccaagggcgaggtgaaactgcaggagtcaggacctggcctggtggcgccctcacagagcctgtccgtcacatgcactgtctcaggggtctcattacccgactatggtgtaagctggattcgccagcctccacgaaagggtctggagtggctgggagtaatatggggtagtgaaaccacatactataattcagctctcaaatccagactgaccatcatcaaggacaactccaagagccaagttttcttaaaaatgaacagtctgcaaactgatgacacagccatttactactgtgccaaacattattactacggtggtagctatgctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctcagcggccgcaattgaagttatgtatcctcctccttacctagacaatgagaagagcaatggaaccattatccatgtgaaagggaaacacctttgtccaagtcccctatttcccggaccttctaagcccttttgggtgctggtggtggttgggggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtgaagaatagaaaggccaaggccaagaggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctccagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctaa。
61.形成本发明的嵌合抗原受体的上述各个部分，相互之间可直接连接，或者可通过接头序列连接。接头序列可以是本领域周知的适用于抗体的接头序列，例如含g和s的接头序列。通常，接头含有一个或多个前后重复的基序。例如，该基序可以是gggs、ggggs、ssssg、gsgsa和ggsgg。优选地，该基序在接头序列中是相邻的，在重复之间没有插入氨基酸残基。接头序列可以包含1、2、3、4或5个重复基序组成。接头的长度可以是3～25个氨基酸残基，例如3～15、5～15、10～20个氨基酸残基。在某些实施方案中，接头序列是多甘氨酸接头序列。接头序列中甘氨酸的数量无特别限制，通常为2～20个，例如2～15、2～10、2～8个。除甘氨酸和丝氨酸来，接头中还可含有其它已知的氨基酸残基，例如丙氨酸(a)、亮氨酸(l)、苏氨酸(t)、谷氨酸(e)、苯丙氨酸(f)、精氨酸(r)、谷氨酰胺(q)等。
62.应理解，在基因克隆操作中，常常需要设计合适的酶切位点，这势必在所表达的氨基酸序列末端引入了一个或多个不相干的残基，而这并不影响目的序列的活性。为了构建融合蛋白、促进重组蛋白的表达、获得自动分泌到宿主细胞外的重组蛋白、或利于重组蛋白的纯化，常常需要将一些氨基酸添加至重组蛋白的n-末端、c-末端或该蛋白内的其它合适区域内，例如，包括但不限于，适合的接头肽、信号肽、前导肽、末端延伸等。有关car的信号肽有不同来源的，主要有cd8和cd28、gm-csf受体的信号肽，其作用：信号肽假说认为，编码分泌蛋白的mrna在翻译时首先合成的是n末端带有疏水氨基酸残基的信号肽，它被内质网膜上的受体识别并与之相结合。信号肽经由膜中蛋白质形成的孔道到达内质网内腔，随即被位于腔表面的信号肽酶水解，由于它的引导，新生的多肽就能够通过内质网膜进入腔内，最终被分泌到胞外。本发明的融合蛋白(即所述car)的氨基端或羧基端还可含有一个或多个多肽片段，作为蛋白标签。任何合适的标签都可以用于本文。例如，所述的标签可以是flag，ha，ha1，c-myc，poly-his，poly-arg，strep-tagii，au1，ee，t7，4a6，ε，b，ge以及ty1。这些标签可用于对蛋白进行纯化。
63.本发明提供的多核苷酸序列，该多核苷酸序列选自：
64.(1)编码权利前述的嵌合抗原受体的多核苷酸序列；和
65.(2)(1)所述多核苷酸序列的互补序列。
66.本发明的多核苷酸序列可以是dna形式或rna形式。dna形式包括cdna、基因组dna或人工合成的dna。dna可以是单链的或是双链的。dna可以是编码链或非编码链。本发明也包括编码融合蛋白的多核苷酸序列的简并变异体，即编码相同的氨基酸序列但核苷酸序列有所不同的核苷酸序列。
67.本文所述的多核苷酸序列通常可以用pcr扩增法获得。具体而言，可根据本文所公开的核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cdna库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cdna库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次pcr扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
68.本发明提供的核酸构建物，含有前述的多核苷酸序列。
69.所述核酸构建物还包括与前述的多核苷酸序列操作性连接的一个或多个调控序列。本发明所述的car的编码序列可以多种方式被操作以保证所述蛋白的表达。在将核酸构建物插入载体之前可根据表达载体的不同或要求而对核酸构建物进行操作。利用重组dna方法来改变多核苷酸序列的技术是本领域已知的。
70.调控序列可以是合适的启动子序列。启动子序列通常与待表达蛋白的编码序列操作性连接。启动子可以是在所选择的宿主细胞中显示转录活性的任何核苷酸序列，包括突变的、截短的和杂合启动子，并且可以从编码与该宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。
71.调控序列也可以是合适的转录终止子序列，由宿主细胞识别以终止转录的序列。终止子序列与编码该多肽的核苷酸序列的3’末端操作性连接。在选择的宿主细胞中有功能的任何终止子都可用于本发明。
72.调控序列也可以是合适的前导序列，对宿主细胞翻译重要的mrna的非翻译区。前导序列与编码该多肽的核苷酸序列的5
′
末端可操作连接。在选择的宿主细胞中有功能的任何终止子都可用于本发明。
