用于增强抗逆转录病毒治疗的hiv感染者的治疗性免疫
1.本技术是申请日是2011年6月9日、申请号是201180038907.1、发明名称是“用于增强抗逆转录病毒治疗的hiv感染者的治疗性免疫”的中国发明专利申请的分案申请。
技术领域
2.本发明涉及用于hiv(艾滋病毒)病毒的接种疫苗的组合物和方法。具体地，本发明将外源性hiv病毒蛋白传递至细胞的胞质溶胶。本发明还涉及与常规逆转录病毒治疗结合使用的方法，以促进逆转录病毒治疗。
3.相关申请的交叉引用
4.本技术要求2010年6月9日提交的美国临时专利申请61/353,176号的权益，所述专利申请以引用的方式并入本文中。
背景技术：
5.大约2500万hiv感染者居住在撒哈拉以南的非洲地区。在资源缺乏的情况下，限制性治疗方案以及替代治疗方案的费用可能会扩大抗逆转录病毒治疗(art)项目的限制1。乌干达目前的hiv感染率为6-10％，依然高得令人无法接受。大多数在乌干达可以使用的art治疗方案都限制于低成本和固定剂量复方制剂2，并且二线治疗亦仍然受到限制。逆转录病毒治疗能够成功地将血浆hiv-1rna水平降低至《50复制数/ml
3-5
，并且与在更晚期的免疫抑制和更高的病毒性载量下开始治疗的人相比，病毒性响应的人的比例更低6。art与人体脂肪代谢和分布异常、高血脂、胰岛素抵抗、高血糖和乳酸性酸中毒相关联7-11，40％的人需要在开始治疗的1年内改变治疗方案
12,13
。
6.通过并行art来增强免疫功能的治疗性干预可以提高hiv感染的长期结果
14
。遵循适当的art的免疫恢复通常都不完整，亦不能够从病毒进展中引起与保护相关的反应
15-18
。这种缺陷与功能失调的t细胞反应有关
19-21
。因此，通过治疗性干预来增强免疫反应可以显著减缓或抑制aids的进展。猕猴中的治疗性干预证明了免疫力能够被诱发，从而降低病毒载量
22
。现有研究表明，hiv感染个体中血浆病毒血症下降，亦证明免疫后hiv特异性t细胞响应会增强。但是，还没有hiv疫苗得到临床准入资格。
7.lfn-p24c由被称作致死因素n末端(lethal factor n-terminus(lfn))的、与hiv-gag蛋白p24相融合的解毒炭疽衍生多肽组成。在这种重组蛋白的活体试验中，已经证明其传递方式是模拟蛋白免疫响应的缩氨酸的细胞内释放。
技术实现要素：
8.本发明涉及治疗性组合物，所述组合物包括hiv多肽或肽和lfn蛋白，以有效地将hiv传递到细胞的胞质溶胶(cystol)，从而对hiv免疫原引起细胞毒性淋巴细胞反应(cytotoxic lymphocyte response，ctl)，以提高抗逆转录病毒治疗期间hiv感染者对hiv的免疫能力。
9.如本文所描述，发明人证明了lfn-p24c疫苗在两期开放性试验中作为治疗免疫原
的用途。1a期评价候选疫苗的安全性，而1b期研究被用来证明lfn-p24c疫苗组合物能够被用来在常规抗逆转录病毒治疗期间形成短暂的中断。
10.相应地，发明人在非洲乌干达的治疗性疫苗试验中证明了hiv疫苗lfn-p24疫苗在提高和促进传统抗病毒治疗疗效方面的临床疗效。该开放性i期试验被设计来评估lfn-p24c作为治疗性hiv-1候选疫苗的安全性、耐受性和免疫原性。招募了三十个正在接受稳定的抗逆转录病毒治疗(art)方案的、cd4 t细胞数》400的、健康的hiv阳性志愿者来进行lfn-p24c的安全性评估。该疫苗包括与c亚型hiv gag蛋白p24融合的炭疽衍生多肽(称为致死因素n末端(lfn))。该疫苗具有良好的耐受性，并且血浆hiv rna水平在每个免疫时间点(0、4和12周)都维持不可检测。发明人证明了12个月之后，与对照个体相比，疫苗接受者的cd4 t细胞数显著增加。还证明了在三次lfn-p24c免疫之后，有hiv特异性反应的个体的cd4 t细胞数增加最多。
11.在12个月安全评估过程之后，志愿者被要求进行为期30天的常规抗逆转录病毒治疗的受观察治疗中断(treatment interruption)。在治疗中断期间，24个个体中有8个(30％)没有表现出病毒反弹的迹象。恢复art之后，所有志愿者都被证明有迅速的病毒量抑制。发明人因此证明了hiv疫苗在受感染的乌干达人中的安全性和有效性，辅助治疗性免疫有利于选择的个体进一步增强免疫响应。
12.在不希望受理论约束的情况下，有效且常规的多种抗逆转录病毒治疗、甚至多种hiv药物治疗都要求严格遵循复杂的治疗方案，其中可能要求每日多种不同的服药量、在精确的时间间隔下服药以及小心注意饮食。伴随着如此复杂的治疗方案，病人不遵从医嘱是hiv治疗中一个众所周知的问题，因为这种不遵从医嘱的行为可能导致hiv的多重耐药菌株的出现，还会导致中途放弃治疗。
13.如本文所证明，包括hiv多肽和lfn(例如作为融合蛋白或使用非共价结合)的组合物可以与常规抗逆转录病毒治疗结合使用，来提高常规抗逆转录病毒治疗的疗效。特别地，在一些实施方式中，hiv-lfn疫苗组合物的脉冲式给药允许在连续的常规抗逆转录病毒治疗中进行休息或中断。因为在连续的常规抗逆转录病毒治疗中可以出现中断，本文所描述的hiv-lfn疫苗组合物的每次脉冲剂量都可以被用来降低治疗过程中抗逆转录病毒治疗的总量。事实上，发明人意外地发现，hiv-lfn疫苗组合物的给药使得可以在连续的常规抗逆转录病毒治疗中出现非预期的中断，同时在抗逆转病毒治疗的中断期间不会显著地增加病毒载量。
14.相应地，本发明的一个方面与组合物的方法相关，该组合物包括hiv多肽和lfn(例如作为融合蛋白或使用非共价结合)，其作为疫苗时在每日治疗中具有相当大的灵活性。这种组合物在很难严格遵守特定的抗逆转录病毒药物方案的国家中特别有用。
15.相应地，本发明涉及包括与hiv抗原(例如作为融合蛋白或其他非共价键关联)复合的lfn多肽的疫苗组合物与传统逆转录病毒治疗或结合性hiv病毒治疗的联合使用。相应地，本发明涉及周期性地(例如脉冲式给药)使用疫苗的双重治疗方法，其与传统结合逆转录病毒治疗相结合，来增强传统逆转录病毒治疗在hiv阳性或经受aids的对象中的疗效。
16.在一个实施方式中，本文所描述的疫苗组合物包括lfn多肽和hiv抗原，使患者可以在传统结合性逆转录病毒治疗中进行周期性中断，这种中断包括非预期的中断，这是hiv抗逆转录病毒治疗(本文称为“art”)中经常出现的问题。在一些实施方式中，向患者施用包
括lfn多肽和hiv抗原的疫苗组合物，患者能够在有限的时间内不服用常规抗病毒药物，例如，从传统抗逆转录病毒治疗中至少中断一周，或中断大约两周或大约三周或一个月或更长时间。因此，本发明使患者能够灵活地暂停服用传统抗病毒药物，以及灵活地按需求遵循严格的药物抗病毒治疗方案，而不会有降低传统抗病毒药物的疗效的风险。
17.在一些实施方式中，周期性地向患者施用包括lfn多肽和hiv抗原(例如作为融合蛋白或使用非共价结合)的疫苗药物组合物，例如，以脉冲的时间间隔施用，例如每月一次，或每隔一个月一次，或每季度一次，或每年两次或每年一次。
附图说明
18.图1a-b示出了在三次免疫注射和一次加强剂量后分别在1a期和1b期的局部和全身反应原性。图1a示出了1a期研究的结果，图1b示出了1b期研究的结果。一共记录有840个事件。24/840(2.9％)的事件被记录为严重程度中的轻度，1/840(0.1％)被记录为严重程度中的中度。没有出现被视为与研究疫苗相关的严重不良事件。
19.图2示出了1a期历史对照个体和疫苗接种者(分别为虚线和纯净的箱线图)的cd4计数分布。水平线代表中位数和四分位间距(第25个和第75个百分位数值)。在对照组(12个月，p＝0.41)或疫苗接种者(招募前6个月，p＝0.2)的cd4 t细胞分布中都没有观察到统计学显著性差异。三次免疫接种之后在12个月和15个月(p分别为0.02和0.006)都观察到cd4细胞计数显著上升。
20.图3a-3b示出了疫苗接种者的cd4和cd8免疫反应。图3a示出了免疫激活。使用hladr fitc、cd38 pe、cd3 amcyan、cd8 percpcy5.5、cd4 apc cy7对pbmc进行染色，并用流式细胞仪进行分析。首先将样品在cd3 /cd8 和cd3 cd4 淋巴细胞群上设门，然后确定cd38阳性和hladr阳性的百分比。在疫苗或对照样品之间没有观察到关于cd4 /cd8 t细胞亚细胞群中免疫激活的显著差异。图3b示出了通过pd-1表达测量的免疫功能低下。使用cd3 amcyan、cd8 percpcy5.5、cd4 apc cy7和pd-1apc对pbmc进行染色。首先将样品在cd3 /cd4 (和cd3 /cd8 )淋巴细胞群上设门，随后确定pd-1阳性的百分比。与疫苗样本相比，对照组的cd4 pd1 和cd8 pd1 表达显著提高(p分别为0.016和0.041)。水平线代表中位数和四分位间距(第25个和第75个百分位数值)。
21.图4a-ab示出了通过gag肽刺激之后cd4和cd8细胞的增殖。图4a示出了gag特异性cd4增殖的代表图形。使用亚型c gag肽对cfse标记的pbmc进行刺激5天，然后用流式细胞仪评估增殖情况。结果表达为通过cfse稀释程度测量的增殖cd4 t细胞的百分比。阳性增殖被定义为》0.1％(净)并至少为本底值的两倍。图4b示出了gag特异性。图4c示出了疫苗和对照样本中cmv特异性cd4 和cd8 增殖。在对照组和疫苗接种者之间观察到cd4和cd8介导的增殖中的反应频率之间对gag存在显著差异(p《0.05)，而对cmv则不存在显著差异(p》0.05)。
22.图5示出了疫苗特异性t细胞增殖和cd4计数增加之间的相关性的箱线图。具有( )和不具有(-)疫苗特异性t细胞增殖迹象的1a期疫苗接种者的cd4 t细胞档案。( )组中的平均cd4增长是151，而未免疫接种(-)组是36。水平线表示平均值。
23.图6a-6b示出了1b期疫苗接种者的免疫学和病毒学特征。24个个体在接受加强的lfn-p24c之后停止art 4周。图6a示出了病毒载量(hiv rna复制数/ml血浆)和每mm3的cd4 t细胞的绝对数值，图6b示出了在整个治疗中断和停止期间中都监控了血液。蓝色阴影描绘
了没有art的时期。
24.图7示出了治疗性免疫和程序性死亡1(pd-1)的表达之间的关联的箱线图。
25.图8示出了33％(8/24)的治疗性疫苗在预定的治疗中断期间表现出完全的病毒载量抑制。
26.图9示出了16％(4/24)的治疗性疫苗在预定的治疗中断期间表现出较低的病毒载量反弹。
27.图10示出了共有50％的治疗性疫苗在预定的治疗中断期间表现出受抑制的病毒载量。
28.图11示出了50％的治疗性疫苗在预定的治疗中断期间表现出病毒载量反弹；无耐药病毒出现。
具体实施方式
29.发明人已经证明了结合到lfn的hiv多肽能够与常规hiv抗逆转录病毒治疗结合使用，来提高常规逆转录病毒治疗的疗效。相应地，本发明的一个方面涉及包括hiv抗原(例如多肽或肽)和lfn(例如作为融合蛋白或使用非共价结合)的疫苗组合物的使用，它使得能够在常规hiv抗逆转录病毒药物的连续给药中进行中断或休息。在一些实施方式中，lfn和hiv抗原是lfn-hiv抗原融合蛋白。在可替代的实施方式中，lfn和hiv抗原是使用非共价结合来联合的。
30.相应地，本发明的一个方面涉及包括结合到lfn的hiv多肽的疫苗组合物的使用方法，使得在很难严格遵守特定的抗逆转录病毒药物方案的国家中，在每日治疗中更加灵活。这代表了能够显著地节约时间、精力和费用，更重要的是，如果病人无意或故意地不遵从严格的抗逆转录病毒药物治疗方案，这能更长时间维持常规hiv抗逆转录病毒药物的疗效。
31.相应地，本发明涉及包括lfn多肽和hiv抗原的疫苗组合物与传统逆转录病毒治疗或结合性hiv病毒治疗的联合使用。相应地，本发明涉及周期性地(例如脉冲式给药)使用疫苗的双重治疗方法，它与传统逆转录病毒治疗相结合，来增强传统逆转录病毒治疗在hiv阳性或经受aids的对象中的疗效。
32.有效且常规的、甚至多种用于hiv的药物治疗都要求严格遵循复杂的治疗方案，其可能要求每日多种不同的服药量、在精确的时间间隔下服药并且小心注意饮食。伴随着如此复杂的治疗方案，病人不遵从医嘱是hiv治疗中一个众所周知的问题，因为这种不遵从医嘱的行为可能导致hiv的多重耐药菌株的出现，还会导致中途放弃治疗。
33.在一个实施方式中，本文所描述的疫苗组合物包括lfn多肽和hiv抗原，使得患者可以在传统连续逆转录病毒治疗中进行周期性中断。在一些实施方式中，向患者施用疫苗接种。在lfn多肽与hiv抗原融合的情况下，患者能够在有限的时间内不服用常规抗病毒药物，例如，从传统抗逆转录病毒治疗中至少中断一个星期，或中断大约2个星期或大约3个星期或一个月或更长时间。因此，本发明使患者能够灵活地暂停服用传统抗病毒药物，以及灵活地按需求遵循严格的药物抗病毒治疗方案，而不会有降低传统抗病毒药物的疗效的风险。
34.在一些实施方式中，周期性地向患者施用包括与hiv抗原相融合的lfn多肽的疫苗药物组合物，例如，每月一次，或每隔一个月一次，或每季度一次，或每年两次或每年一次。
35.相应地，本发明使得包括与hiv抗原相融合的lfn多肽的治疗性疫苗能够作为结合治疗来减少常规hiv药物所增加的疗效。更重要的是，能够简化给药方案，从而提高病人的依从性。在一些实施方式中，和包括与hiv抗原相融合的lfn多肽的疫苗的结合还提高了常规hiv治疗的药物有效性。在一些实施方式中，包括lfn多肽和hiv抗原的疫苗与传统hiv抗逆转录病毒治疗的结合使用，能够在更低的毒性下得到同等的抗病毒效果。这对于急性治疗和/或抗hiv病毒的结合的发展来说特别有用。
36.在一些实施方式中，本发明的一个目的是提供一种疫苗药物组合物，其包括lfn多肽和hiv抗原，用于治疗具有人类免疫缺陷病毒(hiv)的个体，以及导致aids的可选择的相关疾病。
37.术语的定义
38.本文所使用的术语“疫苗组合物”被定义为用来对组合物中的抗原引发免疫反应的组合物，从而抵抗疾病、保护或治疗机体。
39.如本文所用，术语“包括”的意思是，除了所出现的已定义的元素之外，还可以出现其他元素。“包括”的使用是指包含，而非限制。
40.术语“由
……
组成”指如本文所述的组合物、方法及其各种组分，未被该实施方式描述到的任何元素都不包括在其中。
41.如本文所用，术语“基本上由
……
组成”指给定的实施方式所需要的那些元素。该术语允许不会对本发明的该实施方式的基础和新的或功能性的特征有重大影响的元素出现。
42.如本文所用，术语“融合”的意思是，一个蛋白物理性地与第二个蛋白相关联，例如通过静电的或疏水的相互作用或共价键相连。共价键可以包括作为融合蛋白的连接，或者化学性耦合连接，例如通过半胱氨酸残基连接。
43.如本文所用，术语“融合多肽”或“融合蛋白”指将两个多肽编码序列结合到一起所形成的蛋白。本发明的融合多肽是如下所形成的融合多肽：将lf多肽或其片段或突变体的编码序列与第二个多肽的编码序列相结合，来形成融合或嵌合的编码序列，从而使它们构成单独的开放阅读框。在转录和翻译时，所述融合编码序列表达为融合多肽。换句话说，“融合多肽”或“融合蛋白”是通过肽键连接的两个或多个蛋白的重组蛋白。
44.如本文所用，术语“蛋白”和“多肽”能够交换使用。
45.如本文所用，术语“促进跨膜转运”指第一多肽促进第二蛋白穿过完整的活细胞的细胞膜的能力。
46.如本文所用，术语“胞质溶胶”(cytosol)指完整的细胞的内部。“胞质溶胶”包括细胞内的细胞质和细胞器。
47.如本文所用，术语“完整的细胞”指具有未破损的、没有瑕疵的细胞质膜的活细胞。所述细胞在细胞膜上具有不同的膜电位，相对于细胞外侧，细胞内侧的膜电位为负。
48.如本文所用，术语“n-糖基化”指糖基共价结合到多肽中的天冬酰胺残基。糖基可以包括但不限于葡萄糖、甘露糖和n-乙酰葡糖胺。还可以包括多糖的变形，例如甲硅烷基化(siaylation)。lfn多肽具有三个n-糖基化位点：氨基酸多肽809中的天冬酰胺位点62、212和286。
49.如本文所用，术语“n-糖基化的lfn融合多肽”、“n-糖基化的lf融合多肽”或“n-糖
基化的融合多肽”，如本文所定义，指具有至少一个糖基共价地连接到天冬氨酸残基的融合多肽。例如，在n-糖基化的lf融合多肽中asn-62、asn-212和asn-286可以被糖基化。
50.如本文所用，在本文描述的融合多肽的内容中，术语“基本上缺乏氨基酸1-33”指缺少信号肽活动的融合多肽。
51.如本文所用，术语“抗原”指针对该物质引起免疫反应的任何物质。
52.抗原递呈细胞是表达主要组织相容性复合物(mhc)分子的细胞，并能够显示与mhc在其表面复合的外来抗原。抗原递呈细胞的例子是：树突状细胞、巨噬细胞、b细胞、成纤维细胞(皮肤)、胸腺上皮细胞、甲状腺上皮细胞、神经胶质细胞(脑)、胰腺β细胞和血管内皮细胞。
53.本文使用的术语“致死因子”或“lf”一般指二分(bipartite)炭疽杆菌(b.anthracis)外毒素的非pa多肽。野生型完整的炭疽杆菌lf多肽具有记载于genbank登录号m29081(gene id no:143143)的氨基酸序列，其对应于seq id no:1。seq id no:1对应于lf，信号肽位于其n末端残基1至33处。换句话说，未成熟的野生型lf对应于809氨基酸蛋白，其在n末端含有33氨基酸信号肽。未成熟野生型lf的氨基酸序列(seq idno:1)如下，信号肽加粗突出显示：
54.mnikkefikvismsclvtaitlsgpvfiplvqgagghgdvgmhvkekeknkdenkrkdeernktqeehlkeimkhivkievkgeeavkkeaaekllekvpsdvlemykaiggkiyivdgditkhislealsedkkkikdiygkdallhehyvyakegyepvlviqssedyventekalnvyyeigkilsrdilskinqpyqkfldvlntiknasdsdgqdllftnqlkehptdfsvefleqnsnevqevfakafayyiepqhrdvlqlyapeafnymdkfneqeinlsleelkdqrmlsryekwekikqhyqhwsdslseegrgllkklqipiepkkddiihslsqeekellkriqidssdflsteekeflkklqidirdslseeekellnriqvdssnplsekekeflkklkldiqpydinqrlqdtgglidspsinldvrkqykrdiqnidallhqsigstlynkiylyenmninnltatlgadlvdstdntkinrgifnefkknfkysissnymivdinerpaldnerlkwriqlspdtragylengklilqrnigleikdvqiikqsekeyiridakvvpkskidtkiqeaqlninqewnkalglpkytklitfnvhnryasnivesaylilnewknniqsdlikkvtnylvdgngrfvftditlpniaeqythqdeiyeqvhskglyvpesrsillhgpskgvelrndsegfihefghavddyagylldknqsdlvtnskkfidifkeegsnltsygrtneaeffaeafrlmhstdhaerlkvqknapktfqfindqikfiins(seq id no:1)。
55.所述未成熟的lf蛋白剪切形成长度为776个氨基酸的成熟的野生型lf多肽。该成熟的野生型lf多肽的776氨基酸多肽序列(即缺少n末端信号肽)对应于seq id no:2，如下所示：
56.agghgdvgmhvkekeknkdenkrkdeernktqeehlkeimkhivkievkgeeavkkeaaekllekvpsdvlemykaiggkiyivdgditkhislealsedkkkikdiygkdallhehyvyakegyepvlviqssedyventekalnvyyeigkilsrdilskinqpyqkfldvlntiknasdsdgqdllftnqlkehptdfsvefleqnsnevqevfakafayyiepqhrdvlqlyapeafnymdkfneqeinlsleelkdqrmlsryekwekikqhyqhwsdslseegrgllkklqipiepkkddiihslsqeekellkriqidssdflsteekeflkklqidirdslseeekellnriqvdssnplsekekeflkklkldiqpydinqrlqdtgglidspsinldvrkqykrdiqnidallhqsigstlynkiylyenmninnltatlgadlvdstdntkinrgifnefkknfkysissnymivdinerpaldnerlkwriqlspdtragylengklilqrnigleikdvqiikqsekeyiridakvvpkskidtkiqeaqlninqewnkalglpkytklitfnvhnryasnivesaylilnewknniqsdlikkvtnylvdgngrfvftditlpniaeqythqdeiyeqvhskglyvpesrsillhgpskgvelrndsegfihefghavddyagylldknqsdlvtnskkfidifkeegsnltsygrtneaeffaeafrlmhstdhaer
lkvqknapktfqfindqikfiins(seq id no:2)。
57.术语“lf多肽”不仅适用于全长的野生型lf(具有或不具有信号序列)，还适用于介导融合的或物理性连接的多肽向完整的细胞(例如抗原递呈细胞)的细胞内传递的lf片段。术语“lf多肽”还包括lf的保守的替代变种，它包括介导这种细胞内传递的保守的替代变种。
58.术语“lfn多肽”指炭疽杆菌lf的n-末端片段，它不会表现锌金属蛋白酶活性，亦不会使丝裂素活化激酶失活，但是会介导融合多肽的细胞内或跨膜转运。本文所定义和描述的lfn多肽是优选的。在一个方面，“lfn多肽”包括seq id no:3，其对应于288个氨基酸的未成熟lfn蛋白。该lfn蛋白是“未成熟的”，在于它包括位于n-末端的残基1-30上的信号肽。换句话说，未成熟lfn对应于288个氨基酸的蛋白，它包括位于n-末端的33个氨基酸信号肽。seq id no:3的未成熟lfn蛋白的剪切形成长度为255个氨基酸的成熟lfn多肽。应该强调的是，为了达到本文所述的方法与组合物的目的，所述lf和/或lfn多肽既能够包括信号肽，也能够没有信号肽。即是说，无论信号肽存在与否，都不会影响lf多肽在本文所述方法中作为跨膜运输促进剂的活性。未成熟lfn的氨基酸序列(seq id no:3)如下，信号肽加粗突出显示：
59.mnikkefikvismsclvtaitlsgpvfiplvqgagghgdvgmhvkekeknkdenkrkdeernktqeehlkeimkhivkievkgeeavkkeaaekllekvpsdvlemykaiggkiyivdgditkhislealsedkkkikdiygkdallhehyvyakegyepvlviqssedyventekalnvyyeigkilsrdilskinqpyqkfldvlntiknasdsdgqdllftnqlkehptdfsvefleqnsnevqevfakafayyiepqhrdvlqlyapeafnymdkfneqeinls(seq id no:3)。
