使用开关样结合反应的亲和分离系统和方法与流程

1.本发明涉及使用开关样结合的亲和分离系统和方法，更具体而言，涉及一种用于将样本中的靶标组分分离成亚群的技术。


背景技术：

2.近来，为了最大限度地减少特定疾病如癌症和退行性疾病的筛查过程中的痛苦并实现疾病的早期诊断，引入了“液体活检”的概念。液体活检是指以相对简单的方式提取包括血液、唾液和尿液在内的体液并分析从体液中释放的特定疾病相关细胞或组分(例如肽、蛋白质、核酸、细胞器和特定物质)的无创性方法。液体活检有助于在早期确定特定疾病的发生。因此，液体活检已作为现有检验方法如诊断成像、组织检查和血液检验的替代方法受到了关注。
3.特别地，外泌体被称为细胞的化身，因为它们以微囊泡(mve)的形式从人体细胞释放并反映原细胞的特性。外泌体可从各种体液如血液、唾液和尿液中提取。由于外泌体是由脂质双层组成的囊泡，故它们不仅在体内稳定，而且不受蛋白酶、rnase和dnase的攻击。在这些情况下，越来越多的研究已使用外泌体作为诊断特定疾病如癌症和退行性疾病的新的生物标志物。在实践中，使用外泌体的产品已经或正在被开发以用于癌症的早期诊断。
4.然而，由于源自所有细胞的外泌体以混合状态存在于体液中，故从自体液分离的大量外泌体样本中准确地诊断特定疾病如癌症是存在局限性的。而且，由于体液中源自特定疾病相关细胞的外泌体的浓度在疾病发作的早期相对来说非常低，故从体液分离并富集靶标外泌体是早期诊断的先决条件。已知许多外泌体分离技术。其中，由于其高重现性和相对稳定的过程，基于密度差异的超速离心用作外泌体分离的黄金标准。然而，超速离心的缺点在于需要使用昂贵的系统并且分离需要很长时间。为了克服这些缺点，已开发出通过沉淀分离外泌体的方法和通过尺寸排阻色谱法或使用微流体基于尺寸分离外泌体的方法。例如，韩国专利第10-1807256号中公开了一种使用微流体基于尺寸分离外泌体的方法。
5.然而，现有的外泌体分离技术在选择性地检测源自特定细胞如癌细胞的痕量外泌体方面受到限制，因为体液中存在的所有外泌体是以单一群体的形式提供的。
6.因此，迫切需要用于分离细胞或细胞衍生成分的常规技术的问题的解决方案。


技术实现要素：

7.发明所要解决的问题
8.本发明努力于解决现有技术的问题并旨在提供一种亲和分离技术，其中靶标组分的亚群以高产率分离并保持靶标组分完好，其基于开关样可逆结合，使用能够特异性识别结合物例如结合蛋白的构象变化的识别材料，所述构象变化是在结合物与配体结合时引起的，从而允许结合物在溶液中存在或不存在配体的情况下与识别材料快速结合或解离。
9.解决问题的手段
10.根据本发明的实施方案的亲和分离系统包括：配体；结合物，其与配体可逆地结合
并且在与配体结合时结构构象发生改变；识别材料，其与结构构象发生改变的结合物特异性结合；固定构件，其表面固定了结合物或识别材料；和捕获材料，其与固定中未使用的结合物或识别材料缀合形成缀合物，并与样本溶液中靶标亚群的靶标特异性结合。
11.配体可选自糖分子、离子、底物、抗原及其组合。
12.结合物可选自糖结合蛋白、离子结合蛋白、酶、抗体、适配体、细胞受体、纳米结构体及其组合。
13.识别材料可选自抗体、蛋白质受体、细胞受体、适配体、酶、纳米颗粒、纳米结构体、重金属螯合剂及其组合。
14.固定构件可选自水凝胶、磁珠、乳胶珠、玻璃珠、纳米金属结构体、多孔膜、无孔膜及其组合。
15.亲和分离系统还可包括在其中容纳固定构件的反应器。
16.当配体与结合物分离时，结合物与识别材料的配对物可彼此解离。
17.可使用磁力、重力和/或离心力来富集与靶标结合的固定构件。
18.样本溶液可包括体液并且靶标可以是从体液中的异质的大量群体分离出来的物质。
19.异质的大量群体可包括选自细胞、外泌体、dna、rna、蛋白质、脂质、糖和用作诊断目标疾病的生物标志物的代谢物中的至少两种物质。
20.根据本发明的实施方案的亲和分离方法包括(a)溶液的系列反应，所述溶液包括：配体；结合物，其与配体结合时结构构象发生改变；识别材料，其与结合配对物即结构构象发生改变的结合物特异性结合；和捕获材料，其与结合物或识别材料缀合形成缀合物，使得缀合中未使用的配对物，即结合物或识别材料，与缀合物结合；(b)加入样本溶液，其含有能够与捕获材料特异性结合的靶标亚群的靶标，使得缀合物的捕获材料与靶标结合；和(c)加入不含配体的回收溶液，使得配体与结合物分离，从而触发缀合物与缀合中未使用的配对物即识别材料或结合物解离，与靶标形成结合复合物。