73.优选的，所述核酸构建物为载体。
74.通常通过可操作地连接编码car的多核苷酸序列至启动子，并将构建体并入表达载体，实现编码car的多核苷酸序列的表达。该载体对于复制和整合真核细胞可为合适的。典型的克隆载体包含可用于调节期望核酸序列表达的转录和翻译终止子、起始序列和启动子。
75.编码本发明car的多核苷酸序列可被克隆入许多类型的载体。例如，可被克隆入质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。进一步地，载体是表达载体。表达载体可以以病毒载体形式提供给细胞。病毒载体技术在本领域中是公知的。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体包含在至少一种有机体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制酶位点和一个或多个可选择的标记。
76.更优选的，所述核酸构建物为慢病毒载体含有复制起始位点、3’ltr、5’ltr以及前述多核苷酸序列。
77.合适的启动子的一个例子为早期巨细胞病毒(cmv)启动子序列。该启动子序列是
能够驱动可操作地连接至其上的任何多核苷酸序列高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的另一个例子为延伸生长因子-1α(ef-1α)。然而，也可使用其他组成型启动子序列，包括但不限于类人猿病毒40(sv40)早期启动子、小鼠乳癌病毒(mmtv)、人免疫缺陷病毒(hiv)长末端重复(ltr)启动子、momulv启动子、鸟类白血病病毒启动子、eb病毒即时早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红素启动子和肌酸激酶启动子。进一步地，也可考虑使用诱导型启动子。诱导型启动子的使用提供了分子开关，其能够在期限表达时打开可操作地连接诱导型启动子的多核苷酸序列的表达，而在当表达是不期望的时关闭表达。诱导型启动子的例子包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。
78.为了评估car多肽或其部分的表达，被引入细胞的表达载体也可包含可选择的标记基因或报道基因中的任一个或两个，以便于从通过病毒载体寻求被转染或感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。在其他方面，可选择的标记可被携带在单独一段dna上并用于共转染程序。可选择的标记和报道基因两者的侧翼都可具有适当的调节序列，以便能够在宿主细胞中表达。有用的可选择标记包括例如抗生素抗性基因，诸如neo等等。
79.报道基因用于鉴定潜在转染的细胞并用于评价调节序列的功能性。在dna已经被引入受体细胞后，报道基因的表达在合适的时间下进行测定。合适的报道基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶或绿色荧光蛋白基因的基因。合适的表达系统是公知的并可利用已知技术制备或从商业上获得。
80.将基因引入细胞和将基因表达入细胞的方法在本领域中是已知的。载体可通过在本领域中的任何方法容易地引入宿主细胞，例如，哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，表达载体可通过物理、化学或生物学手段转移入宿主细胞。
81.将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染法、粒子轰击、微注射、电穿孔等等。将感兴趣的多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用dna和rna载体。将多核苷酸引入宿主细胞的化学手段包括胶体分散系统，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠；和基于脂质的系统，包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。
82.将多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用病毒载体，特别是慢病毒载体，这已经成为最广泛使用的将基因插入哺乳动物例如人细胞的方法。其他病毒载体可源自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒i、腺病毒和腺伴随病毒等等。已经开发了许多基于病毒的系统，用于将基因转移入哺乳动物细胞。例如，慢病毒提供了用于基因传递系统的方便的平台。可利用本领域中已知的技术将选择的基因插入载体并包装入慢病毒颗粒。该重组病毒可随后被分离和传递至体内或离体的对象细胞。许多反转录病毒系统在本领域中是已知的。在一些实施方案中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体在本领域中是已知的。在一个实施方案中，使用慢病毒载体。
83.本发明提供的慢病毒载体系统，所述慢病毒载体系统含有前述的核酸构建物及慢病毒载体辅助成分。
84.所述慢病毒辅助成分包括慢病毒包装质粒和细胞系。
85.所述慢病毒载体系统是前述核酸构建物在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装而成。所述慢病毒载体系统构建方法为本领域常用方法。
86.本发明提供的一种离体活化t细胞的方法，所述方法包括使用前述慢病毒感染所
述t细胞的步骤。
87.相对其他药物疗法，基于car-t细胞有自我增殖和维持存活的能力，car-t细胞在体内可维持较长的时间，遇到所靶向的特异抗原的刺激，可快速扩增并杀伤带有靶点的肿瘤细胞，而后可形成特异性记忆细胞，比如效应记忆细胞(effector memory t cell)和中心记忆细胞(central memory t cell)。
88.本发明还包括一类细胞疗法，其中t细胞被基因修饰以表达本文所述的car，和car-t细胞被注入需要其的接受者中。注入的细胞能够杀死接受者的肿瘤细胞。不像抗体疗法，car-t细胞能够体内复制，产生可导致持续肿瘤控制的长期持久性。
