一种甘薯的组培快繁方法与流程

1.本发明属于组织培养技术领域。更具体地，涉及一种甘薯的组培快繁方法。


背景技术：

2.甘薯(ipomoea batatas(l.)lam)又名番薯、红薯、白薯、地瓜、红苕等，为旋花科甘薯属，草质蔓性藤本植物。甘薯味道甜美，营养丰富，又易于消化，含有丰富的淀粉、膳食纤维、胡萝卜素、va、vb、vc、ve、钾、铁、铜、硒和钙等，营养价值很高，具有预防肺气肿、抗糖尿病、抗癌及抑制胆固醇的功效。
3.甘薯病毒病会严重影响甘薯的产量和品质，目前多用茎尖组织培养脱毒技术来应对，如现有一种甘薯的化学消毒组培方法，但该方法采用的诱导培养基成分除植物激素外，还需要添加次氯酸钠、青霉素、丙酸钙等诸多成分，该方法繁琐复杂，不利于甘薯组培技术的规模化推广。


技术实现要素：

4.本发明针对上述现有甘薯组培技术的不足，提供一种甘薯的组培快繁方法，用于甘薯的产业化生产。
5.本发明上述目的通过以下技术方案实现：
6.本发明提供了一种甘薯的组培快繁方法，包括如下步骤：
7.s1.前处理：将甘薯进行病毒钝化，水培得到茎尖；
8.s2.脱毒：将步骤s1所得茎尖依次进行酒精消毒、2.5～3.5wt％次氯酸钙溶液消毒后备用；
9.s3.培养：将步骤s2脱毒后的茎尖置于ms培养基中，密封培养成苗；
10.其中，所述ms培养基含有浓度为0.45～0.55mg/l的6-苄氨基嘌呤，还含有浓度为0.08～0.12mg/l的吲哚丁酸或3－萘乙酸。
11.本发明对玛莎莉甘薯和西瓜红甘薯进行了针对性研究，结合组织培养技术，具体探究了各个环节的最佳操作方式，包括脱毒手段的优化和培养条件的针对性优化，如在培养基中加入了特定种类的激素——6-苄氨基嘌呤(6-ba)、3－萘乙酸(naa)、吲哚丁酸(iba)，并特定控制激素浓度等参数，得到了专门针对玛莎莉甘薯和西瓜红甘薯的组培快繁方法，该方法能显著促进甘薯茎尖的成活率、成苗率和愈伤组织形成率，以促进茎尖的生长发育，有利于甘薯的产业化生产。
12.优选地，所述6-苄氨基嘌呤的浓度为0.48～0.52mg/l。最优选为0.5mg/l。
13.优选地，所述吲哚丁酸或3－萘乙酸的浓度为0.09～0.11mg/l。最优选为0.1mg/l。
14.优选地，步骤s1所述甘薯为玛莎莉甘薯或西瓜红甘薯。玛莎莉甘薯品质优良，一直深受消费者喜爱。西瓜红甘薯是广东本地选育出来的甘薯品种，又称普薯32，被广泛引种。
15.进一步优选地，步骤s1所述甘薯为表面没有发霉和病虫害的甘薯。优选100～300g的甘薯。这种较优质的甘薯薯块相较于品相差的甘薯薯块更容易长出优质的薯苗，其在进
行消毒处理后不容易腐烂变质；而若选取发霉或发病的种薯，在水培过程中，不仅易发霉导致无法发芽，而且会影响同一培养容器中其它甘薯的正常发芽。
16.优选地，步骤s2所述次氯酸钙溶液的浓度为3wt％。使用次氯酸钙溶液对茎尖进行消毒，是为了降低后期培养过程中的污染率，以提高茎尖的成活率。
17.优选地，步骤s1所述病毒钝化为：将甘薯洗净，在55～60℃下水浴2～4min，再在48～54℃下水浴25～35min后，置于多菌灵700～900倍液中翻滚消毒13～20min，洗净即可。
18.最优选地，所述病毒钝化为：将甘薯洗净，在57℃下水浴3min，再在51℃下水浴30min后，置于50％多菌灵800倍液中翻滚消毒15min，洗净即可。
19.优选地，步骤s1所述病毒钝化后，将甘薯放入人工气候恒温箱中进行后续水培操作。优选将甘薯平整置于塑料盘上，再放入人工气候恒温箱，并加水淹没至甘薯大小的1/3。