21.步骤(a)可包括将缀合中未使用的结合物或识别材料固定到固定构件的表面，并向固定构件加入含有溶解于其中的缀合物的配体溶液，以使得缀合物与固定到固定构件上的配对物结合。
22.亲和分离方法还可以包括在步骤(b)和(c)之间使用磁力、重力和/或离心力来将与靶标结合的固定构件捕获在与样本混合的配体溶液的预定空间内，然后除去一部分其中不存在固定构件的混合溶液以富集靶标。
23.样本溶液可包括体液，并且靶标可以是从体液中的异质的大量群体中分离出来的物质。
24.异质的大量群体可包括选自细胞、外泌体、dna、rna、蛋白质、脂质、糖和用作目标疾病诊断的生物标志物的代谢物中的至少两种物质。
25.本发明的特征和优点将从以下参考附图的描述中变得显而易见。
26.在详细描述本发明之前，应理解，说明书和权利要求书中使用的术语和词语不应解释为具有普通含义和字典含义，而是鉴于发明人为了以最佳的方法描述他/她的发明而适当地定义术语和词语的概念这一原则，理解为具有与本发明的技术精神相对应的含义和概念。
27.发明的效果
28.根据本发明，可在温和的条件下将特定疾病相关的靶标生物组分分离成亚群。靶标亚群可用作液体活检样本，从而以高灵敏度诊断特定疾病如癌症和退行性疾病。
附图说明
29.图1是根据本发明的实施方案的基于开关样结合的亲和分离系统的构造的示意图。
30.图2是根据本发明的又一实施方案的基于开关样结合的亲和分离系统的构造的示意图。
31.图3为描述根据本发明的实施方案的基于开关样结合的亲和分离方法的工艺流程图。
32.图4为描述根据本发明的又一实施方案的基于开关样结合的亲和分离方法的工艺流程图。
33.图5为流程图，描述了根据本发明的实施方案的使用基于开关样结合的亲和分离方法分离与黑色素瘤癌细胞相关的外泌体亚群的过程。
34.图6示出了使用根据本发明的基于开关样结合的亲和分离系统和方法从样本分离cd63 外泌体的过程中免疫亲和色谱法的结果。
35.图7示出了在重复图6的免疫亲和色谱法时外泌体分离的再现性。
36.图8示出了使用根据本发明的基于开关样结合的亲和分离系统和方法从样本分离和富集cd63 外泌体的过程中免疫磁性分离的结果。
37.图9示出了在重复图8的免疫磁性分离时外泌体分离的再现性。
38.图10示出了使用根据本发明的基于开关样结合的亲和分离系统和方法分离出的cd63 外泌体的物理表征的结果。
39.图11示出了使用根据本发明的基于开关样结合的亲和分离系统和方法分离出的cd63 外泌体样本的外泌体表面标志物的免疫化学表征的结果。
40.图12示出了基于cd9浓度的cav1校正浓度以补偿外泌体标准样本之间的浓度变化。
41.图13示出了使用根据本发明使用基于开关样结合的亲和分离系统和方法分离的cd63 外泌体作为对黑色素瘤癌诊断的分析样本的潜在效果。
42.图14比较了基于开关样结合的本发明的亲和分离系统和目前市售的外泌体分离系统，基于通过分离样本的免疫测定确定的cav1/cd9浓度比区分黑色素瘤癌样本与标准样本的能力。
具体实施方式
43.通过以下详细描述和优选实施方案，本发明的目的、具体优点和新颖特征将变得更显而易见，其中的实例在附图中说明。相同的附图标记和符号表示相同或相似的组件，即使它们在彼此不同的附图中示出。尽管本文使用了术语“第一”、“第二”等来描述各种组件，但这些组件不应受这些术语的限制。这些术语仅用于将一个组件与另一个组件区分开来。为了避免混淆本发明的主题，避免了对公知技术的详细描述。
44.下文将参考附图详细描述本发明的优选实施方案。
45.图1是根据本发明的实施方案基于开关样结合的亲和分离系统的构造的示意图；图2是根据本发明的又一实施方案基于开关样结合的亲和分离系统的构造的示意图。
46.图1和图2中描述的亲和分离系统中均包括配体10；结合物20，其与配体可逆地结合并且在与配体10结合时其结构构象发生改变；识别材料30，其与结构构象发生改变的结合物20特异性结合；固定构件40，其表面固定了结合物20或识别材料30；和捕获材料50，其与固定中未使用的结合物20或识别材料30缀合形成缀合物c，并与样本溶液中靶标亚群的靶标1特异性结合。
47.本发明涉及用于将样本中的靶标组分分离成亚群的技术。液体活检是一种诊断方法，其通过抽取体液如血液、唾液或尿液并随后分析由特定疾病相关细胞释放的组分(例如，肽、蛋白质、核酸、细胞器及其他特定物质)而可用于早期确定特定疾病的发生。特别地，源自体液的外泌体已作为用于诊断特定疾病如癌症和退行性疾病的新的生物标志物得到深入研究。然而，由于源自所有细胞的外泌体以混合状态存在于体液中，故使用仅从体液分离的大量群体形式的外泌体样本准确地诊断特定疾病如癌症是存在局限性的。因此，需要开发用于分离和富集靶标外泌体的技术。用于外泌体分离的常规技术基于超速离心、沉淀分离、尺寸排阻色谱法或微流体。然而，由于这些技术以混合的大量群体的形式提供体液的所有外泌体作为样本，故在选择性检测源自特定细胞如癌细胞的痕量靶标外泌体方面存在局限性。
