快速检测牛至挥发性酚类物质浓度的试剂盒及其与应用的制作方法

1.本发明涉及检测用试剂盒及其应用，尤其是涉及一种快速检测牛至挥发性酚类物质浓度的试剂盒及其应用。


背景技术：

2.牛至为唇形科牛至属的多年生草本植物，全草入药，可预防流感，治中暑、感冒、头痛身重、腹痛、呕吐、胸膈胀满、气阻食滞、小儿食积腹胀、腹泻、月经过多、崩漏带下、皮肤搔痒及水肿等症，其散寒发表功用，尤胜于薄荷。牛至精油是从牛至的花、叶、茎中提取出的具有挥发性成分的液体，主要含有香芹酚、百里香酚等酚类物质。国内外研究表明，香芹酚、百里香酚能够有效抑制革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、真菌、寄生虫，而且具有很强的抗氧化活性。因此，牛至精油被广泛作为添加剂添加于饲料中，具有促进动物肠道菌落平衡和营养物质的吸收、促进动物生长，增强免疫能力的作用，有望成为重要的抗生素替代品。牛至精油还可作为天然植物保鲜剂，可以取代化学成分作为食品添加剂，具有非常好的防腐作用。牛至精油的抗菌、抗氧化活性由其化学成分和浓度决定，因此，酚类物质含量的高低直接影响牛至精油的活性和品质，众多育种学者也把高香芹酚作为牛至新品种培育的重要目标。
3.三氯化铁作为常规显色剂，常被用作酚类化学物的显色反应中，酚类化合物的酚羟基可与fe离子形成有颜色的化合物，故此反应常用来鉴别酚类。研究表明，牛至中香芹酚、百里香酚等挥发性酚类物质与三氯化铁溶液发生显色反应，使溶液显绿色。加入乙醇溶液会让叶片中挥发性酚类物质更好、更快的溶解，但叶片中的叶绿素也会随之溶解于溶液中，使溶液显绿色，干扰显色结果。按照一定比例加入稀盐酸后，使溶液呈现酸性，叶绿素在酸性条件下破解，使溶液显黄色，从而避免了叶绿素的影响。
4.牛至叶片中酚类物质浓度的常规检测方法：取适量牛至叶片采用水蒸馏、超临界萃取等方法提取精油，将提取的精油进行气相色谱-质谱-数据系统联用(gc/ms/ds)技术，根据香芹酚、百里香酚等酚类物质质谱碎片规律进行解析，再与标准图谱对照，同时参考文献数据加以确认，从而计算得到牛至叶片中酚类物质的浓度值。