20.优选地，步骤s1所述水培为在温度30～34℃、光照时长10～14h/d、光照强度2800～3200lx、湿度90～98％下进行水培。
21.最优选地，所述水培为在温度32℃、光照时长12h/d、光照强度3000lx、湿度95％下进行水培。
22.优选地，步骤s1所述水培至其长出大于10cm的幼苗，切下幼苗，去除幼苗上的叶，得到茎尖。进一步优选地，步骤s1所述茎尖还裁剪至2～3cm。裁剪的茎尖过大不能保证完全脱毒，茎尖越小病毒越少；茎尖过小又不易成活。
23.优选地，步骤s1所述去除幼苗上的叶为：切掉叶片和剥离茎尖外包被的幼叶。优选用刀片切掉叶片，在解剖镜下剥离茎尖外包被的幼叶。具体可为：用已消毒的刀片切掉肉眼可见的叶片，用镊子在10倍解剖镜下切掉茎尖较大的幼叶，再在40倍镜下剥离茎尖外包被的幼叶。
24.优选地，步骤s2所述脱毒的具体步骤为：取步骤s1所得茎尖依次水洗1～2次、洗洁精浸泡2～3min、水洗25～30min、70～75wt％酒精消毒25～35s、水洗1～2次、2.5～3.5wt％次氯酸钙溶液消毒8～12min、水洗5～8次。该脱毒方法对甘薯的伤害较低，脱毒也更加彻底，能显著抑制甘薯本身携带的细菌和真菌，也能显著减少培养过程中病毒的污染。
25.最优选地，所述脱毒的具体步骤为：取步骤s1所得茎尖依次水洗1次、洗洁精浸泡2min、流水冲洗30min，将茎尖用玻璃皿装好，置于无菌超净工作台上，再依次75wt％酒精消毒30s、流水冲洗1次、3wt％次氯酸钙溶液消毒10min、水洗6次。
26.优选地，步骤s3所述培养前在茎尖尖端切下0.1～0.3mm的生长锥，用于后续的培养操作。优选地，所述生长锥还带有1～2个叶原基。
27.优选地，步骤s3所述密封培养为在温度25～30℃、湿度78～82％、光照时间15～17h/d、光照强度1800～2200lx下进行密封培养。进一步优选地，所述密封培养为置于恒温培养箱中进行恒温培养。最优选地，所述密封培养为在恒温培养箱中，在温度28℃、湿度80％、光照时间16h/d、光照强度2000lx下进行密封培养。
28.在本发明优选的实施方案中，所述甘薯的组培快繁方法包括如下步骤：
29.s1.前处理：将表面没有发霉和病虫害的100～300g玛莎莉甘薯或西瓜红甘薯洗净，在55～60℃下水浴2～4min，再在48～54℃下水浴25～35min后，置于多菌灵700～900倍液中翻滚消毒13～20min，洗净再将甘薯平整置于塑料盘上，放入人工气候恒温箱中，并加水淹没至甘薯大小的1/3，在“温度30～34℃，光照时长10～14h/d，光照强度2800～3200lx，
湿度90～98％”的条件下水培至其长出大于10cm的幼苗，切下幼苗，用已消毒的刀片切掉肉眼可见的叶片，用镊子在10倍解剖镜下切掉茎尖较大的幼叶，再在40倍镜下剥离茎尖外包被的幼叶，将幼苗裁剪至2～3cm，得到茎尖；
30.s2.脱毒：取步骤s1所得茎尖依次水洗1～2次、洗洁精浸泡2～3min、水洗25～30min、70～75wt％酒精消毒25～35s、水洗1～2次、2.5～3.5wt％次氯酸钙溶液消毒8～12min、水洗5～8次，备用；
31.s3.培养：将步骤s2脱毒后的茎尖置于ms培养基中，密封后置于恒温培养箱中，在温度25～30℃、湿度78～82％、光照时间15～17h/d、光照强度1800～2200lx下培养3～4个月；
32.其中，步骤s3所述ms培养基含有浓度为0.45～0.55mg/l的6-苄氨基嘌呤，还含有浓度为0.08～0.12mg/l的吲哚丁酸或3－萘乙酸。