48.因此，本发明基于外泌体表面上存在与癌症高度相关的蛋白质标志物例如窖蛋白1(cav1)之于黑色素瘤癌、her-2/neu之于胃癌和l1cam之于卵巢癌的发现，对特定标志物采用免疫亲和分离来分离特定的外泌体亚群。相比之下，现有的用于分离和检测体液中的痕量外泌体的一般过程难以克服检测的限制和保持再现性。在实践中，由于使用苛刻条件如酸性ph和/或表面活性剂来回收捕获在固体基质表面上的特定外泌体，仍然存在外泌体受损和回收产率低等问题。本发明针对上述问题而完成，并提供了一种亲和分离技术，在不使用苛刻条件的情况下高产率地从样本回收靶标亚群，同时保持靶标完好。
49.样本为用于液体活检的体液，靶标1可为外泌体，但并不一定限于此。体液的使用不一定局限于液体活检，并且样本可以是含有靶标1的任何类型。或者，靶标1可以是细胞或细胞来源的组分并且不受特别限制，只要它们可通过本发明分离。
50.具体地，本发明的亲和分离系统包括配体10、结合物20、识别材料30、固定构件40和捕获材料50。
51.配体10是能够与结合物20可逆地结合的材料，并可选自糖分子、离子、底物、抗原及其组合。
52.结合物20为在与配体10结合时其结构构象发生改变的材料。结合物20可选自糖结合蛋白、离子结合蛋白、酶、抗体、适配体、细胞受体、纳米结构体及其组合。因此，结合物20和配体10可形成结合物-配体对，例如糖结合蛋白-糖分子对、离子结合蛋白-离子对、酶-底物对、抗原-抗体对、适配体-配体对、细胞受体-配体对或纳米结构体-配体对。结合物20和配体10的最具代表性的实例包括钙结合蛋白(cbp)和钙离子。然而，结合物10和配体10不一定局限于上述材料，并且可以是可彼此可逆地结合而引起其构象改变的任何材料。
53.识别材料30是与在同配体20结合后结构构象已发生改变的结合物20特异性结合
的材料。识别材料30可选自抗体、蛋白质受体、细胞受体、适配体、酶、纳米颗粒、纳米结构体、重金属螯合剂及其组合。然而，这些材料仅是示意性的并且本发明的范围不一定限于此。例如，作为配体10的钙离子首先与作为结合物20的钙结合蛋白结合而引起钙结合蛋白的构象改变，结构构象已改变的钙结合蛋白再与作为识别材料30的抗体反应并结合(“抗原-抗体反应”)。
54.结合物20和识别材料30中的一种被固定到固定构件40上，而固定中未使用的结合物20或识别材料30与捕获材料50缀合形成缀合物c。即，识别材料30固定到固定构件40上而结合物20与捕获材料50缀合形成缀合物c，如图1中所示意(参见第一实施方案及实施例2和3)。或者，结合物20固定到固定构件40上而识别材料30与捕获材料50缀合形成缀合物c，如图2中所示意(参见第二实施方案)。
55.在第一和第二实施方案中的每一个中，结合物20或识别材料30被固定在固定构件40的表面上。固定构件40可选自但不一定限于水凝胶(参见实施例2)、磁珠(参见实施例3)、乳胶珠、玻璃珠、纳米金属结构体、多孔膜、无孔膜及其组合。然而，可使用可与结合物20或识别材料30结合的任何材料作为固定构件40而没有特别限制。捕获材料50是与结合物20或识别材料30缀合并与靶标1特异性结合的物质，例如抗体。捕获材料50如抗体可与靶标1的靶标标记物p(例如，表面蛋白)特异性结合，例如通过抗原-抗体反应。
56.在第一实施方案中，识别材料30被固定到固定构件40上，通过与配体10结合而结构构象已发生改变的结合物20与识别材料30反应，与结合物20缀合的捕获材料50与靶标1特异性结合并捕获靶标1。这里，结合物20与捕获材料50缀合形成缀合物c并然后与配体10结合。或者，结合物20与配体10结合并然后与捕获材料50缀合。
57.在第二实施方案中，结合物20被固定到固定构件40上，识别材料30与通过与配体10结合而结构构象已发生改变的结合物20结合，与识别材料30缀合的捕获材料50与靶标1特异性结合并捕获靶标1。这里，识别材料30与捕获材料50的缀合物c与结合物20反应。或者，识别材料30与配体10反应并然后与捕获材料50缀合。