60.成熟的lfn多肽(其缺少n-末端信号肽)的多肽序列的长度为255个氨基酸，对应于如下的seq id no:4：
61.agghgdvgmhvkekeknkdenkrkdeernktqeehlkeimkhivkievkgeeavkkeaaekllekvpsdvlemykaiggkiyivdgditkhislealsedkkkikdiygkdallhehyvyakegyepvlviqssedyventekalnvyyeigkilsrdilskinqpyqkfldvlntiknasdsdgqdllftnqlkehptdfsvefleqnsnevqevfakafayyiepqhrdvlqlyapeafnymdkfneqeinls(seq id no:4)。
62.在“lfn的功能性片段”中使用的术语“功能性片段”指lfn多肽的这样的片段，该片段介导、影响或促进抗原跨过完整活细胞的细胞膜的运输。lfn多肽的这种片段的一个例子是对应于seq id no:5的lfn的104个氨基酸c-末端片段，该序列亦在美国专利申请10/473190(以引用的方式并入本文中)中以seq id no:3公开，序列如下：
63.gkilsrdilskinqpyqkfldvlntiknasdsdgqdllftnqlkehptdfsvefleqnsnevqevfakafayyiepqhrdvlqlyapeafnymdkfneqeinls(seq id no:5)。
64.本文使用的术语“lfn多肽”包含本文所述的每一个“未成熟的”lfn和“成熟的”lfn分子，以及其片段、变种(包括保守的替代变种)和衍生物，其介导、影响或促进物理性相连(例如融合)的多肽跨过完整活细胞的细胞膜的运输。特别着重在本文所述方法、组合物和试剂盒中使用的额外的lfn多肽片段包括含有seq id no:3的c-末端60、80、90、100或104个氨基酸的片段、或者基本上由它们组成的片段、或者其保守的替代变种，其介导、影响或促进物理性相连(例如融合)的多肽跨过活细胞的完整细胞膜的运输。
65.本文所用的术语“佐剂”指任何能够提高细胞对hiv抗原的抗原反应或免疫反应的
试剂或实体。佐剂的例子包括但不限于：矿物凝胶(如氢氧化铝)、表面活性物质(如溶血卵磷脂、复合多元醇、聚阴离子)、其他肽、乳化油，以及可能有用的人类佐剂，例如bcg、短小棒状杆菌、qs-21、detox-pc、mpl-se、mogm-csf、titermax-g、crl-1005、gerbu、teramide、psc97b、adjumer、pg-026、gsk-i、gcmaf、b-alethine、mpc-026、adjuvax、cpgodn、betafectin、alum和mf59。
66.术语“保护性抗原”或“pa”(当与炭疽杆菌关联使用时)在本文中可以互换使用，指炭疽杆菌外毒素二分蛋白质的一部分，其通过细胞受体结合到哺乳动物细胞。本文中使用的术语“pa”具有其完整和功能性的受体结合位点。美国专利号5,591,631和5,677,274(其全文以引用的方式并到本文中)描述了pa融合蛋白，其将pa靶向特定的细胞(例如癌细胞和hiv感染细胞)，用作目标细胞上受体的融合蛋白配体。
67.作为本文所使用的术语，hiv抗原的“片段”的长度至少为6个氨基酸，并且可以是，例如至少8个、至少10个、至少14个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少25个氨基酸或更多氨基酸。
68.术语“细胞毒性t淋巴细胞”或“ctl”指在目标细胞中诱导凋亡的淋巴细胞。ctl通过与tcr的相互作用与目标细胞形成抗原特异性偶联物，在目标细胞的表面形成处理过的抗原(ag)，造成目标细胞的凋亡。凋亡的个体被巨噬细胞消除。术语“ctl反应”被用来指由ctl细胞介导的初次免疫反应。
69.本文所使用的术语“细胞介导免疫”或“cmt”指一种免疫反应，该反应不涉及抗体或补体，反而涉及例如是巨噬细胞、自然杀手(nk)细胞、抗原特异性细胞毒性t淋巴细胞(t-细胞)的活化以及响应hiv抗原的多种细胞因子的释放。换句话说，cmi指结合到其他细胞的表面的免疫细胞(例如t细胞和淋巴细胞)，这些其他细胞显示目标抗原(例如抗原递呈细胞)并触发响应。这种响应既可以涉及其他淋巴细胞，并且/或者可以涉及其他任意白血细胞(白血球)和细胞因子释放。细胞免疫通过以下手段保护人体：(i)激活抗原特异性细胞毒性t淋巴细胞(ctl)，它能够破坏在表面显示外来抗原的表位的体细胞，例如病毒感染细胞和具有胞内菌的细胞；(2)激活巨噬细胞的nk细胞，使它们能够破坏细胞内病原体；和(3)刺激细胞，以分泌多种细胞因子，这些细胞因子影响适应性免疫反应和先天免疫反应所涉及的其他细胞的功能。
70.本文所用的术语“免疫细胞”指任何能够对直接或间接的抗原刺激作出响应并释放细胞因子的细胞。本文的“免疫细胞”包括淋巴细胞，其包括自然杀手(nk)细胞、t细胞(cd4 和/或cd8 细胞)、b细胞、巨噬细胞和单核细胞、th细胞、th1细胞、th2细胞、tc细胞、白细胞、树突状细胞、巨噬细胞、肥大细胞和单核细胞，以及其他任何能够对直接或间接的抗原刺激做出响应并制造细胞因子分子的细胞。通常情况下，免疫细胞是淋巴细胞，例如t细胞淋巴细胞。
71.本文所用的术语“细胞因子”与术语“效应分子”可以互换使用，指对刺激抗原做出响应并从免疫细胞释放的分子。这种细胞因子的例子包括但不限于：gm-csf、il-1α、il-1β、il-2、il-3、il-4、il-5、il-6、il-7、il-8、il-10、il-12、ifn-α、ifn-β、ifn-γ、mip-1α、mip-1β、tgf-β、tnfα和tnfβ。术语“细胞因子”不包括抗体。
72.本文所用的术语“复合”指两个或以上分子的聚集，它们特别通过不同于共价相互作用的方式相连。例如，它们可以通过静电作用(例如范德华力等)相连。
73.术语“转移到细胞内”指基团(例如hiv抗原)和可选的本文所述的融合蛋白从细胞外的位置经过细胞质膜进入到完整活细胞内的运动。
74.术语“在活体内”指在动物体内发生的实验或过程。
75.术语“哺乳动物”意指包括单一的“哺乳动物”和复数的“哺乳动物”，并且包括但不限于：人类、灵长类动物(如类人猿、猴子、猩猩和黑猩猩)、犬科动物(如狗和狼)、猫科动物(如猫、狮子和老虎)、马科动物(如马、驴和斑马)、食用动物(如牛、猪和羊)、有蹄动物(如鹿和长颈鹿)、啮齿动物(如小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠)和熊。在一些实施方式中，哺乳动物是人类。
76.术语“药学上可接受的”指可以向哺乳动物施用并且没有异常毒性的化合物和组合物。术语“药学上可接受的载体”不包括组织培养基。示例性的药学上可接受的盐包括但不限于无机酸盐(如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐等)，和有机酸盐(乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等)。
77.术语“多肽”和“蛋白”可以互换使用，指通过肽键连接的氨基酸残基的聚合物。为了达到本发明的目的，其长度最小为15个氨基酸。低聚肽、低聚物多聚体等一般指更长链的氨基酸，由通过肽键连接的线性排列的氨基酸组成。无论是通过生物学、重组还是合成来制造，亦无论是由自然生成的氨基酸还是由非自然生成的氨基酸组成，都包括在所述定义之内。其大于15个氨基酸的全长蛋白和片段都包括在所述定义之内。该术语还包括具有共翻译修饰(例如信号肽切割)和后翻译修饰的多肽，例如形成二硫键、糖基化、乙酰化、磷酸化、蛋白水解裂解(例如用弗林蛋白酶或金属蛋白酶裂解)等。进一步地，如本文所使用的，“多肽”指包括修饰的蛋白，该修饰例如是对原本的序列进行缺失、添加和替代(本领域技术人员通常可以理解为保守性)，只要该蛋白保持所需的活性。该修饰可以是故意的，例如通过定点诱变，也可以是偶然的，例如通过宿主能够产生蛋白的突变，或者是由pcr扩增或其他重组dna方法产生的误差。为了本文所述的方法和组合物，术语“肽”指由肽键连接的氨基酸的序列，其长度为6至15个氨基酸。
78.应该理解的是，蛋白或多肽通常包含除了通常被称为自然生成的氨基酸的20个氨基酸之外的氨基酸。许多氨基酸(包括末端氨基酸)可以在给定的多肽中被修饰，这种修饰既可以通过自然过程(例如糖基化和其他翻译后修饰)，也可以通过本领域所熟知的化学修饰技术。可以在本发明的多肽中出现的已知修饰包括但不限于：乙酰化、酰化、adp-核糖基化、酰胺化、黄素的共价连接、血红素基团的共价连接、多核苷酸或多核苷酸衍生物的共价连接、脂类或脂类衍生物的共价连接、肌醇磷脂的共价连接、交联、环化、形成二硫键、去甲基化、形成共价交联、形成胱氨酸、形成焦谷氨酸、生成、γ-羧基化、糖化、糖基化、形成gpi锚定、羟基化、碘化、甲基化、肉豆蔻酰化、氧化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊烯基化、外消旋化、硒化(selenoylation)、硫酸化、添加到蛋白的转运rna介导的氨基酸，如精氨酰化(arginylation)和泛素化。
79.如本文所用，术语“同源的”和“同系的”可以互换使用，当被用来描述多核苷酸或多肽时，指两个多核苷酸或多肽或其指定的序列在进行最佳比对或比较(例如使用blast，版本2.2.14，默认参数进行对齐(如本文))时，至少有70％的核苷酸是相同的，通常约75～99％相同，更优选至少约98～99％的核苷酸相同，并有适当的核苷酸或氨基酸插入或缺失。对于一个多肽，应该有至少50％的氨基酸是在多肽中相同的。本文所用的术语“同系”或“同
源”还指关于结构相同。本领域技术人员可以很容易确定基因或多肽的同源性。关于定义的百分比，所定义的同源百分比指至少该百分比的氨基酸相似性。例如，85％同源指氨基酸相似性至少为85％。
80.如本文所用，核酸序列、蛋白或多肽中引用的术语“异源的”指这些分子不是在该细胞内自然生成的。例如，被插入到细胞中(例如在蛋白表达载体处)的编码本文所述的融合lfn-hiv抗原多肽的核酸序列，就是异源核酸序列。
81.关于序列比对，通常一个序列作为参考序列，将测试序列与其进行比对。当使用序列比对算法时，测试序列和参考序列都被输入到电脑，并指定序列坐标(如有必要)，再指定序列算法程序参数。根据指定的程序参数，序列对比算法会计算测试序列相对于参考序列的相同序列百分比。
82.在有必要或者需要的时候，可以进行用于比较的序列的最佳对齐。例如，通过smith和waterman的局部同源性算法(adv.appl.math.2:482(1981)，以引用的方式并入本文中)，通过needleman和wunsch的同源性比对算法(j.mol.biol.48:443-53(1970)，以引用的方式并入本文中)，通过pearson和lipman的相似方法的搜索(proc.natl.acad.sci.usa 85:2444-48(1988)，以引用的方式并入本文中)，通过这些算法的计算机实现(例如wisconsin genetics software package,genetics computer group,575science dr.,madison,wis的gap,bestfit,fasta和tfasta)，或者通过视觉检测(一般参看ausubel et.al.(eds.),current protocols in molecular biology,4thed.,john wiley and sons,new york(1999))。
83.一个有用的算法的例子是pileup。pileup使用渐进式的双序列比对，从一组相关的序列中创建多序列比对，从而展示相同序列百分比。它还绘制树或聚类图，其表示用来创建比对的聚类关系。pileup使用feng和doolittle的逐行比对方法(j.mol.evol.25:351-60(1987)，以引用的方式并入本文中)的简化版。所用的方法相似于higgins和sharp描述的方法(comput.appl.biosci.5:151-53(1989)，以引用的方式并入本文中)。该程序最多能够对齐300个序列，每个序列的最大长度为5000个核苷酸或氨基酸。该多重比对过程始于两个最相似序列的双序列比对，生成两个对齐序列的聚类。该聚类随后对齐到下一个最相关的序列或对齐序列的聚类。通过两个独立序列的双序列比对的简单延伸，对齐两个序列的聚类。通过一系列渐进式的双序列比对获得最终的对齐结果。通过对序列比较区域指定特定的序列，以及它们的氨基酸或核苷酸坐标并且指定程序参数来运行程序。例如，一个参考序列可以使用以下参数与其他测试序列比较，来确定相同序列百分比关系：默认的gap权重(3.00)、默认的gag长度权重(0.10)和加权的末端gap。
84.另一个适于确定相同序列百分比和序列相似度的算法的例子是blast算法，该算法被altschul等公开(j.mol.biol.215:403-410(1990)，以引用的方式并入本文中)(亦可以参看zhang et al.,nucleic acid res.26:3986-90(1998)；altschul et al.,nucleic acid res.25:3389-402(1997)，以引用的方式并入本文中)。用于执行blast分析的软件可以通过国家生物技术中心网页公共获取。这一算法包括：首先通过识别查询序列中长度为w的短字(short word)，来识别高得分的序列对(hsps)，当其与数据库序列中长度相同的字词对齐时，能够匹配或满足某些正阀值的分数t。t被称为邻近字词分数阀值(altschul et al.,(1990),supra)。以这些初始的邻近字词命中(word hit)作为初始化搜索的起点，找到
包含它们的更长的hsps。这些字词命中随后沿着每一个序列从两个方向延伸至尽可能远，只要能使累积的对齐分数增加即可。当出现以下情况时停止延伸字词命中：累积对齐分数从其达到的最大值下降至数量x；由于一个或多个得分为负的残基对齐的累积，使累积对齐分数变成0或更小；或者到达任意一个序列的末端。blast算法参数w、t和x决定该对齐的敏感度和速度。blast程序使用的默认字词长度(w)为11，blosum62得分矩阵(参看henikoff和henikoff，proc.natl.acad.sci.usa89:10915-9(1992)，以引用的方式并入本文中)对齐(b)为50，期望值(e)为10，m＝5，n＝-4，以及比较两条链。
85.除了计算相同序列百分比之外，blast算法还进行两个序列之间相似度的统计分析(参看karlin和altschul,proc.natl.acad.sci.usa 90:5873-77(1993)，以引用的方式并入本文中)。blast算法提供的一种相似度的量度是最小概率和(p(n))，其指示了两个核苷酸或氨基酸序列之间可能意外匹配的概率。例如，如果测试氨基酸与参考氨基酸相比，最小概率和小于约0.1(更通常小于约0.01，最通常小于约0.001)，则认为该氨基酸序列与参考氨基酸序列相似。
86.本文所用的术语“变种”指不同于自然生成的多肽或核酸的多肽或核酸，其差别在于一个或多个氨基酸或核酸缺失、添加、替换或侧链修饰，但保持自然生成分子的一个或多个特定功能或生物活性。氨基酸替换包括用不同的自然生成氨基酸残基或非常规的氨基酸残基来替换氨基酸。这种替换可以归类为“保守的”，这时多肽中所含有的氨基酸残基被另一个具有相似特征(无论是关于极性、侧链功能还是大小)的自然生成的氨基酸所替代。本文所述的变种所包含的替换也可以是“非保守的”，这时肽中所存在的氨基酸残基被具有不同特性的氨基酸替代(例如使用丙氨酸替代带电氨基酸或疏水氨基酸)，又或者是自然生成的氨基酸被非常规氨基酸替代。当涉及多核苷酸或多肽时，术语“变种”还可以包含分别与参考多核苷酸或多肽相比(例如与野生型多核苷酸或多肽相比)的第一结构、第二结构或第三结构变种。lfn多肽的“变种”指在结构和功能上基本上与seq id no:3的多肽相似的分子，所述功能是介导、影响或促进相关的或融合的多肽跨过患者活细胞的细胞膜的运输的能力。在一些实施方式中，seq id no:3或seq id no:4的变种是本文所述的seq idno:3或4的片段，例如seq id no:5。
87.当与由seq id no:3编码的lfn蛋白相比，被用来参照lfn的变种或lfn的功能性衍生物时，术语“基本上相似”指特定目标序列(例如lfn片段或lfn变种或lfn衍生序列)与由seq id no:3编码的lfn多肽的序列有所不同，有一个或多个与seq id no:3相关的替换、缺失或添加，但保持seq id no:3的lfn蛋白所表现的至少50％的跨膜运输促进活性，优选保持得更高，例如至少60％、70％、80％、90％或更高。(已经被承认的是，lfn不会自然生成，引用到“原生”或“自然”的lf序列是为了表达该序列与自然生成的lf多肽(本文所指定的lfn)的一部分相同)。在确定多核苷酸序列时，所有能够编码基本相似的氨基酸序列的目标多核苷酸序列都被认为与参考多核苷酸序列相似，而不论密码子序列的不同。以下情况下认为核苷酸序列与给定的lfn核酸序列“基本上相似”：(a)该核苷酸序列与原生lfn序列的编码区杂交，或者(b)该核苷酸序列能够与seq id no:1编码的lfn的核苷酸序列在适度严格条件下杂交，并具有与原生lfn蛋白相似的生物活性；或(c)该核苷酸序列是与(a)或(b)中所定义的核苷酸序列相关的遗传密码退化的结果。基本上相似的蛋白与原生蛋白的相应序列相似度通常会大于约80％。
88.变种可以包括如下所述保守的或非保守的氨基酸变化。多核苷酸变化可以造成参考序列编码的多肽中的氨基酸替代、添加、缺失、融合和截断。变种也可以包括氨基酸的插入、缺失或替代，包括通常不会在作为变异基础的多肽序列中出现的氨基酸和其他分子的插入和替代，比如但不限于通常不在人类蛋白中出现的鸟氨酸的插入。“保守的氨基酸替代”由一个具有相似结构特性和/或化学特性的氨基酸替代另一个氨基酸而产生。提供功能性相似的氨基酸的保守性替换表在本领域中是公知的。例如，以下六个组中每一个都包含互为保守性替换的氨基酸：1)丙氨酸(a)，丝氨酸(s)，苏氨酸(t)；2)天冬氨酸(d)，谷氨酸(e)；3)天冬酰胺(n)，谷氨酰胺(q)；4)精氨酸(r)，赖氨酸(k)；5)异亮氨酸(i)，亮氨酸(l)，蛋氨酸(m)，缬氨酸(v)；和6)苯丙氨酸(f)，酪氨酸(y)，色氨酸(w)。(亦可参看creighton,proteins,w.h.freeman and company(1984))。
89.保守的氨基酸的选择可以根据肽中要替代的氨基酸的位置来决定。例如，该氨基酸是位于肽的外部并且暴露于溶剂，还是位于内部并且不暴露于溶剂。这些保守的氨基酸替代的选择属于本领域一般技术人员所掌握的技能，并且在例如dordo et al.,j.molbiol,1999,217,721-739和taylor et al.,j.theor.biol.119(1986)；205-218和s.french and b.robson,j.mol.evol.19(1983)171中都有描述。相应地，可以为位于蛋白或肽的外部的氨基酸(例如暴露于溶剂的氨基酸)选择保守的氨基酸替换。这些替换包括但不限于以下几种：用f替代y，用s或k替代t，用a替代p，用d或q替代e，用d或g替代n，用k替代r，用n或a替代g，用s或k替代t，用n或e替代d，用l或v替代i，用y替代f，用t或a替代s，用k替代r，用n或a替代g，用r替代k，用s、k或p替代a。
90.在可选的实施方式中，可以为位于蛋白或肽的内部的氨基酸(例如没有暴露于溶剂的氨基酸)选择合适的保守的氨基酸替换。例如，可以使用以下保守的替换：用f替换y，用a或s替换t，用l或v替换i，用y替换w，用l替换m，用d替换n，用a替换g，用a或s替换t，用n替换d，用l或v替换i，用y或l替换f，用a或t替换s以及用s、g、t或v替换a。在一些实施方式中，包括非保守的氨基酸替换的lf多肽也包含于术语“变种”之中。lfn多肽的变种，例如seq id no:3或4的变种意在指任何在结构(例如使用默认参数通过blastp分析，得出具有至少50％的同源性)和功能(例如与seq id no:3的多肽在跨膜运输中至少50％等效)上与seq id no:3或4的分子基本上相似的分子。
91.如本文所用，术语“非保守的”指用具有不同化学特性的不同氨基酸残基来替代氨基酸残基。非保守的替代的例子包括但不限于：天冬氨酸(d)被替换为甘氨酸(g)；天冬酰胺(n)被替换为赖氨酸(k)；以及丙氨酸(a)被替换为精氨酸(r)。
92.本文所用的术语“衍生物”指被化学修饰的肽，例如通过泛素化、标记化、聚乙二醇化(使用聚乙二醇衍生)或其他分子的添加。如果一个分子包括通常不属于该分子的一部分的化学基团，则该分子也是另一个分子的“衍生物”。这些基团能够提高分子的溶解性、吸收性、生物半衰期等。这些基团同样也能够降低分子的毒性，或者消除或减弱分子的不良副作用等。能够介导这些效果的基团在remington’s pharmaceutical sciences,18th edition,a.r.gennaro,ed.,mackpubl.,easton,pa(1990)中有描述。
93.与“衍生物”或“变种”配合使用时，术语“功能的”指具有生物学活性的蛋白分子，其与衍生物或变种的实体或分子的生物学活性基本上相似。本文“基本上相似”的意思是，相关多肽的生物学活性(例如跨膜运输)为参考多肽(例如相应的野生型多肽)的至少50％，
优选至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少100％或甚至更高(例如变种或衍生物的活性大于野生型)，例如110％、120％或更多。
94.在本文用来描述核酸分子的术语“重组体”的意思是指基因组的、cdna、病毒的、半合成的和/或人工合成的多核苷酸，它们由于其来源或处理，与与其本质相关的多核苷酸序列的全部或部分不相关。在涉及蛋白或多肽时使用的术语重组体，指由重组多核苷酸的表达而创建的多肽。涉及宿主细胞所使用的术语重组体，是指已经有重组多核苷酸引入的宿主细胞。涉及材料(例如细胞、核酸、蛋白或载体)时，重组体在本文中还被用来指该材料已经通过引入异源材料(例如细胞、核酸、蛋白或载体)而被修改过。
95.术语“载体”指能够将异源核酸的表达运输或介导至与宿主细胞连接的核酸分子。质粒是包含在术语“载体”中的属种的一个种类。术语“载体”通常指含有在宿主细胞中复制和/或维持所必须的复制来源和其他实体的核酸序列。能够将基因和/或核酸序列的表达导向至可操作地连接的载体在本文被称作“表达载体”。一般地，实用的表达载体通常是“质粒”的形式。“质粒”指圆形的双链dna分子，它们在载体形式下没有绑定到染色体，并通常包含用于稳定表达或瞬时表达或编码的dna的实体。能够被用在本文所述方法中的其他表达载体包括但不限于质粒、附加体、细菌人工染色体、酵母人工染色体、噬菌体或病毒载体，这些载体能够融入宿主的基因组或在特定细胞中自主复制。所述载体可以是dna或rna载体。也可以使用本领域技术人员所知的具有同等功能的其他形式的表达载体，例如自我复制外染色体载体或融入宿主基因组的载体。优选的载体是能够将核酸自主复制和/或表达至与其相连的物体的载体。