33.本发明具有以下有益效果：
34.本发明对玛莎莉甘薯和西瓜红甘薯进行了针对性研究，结合组织培养技术，具体探究了各个环节的最佳操作方式，包括脱毒手段的优化和培养条件的针对性优化，得到了专门针对玛莎莉甘薯和西瓜红甘薯的组培快繁方法，该方法能显著促进甘薯茎尖的成活率(80～100％)、成苗率(30～50％)和愈伤组织形成率(65～90％)，以促进茎尖的生长发育，有利于甘薯的产业化生产。
附图说明
35.图1是实施例1病毒钝化操作时的照片。
36.图2是实施例1茎尖在恒温培养箱培养的照片。
37.图3是实施例1茎尖培养4个月时茎尖出苗的照片。
具体实施方式
38.以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
39.除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
40.本发明所用培养基中，每升培养基溶液(双蒸水)中加入4.406gms，成分配方如表1所示，还另外加入30g蔗糖和6g琼脂。
41.表1培养基配方
42.[0043][0044]
实施例1一种甘薯的组培快繁方法
[0045]
s1.前处理：将20个表面没有发霉和病虫害的300g玛莎莉甘薯洗净，分别在57℃下水浴3min，再在51℃下水浴30min后，置于50％多菌灵800倍液中翻滚消毒15min，洗净完成病毒钝化操作(见图1)；再将甘薯平整置于塑料盘上，放入人工气候恒温箱中，并加水淹没至甘薯大小的1/3，在温度32℃、光照时长12h/d、光照强度3000lx、湿度95％下水培至其长出大于10cm的幼苗，切下幼苗，用已消毒的刀片切掉肉眼可见的叶片，用已消毒的镊子在10倍解剖镜下切掉茎尖较大的幼叶，再在40倍镜下剥离茎尖外包被的幼叶，将幼苗裁剪至3cm，得到茎尖；
[0046]
s2.脱毒：取步骤s1所得茎尖依次水洗1次、洗洁精浸泡2min、流水冲洗30min，将茎尖用玻璃皿装好，置于无菌超净工作台上，再依次75wt％酒精消毒30s、流水冲洗1次、3wt％次氯酸钙溶液消毒10min、水洗6次，放置于干净无菌的培养皿中备用；
[0047]
s3.培养：将步骤s2所述脱毒后的茎尖置于ms培养基(含有浓度为0.5mg/l的6-苄氨基嘌呤、浓度为0.1mg/l的吲哚丁酸)中，密封后置于恒温培养箱(见图2)中，在温度28℃、湿度80％、光照时间16h/d、光照强度2000lx下培养4个月(见图3)。
[0048]
实施例2一种甘薯的组培快繁方法
[0049]
同实施例1的方法，区别在于，步骤s1所述玛莎莉甘薯用西瓜红甘薯替代。
[0050]
实施例3一种甘薯的组培快繁方法
[0051]
同实施例1的方法，区别在于，步骤s3所述吲哚丁酸用3－萘乙酸替代。
[0052]
实施例4一种甘薯的组培快繁方法
[0053]
同实施例1的方法，区别在于，步骤s3所述6-苄氨基嘌呤的浓度为0.52mg/l，所述吲哚丁酸的浓度为0.09mg/l。
[0054]
实施例5一种甘薯的组培快繁方法
[0055]
同实施例1的方法，区别在于，步骤s3所述6-苄氨基嘌呤的浓度为0.48mg/l，所述吲哚丁酸的浓度为0.11mg/l。
[0056]
实施例6一种甘薯的组培快繁方法
[0057]