58.在第一和第二实施方案中，每个结合反应可在反应器(未示出)中进行，其中容纳固定构件40。固定构件40经由反应器内的识别材料30、结合物20和捕获材料50的介导来捕获靶标1。这里，可使用磁力、重力和/或离心力来富集靶标1。例如，当使用磁珠作为固定构件40时，使用磁体来磁性捕获已与靶标1反应的固定构件40。然后弃去上清液并除去磁珠以富集靶标。
59.可通过将配体10与结合物20分离以将结合物20改变的构象恢复至其原始状态，从而使得结合物20与识别材料30的配对物彼此解离从而从磁珠回收捕获的靶标1。这里，可通过加入不含配体10的回收溶液来使配体10分离。
60.由于其构造，本发明的亲和分离系统可用于从体液分离和回收与特定疾病如癌症或退行性疾病相关的细胞或细胞来源的组分。在这种情况下，样本溶液含有其中存在异质的大量群体的体液。亲和分离系统可用于从异质的大量群体中分离和回收靶标。异质的大量群体可以包括选自细胞、外泌体、dna、rna、蛋白质、脂质、糖和用作诊断目标疾病的生物标志物的代谢物中的至少两种物质。
61.总的来说，本发明基于材料30(例如抗体)的使用，其能够特异性识别结合物20(例如钙结合蛋白)由于与配体10(例如钙离子)结合而引起的构象变化，具体地与结合物20发
生特异性反应。结合物20与识别材料30之间的反应可以是抗原-抗体反应，其中结合物20根据配体10例如钙离子的存在与否而与识别材料30快速结合或从两种组分之间的配对物中解离。这种结合或解离反应被描述为“开关样可逆结合”，因为其原理类似于通过开关来开/关灯的原理。根据本发明，可基于新的结合反应例如可逆抗原-抗体反应在温和的条件下高效地分离和浓缩包含靶标标记物的靶标亚群。也就是说，与使用苛刻条件如酸性ph来回收经由抗原-抗体反应结合到固体珠的表面的靶标亚群的靶标(例如外泌体)的方法相比，本发明能够以高产率回收靶标亚群的靶标(例如外泌体)，同时保持靶标的结构完好。
62.下面将描述根据本发明使用亲和分离系统的亲和分离方法。由于亲和分离系统已在上文描述，重复的说明将略去或简化。
63.图3为说明根据本发明的实施方案的基于开关样结合的亲和分离方法的工艺流程图，图4为根据本发明的又一实施方案的基于开关样结合的亲和分离方法的工艺流程图。
64.图3和图4中的每一个示意的亲和分离方法包括(a)溶液的系列反应，所述溶液包括：配体10；结合物20，其与配体10结合时结构构象发生改变；识别材料30，其与结构构象已发生改变的结合物特异性结合；和捕获材料50，其与结合物20或识别材料30缀合形成缀合物c，使得缀合中未使用的配对物，即结合物20或识别材料30，与缀合物c结合(s100)；(b)加入样本溶液，其含有能够与捕获材料50特异性结合的靶标亚群的靶标1，使得缀合物c的捕获材料50与靶标1结合(s200)；和(c)加入不含配体10的回收溶液，使得配体10与结合物20分离，从而触发缀合物c与缀合中未使用的配对物即识别材料30或结合物20解离，与靶标1形成结合复合物(s300)。
65.步骤(a)可以包括将缀合中未使用的结合物或识别材料固定到固定构件的表面上，并向固定构件加入含有溶解于其中的包括结合配对物的缀合物的配体溶液，使得缀合物与固定到固定构件上的结合物或识别材料结合。
66.亲和分离方法还可以在步骤(b)和(c)之间包括使用磁力、重力和/或离心力来将与靶标结合的固定构件捕获在与样本混合的配体溶液的预定空间内，并然后除去一部分其中不存在固定构件的混合溶液以富集靶标。
67.为了分离和回收样本溶液中靶标亚群的靶标1，首先，让配体10、结合物20、识别材料30和捕获材料50在溶液中彼此反应(s100)。作为系列反应的结果，当结合物20或识别材料30与捕获材料50缀合形成缀合物c时，缀合中未使用的结合物20或识别材料30与缀合物c结合。这里，配体溶液中存在的配体10与结合物20结合引起结合物20的构象发生改变，并且识别材料30特异性识别结构构象已发生改变的结合物20并与之结合。
68.具体参考图3，结合物20与捕获材料50缀合形成缀合物c，并且识别材料30与因配体溶液的加入而结构构象已改变的结合物20结合，如在上文的第一实施方案中所述的。这里，可加入结合物20与捕获材料50的缀合物c，或者可单独加入结合物20和捕获材料50以随后形成缀合物c。在一个实施方案中，将识别材料30固定到固定构件40的表面上，并向固定构件40加入含有溶解于其中的结合物-捕获材料缀合物c的配体溶液，以让识别材料30与缀合物c结合。