89.由car-t细胞引起的抗肿瘤免疫应答可为主动或被动免疫应答。另外，car介导的免疫应答可为过继免疫疗法步骤的一部分，其中car-t细胞诱导对car中的抗原结合部分特异性的免疫应答。
90.可治疗的癌症可以是非实体瘤，如血液肿瘤，例如白血病和淋巴瘤。尤其是，可采用本发明的car、其编码序列、核酸构建物、表达载体、病毒以及car-t细胞治疗的疾病优选为cd19介导的疾病，尤其是cd19介导的血液肿瘤。
91.具体而言，本文中，“cd19介导的疾病”包括但不限于白血病和淋巴瘤，例如b细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、多毛细胞白血病、和急性髓性白血病。
92.本发明提供的基因修饰的t细胞或含该基因修饰的t细胞的药物组合物，所述细胞含有前述多核苷酸序列，或含有前述核酸构建物，或感染了前述慢病毒载体系统。
93.本发明的car-修饰的t细胞可被单独施用或作为药物组合物与稀释剂和/或与其他组分诸如相关的细胞因子或细胞群结合施用。简单地说，本发明的药物组合物可包括如本文所述的car-t细胞，与一种或多种药学或生理学上可接受载体、稀释剂或赋形剂结合。这样的组合物可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如edta或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。
94.本发明的药物组合物可以以适于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。施用的数量和频率将由这样的因素确定，如患者的病症、和患者疾病的类型和严重度。
95.当指出“免疫学上有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤-抑制有效量”或“治疗量”时，待施用的本发明组合物的精确量可由医师确定，其考虑患者(对象)的年龄、重量、肿瘤大小、感染或转移程度和病症的个体差异。可通常指出：包括本文描述的t细胞的药物组合物可以以104至109个细胞/kg体重的剂量，优选105至106个细胞/kg体重的剂量。t细胞组合物也可以以这些剂量多次施用。细胞可通过使用免疫疗法中公知的注入技术施用。对于具体患者的最佳剂量和治疗方案可通过监测患者的疾病迹象并因此调节治疗由医学领域技术人员容易地确定。
96.对象组合物的施用可以以任何方便的方式进行，包括通过喷雾法、注射、吞咽、输液、植入或移植。本文描述的组合物可被皮下、皮内、瘤内、结内、脊髓内、肌肉内、通过静脉内注射或腹膜内施用给患者。在一个实施方案中，本发明的t细胞组合物通过皮内或皮下注射被施用给患者。在另一个实施方案中，本发明的t细胞组合物优选通过静脉注射施用。t细胞的组合物可被直接注入肿瘤、淋巴结或感染位置。
97.在本发明的一些实施方案中，本发明的car-t细胞或其组合物可与本领域已知的其它疗法结合。所述疗法包括但不限于化疗、放疗和免疫抑制剂。例如，可结合各种放疗制剂进行治疗，这些放疗制剂包括：环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨喋呤、麦考酚酯、fk506、氟达拉滨、雷帕霉素和麦考酚酸等。在进一步的实施方案中，本发明的细胞组合物与骨髓移植、利用化疗剂诸如氟达拉滨、外部光束放射疗法(xrt)、环磷酰胺或抗体诸如okt3或campath的t细胞烧蚀疗法结合(例如，之前、同时或之后)而施用给患者。
98.本文中，“抗肿瘤能力”指一种生物学效应，其可由肿瘤体积的减少、肿瘤细胞数的减少、转移数的减少、预期寿命的增加或与癌相关的各种生理症状的改善表示。
[0099]“患者”、“对象”、“个体”等等在本文中可交换使用，指可引起免疫应答的活有机体，如哺乳动物。例子包括但不限于人、狗、猫、小鼠、大鼠和其转基因物种。
[0100]
前述包含cd3ε胞内碱性氨基酸富集区基序的嵌合抗原受体、前述多核苷酸序列、前述核酸构建物、前述慢病毒载体系统在制备以下任一种或多种用途产品中的应用：(1)制备t细胞；(2)提高t细胞存活能力；(3)抑制t细胞凋亡；(4)增强t细胞增殖能力；(5)提高t细胞抗肿瘤能力；(6)抑制t细胞的细胞因子ifn-γ水平。
[0101]
存活能力的提高、凋亡水平的下降、增殖能力的提高可以显著提高t细胞的持续性，从而显著提高t细胞的抗肿瘤能力。
[0102]
前述包含cd3ε胞内碱性氨基酸富集区基序的嵌合抗原受体、前述多核苷酸序列、前述核酸构建物、前述慢病毒载体系统在还可以用于制备以下任一种或多种用途产品中的应用：增强t细胞增殖存活能力、生长增殖能力、持续增殖能力或提高t细胞数量。
[0103]
前述包含cd3ε胞内碱性氨基酸富集区基序的嵌合抗原受体、前述多核苷酸序列、前述核酸构建物、前述慢病毒载体系统或前述基因修饰的t细胞在制备肿瘤治疗产品中的应用。
[0104]
可选的，所述肿瘤选自白血病或实体瘤中的一种或多种。
[0105]
可选的，所述肿瘤选自b细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、多毛细胞白血病、和急性髓性白血病。
[0106]
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
[0107]
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
[0108]
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
[0109]
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组dna技术及相关领域的常规技术。
[0110]
实施例1
[0111]