技术实现要素：

5.本发明目的是提供一种快速检测牛至挥发性酚类物质浓度的试剂盒及其应用。
6.本发明所采用的技术方案是：
7.一种快速检测牛至挥发性酚类物质浓度的试剂盒，其包括试剂盒盒体、检测液、标准比色卡、试纸条，所述的检测液是由fecl3溶液、乙醇、稀盐酸以1:15:1-1:20:1的体积比例混合而成，所述的fecl3溶液的浓度为45％，所述的乙醇为无水乙醇，所述的稀盐酸的浓度为1mol/l。
8.其中，所述试剂盒还可包括样品盛装容器，所述的样品盛装容器优选为直径1.5cm、1cm高的圆柱形塑料容器，带盖。
9.其中，所述的试剂盒还可包括取液器，优选为注射器，所述注射器为容量在0.5ml
以上规格均可。
10.其中，所述的试剂盒还可包括剪刀。
11.其中，所述的标准比色卡为根据不同挥发性酚类物质浓度对fecl3溶液的显色反应定制的浓度比色卡，该比色卡的绿色由浅至深分为4个档次，并对不同颜色对应标注所代表的香芹酚浓度分别为20％以下、20％-50％、50％-80％、80％以上。
12.其中，所述试纸条为长1.5cm、宽0.5cm的吸水滤纸条。
13.该试剂盒的应用方法如下：在样品盛装容器中，倒入检测液，取鲜叶0.5g快速剪碎置于溶液中，充分反应5min后观察颜色变化，并用注射器吸0.5ml液体注射到试纸条上，与标准比色卡进行比较，随即确定叶片中酚类物质的浓度范围。
14.本发明利用挥发性酚类成分香芹酚、百里香酚与三氯化铁的显色反应，且浓度不同而显色不同，建立一个快速、准确检测牛至挥发性酚类物质浓度的试剂盒。检测液中加入稀盐酸，使检测液显酸性，从而避免了叶片中叶绿素溶解于检测液中，使溶液显绿色，干扰显色结果。本发明试剂盒可直接用于检测牛至挥发性酚类物质含量的高低。该方法检测过程简单、判别直观方便，试剂盒小而易携带，易于普及推广。
附图说明
15.图1所示为牛至挥发性酚类物质浓度的检测的标准比色卡。
具体实施方式
16.以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
17.实施例1
18.检测液的制备：首先配制45％的fecl3溶液，并配制1mol/l的稀盐酸溶液，准备无水乙醇溶液。
19.按照45％的fecl3溶液1份、无水乙醇15份、1mol/l的稀盐酸1份的体积比例充分混合，取混合液(5ml)倒入干净的安瓿瓶中，即可得到检测液。
20.标准比色卡的制备：取不同挥发性酚类物质浓度的牛至品种叶片，采用水蒸馏法、气相色谱-质谱-数据系统联用法等常规方法进行叶片中酚类物质浓度的确定，最终确定了9个不同酚类物质浓度的牛至品种，其中浓度分别为12％、25％、33％、46％、53％、67％、72％、88％、95％。分别取9个牛至品种叶片0.5g剪碎置于样品盛装容器中，倒入检测液，充分反应5min后观察颜色变化，对比发现，浓度为20％以下的溶液为fecl3溶液的黄绿色，编号为g1；浓度20％-50％的溶液为浅绿色，编号为g2；浓度50％-80％的溶液为绿色，编号为g3；浓度80％以上的溶液为深绿色，编号为g4。分别给4个浓度梯度显色的溶液拍照，采集颜色制作成标准比色卡。
21.未知浓度的挥发性酚类物质浓度的测定：在样品盛装容器中，倒入安瓿瓶检测液，取鲜叶0.5g牛至叶片快速剪碎置于溶液中，充分反应5min后观察颜色变化，并用注射器吸0.5ml液体注射到试纸条上，与上述标准比色卡进行比较，发现显色为深绿色(比色卡编号为g4)，暂定此牛至品种叶片的酚类物质浓度为80％以上，将反应液进行分光光度计检测，以乙醇为空白对照，检测到吸光度为1.855abs。随后通过采该牛至叶片适量，采用水蒸馏法、气相色谱-质谱-数据系统联用法进行叶片的香芹酚、百里香酚等挥发性酚类浓度的测
定，确定该牛至叶片中酚类物质浓度为90％，与试剂盒结果相符。
22.实施例2
23.检测液的制备：首先配制45％的fecl3溶液，并配制1mol/l的稀盐酸溶液，准备无水乙醇溶液。按照45％的fecl3溶液1份、无水乙醇20份、1mol/l的稀盐酸1份的体积比例充分混合，取混合液(5ml)倒入干净的安瓿瓶中，即可得到检测液。