69.参考图4，形成识别材料-捕获材料缀合物c，并且因加入配体溶液而结构构象已改变的结合物20与缀合物c的识别材料30结合，如在上文的第二实施方案所述的。同样在本实施方案中，可加入识别材料30与捕获材料50的缀合物c，或者可单独加入识别材料30和捕获
材料50以随后形成缀合物c。作为实例，将结合物20固定到固定构件40的表面上，并向固定构件40加入含有溶解于其中的识别材料-捕获材料缀合物c的配体溶液，以让结合物20与缀合物c结合。
70.接下来，加入含有靶标亚群的靶标1的样本溶液(s200)。此时，缀合物c的捕获材料50与靶标1特异性结合。样本溶液可包括体液。在这种情况下，靶标1从体液中的异质的大量群体中分离。大量群体可包括选自细胞、外泌体、dna、rna、蛋白质、脂质、糖和用作诊断目标疾病的生物标志物的代谢物中的至少两种物质。例如，可从包含外泌体的异质的大量群体中分离出作为靶标1的外泌体。
71.其后，加入回收溶液(s300)。回收溶液为不含配体10的溶液。在加入回收溶液时，与结合物20结合的配体10将分离，导致构象改变的结合物20恢复至其原始状态，从而结合物20与识别材料30解离。因此，与靶标1结合的缀合物c与识别材料30(参见第一实施方案和图3)或结合物20(参见第二实施方案和图4)解离以回收靶标1。此时，靶标1与缀合物c一起被回收，而识别材料30(参见第一实施方案和图3)或结合物20(参见第二实施方案和图4)保持固定于固定构件40上。相应地，固定了识别材料30或结合物20的固定构件40可被重复使用以从新的样本溶液分离出靶标。
72.在加入样本溶液之后，可在加入回收溶液之前富集靶标。具体而言，使用磁力、重力和/或离心力来将与靶标1结合的固定构件40捕获在与样本混合的配体溶液的预定空间内。然后，可通过除去一部分其中不存在固定构件的混合溶液来富集靶标1。
73.该过程可在反应器中进行。将固定了识别材料30或结合物20的固定构件40填充在反应器中并向其中加入配体溶液、缀合物c和样本溶液。反应器可以是色谱柱，其中以色谱方式进行缔合和解离反应。或者，反应器可以是间歇容器，其中以间歇方式进行反应。可在反应器中使用磁力、重力或离心力来分离靶标。
74.例如，可利用本发明来在液体活检过程中从体液分离和浓缩外泌体亚群以诊断特定疾病。将参考图5描述分离外泌体亚群的过程。图5为示意根据本发明的实施方案的使用基于开关样结合的亲和分离方法分离与黑色素瘤癌细胞相关的外泌体亚群的过程的流程图。
75.通过简单地浓缩体液制成的大量群体形式的外泌体样本向从体液选择性地分离出的疾病相关外泌体样本的转化可改善液体活检的诊断准确性。为了在实验上例示该方法，选择黑色素瘤癌，一种由黑色素细胞引起的皮肤癌，作为目标疾病。作为参考，黑色素瘤癌具有最高的恶性程度和高转移率。因此，黑色素瘤癌是一种需要早期准确诊断以提高存活率的疾病。根据先前的研究，与健康对象的血液相比，黑色素瘤癌患者血液中的窖蛋白1(cav1)——一种外泌体表面蛋白——显著增加。结果显示，基于cav1阳性(cav1 )外泌体的诊断灵敏度为68％，高于基于作为另一黑色素瘤癌标志物的cd63的诊断灵敏度(43％)。具有改进性能的液体活检的临床使用需要选择性分离和富集靶标外泌体如cav1 外泌体，然而，由于靶标外泌体在来自体液的总外泌体中的比例非常低，故使用本领域已知的一般方法是难以实现的。
76.因此，本发明旨在提供一种使用从体液选择性分离出的含有cav1 外泌体的亚群作为检验样本来以高准确度和灵敏度诊断例如黑色素瘤癌的方法。考虑到外泌体分离的产率和再现性，不使用cav1 外泌体作为分离靶标，而是使用与该疾病相关的外泌体的群体作
为首要分离靶标。例如，由于与其他表面蛋白相比，在某些癌症(包括黑色素瘤癌)发生时，在一般外泌体中大量发现的管家蛋白cd63蛋白将在外泌体的表面上增加并表达，故可使用该表面蛋白作为初始分离介体。在实践中，外泌体表面蛋白cd63 外泌体作为黑色素瘤癌诊断标志物的灵敏度为43％，据报道低于外泌体表面蛋白cav1 外泌体的灵敏度。然而，据推测含有cav1 外泌体的cd63 外泌体亚群作为检验样本在黑色素瘤癌诊断中的灵敏度与大量群体样本相比显著较高(关于术语的定义，参见图5顶部)。
77.使用对靶标标记物具有特异性的抗体的免疫分离技术可应用于根据其表面蛋白标志物分离外泌体。利用这种技术，可通过使外泌体样本与固定在固体表面如磁珠或凝胶珠上的特异性抗体反应并使外泌体与抗体解离来分离靶标外泌体。由于抗原-抗体反应固有地提供的高选择性，故该技术比其他现有分离技术(例如，超速离心、加速沉降和基于尺寸的分离)更适合于分离与表面蛋白相关的外泌体。然而，需要使用苛刻条件如酸性ph来从固体表面回收经由抗原-抗体反应与抗体结合的外泌体，但可能会对外泌体造成损伤并使得难以高产率地回收外泌体。相比之下，本发明使用一种新的结合反应如可逆抗原-抗体反应来在温和的条件下高效地分离和浓缩包含靶标标记物的外泌体亚群。