anti-cd19 28z car序列包括fmc63 scfv、cd28铰链区、cd28跨膜区、和cd3ζ胞内区结构，即rosenberg,s.a.实验室于ncbi共享的序列(genbank:hm852952.1)；通过基因合成获得anti-cd19 28z car，在此基础上，设计car结构序列如图1a，通过t2a自我剪切肽将egfp与car序列连接在同一个开放读码框(orf)编码，故car的表达水平可通过egfp表达量/荧光强度指示。采用基于重叠延伸pcr技术，将cd3ε胞内段brs基序插在cd28跨膜区后面，构建出来新型car称为anti-cd19 e
brs
28z car。
[0112]
合成获得的anti-cd19 e
brs
28z car的核苷酸序列如seq id no：8所示。具体为：atggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagggaagcggagagggcagaggaagtctgctaacatgcggtgacgtcgaggagaatcctggacctatgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatcccatacccctacgacgtgcccgactacgccgacatccagatgacacagactacatcctccctgtctgcctctctgggagacagagtcaccatcagttgcagggcaagtcaggacattagtaaatatttaaattggtatcagcagaaaccagatggaactgttaaactcctgatctaccatacatcaagattacactcaggagtcccatcaaggttcagtggcagtgggtctggaacagattattctctcaccattagcaacctggagcaagaagatattgccacttacttttgccaacagggtaatacgcttccgtacacgttcggaggggggactaagttggaaataacaggctccacctctggatccggcaagcccggatctggcgagggatccaccaagggcgaggtgaaactgcaggagtcaggacctggcctggtggcgccctcacagagcctgtccgtcacatgcactgtctcaggggtctcattacccgactatggtgtaagctggattcgccagcctccacgaaagggtctggagtggctgggagtaatatggggtagtgaaaccacatactataattcagctctcaaatccagactgaccatcatcaaggacaactccaagagccaagttttcttaaaaatgaacagtctgcaaactgatgacacagccatttactactgtgccaaacattattactacggtggtagctatgctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctcagcggccgcaattgaagttatgtatcctcctccttacctagacaatgagaagagcaatggaaccattatccatgtgaaagggaaacacctttgtccaagtcccctatttcccggaccttctaagcccttttgggtgctggtggtggttgggggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtgaagaatagaaaggccaaggccaagaggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctccagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcagga
aggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctaa
[0113]
将car亚克隆至慢病毒表达质粒phage载体，将car表达质粒与包装质粒pspax2和pmd2g分别按照10：7.5：3.5的比例混合后用磷酸钙转染的方法转入293ft细胞以生产慢病毒颗粒。用超高速离心方法分别表达anti-cd19 28z car或anti-cd19 e
brs
28z car慢病毒经浓缩为小体积高滴度病毒(～108iu/ml)，然后分别转染经αcd3/αcd28 ab-beads活化一天的原代t细胞(moi＝10)。原代t细胞用t细胞完全培养基(xivo-15 1％p.s. 10ng/ml human il-7 10ng/ml human il-15 5％human ab serum,10mm neutralized nac)培养期间，病毒转染一天后则除去，抗体刺激四天后即除去，抗体刺激后的第5天分选出car表达量(用egfp荧光强度指示)相同的car-t细胞，获得的t-细胞分别为anti-cd19 28z car-t细胞和anti-cd19 e
brs
28z car-t细胞。经过一段时间扩增后，对car-t进行一系列的指标鉴定，如car上膜水平，cd4和cd8亚群比例，体外细胞因子分泌，体外杀伤能力、体外增殖能力，体外凋亡水平，体外持续生存能力，以及体内抗肿瘤效果等。
[0114]
指标检测方法与结果描述：
[0115]
获得的anti-cd19 28z car和anti-cd19 e
brs
28z car的结构如图1a所示。其中fmc63为靶向cd19抗原的单链抗体，受体的铰链区(hinge region)和跨膜区(transmembrane region)来源于人cd28，人cd3ε胞内碱性富集区基序插在cd28跨膜区后面，在cd28胞内区前面。
[0116]
用anti-mouse fmc63 scfv偶联alexa fluor647抗体流式检测anti-cd19 28z car-t和anti-cd19 e
brs
28z car-t细胞膜表面的car水平，流式图结果如图1b所示，显示两者car阳性率和表达量(mfi)没差异。
[0117]
用anti-human cd4-apc和anti-human cd8-pe-cy7抗体流式检测anti-cd19 28z car-t和anti-cd19 e
brs
28z car-t细胞，流式图结果如图1c所示，显示两者的cd4