24.未知浓度的挥发性酚类物质浓度的测定：在样品盛装容器中，倒入安瓿瓶检测液，取鲜叶0.5g牛至叶片快速剪碎置于溶液中，充分反应5min后观察颜色变化，并用注射器吸0.5ml液体注射到试纸条上，与实施例1中制备的标准比色卡进行比较，发现显色为绿色(比色卡编号为g3)，暂定此牛至品种叶片的香芹酚浓度在50％-80％之间，将反应液进行分光光度计检测，以乙醇为空白对照，检测到吸光度为1.393abs。随后通过采该牛至叶片适量，采用水蒸馏法、气相色谱-质谱-数据系统联用法进行叶片的香芹酚、百里香等酚类物质浓度的测定，确定该牛至叶片中酚类物质浓度为63％，与试剂盒结果相符。
25.实施例3
26.检测液的制备：首先配制45％的fecl3溶液，并配制1mol/l的稀盐酸溶液，准备无水乙醇溶液。按照45％的fecl3溶液1份、无水乙醇15份、1mol/l的稀盐酸1份的体积比例充分混合，取混合液(5ml)倒入干净的安瓿瓶中，即可得到检测液。
27.未知浓度的挥发性酚类物质浓度的测定：在样品盛装容器中，倒入安瓿瓶检测液，取鲜叶0.5g牛至叶片快速剪碎置于溶液中，充分反应5min后观察颜色变化，并用注射器吸0.5ml液体注射到试纸条上，与实施例1中制备的标准比色卡进行比较，发现显色为浅绿色(比色卡编号为g2)，暂定此牛至品种叶片的香芹酚浓度在20％-50％之间，将反应液进行分光光度计检测，以乙醇为空白对照，检测到吸光度为0.910abs。随后通过采该牛至叶片适量，采用水蒸馏法、气相色谱-质谱-数据系统联用法进行叶片的香芹酚、百里香等酚类物质浓度的测定，确定该牛至叶片中酚类物质浓度为35％，与试剂盒结果相符。
28.实施例4
29.检测液的制备：首先配制45％的fecl3溶液，并配制1mol/l的稀盐酸溶液，准备无水乙醇溶液。按照45％的fecl3溶液1份、无水乙醇18份、1mol/l的稀盐酸1份的体积比例充分混合，取混合液(5ml)倒入干净的安瓿瓶中，即可得到检测液。
30.未知浓度的挥发性酚类物质浓度的测定：在样品盛装容器中，倒入安瓿瓶检测液，取鲜叶0.5g牛至叶片快速剪碎置于溶液中，充分反应5min后观察颜色变化，并用注射器吸0.5ml液体注射到试纸条上，与实施例1中制备的标准比色卡进行比较，发现显色为黄绿色(比色卡编号为g1)，暂定此牛至品种叶片的挥发性酚类物质浓度在20％以下，将反应液进行分光光度计检测，以乙醇为空白对照，检测到吸光度为0.652abs。随后通过采该牛至叶片适量，采用水蒸馏法、气相色谱-质谱-数据系统联用法进行叶片的香芹酚、百里香等酚类物质浓度的测定，确定该牛至叶片中酚类物质浓度为11％，与试剂盒结果相符。
31.实施例5
32.检测液的制备：首先配制45％的fecl3溶液，准备无水乙醇溶液。按照45％的fecl3溶液1份、无水乙醇18份的体积比例充分混合，取混合液(5ml)倒入干净的安瓿瓶中，即可得到检测液。
33.取实施例4中已知浓度的牛至品种(叶片中酚类物质浓度为11％)的挥发性酚类物
质浓度的测定：在样品盛装容器中，倒入安瓿瓶检测液，取鲜叶0.5g牛至叶片快速剪碎置于溶液中，充分反应5min后观察颜色变化，并用注射器吸0.5ml液体注射到试纸条上，与实施例1中制备的标准比色卡进行比较，发现显色为绿色(比色卡编号为g3)，暂定此牛至品种叶片的挥发性酚类物质浓度在50％-80％，将反应液进行分光光度计检测，以乙醇为空白对照，检测到吸光度为1.156abs。
34.可见，检测液中不加入稀盐酸所测定的叶片挥发性酚类物质浓度与实际浓度相差较大。与加入稀盐酸的检测液的结果与实际浓度相符。说明未加入稀盐酸时叶片中叶绿素溶解于检测液中，使溶液显绿色，干扰了显色结果。加入稀盐酸后，避免了叶片中叶绿素溶解于检测液中，使结果能够正常表达。
35.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。