一种珠芽魔芋组培微球茎催芽育苗方法与流程

1.本发明属于植物无性繁殖技术领域，尤其涉及一种珠芽魔芋组培微球茎催芽育苗方法。


背景技术：

2.珠芽魔芋为天南星科魔芋属多年生草本植物，叶面上长有气生小球茎的一类魔芋的统称，是迄今自然界中唯一含有大量葡甘聚糖的植物，被广泛应用于食品、医疗和工业等领域。因其高产，抗病性强，适宜高温高湿环境种植，深受种植户喜爱；近几年种植面积快速扩大，种质缺乏，成为发展的主要制约因素。目前种植产业中采用的繁殖材料主要是球茎、珠芽与少部分的实生种子，但通常采用常规种植方式，一个球茎(珠芽、实生种子)播种后依然只收获一个球茎，产量虽较白魔芋、花魔芋高，但多苗生长特性未充分得到利用。
3.中国科学院昆明植物研究所公开了一种珠芽魔芋种苗繁育方法(申请号200410040723.0)，以野外采集珠芽魔芋的珠芽，以及植物的叶片、叶柄、根、块茎芽、鳞叶和块茎切片为外植体，经过芽的诱导与增殖、类似块茎状物的诱导、生根和移植，首次完成了珠芽魔芋的组织培养；吴金平等进行了珠芽魔芋的组培繁殖与快速繁殖，以珠芽魔芋的芽鞘为外植体，经过愈伤组织诱导和不定芽的形成、生根炼苗及移栽，获得了珠芽魔芋生根苗，成活率达到90％；昆明学院(申请号201611000366.4)通过组培技术，改变外植体的诱导发育、生长途径，通过添加相应的生长调节物质，引导生长发育途径由器官发生途径转向胚状体发生途径，直接通过离体培养获得大量成熟的珠芽魔芋种球，用于播种进一步生长膨大，来收获并提高珠芽魔芋产量。显然，现有技术中并未有利用珠芽魔芋组培苗微球茎的无性繁殖特性，进行大规模繁殖育苗的记载。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明的目的在于针对当前珠芽魔芋发展快速，种质缺乏，自然繁殖周期长、收获率低的问题，提供一种利用珠芽魔芋组培微球茎催芽育苗的技术，同时对珠芽魔芋的组织培养技术和炼苗机制进行研究，获取大量的珠芽魔芋种苗，加快产业发展和扩大规模化种植面积。
5.为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
6.一种珠芽魔芋组培微球茎催芽育苗方法，包括以下步骤：
7.取珠芽魔芋外植体经过愈伤组织诱导、不定芽诱导、不定芽增殖及生根培养，获得无菌组培苗；无菌组培苗经移栽炼苗，培育收获微球茎；对微球茎进行催芽，待微球茎长出芽头后，取下芽头移栽培养。
8.优选的是，所述愈伤组织诱导、不定芽诱导培养基组成为：ms 6-ba 1-2mg/l naa 0.1-0.5mg/l 琼脂6.5-8g/l 蔗糖25-32g/l。
9.优选的是，所述不定芽增殖培养基组成为：ms 6-ba 1-2mg/l iaa 0.3-0.6mg/l 琼脂6.5-8g/l 蔗糖25-32g/l。
10.优选的是，所述生根培养基组成为：1/2ms naa 0.1-0.5mg/l 琼脂6.5-8g/l 蔗糖13-17g/l。
11.优选的是，所述炼苗基质由体积份数的泥炭土2-4份，红土0-2份，椰糠1-2份组成，基质含水量为65％-82％。
12.优选的是，所述炼苗过程包括：遮阴度60％-80％，温度25-32℃，空气湿度65％-92％。
13.优选的是，所述微球茎的重量为1-3g。
14.优选的是，所述催芽包括：在收获的微球茎上盖一层纸，喷施清水或40-60mg/l ga3或40-60mg/l iaa，至纸面潮湿但无水珠滴下。
15.优选的是，所述取芽包括：待所述微球茎长出芽头且长度1cm以上，在芽根基与微球茎表面相接处取芽。