s1.前处理：将20个表面没有发霉和病虫害的100g玛莎莉甘薯洗净，分别在55℃下水浴4min，再在54℃下水浴25min后，置于多菌灵900倍液中翻滚消毒13min，洗净完成病毒钝化操作；再将甘薯平整置于塑料盘上，放入人工气候恒温箱中，并加水淹没至甘薯大小的1/3，在温度34℃、光照时长10h/d、光照强度3200lx、湿度98％下水培至其长出大于10cm的幼苗，切下幼苗，用已消毒的刀片切掉肉眼可见的叶片，用已消毒的镊子在10倍解剖镜下切掉茎尖较大的幼叶，再在40倍镜下剥离茎尖外包被的幼叶，将幼苗裁剪至3cm，得到茎尖；
[0058]
s2.脱毒：取步骤s1所得茎尖依次水洗2次、洗洁精浸泡2min、水洗30min，将茎尖用玻璃皿装好，置于无菌超净工作台上，再依次75wt％酒精消毒25s、水洗2次、3.5wt％次氯酸钙溶液消毒8min、水洗8次，放置于干净无菌的培养皿中备用；
[0059]
s3.培养：将步骤s2所述脱毒后的茎尖置于ms培养基(含有浓度为0.55mg/l的6-苄氨基嘌呤、浓度为0.08mg/l的吲哚丁酸)中，密封后置于恒温培养箱中，在温度30℃、湿度78％、光照时间15h/d、光照强度2200lx下培养3个月。
[0060]
实施例7一种甘薯的组培快繁方法
[0061]
s1.前处理：将20个表面没有发霉和病虫害的300g西瓜红甘薯洗净，分别在60℃下水浴2min，再在48℃下水浴35min后，置于多菌灵700倍液中翻滚消毒20min，洗净完成病毒钝化操作；再将甘薯平整置于塑料盘上，放入人工气候恒温箱中，并加水淹没至甘薯大小的1/3，在温度30℃、光照时长14h/d、光照强度2800lx、湿度90％下水培至其长出大于10cm的幼苗，切下幼苗，用已消毒的刀片切掉肉眼可见的叶片，用已消毒的镊子在10倍解剖镜下切掉茎尖较大的幼叶，再在40倍镜下剥离茎尖外包被的幼叶，将幼苗裁剪至2cm，得到茎尖；
[0062]
s2.脱毒：取步骤s1所得茎尖依次水洗1次、洗洁精浸泡3min、水洗25min，将茎尖用玻璃皿装好，置于无菌超净工作台上，再依次70wt％酒精消毒35s、水洗1次、2.5wt％次氯酸钙溶液消毒12min、水洗5次，放置于干净无菌的培养皿中备用；
[0063]
s3.培养：将步骤s2所述脱毒后的茎尖置于ms培养基(含有浓度为0.45mg/l的6-苄氨基嘌呤、浓度为0.12mg/l的3－萘乙酸)中，密封后置于恒温培养箱中，在温度25℃、湿度82％、光照时间17h/d、光照强度2200lx下培养4个月。
[0064]
对比例1
[0065]
同实施例1的方法，区别在于，步骤s2所述次氯酸钙的浓度为1wt％。
[0066]
对比例2
[0067]
同实施例1的方法，区别在于，步骤s2所述次氯酸钙的浓度为4wt％。
[0068]
对比例3
[0069]
同实施例1的方法，区别在于，步骤s3所述6-苄氨基嘌呤的浓度为0.3mg/l。
[0070]
对比例4
[0071]
同实施例1的方法，区别在于，步骤s3所述6-苄氨基嘌呤的浓度为0.7mg/l。
[0072]
对比例5
[0073]
同实施例1的方法，区别在于，步骤s3所述吲哚丁酸的浓度为0.05mg/l。
[0074]
对比例6
[0075]
同实施例1的方法，区别在于，步骤s3所述吲哚丁酸的浓度为0.2mg/l。
[0076]
对比例7
[0077]
同实施例3的方法，区别在于，步骤s3所述3－萘乙酸的浓度为0.05mg/l。
[0078]
对比例8
[0079]
同实施例3的方法，区别在于，步骤s3所述3－萘乙酸的浓度为0.2mg/l。
[0080]
对比例9
[0081]
同实施例1的方法，区别在于，步骤s3所述吲哚丁酸用吲哚乙酸替代。