96.除了在操作实例中，或者另有说明，本文所使用的表示成分数量或者反应条件的所有数字在所有情况下都应理解为修饰有术语“约”。当连同百分比使用时，术语“约”可以指
±
1％。
97.除非上下文另外明确指出，单数术语“一”、“一个”和“所述”包括复数指代。相似地，除非上下文另外明确指出，词汇“或者”意在包括“和”。应该进一步理解的是，用于核酸或多肽的所有基本大小(base size)或氨基酸大小，以及所有分子量或分子质量值，都是近似值，并且都用于说明。与本文所述发明相似或等同的方法和材料可以被用于本发明的实践或测试之中，下文亦描述了合适的方法和材料。“等”在本文被用来指示非限制性的例子。因此，“等”与“例如”的意思相同。
98.疫苗组合物
99.本发明的一个方面涉及一种疫苗组合物，所述疫苗组合物包括lfn多肽和至少一种hiv抗原。在一些实施方式中，所述lfn多肽和hiv抗原被共价地连接成融合蛋白。在一个实施方式中，所述hiv抗原多肽(例如hiv抗原)结合到所述lfn多肽或其片段。在某些实施方式中，该交叉连接可以是共价键(例如作为融合蛋白)，在一些实施方式中，该交叉连接可以例如通过位于独立的整个hiv抗原的末端结构域的自由巯基来形成。形成这些结合的方法在美国专利号5,612,037中有描述，该专利的全文以引用的方式并入本文中。
100.在可选的实施方式中，lfn和hiv多肽抗原是非共价连接的，例如lf多肽可以与目标抗原形成非共价连接的复合物或者通过某些方式相连，例如形成lfn：hiv抗原复合物，其中lfn和hiv抗原通过共价键之外的力(例如范德华力、静电力等)相连。在本文所述的这个或其他方面的一些实施方式中，所述组合物包括lf多肽：hiv抗原复合物，其中lf多肽(例如
lfn)通过范德华力或其他非共价相互作用与目标抗原直接相连。在可选的实施方式中，所述组合物包括lf多肽：hiv抗原复合物，其中lf多肽(例如lfn多肽)与hiv抗原间接相连，例如通过lfn多肽与至少一个第三方实体或基团的相互作用，所述hiv抗原亦与所述第三方实体的单独的部分(与lf多肽相互作用的部分)相互作用。
101.在本文所述的这个或其他方面的一些实施方式中，所述组合物包括lf多肽或lfn多肽以及hiv抗原，其中lf多肽与目标抗原不是共价连接的，但是所述lf多肽与目标抗原通过某些方式非共价相连或复合。例如，形成lfn:hiv抗原复合物。在一些实施方式中，所述组合物包括lfn:hiv抗原复合物，其中所述lfn(或其片段或变种)通过范德华力或其他非共价相互作用与目标抗原直接相连。在可选的实施方式中，所述组合物包括lfn:hiv抗原复合物，其中所述lfn(或其片段或变种)与目标抗原间接相连，例如通过lfn(或其片段或变种)与至少一个第三方基团的相互作用，目标抗原和lfn多肽与同一个第三方基团相互作用。这些相互作用可以是熟练的技术人员所知的任何非共价键连接，例如但不限于，范德华力、亲水性相互作用、疏水性相互作用和其他非共价相互作用。在一些实施方式中，可以使用至少一个、或至少两个、或至少三个、或至少四个或更多的第三方实体来连接lfn(或其片段或变种)和hiv抗原。例如，本发明包括的组合物含有例如是lfn:基团:hiv抗原复合物，或lfn:基团:基团:hiv抗原复合物、lfn:基团:基团:基团:hiv抗原复合物等复合物。在一些实施方式中，与lfn相连的基团可以与绑定到hiv抗原的基团相同或不同，复合物中所有基团可以相同、也可以不同。
102.hiv抗原
103.还可以考虑的是，本文所述的疫苗组合物可以包括一个或多个所述的hiv抗原多肽。优选地，所述疫苗组合物至少包括lfn和至少一种hiv抗原多肽，该抗原多肽例如是p24、gag或其他hiv多肽，它们以任意组合共同地、或者单独地融合至lfn多肽。可以使用本领域一般技术人员普遍知晓的任意hiv多肽，它们包括(例如但不限于)，在美国专利7,067,134和7,067,134(其全文以引用的方式并入本文)的描述中用为疫苗的hiv抗原的多肽。在一些实施方式中，在本文所述的疫苗组合物中使用的hiv抗原可以来自任何逆转录病毒(包括hiv-1、hiv-2、siv、htlv-1)。在一些实施方式中，hiv抗原是选自hiv-1和hiv-2的人类免疫缺陷病毒多肽，所述逆转录病毒更优选hiv-1。在一些实施方式中，hiv抗原多肽可以是来自env的不同分支(可选env嵌合体)的组分，也可以是来自单个分支的gag-pol-(可选的)nef的组分。上述分支(clade)已在美国申请2008/0286306和2009/0227658(其全文以引用的方式并入本文)中公开。
104.在一些实施方式中，所述hiv抗原是包膜蛋白，可以任意选自gp41、gp120、gp160或其片段。可以使用其他hiv蛋白作为本文所述的疫苗组合物中的hiv抗原。例如，这些hiv蛋白包括但不限于：gag多肽、pol、蛋白酶、nef、vpr、vpu、tat1、tat2、逆转录酶、整合酶、vif等。
105.在一些实施方式中，hiv抗原多肽折叠成其原生构象。在一个实施方式中，hiv抗原多肽是多分子多肽复合物的一部分。在一个实施方式中，hiv抗原多肽是多分子多肽目标抗原的亚单元(subunit)多肽。
106.在一些实施方式中，hiv抗原可以是完整的(即整个或全部或完全)hiv抗原，其通过本文所述的非连接的或非共价连接的lf多肽传递到细胞的胞质溶胶中。“完整的”在本文
中意指所述hiv抗原是长度完整的目标抗原，与抗原多肽自然生成的情况相同。这与只传递目标抗原的一小部分或肽恰好相反。通过将完整的hiv抗原传递到细胞，所述lfn多肽能够完成或促进整个hiv抗原跨过细胞膜运输，以及在具有mhv i分子的复合物中显示所述完整目标抗原的表位的所有范围。再者，这也便于探测对整个目标抗原表位的所有范围做出的细胞介导免疫(cmi)反应，而非单个或选定的少数肽表位。cmi在t细胞(淋巴细胞)结合到其他细胞表面时发生，所述其他细胞显示抗原并触发反应(例如生成或释放细胞因子)。所述反应可以涉及其他淋巴细胞和任意其他白血细胞(白血球)。
107.相应地，与单独使用完整的目标抗原或目标抗原的一部分(即肽)相比，由于可以对整个抗原的基本上任意的表位提高cmi反应，所述包括hiv抗原和lfn多肽(与完整的hiv抗原非连接或非共价地连接)的疫苗组合物可以被用来使对完整目标抗原做出的cmi反应更强大和更强烈。
108.在一些实施方式中，完整的hiv抗原可以被划分成完整hiv抗原的片段或部分。例如根据该完整hiv抗原蛋白的大小，划分成至少2个、或至少3个、或至少4个、或至少5个或更多的hiv抗原片段。这些完整hiv抗原的片段可以被用作例如是质量控制，以过滤掉阳性cmi反应中的假阳性。仅仅作为例子的是，对整个hiv抗原的阳性cmi反应可以通过评估对hiv抗原一个板块的cmi反应来确定，所述板块是整个hiv抗原的片段。如果一个或两个片段给出阳性反应，而非全部片段都给出阳性反应，则可以判断是真正的cmi反应。如果对所有片段都探测到阳性cmi反应，则该阳性cmi反应很可能是假阳性。
109.在一些实施方式中，根据初始hiv抗原的大小，完整hiv抗原可以被划分成多个部分，以用作子hiv抗原的板块。通常地，如果整个hiv抗原是多聚体多肽，该整个hiv蛋白可以被划分成子单元和/或区域，其中的每一个都能够单独地与lf多肽混合并被用到本文所述的测定方法和组合物中。可选地，完整的hiv抗原可以被分为完整hiv抗原的片段或部分，例如分为至少2个、或至少3个、或至少4个、或至少5个、或至少6个、或至少7个、或至少8个、或至少9个、或至少10个、或至少11个、或至少12个、或至少13个、或至少15个、或至少20个、或至少25个、或25个片段以上，并且每个片段单独地或组合地与lf多肽混合，以用到本文所述的测定方法和组合物中。
110.全长hiv抗原多肽的片段或分块可以是该全长hiv抗原多肽的平均划分，或者可选地，在一些实施方式中，该片段是不对称或不平均的。作为一个非限制性例子，在hiv抗原被分为两个重叠片段的情况下，hiv抗原可以被分成大小几乎相同(平均)的片段，或者可选地，一个片段可以是整个hiv抗原的约45％，而另一个片段可以是约65％。作为进一步的非限制性例子，整个hiv抗原可以被分成不同大小的片段的组合。例如，在hiv抗原被分为两个片段的情况下，这些片段可以被分成整个hiv抗原的约40％和约70％、或者约45％和约65％、或者约35％和约75％、或者约25％和约85％。全长完整hiv抗原的重叠片段的任意组合都被包含来用于生成hiv抗原板块。可以组合多个hiv抗原，例如，所述hiv env、gag和pol组合形成空的hiv衣壳。这些多肽可以以多个组合和任意组合和全部组合的形式被放在一起。仅作为示例性例子的是，在hiv抗原被分成5个部分的情况下，所述部分可以被平均划分(即每个重叠片段都占hiv抗原的完整长度的约21～25％)或者不平均划分(即hiv抗原可以被分成以下5个重叠片段：在每个片段都与至少一个其他片段重叠的情况下，片段1约占全长hiv抗原大小的25％，片段2约占5％，片段3约占35％，片段4约占10％，片段5约占25％)。
111.作为肽的hiv抗原(即其任意长度为6个残基至20个残基之间)能够通过非连接的lf多肽传递。多肽亦可以作为支链结构而合成，这些支链结构例如是在美国专利5,229,490和5,390,111(其以引用的方式并入本文中)中公开的。抗原多肽包括例如合成的或重组的b细胞和t细胞表位、通用t细胞表位，以及一个有机体或疾病中的t细胞表位和另一个有机体或疾病中的b细胞表位的混合。
112.如上所述，hiv抗原可以通过重组方法或肽合成来获得。其他来源包括自然来源或提取物。在任何情况下，所述抗原可以通过抗原的物理特征或化学特征来纯化，优选通过分馏或色谱法纯化(janson&ryden,1989；deutscher,1990；scopes,1993)。
113.在一些实施方式中，本文所述的疫苗组合物包括多价hiv抗原，例如在一个以上的hiv抗原与lfn多肽相连的情况下，以同时诱发一个以上的hiv抗原的免疫反应，所述抗原例如hiv env、gag、pol和nef肽的任意组合和所有组合。可以使用轭合物来诱发多个hiv抗原的免疫反应，也可以用来促进免疫反应，或者两者同时进行。
114.lfn
115.本发明的一个方面涉及一种治疗性组合物，以增强(例如有效提高)用于治疗带hiv患者的常规hiv抗逆转录病毒治疗。该疫苗的开发被认为对控制获得性免疫缺陷综合症(aids)的传染是非常有用的。这样的组合物应该引起细胞毒性t淋巴细胞(ctl)。这可以通过免疫原性肽或来自感染因子的肽的免疫来获得。但是，在人类免疫缺陷病毒(hiv)的情况下，这些方法并没有成功。猕猴中已经表示出了通过中和抗体来同时针对静脉和阴道的类人猿人类免疫缺陷病毒(shiv)进行保护(parren,2001；mascola,2000；shibata,1999)。
116.在本文中，发明人证明了hiv抗原和lfn的共同施用能够诱发hiv肽的ctl反应。在一些实施方式中，hiv肽和lfn是融合蛋白，而在一些实施方式中，hiv肽和lfn相互复合(非共价地连接)。
117.炭疽杆菌是动物和人类中炭疽的的病原体。炭疽杆菌产生的毒素由两个二分蛋白质毒素组成，即致命毒素(lt)和水肿毒素。lt由保护性抗原(pa)和致死因子(lf)组成，而水肿毒素由pa和水肿因子(ef)组成。炭疽杆菌lf的氨基酸末端结构域被称为lfn。它是lf的n末端的255个氨基酸。已经发现lf含有结合至保护性抗原(pa)并介导转运所必须的信息。该结构域本身不具有致死的可能，其依赖于近似于酶的羧基末端基团(arora&leppla 1993,j.biol.chem.,268:3334-3341)。
118.lf的炭疽致死因子是由genbank登录号m29081(gene id no:143143)编码的蛋白，该蛋白由炭疽杆菌自然产生并具有mapkk蛋白酶活性。所述基因编码的炭疽杆菌lf是809个氨基酸的多肽，而成熟的炭疽杆菌lf是n末端前导肽分裂后形成的796个氨基酸的多肽。lf的缺失分析表示，pa结合域位于lfn的氨基末端之中。突变研究证明了pa结合域位于seq id no:1的lf多肽的34～288氨基酸的区域中，还位于seq id no:2的lf多肽的1～254氨基酸的区域中(arora et al.,j.biol.chem.268:3334 3341(1993)；milne,et al.,(1995)mol.microbiol.15,661
–
66)。lf的三维原子分辨率结构已经由x-射线晶体获得。pannifer等在nature vol.414,pg.229-233(2001)中描述了lf的晶体结构，以及其与代表其原生底物的n末端的16-氨基酸残基(16-mer)肽形成的复合物mapkk-2。mapkk-2作为蛋白含有以下四个结构域：结构域i结合炭疽毒素的膜转运组分和保护性抗原(pa)；结构域ii、iii和iv共同形成长而深的沟槽，该沟槽在分裂前保留着mapkk-2的16-残基n末端结尾。结构域i位于
其他三个结构域的顶部，它们是紧密相连的并且包括单独的折叠单元。结构域i和该分子的其余部分唯一接触的地方是结构域ii，这主要涉及带电极性和水介导的相互作用。接口的性质与重组的n末端片段(残基1-254，除了信号肽之外)的能力一致，该片段被表达为可溶性折叠域，该折叠域保持结合pa的能力并使异源融合蛋白能够转运到胞质溶胶内(ballard,j.d,et.al.,1996,proc.natl acad.sci.usa 93,12531-12534；goletz,t.j.et al.,1997,proc.natl acad.sci.usa 94,12059-12064)。再者，lfn的最前面36个残基的缺失对其结合至pa或lf以及跨膜转运的能力没有影响(d.borden lacy et al.,2002,j.biol.chem.,277:3006-3010)。结构域i由12-螺旋的束组成，该束针对混合的4链β折叠的一个面包合，并在该折叠的远端面上形成瓣(flap)的第二链和第三链之间具有大的(30-残基)有序循环l1(参看图1)。结构域i上对pa的准确停泊位点是未知的，但是该折叠域的完整性看起来是需要的，因为结构域i中隐蔽残基的一系列插入和点突变想必会破坏该折叠，从而取消pa和毒素的结合(quinn,c.p.,et.al.,1991,j.biol.chem.,266:20124-20130；gupta,p.,et.al.,2001,biochem.biophys.res.comm.,280:158-163)。另外，lfn已经被证实在不存在pa的情况下，将外源蛋白抗原传递到b细胞、ctl细胞和巨噬细胞的胞质溶胶中的主要组织相容性复合i类通道(huyen cao,et.al.,2002,the journal of infectious diseases；185:244
–
251；n.kushner,et.al.,2003,proc natl acad sci u s a.100:6652
–
6657)。lfn融合蛋白的独立于pa的lfn传递依赖于功能性运输相关的蛋白，该蛋白用于细胞内抗原处理和传输至内质网，以结合至mhc i类分子。
119.位于结构域i最后一个螺旋的末端的急转弯直接通向结构域ii的第一个螺旋(残基263-297和385-550)。虽然基于序列的比较没有产生任何同源性，但与蜡样芽胞杆菌(b.cereus)毒素vp2(protein data bank登陆代码1qs2)相比具有非常显著的结构相似性。结构域ii和vip2以的rmsd和15％的序列相同性叠合，该数值由dali测得(holm,l.&sander,1997,nucleic acids res.25,231-234)。vip2含有nad结合口袋和参与nad结合和催化的保守的残基。结构域ii缺少这些保守的残基；并且，在整个adp核糖基化毒素家族中都是保守的(carroll,s.f.&collier,r.j.,1984,proc.natl acad.sci.usa 81,3307-3311)关键的谷氨酸被赖氨酸(k518)替代。因此可以推断结构域ii不具有adp核糖基化活性。
120.结构域iii是一个具有疏水核心(残基303-382)的小型α-螺旋束，其被插入到结构域ii的第二螺旋和第三螺旋之间的转弯处。序列分析发现其中存在包括5个串联反复(残基282-382)的101残基段，并暗示反复2-5起源于反复1的复制。晶体结构显示，反复1实际上形成结构域ii的第二螺旋转弯元素，而反复2-5形成螺旋束的4个螺旋转弯元素，这揭示了通过父域的一个段的反复复制来生成新的蛋白结构域的机理。结构域iii是lf活性所必须的，因为这个结构域中隐藏残基的插入突变和点突变会使功能消失(quinn,c.p.,et.al.,1991,j.biol.chem.266,20124-20130)。结构域iii与结构域ii有限地接触，但是与结构域iv共享一个疏水性表面。其位置使得通过潜在的底物(例如球状蛋白的循环)严格限制对活性位点的进入；也就是说，它促进了蛋白底物的灵活的“尾部”的特异性。它还通过与底物形成特定的相互作用来促进序列特异性。
121.结构域iv(残基552-776)由相对于4链折叠包合的9-螺旋束组成。序列比较没有探测到任何与除hexxh基序之外的结构已知的其他蛋白的同源性。三维结构显示，β-折叠和最
先的6个螺旋可以与131个残基的rmsd为的金属蛋白酶嗜热菌蛋白酶的相应部位相叠合。大型的插入和缺失发生在连接这些元素的循环中的其他地方，因此该结构域的整个形状是相当不同的。特别地，插入到折叠的链42和43之间的大型有序循环(l2)部分掩盖了活性位点，针对结构域ii包合，并为结构域iii提供支撑。
122.锌离子(zn
2
)以嗜热菌蛋白酶家族典型的设置方式四面体地整合有一个水分子和三个蛋白侧链。正如所料，其中两个整合残基是来自hexxh基序(his 686和his 690)的位于螺旋(44)上的组氨酸。其结构显示，第三整合残基是来自螺旋46的glu 735。来自hexxh基序的glu 687位于离水分子687位于离水分子之处，其位置被设置成作为催化期间激活锌合水的广义碱(general base)。酪氨酸残基(tyr 728)的羟基基团在glu 687的相反一侧形成与水分子的强力氢键(o
–
o距离)，并可能作为使胺离去基团质子化的催化酸。
123.所述基因编码的809氨基酸多肽炭疽杆菌lf具有位于天冬酰胺位点62、212、286、478、712、736和757的7个潜在的n-糖基化位点。在lfn(1-288)之内，在天冬酰胺位点62、212和286具有3个潜在的n-糖基化位点，每一个都具有》0.51的潜力，该数值根据丹麦技术大学的netnglyc 1.0prediction软件测得。netnglyc服务器使用检查asn-xaa-ser/thr序列子(sequon)序列内容的人工神经网络来预测蛋白中的n-糖基化位点。
124.根据丹麦技术大学的netoglyc 3.1prediction软件，没有预测到基因编码的809-aa多肽炭疽杆菌lf具有任何o-糖基化位点。netoglyc服务器生成蛋白中粘蛋白型galnaco-糖基化位点的神经网络预测。
[0125]“lfn多肽”包括由seq id no:3和4代表的lf多肽片段、重组的lfn和功能性lfn，以及保持有将lfn融合hiv抗原多肽传递到完整细胞(优选活细胞)的胞质溶胶的功能的片段和变种。术语“lfn多肽”因此包括功能性lfn同源物，例如多态的变种、等位基因、突变体和密切相关的种间变种。如使用本文所述实验来确定的，这些种间变种与lfn至少具有约60％的氨基酸序列相同性以及将融合的多肽hiv抗原传递至细胞的胞质溶胶的功能。在特定的实施方式中，所述lfn多肽基本上和本文所述的seq id no:3和seq id no:4的lfn相同。在其他实施方式中，所述lfn多肽是本文所述的seq id no:3和seq idno:4的lfn的保守的替代突变体。如使用本文所述实验所确定的，这些lfn的保守的替代突变体还可以作用来将融合的多肽hiv抗原传递至细胞的胞质溶胶。在一些实施方式中，lfn的一些功能性多态的变种、等位基因、突变体和密切相关的种间变种作用来将hiv抗原多肽传递至完整细胞，它们可以由美国专利申请10/473,190(以引用的方式合并入本文中)所公开的方法和实验来确定。
[0126]
在一些实施方式中，对本文所述方法和治疗性组合物有用的所述疫苗组合物包括lfn的片段，该片段约250个氨基酸或更少、或者约150个氨基酸或更少、或者约104个氨基酸或更少。它能够将融合的hiv抗原传递至细胞，并且在本文所述方法和组合物中有作用。
[0127]
在一个实施方式中，所述治疗性组合物包括lfn多肽，所述多肽包括对pa的非功能性结合位点，因此是不能与pa形成功能性结合的lfn的突变体。这些突变体包括但不限于，在一个或多个对与pa的相互作用是关键的残基上作出改变的突变体，例如是以下残基中的一个或多个的突变：y22；l188；d187；y226；l235；h229(参看lacy et al.,j.biol.chem.,2002；277；3006-3010)；d106a；y108k；e135k；d136k；n140a和k143a(参看melnyk et al.,j.biol.chem.,2006；281；1630-1635和cunningham et al.,pnas,2002；99；70497052，其全
文以引用的方式合并入本文中)。
[0128]
在一个实施方式中，如本文所述的治疗性组合物包括lfn多肽或其片段。在一些实施方式中，如本文所述的治疗性组合物包括具有lfn多肽或其片段的至少34-288残基的片段。所述lfn多肽可以是n末端(lfn)多肽，或者其保守的替代变种，它能够促进对完整细胞的胞质溶胶的跨膜转运。炭疽杆菌lf多肽的氨基末端结构域被称作lfn。lf结合至保护性抗原(pa)并且介导跨过细胞膜的转运。lfn本身不具有致死可能，其依赖于近似于酶的羧基末端基团(arora&leppla 1993,j.biol.chem.,268:3334-3341)。由于不想被理论束缚，lf多肽(单独的或融合的)被认为作用来介导细胞膜转运。已经证明的是，即使在不存在pa的情况下，具有外来抗原的lfn结构域的融合蛋白可以诱导cd8 t细胞免疫反应(kushner,et.al.2003,pnas,100:6652-6657)。所述lfn多肽包括lf多肽的1-288氨基酸残基，并且能够在没有炭疽杆菌保护性抗原(pa)的情况下穿越细胞膜。1-288氨基酸包括n末端前导序列。此外，当第二个蛋白被连接到lfn或lf多肽时，该第二个蛋白亦会连同lfn或lf多肽被跨过细胞膜转运至胞质溶胶内。因此，lfn可以在没有pa的情况下被用作进入胞质溶胶的传递载体。因此所述lfn或lf多肽能够促进或提高其他蛋白的跨膜转运。
[0129]