16.优选的是，所述微球茎重复进行催芽、取芽、移栽培养直至球茎皱缩加重，质地松软，移栽播种。
17.相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：
18.(1)珠芽魔芋组培微球茎一年内各时段均可培育，作为来年种植的繁殖材料，其表面具有多个萌芽点，芽上具有生长点和细胞全能性，取下扦插亦可形成一完整植株，正常生长。
19.(2)本发明组培苗培育方法的愈伤组织诱导率、不定芽诱导率、增殖率和生根率都较高，简单易操作。
20.(3)本发明中珠芽魔芋炼苗方法能有效提高珠芽魔芋组培苗成活率至92％及以上，有助于促进珠芽魔芋产业发展。
21.(4)本发明中组培微球茎的生长周期短，在组培苗供应充足的情况下，1-2个月便可收获单重1-3g左右的珠芽魔芋微球茎，一年可收获3-4轮，繁育2-3次，体积小，储存、运输方便。
22.(5)本发明中催芽育苗方法能有效提高组培微球茎出芽率，扩大珠芽魔芋种苗，繁殖系数翻倍，可缩小用种量和用种成本，提高经济效益，方法简单易操作。
具体实施方式
23.本发明提供了一种珠芽魔芋组培微球茎催芽育苗方法，包括以下步骤：取珠芽魔芋外植体经过愈伤组织诱导、不定芽诱导、不定芽增殖及生根培养，获得无菌组培苗；无菌组培苗经移栽炼苗，培育收获微球茎；对微球茎进行催芽，待微球茎长出芽头后，取下芽头移栽培养。
24.本发明优选珠芽魔芋外植体为地下球茎或叶面珠芽，进一步优选外植体材料健康、饱满，无机械损伤、无病害、霉变。采集外植体后，用清水清洗干净外植体表面杂质，削去表皮，备用。
25.本发明优选对外植体材料进行消毒处理，进一步优选消毒处理包括：将削皮后的外植体用流水冲洗30min，取出用无菌水冲洗2次后转入无菌操作台上，用75％的酒精浸泡20min，再分别用0.1％的升汞溶液浸泡20min和无菌水冲洗3次。
26.本发明在外植体消毒后，将其切移至无菌操作台上切成小块。优选小块体积为
ga3或40-60mg/l iaa，至纸面潮湿但无水珠滴下；进一步优选喷施50mg/l的ga3或iaa。
40.待微球茎长出芽头且长度1cm以上，在芽根基与微球茎表面相接处取芽。作为一种可实施方式，取芽工具需要利用75％-100％酒精消毒。
41.本发明优选取下的芽头用体积份数的多菌灵1-2份，噻菌酮1-2份的800-1000混合溶液消毒后，在通风干燥处晾干后移栽种植；进一步优选利用体积比多菌灵和噻菌酮＝1:1的1000倍混合溶液消毒。
42.本发明优选芽头移栽基质由体积份数的泥炭土2-4份，红土0-2份，椰糠1-2份组成；进一步优选泥炭土:红土:椰糠体积比为2:2:1。优选基质含水量保持在20％-45％；进一步优选保持在30％。10天后待芽根部长出新根后，可正常浇水、施肥，基质湿度保持80％及以上。
43.本发明优选微球茎取芽后，使用体积份数的多菌灵1-2份，噻菌酮1-2份的800-1000混合溶液消毒后，重复进行催芽、取芽、移栽培养直至球茎皱缩加重，质地松软，移栽播种；进一步优选利用体积比多菌灵和噻菌酮＝1:1的1000倍混合溶液消毒。
44.下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
45.实施例1
46.1、珠芽魔芋组培苗的培育
47.1.1、挑选健康、饱满，无机械损伤、无病害、霉变的的叶面珠芽为组培外植体。
48.1.2、用清水清洗干净外植体表面杂质，削去表皮。
49.1.3、将削皮后的外植体用流水冲洗30min，取出用无菌水冲洗2次后转入无菌操作台上，用75％的酒精浸泡20min，再分别用0.1％的升汞溶液浸泡20min和无菌水冲洗3次，最后移至无菌操作台上切成1cm