[0082]
对比例10
[0083]
采用现有组培技术对玛莎莉甘薯进行繁殖培养成苗，具体方法为：
[0084]
(1)培养容器消毒：将培养瓶、瓶盖及接种用的不锈钢盘在100mg/l次氯酸钠 10mg/l乳酸链球菌素 100mg/l丙酸钙的水溶液中浸泡10h，保存备用；
[0085]
(2)培养基配制：茎尖诱导培养基为ms 0.5mg/l 6-ba 0.2mg/l iaa 50mg/l次氯酸钠 1.5mg/l青霉素 20mg/l丙酸钙 20g/l蔗糖 3.5g/l琼脂粉，ph 5.8；配制培养基时，先称取培养基配方中蔗糖和琼脂粉，加培养基总体积1/2的自来水，加热至琼脂粉完全溶解，再配齐其他原料后，定容，用1mol/l hcl调ph值至5.8，分装到消毒过的培养容器中，封口，冷却凝固后备用；
[0086]
(3)茎尖诱导培养：选取20个健康无病斑的玛莎莉甘薯块，洗净后用30mg/l ga3漫种30min，用消毒湿砂覆埋，于25℃黑暗下催芽，当芽露出砂面后用38～40℃热处理7d，剪取生长旺盛的茎尖3～5cm。在室内切去叶片，用自来水冲洗20～30min，在75wt％的酒精中浸泡30s，用0.1wt％的升汞溶液消毒8min，再用无菌水冲洗3次，然后在解剖镜下剥取带1～2个叶原基、长0.2～0.3mm的茎尖，分别接种于茎尖诱导培养基上培养4个月，获得无菌苗(培养室温度为26℃，光照12h，光照强度为2000～3000lx)。
[0087]
对比例11
[0088]
同对比例10的方法，区别在于，步骤(2)培养基配制时，茎尖诱导培养基为ms 0.5mg/l 6-ba 0.2mg/l iaa，ph5.8。
[0089]
实验例
[0090]
在培养第30天时，分别统计实施例1～7、对比例1～11和空白组(培养过程中用等量双蒸水替代激素)的成活茎尖数和形成愈伤组织茎尖数；第70天时分别统计实施例1～7、对比例1～11和空白组的成苗茎尖数。再根据以下公式分别计算成活率、成苗率、愈伤组织形成率：成活率＝成活茎尖数/培养茎尖数，成苗率＝成苗茎尖数/培养茎尖数，愈伤组织形成率＝形成愈伤组织茎尖数/接种茎尖数。计算结果如表2所示：
[0091]
表2
[0092][0093]
对比实施例1～7、对比例1～11和空白组可知：对比例1～6(50～75％)、对比例10～11(55～60％)、空白组(20％)的成活率均显著低于实施例1～7(80～100％)；对比例1～8(40～60％)、对比例10～11(45～50％)、空白组(0％)的愈伤组织形成率均显著低于实施例1～7(65～90％)；而虽然对比例7～9的成活率达到了80～95％的水平，对比例9的愈伤组织形成率达到了70％的水平，但对比例7～9的成苗率(10～20％)均显著低于实施例1～7(30～50％)。总体而言，实施例1～7的成活率(80～100％)、成苗率(30～50％)和愈伤组织形成率(65～90％)显著优于对比例1～11。
[0094]
综上，本发明对玛莎莉甘薯和西瓜红甘薯进行了针对性研究，结合组织培养技术，具体探究了各个环节的最佳操作方式，包括脱毒手段的优化和培养条件的针对性优化，得到了专门针对玛莎莉甘薯和西瓜红甘薯的组培快繁方法，该方法能显著促进甘薯茎尖的成活率(80～100％)、成苗率(30～50％)和愈伤组织形成率(65～90％)，以促进茎尖的生长发育，有利于甘薯的产业化生产。
[0095]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。