car-t细胞和cd8

car-t细胞的比例相近。
[0118]
10万anti-cd19 28z car-t细胞和anti-cd19 e
brs
28z car-t细胞分别与cd19

淋巴瘤细胞系raji按照1：1比例接种于圆底96孔板中，混匀，室温离心(400g,1min)促细胞间接触，用完全培养基于37℃培养箱中培养一天即收样。收样前6小时加1x bfa抑制细胞因子外排，收样后将样品pbs洗一次，然后4％pfa室温固定5min，0.1％tritonx-100室温打孔5min,接着按照常规操作胞内染色步骤，用相应直标抗体检测il-2、ifn-γ、tnf-α。结果如图1d、图1e和图1f所示，表明anti-cd19 e
brs
28z car-t细胞经cd19

细胞特异刺激后产生的il-2和tnf-α细胞因子水平与anti-cd19 28z car-t细胞相近，而ifn-γ细胞因子水平比anti-cd19 28z car-t细胞降低。
[0119]
10万anti-cd19 28z car-t细胞和anti-cd19 e
brs
28z car-t细胞分别与cd19 淋巴瘤细胞系raji按照1：1比例接种于圆底96孔板中，混匀，室温离心(400g,1min)促细胞间接触，用完全培养基于37℃培养箱中培养一段时间。于不同时间点收样后将样品pbs洗一次，按照foxp3/transcription factor staining buffer set试剂盒说明书操作，用anti-human ki67-apc抗体染色后流式检测ki67的表达量。结果如图1g表示，anti-cd19 e
brs
28z car-t细胞经cd19