在一个实施方式中，本文所述的治疗性组合物可以包括糖基化蛋白。换句话说，每一个所述lfn和/或hiv蛋白都可以是糖基化蛋白。在本文所述的治疗性组合物的一个实施方式中，单独的或融合的多肽是o-连接糖基化的。在本文所述的组合物的另一个实施方式中，单独的或融合的多肽是n-连接糖基化的。在本文所述的组合物的又一个实施方式中，单独的或融合的多肽是同时o-连接糖基化和n-连接糖基化的。在其他实施方式中，其他类型的糖基化也是可能的，例如c-甘露糖化。在本文所述的组合物的一个实施方式中，所述lfn多肽是n-糖基化的。蛋白的糖基化主要发生在真核細胞中。n-糖基化对于一些真核蛋白的折叠来说是重要的，它提供了共转运和后转运修饰机制，该机制调节细胞膜和分泌蛋白的结构和功能。糖基化是连接糖类以产生聚糖并将它们连接至蛋白和脂质的酶解过程。在n-糖基化中，聚糖在蛋白质翻译期间被连接到天冬酰胺侧链的酰胺氮。形成聚糖的三个主要糖类是葡萄糖、甘露糖和n-乙酰葡糖胺分子。该n糖基化共同体(consensus)是asn-xaa-ser/thr，其中xaa可以是任何已知的氨基酸。o-连接糖基化发生在蛋白质处理期间的较后阶段，大概在高尔基体中。在o-连接糖基化中，n-乙酰-半乳糖胺、o-岩藻糖、o-葡萄糖和/或n-乙酰葡糖胺被添加到丝氨酸或苏氨酸残基。本领域技术人员可以使用生物信息学软件(例如丹麦技术大学的netnglyc 1.0和netoglyc prediction软件)来寻找本发明的多肽的n-糖基化和o-糖基化位点。netnglyc服务器使用检查asn-xaa-ser/thr序列子序列内容的人工神经网络来预测蛋白中的n-糖基化位点。netnglyc 1.0和netoglyc 3.1prediction软件可以从expasy网点进入。在一个实施方式中，n-糖基化发生在本文所述融合多肽的hiv抗原多肽之中。
[0130]
在另一个实施方式中，n-糖基化发生在本文所述融合多肽的lfn多肽之中，例如，在天冬酰胺位点62、212和/或286，其中的全部都具有》0.51的潜力，该数值根据netnglyc 1.0prediction软件测得。本发明的融合多肽中的n-糖基化的各种组合都是可能的。在一些实施方式中，本文所述的单独的或融合的多肽在如下三个位点的其中一个上发生单独的n-糖基化：lfn的天冬酰胺位点62、212和286。在其他实施方式中，本文所述的单独的或融合的多肽在以下三个位点的两个上发生n-糖基化：lfn的天冬酰胺位点62、212和286。在另一个
实施方式中，本文所述的单独的或融合的多肽在以下三个位点上发生n-糖基化：lfn的天冬酰胺位点62、212和286。在又一个实施方式中，n-糖基化同时发生在hiv抗原多肽(hiv p24抗原)和lfn多肽。在一些实施方式中，本文所述的单独的或融合的多肽的聚糖被修饰，例如唾液酸化或去唾液酸化。蛋白的糖基化分析在本领域是已知的，例如通过聚糖水解(使用n-糖苷酶f、endos糖类内切酶、唾液酸酶等酶或使用4n三氟乙酸)、衍生化和色谱分离(例如lc-ms或lc-ms/ms(pei chen et.al.,2008,j.cancer res.clin.oncology,134:851-860；kainz,e.et.al.,2008,appl.environ.microbiol.,74:1076-1086))。预测到lfn不具有任何潜力》0.50的o-连接糖基化位点。
[0131]
在一个实施方式中，所述完整细胞是具有未破损的、没有瑕疵的细胞质膜的活细胞。活细胞通常在细胞膜上具有已定义的不同的膜电位，相对于细胞外侧，细胞内侧的膜电位为负。在一个实施方式中，所述完整细胞是哺乳动物细胞，包括例如是抗原呈递细胞。
[0132]
虽然lf多肽的n末端氨基酸残基1-288(即晶体结构的结构域i，pannifer et.al.,2001,nature414:229-233)的全部都促进其他蛋白的跨膜转运，应该理解的是，结构域i的更小的片段可以被用在本文所述的组合物中，并且当它与hiv蛋白结合成融合多肽时，足够于跨细胞膜转运hiv抗原并促进hiv蛋白的跨膜转运。lf的结构域i的x射线晶体结构显示了12个α螺旋和4个β折叠二次蛋白结构(pannifer et.al.,2001,supra)。保留有结构域i的这些α螺旋和/或β折叠二次蛋白结构的结构域i的更小片段能够跨细胞膜转运，并在结合成融合多肽时促进其他蛋白的跨膜转运。本领域的技术人员可以使用本领域已知的方法(例如圆二色谱(cd))来确定融合多肽的lfn多肽中α螺旋和β折叠二次蛋白结构的存在。
[0133]
在一个实施方式中，本文所述组合物的lfn多肽包括seq.id.no.3的至少60个羧基末端氨基酸或其保守的替代变种。在一个实施方式中，本文所述组合物的lfn多肽基本上由seq.id.no.3的60个羧基末端氨基酸或其保守的替代变种组成。在一个实施方式中，本文所述组合物的lfn多肽由seq.id.no.3的60个羧基末端氨基酸或其保守的替代变种组成。
[0134]
在一个实施方式中，本文所述组合物的lfn多肽包括seq.id.no.3的至少80个羧基末端氨基酸或其保守的替代变种。在一个实施方式中，本文所述组合物的lfn多肽基本上由seq.id.no.3的80个羧基末端氨基酸或其保守的替代变种组成。在一个实施方式中，本文所述组合物的lfn多肽由seq.id.no.3的80个羧基末端氨基酸或其保守的替代变种组成。
[0135]
在一个实施方式中，本文所述疫苗组合物的lfn多肽包括seq.id.no.3的至少104个羧基末端氨基酸或其保守的替代变种。在一个实施方式中，本文所述疫苗组合物的lfn多肽基本上由seq.id.no.3的104个羧基末端氨基酸或其保守的替代变种组成。在一个实施方式中，本文所述疫苗组合物的lfn多肽由seq.id.no.3的104个羧基末端氨基酸或其保守的替代变种组成。
[0136]
在一个实施方式中，本文所述组合物的lfn多肽包括对应于seq.id.no.5的氨基酸序列或其保守的替代变种。在一个实施方式中，本文所述组合物的lfn多肽基本上由对应于seq.id.no.5的氨基酸序列或其保守的替代变种组成。在一个实施方式中，本文所述组合物的lfn多肽由对应于seq.id.no.5的氨基酸序列或其保守的替代变种组成。
[0137]
在一个实施方式中，本文所述组合物的lfn多肽包括对应于seq.id.no.4的氨基酸序列或其保守的替代变种。在另一个实施方式中，本文所述组合物的lfn多肽基本上由对应于seq.id.no.4的氨基酸序列或其保守的替代变种组成。在又一个实施方式中，本文所述组
合物的lfn多肽由对应于seq.id.no.4的氨基酸序列或其保守的替代变种组成。
[0138]
在一个实施方式中，本文所述组合物的lfn多肽包括对应于seq.id.no.3的氨基酸序列或其保守的替代变种。在另一个实施方式中，本文所述组合物的lfn多肽基本上由对应于seq.id.no.3的氨基酸序列或其保守的替代变种组成。在又一个实施方式中，本文所述组合物的lfn多肽由对应于seq.id.no.3的氨基酸序列或其保守的替代变种组成。
[0139]
在一个优选的实施方式中，本文所述组合物的lfn多肽促进hiv抗原的跨膜转运。
[0140]
在一个实施方式中，本文所述组合物的lfn多肽没有结合炭疽杆菌保护性抗原(pa)蛋白。pa蛋白是lf的原生结合配体，形成二分蛋白质毒素-致死毒素(lt)。所述pa蛋白是735-氨基酸多肽，是结合至细胞表面受体、介导复合物的组装和内在化并将它们传递到宿主细胞核内体的多功能蛋白。一旦pa连接到宿主受体，在其能够结合到lf之前就会被宿主细胞表面(弗林家族)蛋白酶裂解。pa的n末端的裂解使得c末端片段能够自由连接到环状七聚体复合物(prepore)，该复合物能够结合lf并将lf传递进胞质溶胶。所述n末端片段(残基1-288，结构域i)能够被表达为可溶性折叠域，其维持了结合pa的能力并且使异源融合蛋白能够转运进胞质溶胶。该残基1-288n末端片段已经被证明还可以在不存在pa的情况下将异源融合蛋白转运入胞质溶胶。因此，在一个实施方式中，本文所述的更小片段能够在不结合pa的情况下跨细胞膜转运。
[0141]
在一个实施方式中，本文所述组合物的lfn多肽基本上缺失seq.id.no.3的氨基酸1-33。seq.id.no.3的氨基酸1-33包含信号肽，该信号肽被预测为引导lf蛋白的翻译后运输。在一些实施方式中，本文所述的任何融合多肽的lfn多肽都缺失能够引导融合多肽的翻译后运输的信号肽。在其他实施方式中，本文所述融合多肽的lfn多肽包括用于在er上共翻译的信号肽。该信号肽又被称为n末端的前导肽，它可以在翻译之后通过er膜被切掉，也可以不被切掉。信号肽的一个例子是mapfeplasgillllwliapsra(seq.id.no.17)。信号肽的其他例子可以在spdb上找到。spdb是一个信号肽数据库，可以在网址http://proline.bic.nus.edu.sg/spdb/上找到。
[0142]
在一些实施方式中，lfn类似物在本文所述组合物和方法中是有用的。“lfn类似物”指与lfn一样能够将目标抗原传递到细胞的胞质溶胶以诱导抗原的cmi反应的化合物或分子(例如肽、多肽或小化学分子)。因此lfn类似物包括lfn同系物。lfn类似物还包括保留有lfn的将多肽抗原(不与lfn类似物连接)传递到细胞的胞质溶胶的功能的小lfn肽及其保守的替代变种，以及保留有lfn的将多肽抗原(不与lfn类似物连接)传递到细胞的胞质溶胶的能力的lfn截断版本。lfn类似物可以使用本文及美国专利申请10/473,190(其全文以引用的方式合并入本文中)的例子所公开的、用于目标抗原的cmi反应的试验来测试，例如，诱导已传递的目标抗原的ctl反应。当测试lfn类似物时，lfn通常被用作将目标抗原传递到细胞的阳性对照。
[0143]
常规的抗逆转录病毒治疗
[0144]
在一些实施方式中，可以在常规抗逆转录病毒治疗的连续给药期间施加本文所述的治疗性组合物。在一些实施方式中，可以在停止常规抗逆转录病毒治疗的连续给药之后立即施加本文所述的组合物。
[0145]
在一些实施方式中，可以在一种常规抗逆转录病毒治疗的连续给药期间的一个精确时间点施加本发明所述的组合物，并且在施加所述组合物后的一段预定时间之后，可以
将常规抗逆转录病毒治疗的连续给药停止一段时间。在一些实施方式中，可以将常规抗逆转录病毒治疗停止1天或一个星期以上，例如至少2个星期、或者至少约3个星期、或者至少约4个星期、或者4个星期以上。在一些实施方式中，当重新开始常规抗逆转录病毒治疗后，可以对患者施用相同的或不同的连续性抗逆转录病毒治疗。
[0146]
抗逆转录病毒治疗在本领域是公知的，并且包含在本文所述的方法的使用中。例如，本领域公知的多种抗病毒化合物可以包括在根据本发明的联合治疗之中。适于与本文公开的组合物联合使用的常规抗逆转录病毒化合物包括细胞(例如干细胞治疗)、核酸、多肽以及其他活性剂，这些活性剂包括但不限于hiv蛋白酶抑制剂、核苷类hiv逆转录酶抑制剂、非核苷类hiv逆转录酶抑制剂和hiv整合酶抑制剂。
[0147]
核苷类hiv逆转录酶抑制剂的例子包括3'-叠氮-3'-脱氧胸苷(齐多夫定，也被称为azt和retrovir.rtm.)、2',3'-二脱氢-3'-脱氧胸苷(司他夫定，也被称为2'，3'-二氢-3'-脱氧胸苷、d4t和zerit.rtm.)、(2r-顺式)-4-氨基-1-[2-(羟基甲基)-1,3-嘿噻烷-5-基]-2(1h)-嘧啶酮(拉米夫定，也被称为3tc和epivir.rtm.)，以及2'，3'-双脱氧肌苷(ddi)。
[0148]
非核苷类hiv逆转录酶抑制剂的例子包括(-)-6-氯-4-环丙基乙炔基-4-三氟甲基-1,4-二氢-2-h-3,1-苯并恶嗪-2-酮(依法韦仑，也被称为dmp-266或sustiva.rtm.)(参看美国专利号5,519,021)、1-[3-[(1-甲基乙基)氨基]-2-吡啶基]-4-[[5-[(甲磺酰基)氨基]-1h-吲哚-2-基]羰基]哌嗪(地拉夫定，参看pct国际专利申请号wo91/09849)，以及(1s,4r)-顺式-4-[2-氨基-6-(环丙氨基)-9h-嘌呤-9-基]-2-环戊烯-1-甲醇(阿巴卡韦)。
[0149]
蛋白酶抑制剂的例子包括[5s-(5r*,8r*,10r*,11r*)]-10-羟基-2-甲基-5-(1-甲基乙基)-1-[2-(1-甲基乙基)-4-噻唑基]-3,6-二氧代-8,11-双(苯基甲基)-2,4,7,12-四氮杂-正十三烷基-13-羧酸-5-噻唑基甲基酯酸(利托那韦，由abbott作为norvir.rtm.销售)、[3s-[2(2s*,3s*),3a,4ab,8ab]]-n-(1,1-二甲基乙基)十氢-2-[2-羟基
‑‑
3-[(3-羟基-2-甲基苯甲酰基)氨基]-4-(苯硫基)丁基]-3-异喹啉基-甲酰胺甲磺酸盐(奈非那韦，由agouron作为viracept.rtm.销售)、n-(2(r)-羟基-1(s)-二氢化茚基)-2(r)-苯甲基-4-(s)-羟基-5-(1-(4-(2
‑‑
苯并[b]呋喃基甲基氨基)-2(s)
‑‑
n(叔丁基甲酰胺基)-哌嗪基))-戊酰胺(参看美国专利号5,646,148)、n-(2(r)-羟基-1(s)-二氢化茚基)2(r)-苯甲基-4-(s)-羟基-5-(1-(4-(3-吡啶甲基)-2(s)
‑‑
n'-(叔丁基甲酰胺基)-哌嗪基))-戊酰胺(茚地那韦，由merck作为crixivan.rtm.销售)、4-氨基-n-((2顺,3s)-2-羟基-4-苯基-3-((s)-四氢呋喃-3-苄氧羰基氨基)-丁基)-n-异丁基-苯磺酰胺(安普那韦，参看美国专利号5,585,397)，以及n-叔丁基-十氢-2-[2(r)-羟基-4-苯基-3(s)
‑‑
[[n-(2-喹啉基羰基)-l-天冬酰胺]氨基]丁基]-(4as,8as)-异喹啉-3(s)-甲酰胺(沙奎那韦，由roche laboratories作为invirase.rtm.销售)。
[0150]
合适的hiv整合酶抑制剂的例子在美国专利号6,110,716、6,124,327和6,245,806中有公开，该专利以引用的方式并入本文中。
[0151]
此外，在例如美国申请号6,017,536中公开的抗膜融合肽也可以包括在根据本发明所述的联合治疗中。这些肽通常由猿猴免疫缺损病毒(siv)蛋白的16-39氨基酸区域组成，并且通过能够识别allmoti5,107
×
178
×
4或plzip氨基酸基序的计算机算法来鉴定。参看美国专利号6,017,536，其以引用的方式并入本文中。
[0152]
在一些实施方式中，所述常规的抗逆转录病毒治疗包括联合治疗，它是指两种或以上的抗逆转录药物或活性剂相结合的连续给药，所述活性剂例如是hiv蛋白酶抑制剂、核苷类hiv逆转录酶抑制剂、非核苷类hiv逆转录酶抑制剂和hiv整合酶抑制剂。在这种联合治疗中，可以在同一药物组合物中施加两种或以上的抗hiv剂，也可以分别施加。因此，本发明还包含本文所述组合物的组合物使用，以使联合治疗可以如上述地暂停或间歇性停止。
[0153]
例如，作为联合治疗的常规抗逆转录病毒治疗是本领域一般技术人员所熟知的。例如，它们包括但不限于：替诺福韦(tenofovir)，它是最近在美国被批准的新的核苷酸逆转录酶抑制剂，与其他抗逆转录剂结合用来治疗hiv-1感染。核苷酸类似物与核苷类似物非常相似，但前者是预磷酸化的，因此需要由主体进行的处理较少。替诺福韦df(替诺福韦酯)在美国专利号5,935,946、5,922,695、5,977,089、6,043,230和6,069,249中有描述，而pmpa或替诺福韦df在美国专利号4,808,716、5,733,788和6,057,305中有描述，这些专利的全文都以引用的方式并入本文中。相似地，us2004/0224917描述了替诺福韦df和恩曲他滨的组合。其他各种抗逆转录病毒药物组合也已经可用来避免hiv耐药菌株的发展以及制定联合治疗方案。其中一个例子是合成核苷类似物拉米夫定(150mg)和齐多夫定(300mg)的组合，这作为glaxosmithkline的是可以商业获得的。另一个这样的组合是核苷类似物阿巴卡韦和拉米夫定的组合，这在glaxo的专利申请号wo 03/101467(其全文以引用的方式并入本文中)中有描述。拉米夫定(亦被称为3tc)及其在病毒感染的治疗和预防中的应用在美国专利号5,047,407(其全文以引用的方式并入本文中)中有描述。拉米夫定及其针对hiv的应用在wo 91/17159和ep0382526(其全文以引用的方式并入本文中)中有描述。拉米夫定的结晶形式在wo 92/21676(其全文以引用的方式并入本文中)中有描述。拉米夫定和其他核苷逆转录酶抑制剂(特别是齐多夫定azt)的组合在wo 92/20344、wo 98/18477和wo/9955372(其全文以引用的方式并入本文中)中有描述。
[0154]
抗逆转录病毒治疗还包括多种非核苷类逆转录酶抑制剂(nnrtis)，已知例如是地拉夫定、卡普韦林(capravirine)、依法韦仑和奈韦拉平。nnrtis是治疗未服用抗逆转录病毒的hiv感染患者的通用组合物，并与核苷逆转录酶抑制剂形成协同作用。依法韦仑的化学名称是(s)-6-氯-4-环丙基乙炔基-1,4-二氢-4-三氟甲基-2h-3,1-苯并恶嗪-2-酮。依法韦仑是hiv-1特异性的非核苷逆转录酶抑制剂。依法韦仑对hiv的治疗有用，并且已经被报道来抑制体内hiv的繁殖。依法韦仑从bristol-myers squibb co可以商业获取，其名称是用于治疗hiv，并且在例如美国专利号5,519,021、5,663,1699、5,811,423和6,238,695(其全文以引用的方式并入本文中)中有描述。奈韦拉平，化学名为11-环丙基-5,11-二氢-4-甲基-6氢-双吡啶-[3,2-b:2’,3
’‑
e][1,4]二氮杂卓-6-酮，是非核苷类逆转录酶抑制剂。奈韦拉平和相关化合物的治疗性应用及其制备方法在美国专利号5,366,972(其以引用的方式并入本文中)中有描述。奈韦拉平可以以200mg片剂及50mg/5ml(共240ml)口服混悬液的形式商业获取。它的销售名称是
[0155]
其他抗逆转录病毒药物在美国申请2008/0317852(其全文以引用的方式并入本文中)中有描述。
[0156]
治疗方案
[0157]
如本文所述，本发明的一个方面涉及将本文所述包括hiv抗原和lfn多肽的药物组合物与传统抗逆转录病毒治疗或结合性hiv病毒治疗联合施加给患者，以增强(例如提高)
传统hiv抗逆转录病毒治疗。相应地，本发明涉及周期性地(例如脉冲式给药)使用本发明组合物的双重治疗方法，它与传统结合逆转录病毒治疗相结合，来增强传统逆转录病毒治疗在hiv阳性或经受aids的对象中的疗效。
[0158]
在一些实施方式中，可以在常规抗逆转录病毒治疗的连续给药期间(例如同时)施加本文所述治疗性组合物。所述“常规抗逆转录病毒治疗的连续给药”指的是定期和经常给药的抗逆转录病毒治疗，其治疗方案中没有间歇，例如每天两次以上、每天两次、每日一次、每隔一日一次、每周一次等。相应地，在一些实施方式中，可以在常规hiv抗逆转录病毒治疗的给药的常规方案期间施加所述组合物一次或两次。
[0159]
在一些实施方式中，可以在停止常规抗逆转录病毒治疗的连续给药之后立即施用本发明所述的组合物。在一些实施方式中，例如可以停止常规hiv抗逆转录病毒治疗的每日或每周疗程，并且在同一日、或者在停止每日疗程前一日或以上，可以向患者接种注射本文所述的组合物。
[0160]
在一些实施方式中，可以在常规hiv抗逆转录病毒治疗的连续给药方案中一个预定的时间点施加本发明所述的组合物，并且在施加所述组合物后的一段预定时间之后，可以将常规hiv抗逆转录病毒治疗的连续给药方案停止一段时间。在一些实施方式中，可以减少常规抗逆转录病毒治疗的剂量或将其完全停止至少一日、一周或以上。例如，可以减少常规抗逆转录病毒治疗的剂量至少2周、或至少3周、或至少4周或以上(例如1个月、6周或2个月以上)。在一些实施方式中，当重新开始常规抗逆转录病毒治疗后，可以对患者施用相同的或不同的连续性抗逆转录病毒治疗。
[0161]
在一些实施方式中，可以在将常规hiv抗逆转录病毒治疗的连续给药方案的剂量减少和/或将其停止前至少1日、或至少2日、或至少3日、或至少4日、或至少约5日、或至少约1周、或至少约10日、或至少约2周、或至少约3周、或至少约1个月、或1个月以上，向患者施用本文所述组合物。
[0162]
在一些实施方式中，向接受常规hiv抗逆转录病毒治疗的患者施用所述药物至少每个月一次、至少每隔一个月一次、或至少每6个月一次、或至少每年一次、或至少每隔一年一次。
[0163]
相应地，因为施加有所述组合物的患者可以减少常规hiv抗逆转录病毒治疗的剂量一段时间，该常规hiv抗逆转录病毒治疗的总日剂量可以减少为常规hiv抗逆转录病毒治疗的通常剂量的25％～75％。在其他实施方式中，本文所述组合物的施用使得常规hiv抗逆转录病毒治疗的剂量减少为该常规hiv抗逆转录病毒治疗(即在向患者施用所述组合物之前)的通常剂量的小于80％、小于75％、小于70％、小于65％、小于60％、小于55％、小于50％、小于45％、小于40％、小于35％、小于30％、小于25％、小于20％、小于15％、小于10％、小于5％、小于2％或小于1％。
[0164]
在可选的实施方式中，因为施加有所述组合物的患者可以从常规hiv抗逆转录病毒治疗的常规剂量疗程中得到休息或中断，故可以使用本文所述组合物来使常规hiv抗逆转录病毒治疗能够进行脉冲式给药。例如，在一些实施方式中，可以通过脉冲式给药来施加常规hiv抗逆转录病毒治疗。在某些实施方式中，施加有所述组合物的患者可以通过脉冲式给药施加常规hiv抗逆转录病毒治疗。该治疗包括在第一时间段施加常规hiv抗逆转录病毒治疗，随后在第二时间段不施加常规hiv抗逆转录病毒治疗。在一些实施方式中，所述第一
时间段是约至少1周、或至少约1个月、或至少约2个月、或至少约3个月或3个月以上。在一些实施方式中，所述第二时间段通常在施加本文所述组合物之后一段预定时间之后发生，该第二时间段可以是至少1日、或1周、或1周以上、或至少2周、或至少3周、或至少4周、或4周以上(例如约1个月、或约6周、或约2个月或2个月以上)。
[0165]
在一些实施方式中，第一时间段(即施用常规hiv抗逆转录病毒治疗的常规疗程)的持续时间与第二时间段(即“休息”或“药物休假”的持续时间，其中常规hiv抗逆转录病毒治疗是被停止的)的持续时间相同。作为一个非限制性的例子，所述第一时间段的持续时间可以是1个月，随后第二时间段持续1个月。在一些实施方式中，所述第一时间段(即施用常规hiv抗逆转录病毒治疗的常规疗程)的持续时间比第二时间段(即休息或“药物休假”的持续时间)的持续时间长。作为一个非限制性的例子，所述第一时间段的持续时间可以是2个月，随后第二时间段持续不到2个月，例如至少1天、或1周、或约2周、或约3周、或约4周、或4周以上但不到2个月。
[0166]
在某些实施方式中，如果患者在充足且规律的时间间隔内施用本文所述的组合物，以使第二时间段(即休息或“药物休假”的整个持续时间，其中没有施用常规hiv抗逆转录病毒治疗)期间的hiv病毒载量保持低水平，则可以重复常规hiv抗逆转录病毒治疗的脉冲式给药。在某些实施方式中，所述组合物使患者能够在其一生中接受常规hiv抗逆转录病毒治疗的脉冲式给药。
[0167]