×
1cm
×
1cm的小块。
50.1.4、愈伤组织诱导：将小块接入配比为ms 6-ba 1.5mg/l naa0.1mg/l 琼脂7g/l 蔗糖30g/l的愈伤组织诱导培养基中，每瓶接种5块，1个月后大量愈伤组织形成。
51.1.5、不定芽诱导：将形成愈伤组织的外植体转接到配比为ms 6-ba1mg/l naa0.5mg/l 琼脂7g/l 蔗糖30g/l的不定芽诱导培养基中；在光照下培养20-25天后外植体上有大量丛生芽形成。
52.1.6、不定芽增殖培养：将丛生芽在无菌操作台上取出，分株后接种到配比为ms 6-ba2mg/l iaa 0.4mg/l 琼脂7g/l 蔗糖30g/l的增殖培养基中，每瓶接种20株，同样在光照下培养，25天后可获得5cm左右的珠芽魔芋丛生苗。
53.1.7、最后将丛生苗分为单株接种到配比为1/2ms naa 0.3mg/l 琼脂7g 蔗糖15g/l的生根培养基中，25-30天时苗高8-12cm、根长2-3cm，便可移栽到大棚进行炼苗。
54.其中，各培养基ph为6.0，培养条件为每天光照12h，温度26℃，光照强度1500lx。
55.2、炼苗
56.2.1、将炼苗基质体积比为泥炭土：红土：椰糠＝2:1:2的混合基质，混合均匀后填入育苗盘内，使用多菌灵和噻菌酮体积比为1:1的1000倍混合溶液喷洒消毒；生长前期基质持水量保持80％，组培苗新根萌发后便可正常浇水、施肥。
57.2.2、将植株、根系健壮的珠芽魔芋组培苗移至四周防雨、遮荫度75％、室温28℃、湿度70％的炼苗大棚内，打开瓶盖过夜；第二天将苗取出，用清水清洗干净根部培养基，移
栽至填入基质的育苗盘内。
58.2.3、前10天，每隔2-3h施用喷雾设施喷施一次清水，时长控制在1min以内，因组培苗植株质嫩，需时刻保持组培苗叶面潮湿，尤其中午11点-15点时段；保持基质含水量在80％；
59.2.4、前期在棚内上方搭建一层遮阳网，保持棚内遮荫度为75％，10天后，组培苗新根系长出，可将遮阳网摘除；早晚喷施一次清水，保持基质潮湿；每周施用两次1
‰
的氮肥。
60.2.5、45-60天后，对组培苗断水断肥，植株倒苗后，便可收集1-3g的组培微球茎。
61.3、采用组培微球茎扩繁种苗
62.3.1、挑选2g的珠芽魔芋组培微球茎，清洗表面杂质，依次摆放于干净的长方形育苗盘内，后再微球茎上盖上一层报纸，每日在报纸上喷施少量清水，保持报纸潮湿，但无水珠滴下，盘内无积水，进行催芽。
63.3.2、待芽长1cm以上时，用75％酒精消毒好的刀片在芽根基与球茎表面相接处取芽。
64.3.3、取芽后的组培微球茎使用多菌灵和噻菌酮＝1:1的1000倍混合溶液消毒后放回原育苗盘内，再次催芽、取芽。
65.3.4、取下的芽用多菌灵和噻菌酮＝1:1的1000倍混合溶液消毒，在通风干燥处晾干后移栽至填有泥炭土：红土：椰糠体积比为2:2:1育苗基质的育苗盘内，前期保持基质含水量在20％-45％。
66.3.5、10天后待芽根部长出新根后，可正常浇水、施肥，基质湿度保持80％及以上；如此重复，至球茎皱缩，质地松软后移栽至大田即可。
67.采用本发明中组培微球茎扩繁种苗的方法：第一次对珠芽魔芋组培微球茎催芽时，球茎出芽率为100％，取芽后移栽成活率达85％，10天后主芽基部根系逐渐萌发；此时球茎出现轻微皱缩，可进行第二次催芽。20天后逐渐第二次萌芽，第二次球茎出芽率为90％，每个球茎出芽数为1-2颗，30天左右可第二次取芽移栽，移栽成活率81％；取芽后球茎皱缩加重，质地松软，此时停止催芽，将球茎播种至田间，45天后球茎出芽破土，出芽率为78％。