raji细胞刺激后持续一段时间一直比anti-cd19 28z car-t细胞增殖
快。
[0120]
10万anti-cd19 28z car-t细胞和anti-cd19 e
brs
28z car-t细胞分别与cd19 淋巴瘤细胞系raji按照1：1比例接种于圆底96孔板中，混匀，室温离心(400g,1min)促细胞间接触，用完全培养基于37℃培养箱中培养一段时间。于不同时间点收样后将样品pbs洗一次，按照annexin v apoptosis detection kit apc试剂盒说明书染色好后流式检测car-t细胞annexin v的表达水平。结果如图1h表示，anti-cd19 e
brs
28z car-t细胞经cd19

raji细胞刺激后，后期的凋亡水平比anti-cd19 28z car-t细胞明显低。
[0121]
10万anti-cd19 28z car-t细胞和anti-cd19 e
brs
28z car-t细胞分别与cd19 淋巴瘤细胞系raji按照1：1比例接种于圆底96孔板中，混匀，室温离心(400g,1min)促细胞间接触，用完全培养基于37℃培养箱中培养一段时间。于不同时间点收样后将样品pbs洗一次，用anti-human cd4-apc和anti-human cd8-pe-cy7抗体染色检测car

t细胞存活数量。结果如图1i表示，anti-cd19 e
brs
28z car-t细胞经cd19

raji细胞刺激后的存活数量比anti-cd19 28z car-t细胞显著增多。
[0122]
10万anti-cd19 28z car-t细胞和anti-cd19 e
brs
28z car-t细胞分别与cd19 淋巴瘤细胞系raji按照1：1比例接种于1.5ml ep管，混匀，4℃离心(500g,2min)促细胞间接触，用完全培养基于37℃水浴刺激一系列时间点。于不同时间点加入等体积8％pfa室温固定5min，然后0.1％tritonx-100室温打孔5min,接着按照常规操作胞内染色步骤，先分别一抗染兔源pakt
s473
(图1j)和一抗兔源ps6
s235/236
(图1k)，洗一次，再二抗染羊抗兔igg多抗偶联alexa647,洗一次后流式检测。结果如(图1j和图1k)所示，anti-cd19 e
brs
28z car-t细胞经抗原特意刺激后的pakt
s473
和ps6
s235/236
整体水平明显高于anti-cd19 28z car-t细胞，其中信号分子akt
s473
磷酸化水平表示促进细胞增殖存活能力，信号分子核糖体蛋白s6
s235/236
磷酸化水平标记细胞生长增殖水平，这两个指标从信号通路层面说明anti-cd19e
brs
28z car-t细胞的增殖存活能力比较好。
[0123]
anti-cd19 28z car-t细胞和e
brs
28z car-t细胞对cd19

肿瘤细胞毒性反应。将cd19-k562细胞重悬于1640无血清培养基，然后预染1x celltraker deep red dye(37
°
水浴，30min)，接着1640无血清培养基洗一次，用t细胞完全培养基重悬后与cd19

k562_cd19(ires mcherry)细胞按照1：1混合为靶细胞。anti-cd19 28z car-t细胞和anti-cd19 e
brs
28z car-t细胞分别再与该混合型靶细胞按照3：1，1：1，1：3比例混合铺板于圆底96孔板，混匀，室温离心(400g,1min)促细胞间接触，用完全培养基于37℃培养箱中培养一天即收样，置冰，流式检测cd19-k562细胞(apc

,mcherry-)百分比与cd19

k562_cd19细胞(apc-,mcherry

)百分比变化，实验组的“cd19-k562细胞(apc

,mcherry-)百分比/cd19

k562_cd19细胞(apc-,mcherry

)百分比”记为n。n值以未加anti-cd19 28z car-t细胞或anti-cd19 e
brs
28z car-t细胞的混合型靶细胞样品孔的“n0＝cd19-k562细胞(apc

,mcherry-)百分比/cd19

k562_cd19细胞(apc-,mcherry

)百分比”标准化后，计得存活比率n/n0，则杀伤率公式为“lysis(％)＝1-n/n
0”。结果如图1l所示，显示，anti-cd19 e
brs
28z car-t细胞对cd19