在一些实施方式中，向正在接受常规hiv抗逆转录病毒治疗的脉冲式给药的患者施用所述组合物至少每个月一次、至少每隔一个月一次、或至少每6个月一次、或至少每年一次、或至少每隔一年一次。
[0168]
组合物、配方及给药
[0169]
在一个实施方式中，本文提供了一种通过向患者施用包括hiv抗原和lfn多肽或其片段的组合物，以增强(例如提高效率)带hiv的患者的常规hiv抗逆转录病毒治疗的方法。
[0170]
在另一个实施方式中，本文提供了一种使哺乳动物免疫hiv的方法，所述方法包括施用含有作为hiv抗原的制剂的组合物，该制剂含有或可选地含有hiv多肽。
[0171]
在另一个实施方式中，本文提供一种使哺乳动物免疫hiv的方法，所述方法包括施用含有药学上可接受的载体炭疽杆菌致死因子(lf)多肽(例如lfn或lfn的34-288残基(例如缺少信号肽))的组合物，以及施用抗原制剂，该抗原制剂包括hiv多肽的一个片段(例如p24)。
[0172]
在一个实施方式中，本文所述组合物包括从昆虫细胞表达并纯化的多肽。在一个实施方式中，所述组合物包括从昆虫细胞表达并纯化的多个hiv多肽或其片段。在另一个实施方式中，所述组合物包括lf多肽(例如lfn)，其中该lf多肽是n-糖基化的。所述n-糖基化可以位于天冬酰胺62、212和/或286。
[0173]
在一个实施方式中，本文所述组合物包括药学上可接受的载体。在另一个实施方式中，本文所述组合物被配方来向哺乳动物施用。合适的配方可以在remington'spharmaceutical sciences,16th and 18th eds.,mack publishing,easton,pa.(1980and 1990)，以及introduction to pharmaceutical dosage forms,4th edition,lea&febiger,philadelphia(1985)中找到，两者都以引用的方式并入本文中。
[0174]
在一个实施方式中，本文所述组合物包括本身无毒的、非治疗性的药学上可接受
的载体。这种载体的例子包括离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白(例如人血清白蛋白)、缓冲物质(例如磷酸盐、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物、水、盐)，或电解质(例如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶体二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、基于纤维素的物质，和聚乙二醇)。对于所有给药，适当地使用常规的药性持久的形式。这些形式包括例如是：微胶囊、纳米胶囊、脂质体、硬膏剂、吸入形式、鼻喷雾剂、舌下片剂和缓释制剂。缓释组合物的例子可以参看美国专利号3,773,919、3,887,699，ep 58,481a、ep 158,277a，加拿大专利号1176565；u.sidman et.al.,biopolymers 22:547(1983)以及r.langer et.al.,chem.tech.12:98(1982)。所述蛋白在配方中的浓度通常是每个病人每次使用约0.1mg/ml～100mg/ml。
[0175]
在一个实施方式中，其他成分也可以被添加进疫苗配方中，这些成分包括抗氧化剂(例如抗坏血酸)；低分子量(小于约10个残基)的多肽(例如聚精氨酸或三肽)；蛋白质(例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白)；亲水性聚合物(例如聚乙烯基吡咯烷酮)；氨基酸(例如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸或精氨酸)；单糖、二糖和其他碳水化合物。这些碳水化合物包括纤维素或其衍生物、葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂(例如edta)；和糖醇(例如甘露糖醇或山梨糖醇)。
[0176]
在一个实施方式中，用于给药的本文所述组合物必须是无菌的。通过无菌过滤膜(例如0.2微米膜)的过滤或其他本领域普遍熟知的技术可以很容易地完成无菌化。
[0177]
在一些实施方式中，本文所述组合物进一步包括药用辅料。所述药用辅料包括但不限于：生物相容的油、生理盐水溶液、防腐剂、碳水化合物、蛋白质、氨基酸、渗透压控制剂、载体气体、ph控制剂、有机溶剂、疏水性剂、酶抑制剂、吸水性聚合物、表面活性剂，吸收促进剂和抗氧化剂。碳水化合物的代表性例子包括可溶性糖，如羟丙基纤维素、羧甲基纤维素、羧基甲基纤维素、透明质酸、壳聚糖、藻酸盐、葡萄糖、木糖、半乳糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、葡聚糖、硫酸软骨素等。蛋白质的代表性例子包括白蛋白、明胶等。氨基酸的代表性例子包括甘氨酸、丙氨酸、谷氨酸、精氨酸、赖氨酸以及它们的盐。
[0178]
在一些实施方式中，本文所述的多肽可以被溶于水、溶剂(如甲醇)或缓冲液中。合适的缓冲液包括但不限于：不含ca 2 /mg2 的磷酸盐缓冲盐水(pbs)、生理盐水(150mm的nacl水溶液)和三羟甲基氨基甲烷缓冲液。不溶于中性缓冲液的抗原可以被溶于10mm的醋酸中，然后用中性缓冲液(例如pbs)稀释到需要的体积。在抗原只溶于酸性ph的情况下，溶解在稀乙酸之后，可以使用酸性ph的醋酸-pbs作为稀释剂。在本发明中可以使用甘油作为合适的非水性缓冲液。
[0179]
如果所述多肽本身不是可溶的，可以将该多肽置于悬浮液的配方中，甚至成为聚集体。在一些实施方式中，可以将疏水性抗原溶于洗涤剂中，该洗涤剂例如是含有跨膜区域的多肽。进一步地，对于含有脂质体的配方，可以将洗涤剂溶液(例如细胞膜提取物)中的抗原与脂质混合，然后通过稀释、透析或柱色谱除去洗涤剂，形成脂质体。
[0180]
在一些实施方式中，可以将所述组合物与其他治疗性成分组合施用，这些成分例如是γ-干扰素、细胞因子、化学治疗剂或抗炎或抗病毒剂。
[0181]
在一些实施方式中，所述组合物是以纯净的或者基本上纯净的形式施用的，但优选形成药物组合物、配方或制剂。这些配方包括本文所述的多肽以及一种或以上药学上可接受的载体和可选的其他治疗性成分。其他治疗性成分包括增强抗原呈递的化合物，例如
γ-干扰素、细胞因子、化学治疗剂或抗炎剂。所述配方可以方便地做成单位剂量的形式，并可以通过药学领域中公知的方法制备。例如plotkin和mortimer(in
‘
vaccines’,1994,w.b.saunders company；2nd edition)描述了诱导特定病原体的免疫反应的动物疫苗或人类疫苗，以及制备抗原、确定合适的抗原剂量的方法和诱导免疫反应的测试方法。
[0182]
在一些实施方式中，本文所述组合物进一步包括佐剂。所述佐剂是增强对同时服用的抗原免疫反应的一组异质性物质。在一些情况下，在疫苗中加入佐剂，以促进免疫反应，从而减少所需疫苗的用量。所述佐剂的作用是将抗原(刺激特定保护性免疫反应的物质)携带到与免疫系统接触，并影响所产生的免疫力的类型以及免疫反应的质量(大小或持续时间)。所述佐剂还可以降低某些抗原的毒性，并使某些疫苗组合物可溶。目前用于增强对抗原的免疫反应的佐剂几乎全部都是微粒或者与抗原共同形成微粒。在书本《vaccinedesign—the subunit and adjuvant approach》(ed:powell&newman,plenum press,1995)中描述了几乎所有已知的佐剂的免疫活性和化学特性。不形成微粒的佐剂种类是作为免疫信号物质的一组物质，以及在常规条件下由免疫系统作为施用微粒佐剂系统后免疫激活的结果而形成的物质组成的一组物质。
[0183]
在一个实施方式中，本文所述的组合物还进一步包括佐剂。所述佐剂的例子包括但不限于qs-21、detox-pc、mpl-se、mogm-csf、titermax-g、crl-1005、gerbu、teramide、psc97b、adjumer、pg-026、gsk-i、gcmaf、b-alethine、mpc-026、adjuvax、cpg odn、betafectin、alum和mf59。
[0184]
在一些实施方式中，合适的佐剂包括但不限于alum、mf59、ltr72(大肠杆菌热不稳定肠毒素的突变体，其部分敲除了adp-核糖转移酶的活性)、聚磷腈佐剂、白细胞介素(例如il-1、il-2、il-4、il-6、il-8、il-10和il-12)、干扰素(例如α-干扰素和γ-干扰素)、肿瘤坏死因子(tnf)、血小板衍化生长因子(pdgf)、gcsf、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)、表皮生长因子(egf)等。能够刺激细胞免疫反应的佐剂的例子包括辅助性t细胞(称为th1细胞)分泌的细胞因子，例如白细胞介素-2(il-2)、白细胞介素-4、白细胞介素-12(il-12)和白细胞介素-18、由这些th1型细胞因子(例如il-2)之一与免疫球蛋白g(igg)的fc蛋白融合形成的融合蛋白、干扰素(例如α-干扰素、β-干扰素和γ-干扰素)和将t细胞吸引至受感染组织的趋化因子。非编码的、富含iss的质粒dna或iss寡核苷酸(iss-odns)也可以在本发明中被用作佐剂，以增强细胞免疫力。
[0185]
将微粒系统用作佐剂，所述抗原可以与基质相连、或与基质混合、或混合进基质，所述基质具有慢速可生物降解的特性。应该注意确保基质不会形成毒性代谢产物。优选地，所使用的基质的主要种类是源自身体的物质。它们包括乳酸聚合物、聚氨基酸(蛋白质)、碳水化合物、脂质和低毒性的生物相容的聚合物。也可以使用源自身体的这些物质的组合或源自身体的物质的组合以及生物相容性的聚合物。优选的物质脂质是，因为它们表现出使其生物可降解的结构，并且它们在所有生物膜中都是关键要素。
[0186]
用于疫苗的佐剂在本领域是公知的。它们的例子包括但不限于：单酸甘油酯和脂肪酸，例如单酸甘油酯、油酸和大豆油的混合物；矿物盐，例如氢氧化铝、铝或磷酸钙凝胶；油乳剂和基于表面活性剂的配方，例如mf59(由微流化洗涤剂稳定的水包油乳液)、qs21(纯化皂甙)、as02[sbas2](水包油乳液 mpl qs-21)、montanide isa-51和isa-720(稳定的水包油乳液))、微粒佐剂(例如病毒颗粒(与流感血凝素合并的单层脂质体载体)、as04(与mpl
的[sbas4]al盐)、iscoms(由皂甙和血脂形成的复合物结构)、聚乳酸-羟基乙酸(plg)；微生物衍生物(原生的和合成的)，例如单磷酸脂质a(mpl)、detox(mpl m.phlei细胞壁骨架)、agp[rc-529](合成酰化单糖)、dc_chol(能够自主组织成脂质体的脂类免疫刺激剂)、om-174(脂质a衍生物)、cpg基序(含有免疫刺激的cpg基序的合成寡核苷酸)、修饰的lt和ct(具有无毒佐剂效果的转基因细菌毒素)；内源性人类免疫调节剂，例如hgm-csf或hil-12(可以作为蛋白或编码的质粒而施用的细胞因子)、immudaptin(c3d串联排列)和惰性载体(例如金颗粒)。更新的佐剂在美国专利号6,890,540、美国专利申请号2005/0244420和pct/se97/01003中有描述，其全文均以引用的方式并入本文中。
[0187]
在一些实施方式中，本文所述组合物可以通过静脉内、鼻内、肌内、皮下、腹膜内或口服施用。在一些实施方式中，施用的途径是口服、鼻内或肌内。
[0188]
相应地，在一些实施方式中，本文所述组合物被配方成适于静脉内、肌内、鼻内、口服、皮下或腹膜内给药。这些配方通常包括活性成分的无菌水溶液，溶液优选与受体的血液等压。这些配方可以通过在水中溶解固体活性成分来方便地配制，所述水中含有生理相容的物质(例如氯化钠(例如0.1-2.0m)、甘氨酸等)，并且水的缓冲ph符合生成水溶液的生理条件并且使溶液无菌。它们可以储存于单元容器或多剂量容器(例如密封的安瓿或小瓶)中。
[0189]
脂质体悬浮液也可以被用作药学上可接受的载体。它们可以根据本领域技术人员所知的方法来配制，例如使用在美国专利号4,522,811(其全文以引用的方式并入本文中)中所描述的方法。
[0190]
用于鼻腔给药的配方在美国专利号5,427,782、5,843,451和6,398,774(其全文以引用的方式并入本文中)中有描述。
[0191]
在一些实施方式中，所述组合物的配方可以包括稳定剂。示例性的稳定剂是聚乙二醇、蛋白质、糖类、氨基酸、无机酸和有机酸，它们既可以单独使用，也可以混合使用。可以在适当的浓度和/或ph下将两种或以上的稳定剂用于水溶液中。在这些水溶液中具体的渗透压一般是在0.1-3.0渗透压的范围内，优选在0.80-1.2的范围内。所述水溶液的ph被调整至5.0-9.0的范围内，优选在6-8的范围内。
[0192]
在一些实施方式中，当需要口服制剂时，所述组合物可以与典型的载体组合，除了其他之外，这些载体例如是乳糖、蔗糖、淀粉、滑石粉、硬脂酸镁、结晶纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素、甘油、藻酸钠或阿拉伯树胶。
[0193]
一种免疫方法或者注射哺乳动物以增强hiv常规抗逆转录病毒治疗的方法包括施用本文所述的疫苗组合物。
[0194]
使用本文所述组合物的给药方法(可以是一种疫苗)可以通过常规方法来实施。例如，多肽可以被用于合适的稀释剂(例如生理盐水或水，或完全或不完全的佐剂)中。可以通过任何合适的途径来施用所述组合物，以诱导免疫反应。可以一次性或者在定期的时间间隔施用所述组合物，直至诱导出免疫反应。可以通过本领域技术人员已知的多种方法来探测免疫反应，这些方法包括但不限于：产生抗体、细胞毒性试验、细胞增殖试验和细胞因子释放试验。例如，可以从经免疫的哺乳动物提取血液样本，并使用elisa(参看boer gf et.al.,1990,arch virol.115:47-61)(即使用the immtech influenza anucleoproteinantigen capture elisa kits(iav-1192和iva-1480))对其分析以确定针
对np、m1和/或m2蛋白的抗体的存在，可以通过本领域已知的方法来确定这些抗体的滴定量。
[0195]
在配方中使用的精确剂量也依赖于施用的途径，并且可以根据医生的判断和每个病人的具体情况来确定。例如，可以每月皮内注射25g-900g的总蛋白，持续3个月或以上。
[0196]
最后，主治医生会确定向特定病人施用的蛋白或组合物的量。
[0197]
测定或检测蛋白质-蛋白质相互作用的方法
[0198]
测定或检测蛋白质-蛋白质相互作用的方法是已熟知的。本领域的技术人员可以确定pa结合活性，例如quinn cp.et.al.,1991,j.biol.chem.266:20124-20130所描述的，通过将pa63与lfn混合并孵育一段时间，将形成的任意复合物进行化学交联，并通过凝胶电泳或放射性计数分析共价相连的复合物。简要来说，所述结合测试在5℃下进行，并与放射性标记的125i-lfn竞争。原生lf或全长n-末端(氨基酸1-288)lf是使用鲍尔通-亨特试剂(amersham公司)放射性标记的(～7.3x 106cpm/μg蛋白)。对于结合研究，将在24孔组织培养板中培养的j774a.l细胞在4℃下孵育60分钟并随后将培养板放在冰上进行冷却。然后用冷的(4℃)最小基本培养基替换培养基，所述最小基本培养基中含有hanks盐(/brl)，并且补充有1％(w/v)的牛血清白蛋白和25mm的hepes(结合介质)。将放射性标记的原生lf(125i-lf,0.1μg/ml,7.3x 106cpm/μg)添加到原生pa(0.1g/ml)中，并将培养板在湿的冰上孵育14小时。在各种浓度下测试突变的lf多肽，以确定它们与原生125i-lf竞争的能力。为了定量结合，在冷的结合介质中将放射性标记的lf、细胞轻洗两次，再在冷的hanks平衡盐溶液中洗一次，再溶解于0.50ml 0.1m的naoh中，并用γ计数管(beckman gamma 9000)计数。
[0199]
确定细胞膜转运的方法
[0200]
在一些实施方式中，可以通过确定hiv抗原的细胞膜转运来确定本文所述组合物是否诱导了患者对hiv抗原的免疫反应。确定细胞膜转运的方法在本领域中是公知的，例如在wesche,j.et.al.,1998,biochemistry 37:15737
–
15746以及sellman,b.r.et.al.,2001,j.biol.chem.276:8371
–
8376中。例如，将24孔培养板中的cho-k1细胞在冰上冷冻、洗涤，并用本文所述任一lfn-hiv抗原融合多肽(或其保守的替代变种或结构域i的片段)在冰上孵育2小时，其中所述融合多肽在体外转录/翻译系统(promega)中被[35s]蛋氨酸标记。然后用经冰冷却的pbs在ph 5.0或8.0下洗涤，并在37℃下孵育1min，再用pronase处理以消化位于细胞表面的剩余的未标记的35s，或者不经处理以作为对照。然后将细胞溶解，并分析释放到溶解缓冲液中的35s。转运百分比定义为免受链霉蛋白酶影响的衰变/分钟(dpm)/结合至细胞的dpm
×
100。用促进跨膜转运的融合多肽或结构域i的片段孵育过的细胞的细胞溶解液会具有更高的转运百分比。
[0201]
可选地，如n.kushner et.al.,2003,proc.natl acad sci u s a.100:6652-6657中所述，融合至lfn、lf或结构域i的更小片段(例如lfn-gfp)的绿色荧光蛋白可以被用来测试细胞膜转运能力。简要来说，在经胶原蛋白处理过的腔室玻片(bdscience)上培养hela细胞(american type culture collection)，以达到～80％的融合度，然后用40μg/ml纯化的gfp或lfn-gfp在37℃下孵育1或2h。洗涤之后，在gfp和gfp-lfn处理的样品之间比较gfp荧光度。经lfn-gfp处理的细胞中的gfp信号比仅用gfp处理的细胞中的gfp信号要大，以此确认细胞膜转运。还可以在100μg/ml与转铁蛋白结合的texas red(invitrogen
tm
inc.,
molecular probes)(作为胞吞途径的标记)中进行孵育。为了转铁蛋白实验，将细胞用冷的dmem洗涤4次，然后在溶于冷的pbs的4％多聚甲醛中固定15min。为了标记抗体，随后将玻片在溶于pbs的50mm nh4cl中且在冰上孵育15min，然后在含有0.1％皂苷的pbs中且在冰上培养20min。经过在pbs中的进一步洗涤之后，将玻片在湿润室内在室温下用含有4％驴血清及以下第一抗体的pbs孵育1h：小鼠抗早期核内体抗原((eea-1)(bd laboratory)，以对早期核内体进行染色；小鼠抗-lamp1和抗-lamp2(developmental studies hybridoma banks,university of iowa,iowa city)，以对后期核内体和溶酶体进行染色；小鼠ab-1(oncogene)，以对高尔基体进行染色；来自的小鼠抗线粒体抗体；和兔抗钙网蛋白(biotechnologies,victoria,canada)。然后将细胞进行二次抗体染色和显微镜检查。促进跨膜转运的融合lfn-gfp将可以在细胞内部观察到。抗原标记会进一步显示转移的gfp的亚细胞定位。
[0202]
由fret分析的锌金属蛋白酶活性
[0203]
在一些实施方式中，可以通过确定锌金属蛋白酶活性，来确定本文所述组合物是否诱导了患者对hiv抗原的免疫反应。可以根据cummings等(2002,proc.natl.acad.sci.usa 99:6603-6606.)的修饰方法，来执行基于fret淬火底物mapkkide的分裂的lf分解肽活性试验。从list biological labs购得mapkkide(邻氨基苯甲酰[o-abz/2,4-二硝基苯基[dnp])，一种含有被炭疽lf特异性切割位点所分离的o-abz供体和dnp受体群的合成肽。如厂家所推荐，在dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水(dpbs)，ph 8.2中用lf将mapkkide消化，随后在spectramax m2酶标仪(molecular devices,sunnyvale,ca)或在ls-5荧光分光光度计(perkin-elmer,wellesley,ma)中使用320nm的λ激发值和420nm的λ发射值。在室温下用指定浓度的公认抑制剂对lf进行预孵育10min，并通过加入指定浓度的底物，使反应混合物达到100-μl或500-μl，从而开始反应。
[0204]
使用杆状病毒系统来生产lfn多肽和hiv抗原
[0205]
在一个实施方式中，本文所述的任何多肽(例如hiv抗原和/或lfn多肽及其片段)都可以通过本领域一般技术人员所熟知的任意表达载体来表达。在一些实施方式中，所述表达载体是一种重组杆状病毒载体。在另一个实施方式中，本文所述的任意多肽是通过昆虫细胞来表达的。在又一个实施方式中，本文所述的任意多肽是从昆虫细胞分离的。用昆虫细胞中的杆状病毒来表达蛋白有多种好处，包括较高的表达水平、易于扩增、产生具有翻译后修饰的蛋白质，并简化了细胞生长。完整细胞的生长并不需要co2，并且能够很容易适应高密度悬浮培养物，以进行大规模表达。哺乳动物系统中出现的许多翻译后修饰途径也都使用在昆虫细胞之中。使产生的重组蛋白能够与原生哺乳动物蛋白在抗原性、免疫原性和功能上相似。
[0206]
杆状病毒(baculoviruses)是baculoviridae家族的dna病毒。这些病毒被认为具有较窄的宿主范围，该范围主要限于鳞翅目昆虫物种(蝴蝶和飞蛾)。苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(acnpv)已经成为原型杆状病毒，其在容易培养的昆虫细胞中可以有效复制。acnpv具有约130,000碱基对的双链闭合环状dna基因组，并对其寄主范围、分子生物学和遗传学特征进行了表征。
[0207]
许多杆状病毒(包括acnpv)在受感染细胞的核内形成大量的蛋白结晶阻塞。单独的多肽(称为多角体蛋白)占这些阻塞体的蛋白质量的大约95％。用于多角体蛋白的基因表
现为acnpv病毒基因组中的单一复制。因为多角体蛋白基因对被培养细胞中的病毒复制来说是没有必要的，因此可以容易地被修饰来表达外来基因。外来基因被插入到acnpv基因3'的多角体蛋白启动子序列，因此它受到多角体蛋白启动子的转录控制。
[0208]
杆状病毒表达载体系统(bevs)是在昆虫细胞和昆虫中大量生产重组蛋白的安全且快捷的方法，率先在max d.summers博士的实验室得到使用。
[0209]
杆状病毒表达系统是用于昆虫细胞内高水平重组蛋白表达的强大且灵活的系统。已有报道使用杆状病毒表达系统能够达到500mg/l的表达水平，令其成为高水平表达的理想系统。表达外来基因的重组杆状病毒是通过杆状病毒dna和含有目的基因序列的嵌合质粒之间的同源重组来构建的。可以通过其不同的噬斑形态和噬斑纯化的同质性来检测重组病毒。