78.根据本发明的一个实施方案，可逆识别材料被固定在固体表面(例如，珠子表面)上(图5中的i，底部)，并且钙结合蛋白(cbp)与外泌体表面蛋白(例如，cd63)的特异性抗体通过生物素-链霉亲和素键缀合形成cbp-捕获抗体缀合物。将cbp-捕获抗体缀合物溶解在含有钙离子(例如，》10mm ca
2
)的溶液中，并加到被固定的可逆识别材料中。缀合物通过“开启”识别反应被固定在固体表面上(图5中的ii)。当制备了大量外泌体样本并加到溶液中时，具有cd63标志物的外泌体将与固体表面上的捕获抗体反应并被其捕获(图5中的iii)。在用相同的溶液洗涤后，加入不含钙的外泌体回收溶液。钙离子从cbp分离，导致“关闭”状态。因此，与捕获抗体结合的被捕获外泌体可被回收到溶液中(图5中的iv)。因此，分离出cd63 外泌体的亚群被分离并回收。可根据样本溶液与所用回收溶液的体积比来富集外泌体。另外，固体表面可被再生并重新用于其他样本的分离。
79.将参考以下实施例、包括评价实施例更具体地说明本发明。然而，这些实施例仅出于说明的目的提供而不旨在限制本发明的范围。
80.材料
81.本发明人已生产出单克隆抗体，其特异性识别与钙离子结合的钙结合蛋白(cbp)的改变的独特结构(paek等人.analyst 139,3781-3789,2014)。选择突变的葡萄糖-半乳糖结合蛋白(ggbp)作为cbp。这些蛋白质是从大肠杆菌(e.coli)产生并经纯化的。氯化钠、三羟甲基氨基甲烷、酪蛋白(钠盐形式，牛乳提取物)、3,3',5,5'-四甲基联苯胺(tmb)、十二烷基硫酸钠(sds)、牛血清白蛋白(bsa)和cnbr活化的sepharose 4b凝胶(4％琼脂糖)购自sigma(美国密苏里州圣路易斯)。氯化钙二水合物和氯化钾由daejung(韩国始兴市)供应。磺基琥珀酰亚胺基-6-[生物素酰胺基]-6-己酰胺基己酸酯(nhs-lc-lc-生物素)、琥珀酰亚胺基4-(n-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯(smcc)、n-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫代)-丙酸酯(spdp)、二硫苏糖醇(dtt)、马来酰亚胺、链霉亲和素(sa)和辣根过氧化物酶(hrp)购自thermo fisher scientific(美国伊利诺伊州洛克福特)。抗-cd63抗体(目录号353014)由biolegend(美国加利福尼亚州圣地亚哥)供应。对cd9(目录号mab1880)、cd81(目录号mab4615)或窖蛋白-1(cav1；目录号mab5736)特异性的单克隆抗体由r&d systems(美
国明尼苏达州明尼阿波利斯)供应。冻干外泌体标准试剂(人血浆来源)和来自健康对象的黑色素瘤癌细胞培养物购自hansabiomed(爱沙尼亚塔林)。磁珠(对甲苯磺酰基活化dynabeads m-280，直径2.8mm)和链霉亲和素-poly-hrp20分别由invitrogen(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)和fitzgerald(美国马萨诸塞州阿克顿)供应。几种其他外泌体分离试剂盒，包括exoquick
tm
试剂盒(system biosciences；美国加利福尼亚州芒廷维尤)、magcapture
tm
试剂盒(wako；日本大阪)和exoeasy maxi
tm
试剂盒(qiagen；德国希尔登)，购自不同的来源。使用的其他试剂均为分析纯。
[0082]
实施例1：用于外泌体分离和表征的组分的制备
[0083]
sa与cbp的缀合。将cbp(400μg)溶解在10mm磷酸盐缓冲液(ph 7.4；pb)中并与20倍摩尔过量的smcc混合。让混合物在室温下反应1小时以活化cbp。使溶解在pb中的sa(2mg)与5倍摩尔过量的spdp反应1小时并用含有5mm乙二胺四乙酸(edta)的10mm dtt溶液在37℃下化学还原1小时以暴露巯基基团。在sephadex g-15凝胶过滤柱(10ml体积)上分离活化的组分以除去过量的试剂。两种活化的蛋白质(即，马来酰亚胺-cbp和硫醇化-sa)以1:5的摩尔比混合。让混合物在室温下反应4小时。其后，将含有cbp-sa聚合物的最终溶液在使用前于4℃下储存在紧密密封的容器中。