68.实施例2
69.1、珠芽魔芋组培苗的培育
70.1.1、挑选健康、饱满，无机械损伤、无病害、霉变的的地下球茎为组培外植体。
71.1.2、用清水清洗干净外植体表面杂质，削去表皮。
72.1.3、将削皮后的外植体用流水冲洗30min，取出用无菌水冲洗2次后转入无菌操作台上，用75％的酒精浸泡20min，再分别用0.1％的升汞溶液浸泡20min和无菌水冲洗3次，最后移至无菌操作台上切成0.8cm
×
0.8cm
×
0.8cm的小块。
73.1.4、愈伤组织诱导：将小块接入配比为ms 6-ba 1mg/l naa 0.2mg/l 琼脂6.5g/l 蔗糖25g/l的愈伤组织诱导培养基中，1个月后大量愈伤组织形成。
74.1.5、不定芽诱导：将形成愈伤组织的外植体转接到配比为ms 6-ba1.2mg/l naa 0.1mg/l 琼脂6.5g/l 蔗糖25g/l的不定芽诱导培养基中；在光照下培养20-25天后外植体上有大量丛生芽形成。
75.1.6、不定芽增殖培养：将丛生芽在无菌操作台上取出，分株后接种到配比为ms 6-ba 1mg/l iaa 0.3mg/l 琼脂6.5g/l 蔗糖25g/l的增殖培养基中，在光照下培养，25天后可
获得5cm左右的珠芽魔芋丛生苗。
76.1.7、最后将丛生苗分为单株接种到配比为1/2ms naa 0.1mg/l 琼脂6.5g/l 蔗糖13g/l的生根培养基中，30天后可移栽到大棚进行炼苗。
77.其中，各培养基ph为5.6，培养条件为每天光照12h，温度22℃，光照强度1000lx。
78.2、炼苗
79.2.1、将炼苗基质体积比为泥炭土:椰糠＝2:1的混合基质，混合均匀后填入育苗盘内，使用多菌灵和噻菌酮体积比为2:1的800倍混合溶液喷洒消毒；生长前期基质持水量保持65％，组培苗新根萌发后便可正常浇水、施肥。
80.2.2、将植株、根系健壮的珠芽魔芋组培苗移至四周防雨、遮荫度60％、室温25℃、湿度92％的炼苗大棚内，打开瓶盖过夜；第二天将苗取出，用清水清洗干净根部培养基，移栽至填入基质的育苗盘内。
81.2.3、前10天，每隔2-3h施用喷雾设施喷施一次清水，时长控制在1min以内，因组培苗植株质嫩，需时刻保持组培苗叶面潮湿，尤其中午11点-15点时段；保持基质含水量在82％；
82.2.4、前期在棚内上方搭建一层遮阳网，保持棚内遮荫度为60％，10天后，组培苗新根系长出，可将遮阳网摘除；早晚喷施一次清水，保持基质潮湿；每周施用两次5
‰
的氮肥。
83.2.5、45-60天后，对组培苗断水断肥，植株倒苗后，便可收集1-3g的组培微球茎。
84.3、采用组培微球茎扩繁种苗
85.3.1、挑选1-2g的珠芽魔芋组培微球茎，清洗表面杂质，依次摆放于干净的长方形育苗盘内，后再微球茎上盖上一层报纸，每日在报纸上喷施50mg/l的ga3，保持报纸潮湿，但无水珠滴下，盘内无积水，进行催芽。
86.3.2、待芽长1.5以上cm时，用100％酒精消毒好的刀片在芽根基与球茎表面相接处取芽。
87.3.3、取芽后的组培微球茎使用多菌灵和噻菌酮＝2:1的800倍混合溶液消毒后放回原育苗盘内，再次催芽、取芽。
88.3.4、取下的芽用多菌灵和噻菌酮＝2:1的800倍混合溶液消毒，在通风干燥处晾干后移栽至填有泥炭土:椰糠体积比为2:1育苗基质的育苗盘内，前期保持基质含水量在20％-45％。
89.3.5、10天后待芽根部长出新根后，可正常浇水、施肥，基质湿度保持80％及以上；如此重复，至球茎皱缩，质地松软后移栽至大田即可。
90.实施例3
91.1、珠芽魔芋组培苗的培育