[0210]
杆状病毒特别适合用作真核细胞克隆和表达载体。由于其宿主范围较窄(限于节肢动物)，它们一般是安全的。美国环境保护署(epa)已经允许使用三种杆状病毒种属来控制昆虫害虫。在epa实验使用许可之下，acnpv已经被用来对作物施用。
[0211]
acnpv野生型和重组病毒在多种昆虫细胞内复制。这些昆虫细胞包括来自秋粘虫的连续细胞系、spodoptera frugiperda(lepidoptera；noctuidae).s.frugiperda细胞具有18至24小时的群体倍增时间，并且可以在单层或自由悬浮培养物中增殖。
[0212]
本文所述的重组融合蛋白可以在昆虫细胞内产生，这些昆虫细胞包括但不限于来自鳞翅目物种的s.frugiperda细胞。其他可以被杆状病毒感染的昆虫细胞，例如来自bombyx mori,galleria mellanoma,trichplusia ni或lamanthria dispar,种属的昆虫细胞，也可以被用作合适的底物，以生产本文所述的重组蛋白。
[0213]
重组蛋白的杆状病毒表达在本领域是公知的，并且在美国专利号4,745,051,4,879,236,5,179,007,5,516,657,5,571,709和5,759,809(其全文以引用的方式并入本文中)有描述。本领域技术人员应该理解的是，所述表达系统并不限于杆状病毒表达系统。重要的是，所述表达系统引导已表达的重组蛋白的n-糖基化。本文所述重组蛋白还可以在其他表达系统中表达，这些表达系统例如是entomopox病毒(昆虫痘病毒)、质型多角体病毒(cpv)，以及使用重组基因或基因组组成性表达的昆虫细胞转化。
[0214]
最常见的表达载体系统是来自昆虫杆状病毒苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(acnpv)。acnpv具有双链环状dna的130千对碱基(kb)的基因组，是最广泛研究的杆状病毒。miller,l.k.,j virol.1981,39:973-976。acnpv具有双相复制周期，并在每个阶段产生一种不同形式的感染性病毒。在感染后(p.i.)10和24h之间，胞外病毒由核壳体通过细胞质膜出芽产生。到了15～18h p.i.，核衣壳被包封在细胞核内并被嵌入到次晶蛋白基质中，其中该蛋白基质是从称为多角体的单个主要蛋白生成的。在受感染的s.frugiperda(秋粘虫，鳞翅类，noctuidae)细胞中，acnpv多角体积累到较高的水平，并且构成细胞中总蛋白质量的25％或以上；可以比病毒感染的真核细胞中的其他任意蛋白更大量合成。
[0215]
在一个实施方式中，本文所述任意多肽都是使用杆状病毒表达载体系统(bevs)来产生的，其中使用包括编码该多肽的多核苷酸的重组杆状病毒载体来感染鳞翅目昆虫细胞，并培养该昆虫细胞以生产所述多肽。
[0216]
在一些实施方式中，所述杆状病毒表达载体系统(bevs)使用鳞翅目昆虫s.frugiperda细胞。
[0217]
编码lf的基因已经被克隆和测序，并且被分配有genbank登录号m29081(robertson&leppla,1986,gene 44:71 78；bragg和robertson,1989,gene 81:4554；亦参看美国专利号5,591,631和5,677,274；通常参看leppla,anthrax toxins,inbacterial toxins and virulence factors in disease(handbook of natural toxins,vol.8.,moss et.al.,eds.,1995)。
[0218]
在转化成原核或真核细胞以复制和/或表达之前，所述编码dna序列通常被克隆至中间载体。这些中间载体通常是克隆质粒(例如ppuc19,)或穿梭载体，所述穿梭载体能够在多个不同宿主中繁殖，并使dna的操控更加有效(例如prs ycp和prsyip载体能够穿梭在细菌和saccharomyces cerevisiae之间)。
[0219]
为了生成流感病毒序列以在杆状病毒系统中表达，例如，可以通过标准方法(cox et.al.,1983,bulletin of the world health organization 61,143-152)从梯度纯化的流感b/ann arbor/1/86和a/ann arbor/6/60(野生型)病毒中提取病毒粒子rna。通过lapeyre和amairic的方法(lapeyre et.al.,1985,gene 37,215-220)制备总病毒rna的cdna复制，但是其中通过逆转录酶的第一链合成是使用与病毒粒子rna的未翻译区域3'互补的通用流感a型或b型引物来准备的。从琼脂糖凝胶中分离对应于流感基因组rna片段5和7(a型流感：1565个碱基对，b型流感：1811个碱基对)的双链cdna片段，纯化，并使用标准方法(maniatis et.al.,2001,3rd edition,molecular cloning:a laboratory manual.cold spring harbor laboratory,cold spring harbor,n.y.)将其连接到sma i位点的质粒puc8。通过原位杂交(maniatis et.al.,(2001).molecular cloning:a laboratory manual.cold spring harbor laboratory,cold spring harbor,n.y.)可以鉴别出含有重组质粒(插入有np、m1或m2)的细菌菌落(e.coli,hb101)具有
32
p标记，以及具有特定于流感a或b np、m1或m2基因的序列的寡核苷酸引物。
[0220]
编码lf和lfn的序列如上所述，并能够由本领域技术人员克隆，或者从本领域可用的既存克隆中获取。
[0221]
从bevs产生重组蛋白的第一步是，通过同源重组或位点特异转座来构建重组杆状病毒载体。为了通过同源重组来获得重组杆状病毒载体，需要杆状病毒转移载体。杆状病毒转移载体是临时载体，其唯一目的是使外来编码dna能够在合适的基因启动子下插入到杆状病毒基因组中不影响常规病毒复制的位点。杆状病毒转移载体包括杆状病毒基因组序列中跨越外来编码dna的预期插入位点的那一部分。最常见的区域含有多角体蛋白或p10基因。对于细胞培养基和昆虫幼虫中的复制病毒和传染性胞外病毒的产物来说，两者都是可分散的。两种蛋白都高度表达于病毒复制晚期，并且当被插回到病毒基因组中时，会影响高水平的外来基因转录。典型的杆状病毒转移载体包括启动子、转录终止子以及最常见的原生病毒序列和位于启动子中与病毒基因组中的目标基因同源的两侧的区域。启动子和转录终止子之间的区域可以具有多个限制性内切酶酶切位点，以便于外来编码序列(在此实例中为lf多肽(例如lfn多肽和hiv抗原)的编码dna序列)的克隆。其他序列可以包括例如信号肽和/或标签编码序列，例如his标签、mat标签、flag标签、肠激酶的识别序列、蜜蜂蜂毒肽分泌信号、β-半乳糖苷酶、用于促进分泌的mcs上游的谷胱甘肽s-转移酶标签，重组病毒的识别、正确插入、阳性选择，和/或重组蛋白的纯化。杆状病毒转移载体构建完成后，将其与acnpv病毒dna混合，并共转染进昆虫细胞以建立感染。用双交叉同源重组事件来去除原生
多角体蛋白基因，并将其替换为外来编码序列，以在昆虫细胞中表达。通过缺失或插入使多角体基因失活，从而形成不会在受感染细胞内产生阻塞的突变体。这些不阻塞病毒形成的噬斑与野生型病毒产生的噬斑不同，该独特的噬斑形态作为筛选重组病毒的方法来说是有用的。
[0222]
很多杆状病毒转移载体及相应的适当修改宿主细胞可商业购得。例如来自bd biosciences的pacgp67、pacsecg2ta、pvl1392、pvl1393、pacghlt和pacab4；来自的p bac-3、pbac-6、pbacgus-6和pbacsurf-1；以及来自sigma的ppolh-flag和ppolh-mat。使用特别设计的寡核苷酸探针和本领域公知的聚合酶链反应(pcr)方法，本领域技术人员能够克隆炭疽杆菌致死因子n末端(lfn)部位的编码区域，并将其与hiv抗原多肽或其片段的编码区域连接，以构建用于融合多肽(含有lfn和hiv抗原多肽或其片段)的嵌合编码序列。本领域技术人员也能够克隆融合入蛋白的嵌合编码序列，并将其连接到选定的杆状病毒转移载体之中。lfn和hiv抗原多肽或其片段的编码序列应该能够框内连接，嵌合编码序列应该能够连接到启动子的下游及启动子和转录终止子之间。在此之后，所述重组杆状病毒转移载体被转染进常规克隆的大肠杆菌(例如xl1blue)中。随后通过抗菌素耐药性来选择带有转移载体dna的重组e.coli，以除去任何带有非重组质粒dna的e.coli。培养选定的e.coli转化体，并随后纯化重组载体dna，以转录入s.frugiperda(sf)细胞。
[0223]
作为一个例子，寡核苷酸5'-ggaggaacatatggcgggcggtcatggtg atg-3'(seq.id.no.19)可以被用来引入nde i位点，并作为扩增lfn-(氨基酸1-263)的编码dna序列的正向引物。而寡核苷酸5'-ctaggatccttaccgttgatctttaagttcttcc-3'(seq.id.no.20)可以被用来引入bam hi位点并作为反向引物。使用根据genbank登录号m29081的cdna模板来进行pcr扩增。可以相应地设计用于lfn-(28-263)、lfn-(33-263)、lfn-(37-263)、lfn-(40-263)和lfn-(43-263)的正向引物，以进行适当截断的lfn的编码序列的pcr扩增，并引入nde i位点。
[0224]
作为一个例子，为了克隆全长的np，寡核苷酸ctagaagtccatggcgtcccaaggcaccaaacgg(seq.id.no.21)可以被用来引入bam hi位点，而5
′‑
ctagagctcattgtcgtactcttctgcattgtc-3
′
(seq.id.no.22)可以被用来引入xho i位点。
[0225]
位于lfn的扩增编码序列的末端和位于np的扩增编码序列的始端的普通bam hi位点能促进两个分离的扩增编码序列连接成嵌合或融合的编码序列。两个分离的扩增编码序列的连接应该是这样的，np与lfn位于框内，在连接位点周围没有翻译终止密码子。可以使用nde i和xho i来消化融合编码序列，并将其连接进选定的杆状病毒转移载体，该载体具有正确方向的nde i和xho i位点。新构建的杆状病毒转移载体可以被转化为e.coli dh5。e.coli转化体可以通过消化来筛选，并通过测序来验证。此后，可以分离出杆状病毒转移载体，以共转染进昆虫细胞，进行同源重组。显然地，可以使用相似的方法来克隆其他流感抗原序列。
[0226]
为了通过位点特异的转座来获得重组杆状病毒载体，例如通过tn7来将外来基因插入到在e.coli.中培养的杆粒dna，invitrogen
tm
inc.提供了pfastbac
tm
质粒和含有dh10bac
tm
感受态e.coli的质粒，以通过位点特异的转座来构建重组杆状病毒载体。该编码序列被克隆进pfastbac
tm
质粒，而该重组质粒被转化为带有dh10bac
tm
感受态e.coli的杆粒
(一种杆状病毒穿梭载体，具有mini-atttn7目标位点和辅助质粒)。在由辅助质粒提供的换位蛋白的存在下，dh10bac
tm
质粒上的mini-atttn7元素可以换位到杆粒上的mini-atttn7目标位点。由于所述换位会使两侧是杆粒上的mini-atttn7目标位点的laczα基因被破坏，含有重组杆粒的群体可以通过抗生素选择和通过蓝/白筛选来识别，然后收获该杆粒以用于昆虫细胞的转染。
[0227]
在一个实施方式中，本文所述的融合多肽具有间隔肽，例如将lf多肽(例如lfn多肽)与流感多肽分隔开的14残基间隔肽(gspgisgggggile)(seq.id.no.23)。这样的短间隔肽的编码序列可以通过使互补的引物对退火来构建。本领域技术人员可以设计并合成编码该选定间隔肽的寡核苷酸。间隔肽通常具有非极性的氨基酸残基(例如甘氨酸和脯氨酸)。
[0228]
在一些实施方式中，可以进行杆状病毒转移载体中嵌合编码序列的特定位点引导的突变，来创建特定的氨基酸突变和替换，以进一步促进跨膜转运、蛋白表达或蛋白折叠。氨基酸替换的一个例子包括用于天冬氨酸的谷氨酸。可以使用例如来自stratagene的位点引导突变试剂盒，并根据厂家的说明或本领域任意已知的方法，来进行位点引导的突变。
[0229]
标准病毒dna被用来共转染s.frugiperda(sf)细胞。从在这些经转染的单分子膜内产生的病毒中分离出含有重组分子的假定的重组病毒。因为多角体蛋白的结构基因已经被移除，可以容易地鉴定出含有重组病毒的噬斑，因为它们会缺少阻塞体。可以通过本领域已知的方法(例如与特定的基因探针杂交、噬斑检测和终点稀释)来建立确定这些重组体含有所需的嵌入编码序列的方法。
[0230]
用于从本文所述的重组杆状病毒中产生蛋白的宿主细胞系优选为sf900 。用于从重组杆状病毒中产生蛋白的另一个宿主细胞系优选为sf9。sf900 和sf9是来自秋粘虫(s.frugiperda(鳞翅目，夜蛾科))的非转化、非致瘤性的连续细胞系。
[0231]
在28
±
2℃、不补充二氧化碳的条件下培养sf900 和sf9。用于sf9的培养基是tnmfh，它是盐、维生素、糖和氨基酸的简单混合物，并补充有胎牛血清。除了胎牛血清，细胞培养中没有使用到其他来自动物的产物(即胰蛋白酶等)。不含血清的培养基(可以使用sf900培养基，brl,gaithersburg,md.)也可以被用来繁殖sf9细胞，并优选来繁殖sf900 细胞。sf9细胞的群体倍增时间为18-24小时，可以被培养于单层膜或自由悬浮培养基中。已经报道的是，s.frugiperda细胞支持任意已知哺乳动物病毒的繁殖。
[0232]
杆状病毒转染的单分子膜sf细胞的噬斑检测方法在本领域中是已知的。以下是一个标准的协议方案。
[0233]
需要的试剂：graces昆虫培养基2x(例如bd biosciences#11667)、牛胎儿血清(热灭活)(例如bd biosciences#16140)、3％的或其他低熔点琼脂糖双蒸水溶液、无菌水、50ml无菌顶部螺杆的锥形管和37℃水浴微波。
[0234]
步骤一：制备感染的单层细胞
[0235]
1.将sf9细胞的悬浮培养基繁殖至密度小于3x106。
[0236]
2.将该培养基稀释至密度为5～6x105。
[0237]
3.对6孔培养皿，向每个孔中转移2ml该细胞悬浮液。对6cm培养皿，将本方案中的所有体积加倍。通过表面积进行测量。细胞数将在一定程度上取决于该细胞系，并且可以根据你的结果来向上或向下调整。如果到了第三日仍没有成片的单层，则增加细胞数。在第二
日应该有可用的空间。
[0238]
4.让细胞沉降至少30分钟，以确保细胞被牢固地连接。
[0239]
5.同时，按照10-4
、10-5
、10-6
和10-7
的稀释比将噬斑病毒稀释至1ml的等分试样。
[0240]
6.在sf细胞被牢固地连接到培养板之后，吸出培养基。
[0241]
7.向6孔培养板的每个孔中快速加入1ml稀释的病毒。
[0242]
8.将培养板转移至摇摆的平台，并缓慢摇动至少2个小时，优选4个小时，但在此之后效果显著衰退。
[0243]
步骤二：在使用前制备覆盖琼脂糖。
[0244]
9.进行如下混合：补充有20％胎牛血清的2x graces培养基1份，3％的溶于蒸馏水(双蒸水)的琼脂糖1份。
[0245]
10.将琼脂糖完全融化。
[0246]
11.令琼脂糖稍微冷却至接近70℃，然后向每个50ml锥形管分装20ml。
[0247]
12.向每个20ml等分的琼脂糖中加入20ml室温或以上的2x graces/fcs，然后置于35-37℃的水浴中。
[0248]
13.每次一试管地从水浴中除去覆盖琼脂糖，并检测温度。让其冷却至至少38℃，但优选低于37℃。
[0249]
步骤三：将琼脂糖覆盖至受感染的细胞单层膜之上。
[0250]
14.准备就绪后，吸出所有培养基。
[0251]
15.将培养基返回水平面，并向每个孔中加入约3ml熔融覆盖混合物，使其能够向下滑到孔的远壁并到达培养板。
[0252]
16.覆盖细胞之后，让培养板在引擎罩上放置30分钟左右，以将其干燥并固化。
[0253]
17.置于27℃、98％湿度控制的培养箱中至少3天。
[0254]
步骤4：对培养板染色。
[0255]
18.制备1％的中性红(neutral red)溶液。
[0256]
19.如上述制备覆盖琼脂糖溶液，但是对每个试验只准备1ml。
[0257]
20.向熔化的琼脂糖中加入1/100体积的1％的中性红溶液(例如100微升至10毫升)。
[0258]
21.向6孔培养皿中的每个孔加入约1ml的红琼脂糖(red agarose)。确保直到琼脂糖设置完成前培养板是水平的。
[0259]
22.加入足够的红琼脂糖来均匀覆盖表面。
[0260]
23.将培养板放回培养箱中至少4小时。几个小时之后，噬斑会作为染色的细胞之间的清晰的点开始出现。
[0261]
24.计数前培养板可以放置过夜。
[0262]
25.对照组可以证实，在使用所述培养基和细胞时，更长时间的孵育并不会产生更高滴度的结果。
[0263]
在一个实施方式中，可以通过终点稀释法(epda)来鉴定阳性噬斑。可以使用96孔培养板epda来替换噬斑试验和噬斑纯化，以作为确定病毒滴度或者鉴定和纯化重组病毒的方法。经修改的12孔培养板epda可以被用作确定病毒滴度的常规方法。它能用于推定初始共转染的效率、确定受感染的细胞、估计病毒滴度，并放大病毒滴度。在12孔epda中，使用
100、10、1或0μl等分试样的原始转染上清液、野生型病毒、或重组xyle阳性对照组病毒上清液来培养含有等量昆虫细胞的单个孔。在用100、10、1和0μl培养的孔中的细胞之间进行视觉比较，来估计病毒滴度。
[0264]
例如，如果接受100μl原始共转染上清液的细胞在epda中看上去受到感染，但是接受10、1和0μl的细胞没有这种情况，则很可能病毒滴度很低，并应该将其扩增以产生高滴度存量。如果接受100μl原始共转染上清液的孔和接受0μl的孔看上去很相似，则很可能该原始共转染没有形成显著的病毒滴度，需要进行重复。当测定共转染的效率或者估计细胞存量的滴度时，如果edpa显示稀释液之间受感染细胞的数量呈10倍下降，则将病毒扩增多一次或两次，以对蛋白生成产生高滴度存量。但是，如果三个孔(100、10、1μl)都表现出相等的感染迹象，则病毒滴度很高，～2x108噬斑形成单位(pfu)/ml。高滴度的重组病毒存量被用来在最佳感染复数(moi＝病毒的#/细胞的#)下感染细胞，以形成最大蛋白产量。
[0265]
如果epda被用作扩增步骤来生成高滴度存量，则可以使用分离的12孔培养板来避免含有不同病毒(例如被用作阳性对照的高感染性野生型病毒)的孔之间发生交叉污染。
[0266]
推荐使用epda对照。来自pvl1392-xyle转染的重组病毒是特别有用的阳性对照。产生xyle蛋白的受感染细胞在苯邻二酚的存在下变黄，因此很容易识别。用于epda的协议方案的一个例子如下：
[0267]
协议方案
[0268]
1.用新鲜的tnm-fh培养基将对数时期的sf9细胞(具有大于98％的活性)稀释至1x105细胞/ml。在12孔培养板(bd falcon
tm
,cat.no.353043)的每一个孔上接种1x105sf9细胞。让细胞紧密连接约10分钟。在光学显微镜下进行视觉观察，以确认30％的融合率。用1ml新鲜的tnm-fh来替换培养基。
[0269]
2.向分离的孔加入100、10、1和0μl共转染开始后5天获得的重组病毒上清液(或其他病毒存量)。对阳性对照(例如pvl1392-xyle上清液)进行相同的处理。
[0270]
3.在27℃下孵育细胞3日。检查细胞的感染迹象。
[0271]
4.成功的转染应该会在100、10和1μl实验孔内形成大小统一的感染细胞。
[0272]
5.如果只有100μl和10μl的孔看上去含有受感染细胞，并且1μl孔看上去更像对照组，则病毒上清液的滴度很低。在进行蛋白生成之前将病毒扩增额外的时间。
[0273]
可以通过蛋白质印迹分析(如果抗原可用)或使用考马斯亮蓝染色的sds-page凝胶从100μl孔中收获细胞，并在适当的裂解缓冲液中裂解，以分析蛋白产量。
[0274]
来自100μl孔的病毒上清液可以被储存为第一病毒扩增存量，但是应该注意避免含有不同病毒的孔之间发生交叉污染。
[0275]
为了进一步纯化病毒群落，可以使用从epda得到的近似滴度来进行共转染上清液的噬斑检测纯化。
[0276]
一旦建立了表达蛋白的重组杆状病毒载体，则可以将病毒扩增和纯化，以感染sf细胞。
[0277]
病毒的纯化。使用已知的纯化方法(例如蔗糖密度梯度离心法)从培养基中纯化得到产自第一通道的病毒颗粒。例如将受感染细胞的培养基离心，以在感染后24-28小时获得病毒。将由此产生的病毒颗粒悬浮在缓冲液中，并通过缓冲的蔗糖梯度来进行离心。从梯度中40-45％蔗糖区域获得病毒带，并用缓冲液稀释，并通过100,000
×
g的离心分离来压成丸
状。将纯化的病毒颗粒悬浮在缓冲液中，并储存在-70℃下或者用在细胞的大规模感染之中，以生成蛋白。
[0278]
感染过程(包括病毒蛋白的合成、病毒装配和部分细胞裂解)可以在感染后约72小时完成。这可能取决于蛋白，因此可以更早或更迟发生。可以用
35
s-蛋氨酸、3h-亮氨酸或3h-甘露糖来对在受感染的细胞内产生的蛋白进行放射性标记，细胞相关的多肽或与细胞无关的多肽都可以在聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分析，以确定它们的分子量。也可以在感染后、细胞裂解前的不同时间来检验这些产物的表达。
[0279]
可以通过例如直接免疫沉淀反应或通过蛋白质印迹法来进行已表达的融合多肽的免疫鉴定。对于蛋白质印迹法，在sds聚丙烯酰胺凝胶上分离培养基中细胞相关的蛋白或多肽，将其转印到硝酸纤维素或尼龙过滤器上，并使用对lf多肽或hiv抗原蛋白或多角体蛋白的抗血清来鉴别。通过用标记有
125
i的蛋白a或结合酶的抗抗体来孵育过滤器，以检测特异性结合的抗体。随后在-80℃下暴露到具有增感屏的x射线胶片，或与酶底物进行显色反应。
[0280]
确认到表达的融合多肽之后，下一步是纯化蛋白，以用到本文所述的应用和组合物(例如用作疫苗(例如保护/预防或治疗性疫苗)或屏蔽剂的评价)中。如果本文所述的融合多肽被设计有分泌信号肽，被编码的多肽通常会被释放到细胞培养基之中。可以使用标准方法来浓缩来自这些受感染细胞的培养基，并纯化蛋白。可以使用盐沉淀、蔗糖密度梯度离心法和色谱法、高压液相色谱法或快压液相色谱法(hplc或fplc)，因为这些方法可以快速、定量和大规模纯化蛋白质，并且不使表达的产物变性。
[0281]