[0084]
抗-cd63抗体的生物素化。使nhs-lc-lc-生物素的琥珀酰亚胺酯部分与抗体分子上的胺基团反应以使抗体生物素化。简言之，将溶解在含有140mm nacl(pbs)的pb溶液中的抗-cd63抗体与溶解在20倍摩尔过量的二甲基亚砜(dmso)中的nhs-lc-lc-生物素混合。让混合物在室温下反应2小时。使用经用pbs平衡的sephadex g-15柱通过尺寸排阻色谱法除去反应混合物中未反应的试剂。将经纯化的缀合物用pbs透析两次，用vivaspin 500浓缩至1mg/ml，并在使用前于4℃储存。
[0085]
用hrp标记抗-cd63抗体。按常规方式用hrp标记抗-cd63抗体。简言之，首先在37℃下用10mm dtt还原抗体1小时，并用凝胶过滤柱除去过量的试剂。用30倍摩尔过量的smcc活化hrp，并如前所述通过尺寸排阻色谱法除去未反应的试剂。在经还原的抗体与10倍摩尔过量的活化hrp混合后，于4℃下进行≥24小时的缀合。将所得缀合物与等体积的甘油混合并储存在-20℃。
[0086]
实施例2：免疫亲和色谱法
[0087]
免疫亲和凝胶的制备。为了进行免疫亲和色谱法，将cbp构象特异性单克隆抗体固定在cnbr活化的sepharose 4b凝胶的表面上。根据制造商的说明使抗体分子上的赖氨酸残基在碱性条件下与凝胶上的官能团反应以使抗体(每毫升水合凝胶2mg)与琼脂糖凝胶化学结合。抗体结合后，用tris-hcl缓冲液水解凝胶上剩余的反应性基团。
[0088]
将所得免疫亲和凝胶装填到塑料柱中以制作免疫亲和色谱柱，其然后在交替的酸性和碱性条件下洗涤以除去非特异性吸附到固体(凝胶)表面的抗体。
[0089]
制作免疫亲和色谱柱和通过此柱分离cd63阳性(cd63 )外泌体。使用免疫亲和凝胶来制作免疫亲和色谱柱。通过以下过程制作对cd63阳性(cd63 )外泌体具有特异性的免疫亲和色谱柱。首先，用免疫亲和凝胶装填塑料柱。通过使用含有ca
2
(10mm)的转运溶液(“ca
2
开启”条件)与cbp构象特异性单克隆抗体反应来用cbp-sa缀合物(5μg/ml)固定免疫亲和凝胶。其后，经由生物素-sa结合将生物素化的抗-cd63抗体(3μg/ml)固定在cbp-sa缀合物层上。
[0090]
使用所制作的免疫亲和柱(9mm
×
3.2mm；1.5ml床体积)来进行外泌体分离。具体而言，将来自健康对象的标准外泌体样本(25μg/ml；1ml)加载到cd63免疫亲和柱上。注入含有ca
2
的转运溶液以洗去未结合的组分。其后，注入不含ca
2
的溶液(“ca
2
关闭”条件)以回收与免疫亲和凝胶结合的cbp-抗体-外泌体复合物(含有cd63 外泌体)的级分。这里，免疫亲和柱被再生并重新用于其他样本的分析。
[0091]
更具体而言，在向免疫亲和柱加入外泌体样本之前，先用含有140mm nacl、10mm ca
2
和2％bsa的20mm tris-hcl(ph 7.4；结合溶液)平衡凝胶。将实施例1中制备的cbp-sa(5μg/ml，1ml)和生物素化抗-cd63抗体(3μg/ml，1ml)及外泌体标准样本(1ml；标准外泌体标准试剂或黑色素瘤癌细胞培养物)中的每一种用结合溶液稀释。向每一稀释物中加入hrp酶(0.1μg/ml)以标记每一试剂的添加位置。将所得溶液依次加到凝胶柱使得它们以预定的洗脱体积被洗脱。使用蠕动泵在120μl/分钟的洗脱速率下将来自柱的洗脱液转移至级分收集器(级分体积：1ml)。通过用不含bsa的结合溶液洗涤以从凝胶柱除去未反应的蛋白质。最后，向柱中加入含有500mm nacl的20mm tris-hcl缓冲溶液(ph 7.4)以洗脱和回收与柱结合的外泌体。其后，向凝胶柱中加入含有500mm nacl、5％(体积/体积)吐温-20和0.02％(重量/体积)硫柳汞的100mm醋酸钠缓冲液(ph 4.5)进行再生，并将柱彻底洗涤直至观察不到蛋白质洗脱。
[0092]
实施例3：免疫磁性分离
[0093]
cd63 外泌体的免疫磁性富集。通常，磁性富集是在磁场下使用抗体结合免疫磁珠通过抗原-抗体反应分离和浓缩靶标物质的方法。基于该方法的cd63 外泌体分离与实施例2中进行的免疫亲和色谱法基本相同。将磁珠与识别因ca
2
结合引起的cbp构象改变的单克隆抗体结合，然后依次与cbp-sa缀合物和生物素化抗-cd63抗体在“ca