肿瘤细胞毒性与anti-cd19 28z car-t细胞相当。
[0124]
实验数据处理方法：
[0125]
使用软件graphpad prism 8.0.2进行数据统计分析，统计p《0.05时表示差异具有显著性，具体表示为：*p《0.05,**p《0.01,***p《0.001,****p《0.0001，每组数据以mean
±
sd
展示。
[0126]
图1d-图1f:单因子变异数分析加sidak’s多重比较检验；
[0127]
图1g,图1h,图1j-图1l:二因子变异数分析加sidak’s多重比较检验；
[0128]
图1i:二因子变异数分析。
[0129]
实验结果：
[0130]
(1)、anti-cd19 e
brs
28z car-t细胞与anti-cd19 28z car-t细胞的上膜水平以及cd4和cd8比例相当；
[0131]
(2)、anti-cd19 28z car-t细胞和anti-cd19 e
brs
28z car-t细胞经过raji细胞体外特异性刺激后，anti-cd19 e
brs
28z car-t细胞产生的il-2和tnf-α细胞因子水平与anti-cd19 28z car-t细胞相近，而ifn-γ细胞因子水平比anti-cd19 28z car-t细胞降低。
[0132]
(3)、anti-cd19 28z car-t细胞和anti-cd19 e
brs
28z car-t细胞经过raji细胞体外特异性刺激扩增一段时间后，于不同时间点采样检测增殖能力(即ki67表达水平)，anti-cd19 e
brs
28z car-t增殖能力明显高于anti-cd19 28z car-t细胞；
[0133]
(4)、anti-cd19 28z car-t细胞和anti-cd19 e
brs
28z car-t细胞经过raji细胞体外特异性刺激扩增一段时间后，于不同时间点采样检测凋亡水平，anti-cd19 e
brs
28z car-t细胞与anti-cd19 28z car-t细胞相比，前期两者相当，而后期anti-cd19 e
brs
28z car-t细胞凋亡水平明显低于anti-cd19 28z car-t细胞；
[0134]
(5)、anti-cd19 28z car-t细胞和anti-cd19 e
brs
28z car-t细胞经过raji细胞特异性刺激扩增一段时间后，于不同时间点采样检测扩增的car t细胞数目，随着时间的推移，anti-cd19 e
brs
28z car-t细胞数量越明显高于anti-cd19 28z car-t细胞；
[0135]
(6)、anti-cd19 28z car-t细胞和anti-cd19 e
brs
28z car-t细胞经过raji细胞特异性刺激扩增一段时间后，于不同时间点采样检测信号分子akt
s473
磷酸化水平，信号分子akt
s473
磷酸化水平表示促进细胞增殖存活能力，anti-cd19 e
brs
28z car-t细胞整体pakts473水平高于anti-cd19 28z car-t细胞，表示anti-cd19 e
brs
28z car-t细胞增殖存活能力高于anti-cd19 28z car-t细胞。
[0136]
(7)、anti-cd19 28z car-t细胞和anti-cd19 e
brs
28z car-t细胞经过raji细胞特异性刺激扩增一段时间后，于不同时间点采样检测信号分子s6
s235/236
磷酸化水平，信号分子s6
s235/236
磷酸化水平标记细胞生长增殖能力，anti-cd19 e
brs
28z car-t细胞整体ps6
s235/236
水平明显高于anti-cd19 28z car-t细胞，表示anti-cd19 e
brs
28z car-t细胞生长增殖能力明显高于anti-cd19 28z car-t细胞。
[0137]
(8)、anti-cd19 28z car-t细胞和anti-cd19 e
brs
28z car-t细胞与cd19 k562:cd19-k562共孵育的体外杀伤实验中，anti-cd19 e
brs
28z car-t细胞的杀伤能力与anti-cd19 28z car-t细胞相当。
[0138]
anti-cd19 e
brs
28z car-t细胞与anti-cd1928z car-t细胞体内抗皮下肿瘤能力的比较，实验方案如下：
[0139]
无菌操作准备3x10^7/ml raji细胞-pbs重悬液，在每只6周龄b-ndg雌鼠的左侧背部皮下接种100ul raji细胞3百万，时间点记为day0。6天后，raji皮下瘤长至直径6-7mm时，将小鼠随机分组，分三组(e
brs
28z组，28z组，vector组)，然后对每只小鼠尾静脉注射100ul8百万t细胞，之后定期用游标卡尺测量肿瘤的大小，记录肿瘤数据和小鼠生存期，肿瘤面积
＝长x宽。实验结论：anti-cd19 e
brs
28z car-t具备抗肿瘤能力。
[0140]
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。