所需基因产物的合成效率取决于以下多个因素：(1)表达载体系统的选择；(2)在作为生成mrna的模板的细胞中可用的基因复制的数目；(3)启动子强度；(4)mrna的稳定性和结构；(5)用于开始翻译的核糖体的有效结合；(6)蛋白产物的性质，例如基因产物的稳定性或产物对宿主细胞的致死率；和(7)系统从细胞合成和导出蛋白的能力，从而简化后续的分析、纯化和使用。
[0282]
在bevs中表达的重组流感蛋白的纯化方法在本领域是已知的，例如美国专利号5,290,686、5,976,552、7,399,840和美国专利申请号2008/0008725(其全文以引用的方式并入本文中)。
[0283]
使用其他表达系统生成融合多肽
[0284]
本文所述的融合多肽全部都可以通过本领域技术人员熟知的蛋白和分子生物学方法来合成和纯化。优选使用分子生物学方法和重组异源蛋白的表达系统。例如可以在哺乳动物、昆虫、酵母或植物细胞中表达重组蛋白。
[0285]
本文还描述了lf、lfn的重组克隆和截断、其表达产物和特定位点突变和插入的一些例子，例如wo/2002/079417、wo/2008/048289、美国专利申请号2004/0166120、huyen cao et.al.,2002,j.infectious diseases；185:244
–
251、n.kushner et.al.,2003,proc.natl.acad.sci.u s a.100:6652
–
6657、ballard,j.d.et.al.,1996,proc.natl acad.sci.usa 93:12531-12534、以及goletz,t.j.et.al.,1997,proc.natl.acad.sci.usa 94:12059-12064(其全文都以引用的形式并入本文中)。与这些参考文献所描述的方法相似的方法也可以被用来产生本文所述的融合多肽。
[0286]
在一些实施方式中，提供了一种编码本文所述融合多肽或非融合多肽的分离的多
核苷酸。可以使用常规聚合酶链反应(pcr)克隆技术来构建编码本文所述融合多肽的嵌合或融合编码序列。可以将编码序列克隆入通用的克隆载体(例如puc19、pbr322、载体(inc.)或来自invitrogen
tm
inc.的pcr)。然后可以将所得到的带有编码本文所述多肽的核酸的重组载体用来进行进一步的分子生物学操作，例如进行位点定向诱变以创建本文所述融合多肽的变种，或者可以被亚克隆到蛋白质的表达载体或病毒载体中，以使用选自哺乳动物细胞系、昆虫细胞系、酵母、细菌和植物细胞的宿主细胞在多种蛋白表达系统中进行蛋白合成。
[0287]
每个pcr引物都应该至少有15个核苷酸在要扩增的区域与其对应的模板重叠。在pcr扩增中使用的聚合酶应该具有高保真度(例如聚合酶)以减少pcr扩增过程期间的序列错误。为了便于结合几个独立的pcr片段，例如在融合多肽的构建中，以及在随后的插入至克隆载体时，pcr引物也应该在其侧翼的末端具有鲜明而独特的限制性酶切位点，而该末端不会在pcr扩增期间使dna模板退火。每对特异性引物的限制性酶切位点都应该这样选择，其使得编码dna序列的融合多肽位于框内并且在没有终止密码子的情况下从开始到结束来编码融合多肽。同时所选择的限制性酶切位点不应该存在于融合多肽的编码dna序列之中。可以将预期多肽的编码dna序列连接到克隆载体pbr322或其衍生物之一，以进行扩增、识别嵌入编码序列的保真度和真实性、多肽中特定氨基酸突变和替换的替换/或特定位点定向诱变。
[0288]
可选地，可以使用例如invitrogen
tm
inc.的克隆方法(其包括拓扑异构酶辅助的ta载体(例如ii-topo、和))将多肽的编码dna序列pcr克隆入载体中。和都是定向topo入门载体，它们使在5
’→3’
方向的dna序列能够克隆入表达载体中。在5
’→3’
方向的定向克隆有利于dna序列单向插入到蛋白表达载体中，从而使启动子位于编码dna序列的融合多肽的5’atg起始密码子的上游，使得启动子驱动蛋白表达。带有融合多肽的编码dna序列的重组载体可以被转染并繁殖到一般克隆的e.coli(例如xl1blue,和top-10细胞(invitrogen
tm
inc.))中。
[0289]
可以使用本领域技术人员知晓的标准技术将突变(在本文所述融合多肽的多肽序列(例如lfn多肽，即seq.id.no.3或4或5)中创建氨基酸替代)引入到编码本文所述的融合多肽的核苷酸序列中，包括例如是位点定向诱变和pcr介导的诱变。优选地，所述融合多肽变种中与本文所述融合多肽相关的氨基酸替换小于50个、小于40个、小于30个、小于25个、小于20个、小于15个、小于10个、小于5个、小于4个、小于3个或小于2个。
[0290]
某些沉默或中性的错义突变也可以发生在dna编码序列中，这些序列不会改变所编码的氨基酸序列或者改变促进跨膜转运的能力。这些种类的突变对于优化密码子的使用、或提高重组蛋白表达和生产来说是非常有用的。
[0291]
载体中融合多肽的编码序列的特定位点定向诱变可以被用来创建特定的氨基酸突变和替换。可以使用例如来自stratagene的定点突变试剂盒并根据厂家说明来进行定点突变。
[0292]
在一个实施方式中，描述了包括本文所述多肽的编码dna序列的表达载体，以使用宿主细胞(选自例如哺乳动物、昆虫、酵母或植物细胞)来表达和纯化产自蛋白表达系统的重组多肽。所述表达载体应该具有必要的5'上游和3'下游调控元件(例如启动子序列、核糖
体识别和tata(seq.id.no.33)盒)，以及3’utr aauaaa(seq.id.no.34)转录终止序列，以在其各自的宿主细胞中进行有效的基因转录和翻译。优选地，所述表达载体是具有转录启动子和转录终止子的载体，所述转录启动子选自cmv(巨细胞病毒)启动子、rsv(劳斯氏肉瘤病毒)启动子、β-肌动蛋白启动子启动子、sv40(猿猴病毒40)启动子和肌肉肌酸激酶启动子，所述转录终止子选自sv40 poly(a)和bgh终止子。更优选地，所述表达载体具有巨细胞病毒的早期启动子/增强子序列以及腺病毒的三联体前导/内含序列，并含有sv40的复制起点和poly(a)序列。所述表达载体可以具有其他序列，例如6x-组氨酸、v5、硫氧还蛋白、谷胱甘肽-s-转移酶、c-myc、vsv-g、hsv、flag、麦芽糖结合肽、金属结合肽、ha和“分泌”信号(honeybee melittin,α-factor,pho,bip)，它们都被合并到所表达的融合多肽中。此外，在这些序列之后还可以合并有酶切位点，以在它们不被需要时便于将其酶切去除。这些额外的序列对于融合多肽表达的缺失来说是非常有用的，以通过亲和层析纯化蛋白、增强宿主细胞质中的重组蛋白质的溶解度、和/或将所表达的融合多肽分泌进培养基或酵母细胞的原生质球中。所述融合多肽的表达可以在宿主细胞中构成，或者可以使用例如硫酸铜、糖(例如半乳糖)、甲醇、甲胺、硫胺素、四环素、杆状病毒感染和(异丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷)iptg(乳糖的稳定的合成类似物)来诱导。
[0293]
在另一个实施方式中，包括本文所述多核苷酸的所述表达载体是病毒载体，例如是腺病毒、腺相关病毒(aav)、逆转录病毒和慢病毒载体。重组载体为基因表达研究和治疗性应用提供了通用的系统。
[0294]
本文所述多肽可以被表达于多种表达宿主细胞之中，这些宿主细胞例如是酵母、哺乳动物细胞、昆虫细胞和植物细胞(例如chlamadomonas)，甚至能表达于无细胞表达系统中。所述核苷酸可以从所述克隆载体被亚克隆进重组表达载体中，所述表达载体适用于哺乳动物、昆虫、酵母或植物细胞或无细胞表达系统(例如兔网织红细胞表达系统)中融合多肽的表达。某些载体被设计来转移编码核苷酸，以表达在一个单独重组反应的哺乳动物细胞、昆虫细胞和酵母中。例如，(invitrogen
tm
inc.)目的载体中的一些被设计来通过感染各自的宿主细胞，使适当的宿主细胞中的融合多肽能够异源表达，以构建杆状病毒、腺病毒、腺相关病毒(aav)、逆转录病毒和慢病毒。根据厂家说明，只需要两个步骤即可将基因转移入目的载体中。用于昆虫细胞、哺乳动物细胞和酵母中蛋白表达的有表达载体。经过在e.coli中的转化和选择之后，所述表达载体已经准备好被用来在合适的宿主中表达。
[0295]
其他表达载体和宿主细胞的例子是：用于在哺乳动物细胞系(例如cho、cos、hek-293、jurkat和mcf-7)中表达的基于强cmv启动子的pcdna3.1(invitrogen
tm
inc.)和pcineo载体(promega)；用于在哺乳动物细胞中进行腺病毒介导的基因转移和表达的复制不完全腺病毒向量载体padeno-x
tm
,pad5f35,plp-adeno
tm-x-cmvpad/cmv/v5-dest,pad-dest载体(invitrogen
tm
inc.)；与clontech的retro-x
tm
系统一起用于哺乳动物细胞中逆转录病毒介导的基因转移和表达的plncx2、plxsn和plapsn逆转录病毒载体；用于哺乳动物细胞中慢病毒载体介导的基因转移和表达的plenti4/v5-dest
tm
、plenti6/v5-dest
tm
和plenti6.2/v5-gw/lacz(invitrogen
tm
)；用于哺乳动物细胞中腺相关病毒介导的基因转移和表达的腺病毒相关病毒表达载体，例如paav-mcs、paav-ires-hrgfp和paav-rc载体(stratagene)；用于s.frugiperda 9(sf9)、sf11、tn-368和bti-tn-5b4-1昆虫细胞系中表
达的bacpak6杆状病毒(clontech)和pfastbac
tm
ht(invitrogen
tm
)；用于在drosophila schneider s2细胞中表达的pmt/bip/v5-his(invitrogen
tm
)；用于在pichia pastoris中表达的毕赤酵母表达载体ppicz、ppicz、pfld和pfld(invitrogen
tm
)和用于在p.methanolica中表达的载体pmetα和pmet；用于在酵母s.cerevisiae.中表达的pyes2/gs和pyd1(invitrogen
tm
)载体。在chlamydomonas reinhardtii中大规模表达异源蛋白的近期进展在griesbeck c.et.al.,2006mol.biotechnol.34:213-33和fuhrmann m.,2004,methods mol med.94:191-5中有描述。通过同源重组将外来异源编码序列插入到细胞核、叶绿体和线粒体的基因组中。带有最通用的叶绿体选择标记氨基糖苷类腺苷酸转移酶(aada)的叶绿体表达载体p64(其赋予对大观霉素或链霉素的抗性)可以被用来在叶绿体中表达外来蛋白。基因枪方法可以被用来在藻类中引入载体。当其进入叶绿体时，外来dna从基因枪粒子中释放，并通过同源重组整合到叶绿体基因组中。
[0296]
在一些实施方式中，本文所述融合多肽是从哺乳动物细胞的病毒感染中表达的。该病毒载体可以是，例如腺病毒、腺相关病毒(aav)、逆转录病毒和慢病毒。he et.al.,proc.natl.acad.sci.usa95:2509-2514,1998中提供了用于产生重组腺病毒的简化系统。首先将目的基因克隆进穿梭载体(例如padtrack-cmv)。通过用限制性内切酶pme i来消化，以将得到的质粒线性化。然后通过腺病毒骨架质粒(例如adeasy
tm
腺病毒载体系统的padeasy-1)将上述质粒共转化入e.coli.bj5183细胞。为卡那霉素抗性和由限制性内切酶分析确定的重组选择重组腺病毒载体。最后，将线性化的重组质粒转染进腺病毒包装细胞系(例如hek 293细胞(转化的e1人胚胎肾细胞)或911(转化的e1人胚胎视网膜细胞)(human gene therapy 7:215-222,1996))。在hek 293内生成重组腺病毒。
[0297]
重组慢病毒的优点是在分裂和未分裂的哺乳动物细胞内进行融合多肽的传递和表达。与基于莫洛尼白血病病毒(momlv)的逆转录病毒系统相比，基于hiv-1的慢病毒可以有效地转换的宿主范围更广。可以与invitrogen
tm
inc.的virapower
tm
慢病毒表达系统一起使用plenti4/v5-dest
tm
、plenti6/v5-dest
tm
或plenti载体来制备得到重组慢病毒。
[0298]
重组腺相关病毒(raav)载体适用于大范围的宿主细胞(包括许多不同的人类和非人类细胞系或组织)。raavs能够转换大范围的细胞种类，该转换不依赖于活跃的宿主细胞分裂。在上清液中可以容易得到高滴度(》108病毒颗粒/ml)，而10
11-10
12
病毒颗粒/ml会进一步浓缩。转基因被整合进宿主基因组中，因此表达是长期且稳定的。
[0299]
aav载体的大规模制备可以由包装细胞系的三质粒共转染制得：带有编码核苷酸的aav载体、含有aav rep和cap基因的aav rc载体，以及加入到具有193个亚融合细胞的50x 150mm培养板中的腺病毒辅助质粒pdf6。转染后第三日收取细胞，再用3个冻融循环或超声处理来释放病毒。
[0300]
根据载体的血清型，可以使用两个不同的方法来纯化aav载体。根据其对肝素的亲和性，可以使用单步重力流柱纯化方法来纯化aav2载体(auricchio,a.,et.al.,2001,human gene therapy 12:71-6；summerford,c.and r.samulski,1998,j.virol.72:1438-45；summerford,c.and r.samulski,1999,nat.med.5:587-88)。目前使用三个连续的cscl梯度来纯化aav2/1和aav2/5载体。
[0301]
可以通过本领域技术人员知晓的多种方法来表达和纯化本文所述的多肽。例如，可以从任何合适的表达系统中纯化出本文所述的融合多肽。可以通过标准技术来将融合多
肽纯化至实质的纯度。这些标准技术包括与硫酸铵等物质的选择沉淀；柱色谱法、免疫纯化方法，以及其他方法(参看例如scopes,protein purification:principles and practice(1982)；美国专利号4,673,641；ausubel et al.,supra；以及sambrook et al.supra)。
[0302]
当纯化重组蛋白时，可以使用许多程序。例如，已经建立起分子附着性能的蛋白可以可逆地融合到所选的蛋白。通过适当的配体，该蛋白可以被选择性地吸附到纯化柱，然后以相对纯的形式从柱中释放出来。然后通过酶活性来除去融合蛋白。最后，可以使用亲和力或免疫亲和柱对所选的蛋白进行纯化。
[0303]
在宿主细胞中表达蛋白之后，宿主细胞可以被裂解来释放表达的蛋白以进行纯化。裂解多种宿主细胞的方法在“sample preparation-tools for protein research”emd bioscience和current protocols in protein sciences(cpps)中都有描述。优选的纯化方法是亲和层析法，例如金属离子亲和层析法，其使用针对组氨酸标记的融合多肽的镍、钴或锌亲和树脂。clontech使用钴树脂描述了纯化组氨酸标记的重组蛋白的方法，在pet系统手册(第10版)中亦有描述。另一个优选的纯化策略是免疫亲和层析法，例如可以使用抗myc抗体融合树脂来亲和纯化myc标记的融合多肽。当存在适当的蛋白酶识别序列时，可以从组氨酸或myc标记中裂解出融合多肽，在组氨酸标记或myc标记被连接到亲和树脂时，从亲和树脂中释放融合多肽。
[0304]
用于纯化重组的和天然形成的蛋白的标准蛋白分离技术在本领域是已知的，例如溶解度分馏、尺寸排阻凝胶过滤法和各种柱色谱法。
[0305]
溶解度分馏(solubility fractionation)：通常作为初始步骤，特别是当蛋白混合物是复合物时，初始的盐析可以从目的蛋白中分离多种不需要的宿主细胞蛋白(或来自细胞培养基的蛋白)。优选的盐是硫酸铵。硫酸铵通过有效减少蛋白混合物中水的量来使蛋白沉淀。蛋白通常在其最小溶解度发生沉淀。蛋白的疏水性越强，则更可能在较低的硫酸铵浓度下发生沉淀。一般的方案包括向蛋白溶液加入饱和硫酸铵，从而使得到的硫酸铵的浓度是20-30％。该浓度可以使疏水性最大的蛋白发生沉淀。然后将沉淀去除(除非目的蛋白是疏水性的)，并向上清液加入硫酸铵，以达到沉淀目的蛋白所需的已知浓度。然后在缓冲液中溶解沉淀，在需要时通过透析或渗滤除去多余的盐。其他依赖蛋白溶解度的方法(例如冷乙醇沉淀)是本领域技术人员所知晓的，并可以被用来分馏复杂的蛋白混合物。
[0306]
尺寸排阻过滤法(size exclusion filtration)：可以使用所选蛋白的分子量来将其从更大或更小尺寸的蛋白中分离，其中通过不同孔大小的膜(例如或薄膜)进行超滤。第一步，通过薄膜对蛋白混合物进行超滤，其中该薄膜孔径的分子量截止点小于目的蛋白的分子量。然后用薄膜来对超滤的滞留物进行超滤，所述薄膜的分子量截止点大于目的蛋白的分子量。重组蛋白会穿过薄膜进入滤液。然后可以如下对滤液进行层析。
[0307]
柱层析法：也可以根据其大小、净表面电荷、疏水性和与配体的亲和力从其他蛋白中分离所选蛋白。另外，可以将针对重组的或自然形成的蛋白的抗体结合到柱基质，然后对蛋白进行免疫纯化。所有这些方法都是在本领域中已知的。本领域技术人员显而易见的是，可以在任何规模下、使用来自多个不同厂家(例如pharmacia biotech)的设备来进行色谱技术。例如可以使用pa63七聚体亲和层析柱(singh et al.,1994,j.biol.chem.269:29039-29046)来纯化lfn。
[0308]
在一些实施方式中，可以使用组合的纯化步骤来纯化本文所述的融合多肽。所述纯化步骤的组合包括：(i)阴离子交换色谱法，(ii)羟基磷灰石色谱法，(iii)疏水性相互作用色谱法，和(iv)尺寸排阻色谱法。
[0309]
也可以考虑无细胞表达系统。相比传统的基于细胞的表达方法，无细胞表达系统具有几个优点，它们包括：容易修改反应条件，便于蛋白折叠；产生毒性的灵敏度下降；以及因为反应体积和处理时间减少，适于采用高通量策略，例如快速表达筛选或大量蛋白生产。所述无细胞表达系统可以使用质粒或线性dna。再者，翻译效率的提高使产量超过一毫克蛋白质/每毫升反应混合物。可商业获得的无细胞表达系统包括结合tnt的网织红细胞裂解系统(promega)，其使用基于兔网织红细胞的体外系统。
[0310]
可以在以下编号的段落中定义本发明的一些实施方式：
[0311]
1.一种药物组合物的应用，所述药物组合物包括药学上可接受的载体和抗原制剂，所述抗原制剂包括hiv多肽或其片段，所述抗原制剂还包括炭疽杆菌致死因子(lfn)多肽的n-末端的至少34-288残基，以增强患者的hiv抗逆转录病毒治疗的治疗效果。
[0312]
2.段落1所述的组合物的应用，其中所述hiv多肽或其片段融合至lfn多肽。
[0313]
3.段落1或2所述的组合物的应用，其中所述组合物与传统抗逆转录病毒治疗联合施用至患者。
[0314]
4.段落1至3中任一项所述的组合物的应用，其中所述组合物周期性地施用至患者。
[0315]
5.段落1至4中任一项所述的组合物的应用，其中至少每年向患者施用所述组合物一次。
[0316]
6.段落1至5中任一项所述的组合物的应用，其中至少每年向患者施用所述组合物两次。
[0317]
7.段落1至6中任一项所述的组合物的应用，其中至少每季度向患者施用所述组合物一次。
[0318]
8.段落1至7中任一项所述的组合物的应用，其中至少每月向患者施用所述组合物一次。
[0319]
9.段落1至8中任一项所述的组合物的应用，其中至少每月向患者施用所述组合物一次以上。
[0320]
10.段落1至9中任一项所述的组合物的应用，进一步包括佐剂。
[0321]
11.段落1至10中任一项所述的组合物的应用，其中所述佐剂选自qs-21,detox-pc,mpl-se,mogm-csf,titermax-g,crl-1005,gerbu,teramide,psc97b,adjumer,pg-026,gsk-i,gcmaf,b-alethine,mpc-026,adjuvax,cpg odn,betafectin,alum和mf59。
[0322]
12.段落1至11中任一项所述的组合物的应用，其中所述lfn多肽是促进向完整细胞胞质溶胶的跨膜转运的其保守的替代变种。
[0323]
13.段落1至12中任一项所述的组合物的应用，其中所述lfn多肽被n-糖基化。
[0324]
14.段落1至13中任一项所述的组合物的应用，其中所述lfn多肽包括seq.id.no.3的至少60个羧基末端氨基酸或其保守的替代变种。
[0325]
15.段落1至14中任一项所述的组合物的应用，其中所述lfn多肽包括seq.id.no.3的至少80个羧基末端氨基酸或其保守的替代变种。
[0326]
16.段落1至15中任一项所述的组合物的应用，其中所述lfn多肽包括seq.id.no.3的至少104个羧基末端氨基酸或其保守的替代变种。
[0327]
17.段落1至16中任一项所述的组合物的应用，其中所述lfn多肽包括对应于seq.id.no.5的氨基酸序列或其保守的替代变种。
[0328]
18.段落1至17中任一项所述的组合物的应用，其中所述lfn多肽不结合炭疽杆菌保护性抗原蛋白。
[0329]
19.段落1至18中任一项所述的组合物的应用，其中所述lfn多肽基本上缺少seq.id.no.3的1-33氨基酸。
[0330]
20.段落1至19中任一项所述的组合物的应用，其中所述lfn多肽由seq.id.no.5或其保守的替代变种组成。
[0331]
21.段落1至20中任一项所述的组合物的应用，其中所述lfn多肽有至少15个氨基酸融合至所述hiv多肽或其片段。
[0332]
22.段落1至21中任一项所述的组合物的应用，其中hiv多肽和/或lfn多肽是从杆状病毒表达系统中表达和分离的。
[0333]
23.段落1至22中任一项所述的组合物的应用，其中所述至少一种抗逆转录病毒治疗选自干细胞治疗、替诺福韦、拉米夫定、齐多夫定、阿巴卡韦、齐多夫定azt、(s)-6-氯-4-(环丙基乙炔基)-1,4-二氢-4-(三氟甲基)-2h-3,11-环丙基-5,11-二氢-4-甲基-6h-双吡啶[3,2-b:2',3'-e][1,4]二氮杂卓-6-酮或其衍生物中的任意一种或其组合。
[0334]
24.段落1至24中任一项所述的组合物的应用，其中所述患者是人类患者。
[0335]
25.段落1至25中任一项所述的组合物的应用，其中接受hiv抗逆转录病毒治疗的患者能够减少其抗逆转录病毒治疗的疗程。
[0336]
26.段落1至26中任一项所述的组合物的应用，其中接受hiv抗逆转录病毒治疗的患者能够偶尔错过一次其抗逆转录病毒治疗的疗程。
[0337]
27.段落1至25中任一项所述的组合物的应用，其中接受hiv抗逆转录病毒治疗的患者能够停止接受其抗逆转录病毒治疗至少一周。
[0338]
28.段落1至25中任一项所述的组合物的应用，其中接受hiv抗逆转录病毒治疗的患者能够停止接受其抗逆转录病毒治疗至少一个月。
[0339]