92.1.1、挑选健康、饱满，无机械损伤、无病害、霉变的的地下球茎为组培外植体。
93.1.2、用清水清洗干净外植体表面杂质，削去表皮。
94.1.3、将削皮后的外植体用流水冲洗30min，取出用无菌水冲洗2次后转入无菌操作台上，用75％的酒精浸泡20min，再分别用0.1％的升汞溶液浸泡20min和无菌水冲洗3次，最后移至无菌操作台上切成0.5cm
×
0.5cm
×
1cm的小块。
95.1.4、愈伤组织诱导：将小块接入配比为ms 6-ba2mg/l naa 0.5mg/l 琼脂8g/l 蔗糖32g/l的愈伤组织诱导培养基中，1个月后大量愈伤组织形成。
96.1.5、不定芽诱导：将形成愈伤组织的外植体转接到配比为ms 6-ba2mg/l naa 0.4mg/l 琼脂8g/l 蔗糖32g/l的不定芽诱导培养基中；在光照下培养20-25天后外植体上有大量丛生芽形成。
97.1.6、不定芽增殖培养：将丛生芽在无菌操作台上取出，分株后接种到配比为ms 6-ba 1.5mg/l iaa 0.6mg/l 琼脂8g/l 蔗糖32g/l的增殖培养基中，在光照下培养，25天后可获得5cm左右的珠芽魔芋丛生苗。
98.1.7、最后将丛生苗分为单株接种到配比为1/2ms naa 0.5mg/l 琼脂8g/l 蔗糖17g/l的生根培养基中，30天后可移栽到大棚进行炼苗。
99.其中，各培养基ph为6.2，培养条件为每天光照12h，温度28℃，光照强度2000lx。
100.2、炼苗
101.2.1、将炼苗基质体积比为泥炭土:红土:椰糠＝4:1:2的混合基质，混合均匀后填入育苗盘内，使用多菌灵和噻菌酮体积比为1:2的900倍混合溶液喷洒消毒；生长前期基质持水量保持82％，组培苗新根萌发后便可正常浇水、施肥。
102.2.2、将植株、根系健壮的珠芽魔芋组培苗移至四周防雨、遮荫度80％、室温32℃、湿度65％的炼苗大棚内，打开瓶盖过夜；第二天将苗取出，用清水清洗干净根部培养基，移栽至填入基质的育苗盘内。
103.2.3、前10天，每隔2-3h施用喷雾设施喷施一次清水，时长控制在1min以内，因组培苗植株质嫩，需时刻保持组培苗叶面潮湿，尤其中午11点-15点时段；保持基质含水量在65％；
104.2.4、前期在棚内上方搭建一层遮阳网，保持棚内遮荫度为80％，10天后，组培苗新根系长出，可将遮阳网摘除；早晚喷施一次清水，保持基质潮湿；每周施用两次n:p:k＝15:5:30的复合肥。
105.2.5、45-60天后，对组培苗断水断肥，植株倒苗后，便可收集1-3g的组培微球茎。
106.3、采用组培微球茎扩繁种苗
107.3.1、挑选2-3g的珠芽魔芋组培微球茎，清洗表面杂质，依次摆放于干净的长方形育苗盘内，后再微球茎上盖上一层报纸，每日在报纸上喷施50mg/l的iaa，保持报纸潮湿，但无水珠滴下，盘内无积水，进行催芽。
108.3.2、待芽长2cm时，用85％酒精消毒好的刀片在芽根基与球茎表面相接处取芽。
109.3.3、取芽后的组培微球茎使用多菌灵和噻菌酮＝1:2的900倍混合溶液消毒后放回原育苗盘内，再次催芽、取芽。
110.3.4、取下的芽用多菌灵和噻菌酮＝1:2的900倍混合溶液消毒，在通风干燥处晾干后移栽至填有泥炭土:红土:椰糠体积比为4:1:2育苗基质的育苗盘内，前期保持基质含水量在20％-45％。
111.3.5、10天后待芽根部长出新根后，可正常浇水、施肥，基质湿度保持80％及以上；如此重复，至球茎皱缩，质地松软后移栽至大田即可。
112.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。