29.一种提高至少一种抗逆转录病毒hiv治疗的疗效的方法，所述方法包括向患者施用一种药物组合物，所述药物组合物包括至少一种hiv多肽或其片段，所述药物组合物还包括炭疽杆菌致死因子(lfn)多肽的n-末端的至少34-288残基。
[0340]
30.一种增强至少一种抗逆转录病毒hiv治疗的效率的方法，所述方法包括向患者施用一种药物组合物，所述药物组合物包括段落1-23中的任一项。
[0341]
31.段落29或30所述的方法，其中所述患者是人类患者。
[0342]
32.段落29至31中任一项所述的方法，其中所述人类患者是hiv阳性的或者患有aids。
[0343]
33.段落29至32中任一项所述的方法，其中所述人类患者已被暴露于hiv。
[0344]
34.段落29至33中任一项所述的方法，其中在传统抗逆转录病毒治疗之前、之后或与其同时联合向患者施用所述组合物。
[0345]
35.段落29至34中任一项所述的方法，其中周期性地向患者施用所述组合物。
[0346]
36.段落29至35中任一项所述的方法，其中至少每年向患者施用所述组合物一次。
[0347]
37.段落29至36中任一项所述的方法，其中至少每年向患者施用所述组合物两次。
[0348]
38.段落29至37中任一项所述的方法，其中至少每季度向患者施用所述组合物一次。
[0349]
39.段落29至38中任一项所述的方法，其中至少每月向患者施用所述组合物一次。
[0350]
40.段落29至39中任一项所述的方法，其中至少每月向患者施用所述组合物一次以上。
[0351]
41.段落29至40中任一项所述的方法，其中所述hiv抗原多肽结合到lfn多肽。
[0352]
42.段落29至41中任一项所述的方法，其中所述hiv抗原多肽存在于与lfn多肽融合的融合蛋白中。
[0353]
43.段落29至42中任一项所述的方法，其中患者能够间断传统抗逆转录病毒治疗。
[0354]
44.段落29至43中任一项所述的方法，其中患者不需要严格遵守传统抗逆转录病毒治疗方案。
[0355]
45.段落29至44中任一项所述的方法，其中患者不需要严格遵守传统抗逆转录病毒治疗方案。
[0356]
46.段落29至45中任一项所述的方法，其中患者能够减少抗逆转录病毒治疗方案中的剂量。
[0357]
47.段落29至46中任一项所述的方法，其中患者能够偶尔一次错过其抗逆转录病毒治疗的疗程。
[0358]
48.段落29至47中任一项所述的方法，其中患者能够停止接受其抗逆转录病毒治疗至少一周。
[0359]
49.段落29至48中任一项所述的方法，其中患者能够停止接受其抗逆转录病毒治疗至少一个月。
[0360]
除非另有解释，否则本文使用的所有技术性和科学性术语都与本文所属领域的一般技术人员的普遍理解具有相同意义。免疫学和分子生物学中常用术语的定义可以在以下文献中找到：the merck manual of diagnosis and therapy,第18版,由merck research laboratories发表,2006(isbn0-911910-18-2)；robert s.porter et al.(eds.),the encyclopedia of molecular biology,由blackwell science ltd.发表,1994(isbn 0-632-02182-9)；以及robert a.meyers(ed.),molecular biology and biotechnology:a comprehensive desk reference,由vch publishers,inc.发表,1995(isbn 1-56081-569-8)；the elisa guidebook(methods in molecular biology 149)by crowther j.r.(2000)；fundamentals of ria and other ligand assays by jeffrey travis,1979,scientific newsletters；immunology by werner luttmann,published by elsevier,2006。definitions of common terms in分子生物学中常用术语的定义也可以在以下文献中找到：benjamin lewin,genes ix,由jones&bartlett publishing发表,2007(isbn-13:9780763740634)；kendrew et al.(eds.),the encyclopedia of molecular biology,由blackwell science ltd.发表,1994(isbn0-632-02182-9)；以及robert a.meyers(ed.),molecular biology and biotechnology:a comprehensive desk reference,由vch publishers,inc.发表,1995(isbn 1-56081-569-8)。
[0361]
除非另有提及，否则本发明使用所述标准程序进行。例如maniatis et al.,molecular cloning:alaboratory manual,cold spring harbor laboratory press,cold spring harbor,n.y.,usa(1982)；sambrook et al.,molecular cloning:a laboratory manual(2ed.),cold spring harbor laboratory press,cold spring harbor,n.y.,usa(1989)；davis et al.,basic methods in molecular biology,elsevier science publishing,inc.,new york,usa(1986)；methods in enzymology:guide to molecular cloning techniques vol.152,s.l.berger and a.r.kimmerl eds.,academic press inc.,san diego,usa(1987))；molecular biology(cpmb)(fred m.ausubel,et al.ed.,john wiley and sons,inc.)中的当前协议；protein science(cpps)(john e.coligan,et.al.,ed.,john wiley and sons,inc.)中的当前协议；immunology(cpi)(john e.coligan,et.al.,ed.john wiley and sons,inc.)中的当前协议；cell biology(cpcb)(juan s.bonifacino et.al.ed.,john wiley and sons,inc.)中的当前协议；culture of animal cells:a manual of basic technique by r.ian freshney,publisher:wiley-liss；5th edition(2005),and animal cell culture methods(methods in cell biology,vol.57,jennie p.mather and david barnes editors,academic press,1st edition,1998)；上述文献的全文都以引用方式并入本文中。
[0362]
应该理解的是，本发明并不限制于本文所述特定的方法、协议和试剂，它们都可以发生变化。本文所用的专业术语仅为了描述特定的实施方式，并不旨在限制本发明的范围，该范围仅由权利要求来定义。
[0363]
本文所确定的所有专利和其他出版物都以引用的形式明确地并入本文中，以达到描述和公开的目的。例如在这些出版物中描述的方法可以与本发明联合使用。提供这些出版物仅仅是为了其在本发明的申请日之前所公开的内容。就这一点而言，不应该凭借现有发明或任何其他原因认为本文的任何地方承认了发明人没有先于这些公开内容的权利。这些文档中所有提及的日期和内容都是基于申请人所能获得的信息，并没有承认这些文档的日期和内容的正确性。
[0364]
例子
[0365]
此处出现的例子涉及组合物，所述组合物包括lfn多肽或其片段以及hiv抗原，以增强hiv患者的常规hiv抗逆转录病毒治疗。在整个本技术中，引用了多种出版物。所有这些出版物及这些出版物全文中引用的参考文献都以引用的形式并入本技术中，以更全面地描述本发明涉及的技术领域的状态。以下例子并不旨在限制本发明权利要求的范围，相反地，旨在成为特定实施方式的示例。在这些示例性方法中经本领域人员所做的任何改动都落入本发明的范围。
[0366]
材料与方法
[0367]
研究设计。从乌干达坎帕拉的联合临床研究中心的hiv诊所中招募了符合条件的成年男性和女性感染hiv-1的志愿者。所招募的人员仅限为具有hiv状态记录和hiv抗逆转录病毒治疗(art)介导的至少6个月病毒抑制的证据的个体。研究合格标准包括：年龄28至60岁，cd4 t细胞计数＞400，正常的全血细胞计数、化学、肝功能检查和尿液分析。所有女性志愿者在基准内均呈妊娠试验阴性，并同意在研究过程中不哺乳并使用适当的节育措施。所有志愿者都提供了书面的知情同意书。每次免疫之后1小时和3日都进行反应原性和不良
反应事件评估。随后的探访是在1a期中招募后6、9和12个月。12个月之后，来自1a期的志愿者被邀请招募进入随后的1b期试验，其中按照单独的lfn-p24c加强免疫(表1)开始4周受观察的治疗中断。每14日进行hiv血浆rna、cd4细胞计数和临床评价。在治疗中断后4周(28日)，要求参加者重新开始之前的抗逆转录治疗方案，并在2个月内每两周进行仔细观察，在第3和第6个月也进行观察。对于使用到血浆半衰期药物浓度较短的药物的抗逆转录病毒治疗，所有抗逆转录病毒都被同时停止并在4周内重新开始。对于使用到单一的长效试剂(例如nevirapine或efavirenz)的抗逆转录病毒治疗，在停止其他art之前7-10日停止使用长效剂，再开始交错中断。
[0368]
在每次研究探访时开展咨询会议，以评估art的依附性和hiv危险行为。在整个研究的两期中都进行安全实验室测试，并收集指定用于免疫原性检测的血液样本。根据研究协议，在探访11a时分离和冷冻保存pbmc。因为安慰剂和基线样本不包括在数据分析之中，所以发明人选择了31个未免疫的个体(样本时间：0个月和12个月)作为历史对照。这些志愿者是从jcrc招募的，并且招募入观察性纵向研究，在所述研究中每三个月进行咨询和抽血。这些历史对照人群的临床档案与研究志愿者的相似，并且他们都具有大于400的cd4 t细胞计数，并在接收至少6个月稳定的art治疗方案后检测不到病毒血症。
[0369]
实验方案协议是经过美国和jcrc irbs、乌干达国家科学和技术委员会和乌干达国家药品管理局批准的。
[0370]
表1：探访计划1a期探访art＝抗逆转录病毒治疗
[0371]
day01a第一次免疫接种day3-72a临床评价day143a实验室与临床评价day284a第二次免疫接种day31-355a临床评价day426a实验室与临床评价day847a第三次免疫接种day87-908a临床评价day989a实验室与临床评价dav16810a实验室与临床评价day36511at细胞档案评价1b期
ꢀꢀ
day01b追加免疫接种day3-72b临床评价day143b停止任何nnrtiday214b停止artday355b实验室与临床评价day496bart重新开始day637b实验室与临床评价day778b实验室与临床评价day919b实验室与临床评价
day10510b实验室与临床评价day18211b实验室与临床评价
[0372]
候选疫苗。免疫原由融合至亚型c hiv-1 gag p24蛋白的炭疽衍生多肽致命因子(lfn，从中除去了毒素结构域)组成。lfn融合蛋白作为细胞内传递剂已经被广泛研究，因为其具有在不影响细胞活性的情况下跨细胞膜转运抗原的独特能力，其中使用经典的mhc i类和ii类途径
27-29
。lfn-p24c由water reed army institute of research(wrair)根据美国良好操作规范(gmp)生产，并由vaccine technologies,inc(vti)提供。该产品经过glp(良好实验室规范)分级动物毒性研究，并完成了由vaccine technologies,inc(vti)提供、由wrair(deborah birx and shirley lecher,个人通信)在马里兰对hiv-1阴性健康志愿者进行的经美国fda批准的阶段安全性研究。用于lfn及其融合衍生物的蛋白表达载体是由novagen(madison,wi)
30
开发的pet28b质粒。该载体系统的主要特征包括可诱导的t7启动子、用于蛋白纯化的内部his.标记和多个克隆位点。重组lfn在大肠杆菌中表达为细胞内可溶性蛋白，其在n末端具有6个串联重复的组氨酸(his)。lfn的分子量大约为31千道尔顿(kd)。将lfn-p24c稀释，并将其以1ml的体积、300μg的剂量与铝胶佐剂进行肌内注射。在1a期的第0、1和3个月时将总共3个注射剂肌内注射入三角肌区，随后在1b期中进行单一的追加免疫接种。
[0373]
cfse增殖试验。使用celltrace
tm
cfse细胞增殖试剂盒(invitrogen,carlsbad,ca)并根据厂家说明，通过羧基二醋酸琥珀酰亚胺酯(cfse)稀释来确定细胞增殖。用肽在370c和5％co2下刺激细胞5天，然后收取并用以下抗体染色形成表面标记：cd3 apc,cd4 pe,cd8 percp-cy5.5(bd biosciences,san jose,ca)。在lsrii流式细胞仪(bd biosciences,san jose,ca)上分析样本。使用紫色激发活性染料(live/dead fixable dead cell stain；invitrogen)从分析中去除死亡细胞。所有流分析都使用flowjo软件(treestar,ashland,or)进行。通过cfse稀释的程度来测量增殖。将金黄色葡萄球菌肠毒素b(seb sigma-aldrich,st.louis,mo)刺激用作阳性对照。在seb刺激之下所有评估样本都证明有显著的增殖。小于1％的本底响应以及大于5％的seb响应的结果被认为是有效的。只对所获得的至小10,000个事件的cd3 cd4 或cd3 cd8 的数据进行分析。只有大于本底值的两倍并在减去本底后大于0.1％的结果会被认为是阳性。
[0374]
免疫档案。使用以下抗体孵育pbmc以进行激活染色：cd3 amcyan,cd4 apc-cy7,cd8percpcy5.5,hladr fitc,cd38 pe,和pd-1apc(bd biosciences san jose,ca)。使用紫色激发活性染料(live/dead fixable dead cell stain；invitrogen)从分析中去除死亡细胞。免疫活性被定义为cd38 hla dr t细胞的百分比，而pd-1水平被定义为cd3 cd8 (或cd4 )t细胞上pd-1apc的表达百分比。使用荧光减去hladr、cd38和pd-1的一个对照来对门进行标准化和设定。使用flowjo软件(treestar,ashland,or)对数据进行分析。从每个样本至少取得了30,000个cd4 细胞，并在lsrii流式细胞仪(bd biosciences,san jose,ca)上对其进行分析31。
[0375]
抗原。对应于一致亚型c gag(122个肽)的肽被合成为用11a.a.(nih/niaid资源库)重叠的15个氨基酸(a.a.)。重叠肽上对应于hcmv pp65 p蛋白(jpt peptide technologies)的氨基酸序列的单独的池(pool)被用来检测人类cmv特异性反应。单个肽的最终浓度是每个肽1μg/ml。
[0376]
统计分析。使用prism version 4.0(graphpad software inc.san diego,ca)来进行统计分析。使用配对t检验来比较时间点之间的数据。使用曼-惠特尼检验来比较对照和研究组之间的差异。p值《0.05被认为具有统计显着性。
[0377]
例子1
[0378]
人员统计
[0379]
进入1a期的筛选和招募发生在2008年4月至2008年9月。在jcrc筛选的153名志愿者中，鉴定并招募了30名hiv阳性志愿者(25名女性和5名男性)。志愿者的平均年龄是41岁(从29岁至55岁)。所有参与者都在art下稳定地抑制了6个月或以上，都具有探测不到的细胞载量(《400复制数/ml)以及520的平均cd4 t细胞计数(从400到1100)。hiv阳性、未免疫的对照组(n＝31)的平均年龄是45岁(从22岁到55岁)。这些对照人群的平均cd4 t计数是540(从400到1370)并在稳定的art治疗下保持不可检测的病毒载量。两个组之间在年龄和cd4 t计数上不存在显著的差异(p》0.05，数据未图示)。
[0380]
30名志愿者中共有29名完成了1a期研究。其中一名移居到国外，未能完成其在第12个月的最后一次探访。1a期中的30名志愿者中有27名同意参与ib期。其中，24名经过完全评估的志愿者接受了加强免疫，并在接受lfn-p24c加强注射后21日经受密切监测的治疗中断。
[0381]
疫苗安全性
[0382]
图1示出了1a和1b期的局部和全身反应原性。最常见的局部症状是在注射部位的局部疼痛和压痛。与lfn-p24c相关的全身症状是全身乏力、肌肉痛和关节痛。这些局部和全身事件通常是轻微的，并通常在随后的探访(3-14日内)之前解除。大部分的自我报告症状是轻度24/840(2.9％)或中度1/840(0.001％)。没有由免疫原引起的严重不良反应，并且没有志愿者因不良事件而停止了研究。其他不认为与lfn-p24c相关的事件包括尿路感染、流感病毒感染、腰背痛、咽炎和急性疟疾。
[0383]
发明人仔细观察了施用lfn-p24c后整个1a期研究过程中的cd4细胞计数和病毒载量。在整个1a期研究持续时间的所有评估时间点上，所有30名志愿者都继续具有不可检测的病毒载量。在第12个月时及其以后，与未接种疫苗的对照人群相比，lfn-p24c的施用使cd4细胞计数显著上升。
[0384]
例子2
[0385]
疫苗反应者的t细胞档案
[0386]
hiv优先影响激活的cd4 t辅助细胞，这曾引起过对aids疫苗是否能够对病毒产生更多目标的关注
32-34
，特别是在hiv感染的个体中。发明人随后研究了三次免疫接种之后(探访11a)cd8和cd4 t细胞的免疫活性，并将其水平与未接受免疫接种的对照样本相比较。发明人在免疫接种者和对照样本之间没有发现在cd4和cd8细胞的免疫活性上存在显著的差异(图3a，p》0.5)。
[0387]
慢性hiv感染期间t细胞的功能障碍使程序性死亡1(pd-1)的表达提高，pd-1的上调也可以预测疾病进展
35-37
。出人意外地，在探访11a，与未接种疫苗的对照样本相比，治疗性免疫使cd4 和cd8 t细胞中的pd-1表达下降(图3b，p分别等于0.016和0.041)。12个月内在未接种疫苗的对照组中并没有在活性和pd-1表达水平上观察到显著的改变(p》0.5，数据未图示)。
[0388]
例子3
[0389]
特定疫苗的t细胞增殖
[0390]
通过干扰素的分泌测定的hiv-1特异性t细胞反应在具有渐进和长期非渐进hiv-1感染的个体之间没有区别，它与病毒复制的水平没有直接关系
38-40
。
[0391]
相比之下，在具有渐进性疾病的个体中没有出现hiv-1特异性增殖反应41。发明人在3次免疫接种之后测量了疫苗接种者的t细胞增殖(图4a示出了图形的例子)。在第12个月(探访11a)测定了疫苗接种者的基于流的增殖(由cfse稀释测定)，并将其与未接种疫苗的对照相比。在23个疫苗接种和20个对照样本中取得了有效的结果。与未接种疫苗的对照组相比，在接受疫苗接种的个体中对gag c的疫苗特异性cd4 增殖显著提高，分别为5/23[21.7％]和0/20[0％](图4b,p《0.05)。两个评估时间点上在对照组中没有检测到cd4介导的增殖(12个月，数据未图示)。
[0392]
相比之下，在12/23[52.2％]的疫苗接种者和13/20[65％]的对照样本之间没有观察到显著不同的cmv特异性反应。相似地，与2/20[10％]的对照样本相比，在5/23[21.7％]的疫苗接种者内观察到更高的cd8 疫苗特异性反应(图4b)。在两组之间没有检测到显著不同的cmv特异性、cd8和cd4介导的反应(图4c,p》0.5％)。与没有可检测的反应的疫苗接种者相比，三次疫苗接种之后，带有可检测的疫苗特异性反应(cd4和/或cd8介导)的个体在cd4 t细胞计数上大幅提高(图5)。
[0393]
例子4
[0394]
结构化治疗中断
[0395]
为了评估治疗性疫苗是否能够诱导控制病毒复制的抗hiv反应，完成了1a期的志愿者随后在加强免疫接种之后被要求接受经受监控的治疗中断。在接受lfn-p24c的第四次剂量之后21日，志愿者被指示不要进行他们的art(art未被免除)，但继续他们目前正在服用的所有其他药物。在开始治疗中断两个星期之后，观察病毒反弹。art恢复后病毒血症完全抑制(图6a)。在该研究的整个过程中密切监察cd4细胞计数(图6b)。随着治疗中断，观察到cd4细胞计数出现预期的下降，且直至探访11b(加强免疫后6个月)cd4仍未完全恢复至基线。在治疗中断期间有8个人(33％)没有病毒反弹的迹象，这些人在cd4细胞计数上没有显著的下降(p＝0.45，数据未图示)。缺少病毒反弹并没有导致在探访11a检测到t细胞繁殖(数据未图示)。
[0396]
随着感染hiv，免疫系统的崩溃主要来源于t细胞的持续破坏。抗逆转录病毒治疗能够恢复cd4 t细胞，但是需要终身服用和完全遵守药物方案。抗逆转录病毒治疗(art)也涉及潜在的副作用，并且候选治疗方案对世界上大部分受感染人群来说仍然非常昂贵
42
。已建立的病毒潜伏期提高了不可能仅通过抗逆转录病毒药物彻底根除hiv的可能性。治疗性疫苗的基本考虑是，提高免疫力对于接受art的人来说是有益的，并且可以顺利地修改hiv疾病的自然历史。基于我们的假设，即有效的治疗性方法需要引起有效的抗病毒免疫反应，发明人调查了lfn-p24c疫苗在维持稳定的抗逆转录病毒治疗方案的hiv阳性的健康乌干达人中的效果。与未接种疫苗的历史对照组相比，接受lfn-p24c的个体在12个月内cd4 t细胞计数上表现出显著的上升。
[0397]
免疫接种能够增强慢性感染者中hiv-1特异性t细胞反应，足够在art中断期间对病毒载量形成显著的效果
43,44
。我们的数据证明了治疗性免疫诱导hiv特异性t辅助与效应
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再多了解一些
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