2
开启”条件下反应。让所得的免疫磁珠与外泌体样本(标准外泌体标准样本(25μg/ml；1ml))反应。用磁体捕获磁珠，除去上清液，并洗涤珠子。然后，在“ca
2
关闭”条件下加入缓冲溶液以回收和浓缩cd63 外泌体。所用缓冲溶液的体积为其初始体积的十分之一。
[0094]
更具体而言，对于磁性富集，使cd63特异性抗体上的胺基团化学结合并固定到磁珠的固体表面上的活化的对甲苯磺酰基基团上。在用tris-hcl缓冲液洗涤3次后，用酪蛋白-pbs封闭剩余的表面。在从溶液磁性分离磁珠(总共1mg)后，加入经用结合溶液稀释的cbp-sa缀合物(5μg/ml；1ml)并在摇床上温育1小时。在用不含bsa的结合溶液洗涤珠子后，于相同的条件下温育生物素化抗-cd63抗体(3μg/ml；1ml)。再次洗涤后，加入经结合溶液稀释的外泌体样本(25μg/ml；1ml)并反应3小时。最后，按与免疫亲和色谱法中相同的操作规程回收cd63 外泌体并再生珠子。
[0095]
评价实施例1：实施例1中回收的洗脱液级分的分析
[0096]
图6示出了使用基于开关样结合的本发明亲和分离系统和方法从样本分离cd63 外泌体的过程中免疫亲和色谱法的结果。
[0097]
首先，进行辣根过氧化物酶(hrp)的显色酶测定以确定实施例2中添加的试剂在色谱图上的洗脱位置。对实施例2中洗脱期间从柱子收集的洗脱液级分的分析确认了每种组分的添加位置和每个级分中cd63 外泌体的分布。当向经预处理的凝胶柱中注入每种组分(即，cbp-sa缀合物、生物素化抗-cd63抗体和外泌体样本)时，让每种溶液含有总共0.1μg的hrp以便确定洗脱后的添加位置。为此，对每个级分的部分取样，铺在微孔中并向其中加入
hrp底物溶液。从结果获得组分的进样位置信息的色谱图。峰(a)、(b)和(c)在图6中以虚线示出。更具体而言，对于酶测定，将预定量(5μl)的每个级分铺在微量滴定板中并然后加入酶底物溶液(200μl)以产生来自酶的信号。酶底物溶液通过将3％(体积/体积)过氧化氢水溶液(10μl)、溶解在二甲基亚砜(dmso)中的10mg/ml tmb(100μl)和0.05m醋酸盐缓冲液(ph 5.1；10ml)混合来制备。在酶信号饱和之前加入2m硫酸溶液(50μl)来终止反应。使用酶标仪(synergy h4,biotek inc.；美国佛蒙特州威努斯基)在450nm的最大吸光度下测量光密度。
[0098]
此外，对每个级分中的外泌体进行酶联免疫吸附测定法(elisa)以确定经由免疫亲和色谱法分离和回收的外泌体的洗脱位置。为此，对每个级分的部分取样并铺在固定了抗-cd63抗体的微孔中，然后温育。其后，使sa-poly hrp 20缀合物与预测与柱中的外泌体反应的生物素化抗体分子上的剩余生物素反应。更具体而言，向每个孔中加入5μg/ml抗体(100μl)并在37℃下温育1小时以固定抗体。洗涤后，用含有0.5％酪蛋白的tris-hcl缓冲液(酪蛋白-tris)封闭剩余的表面。然后，向每个孔中加入每个级分的等分试样(100μl)并在保持37℃和100％湿度的容器中温育12小时。洗涤孔并向其中加入实施例1中制备的生物素化抗-cd63抗体(1μg/ml；100μl)，然后于37℃下温育1小时。再次洗涤后，加入经酪蛋白-tris稀释的sa-poly hrp20(66ng/ml；每孔100μl)并于37℃下温育1小时。最后，加入hrp底物溶液(200μl)并在显色饱和前加入2m硫酸溶液(50μl)终止反应。如上文所述测量光密度。通过添加hrp底物溶液获得的外泌体特异性色谱结果由图6中的实线示出。“ca
2
关闭”条件下的显著信号由图6中的峰(d)指示。由于免疫测定法仅检测到在cd63 外泌体周围形成的抗-cd63抗体夹心复合物(参见图6中的插图)，故确定从柱子洗脱的峰(d)含有通过免疫分离法分离和回收的cd63 外泌体。另外，由于一些外泌体复合物的洗脱或对柱子无亲和力的过量外泌体的非特异性反应，预测即使在外泌体样本的注入位置也会产生弱信号(图6中的峰(c))。然而，峰(c)被排除在进一步分析之外，因为其大小小于峰(d)的10％。
[0099]
评价实施例2：实施例2的免疫亲和色谱法的再现性评价
[0100]
图7示出了在重复图6的免疫亲和色谱法时外泌体分离的再现性。
[0101]
为了确认使用实施例2的免疫亲和柱进行外泌体分离的再现性，将相同的免疫分离过程重复三次。如上文已提到的，对从每个实验获得的洗脱液级分进行cd63 外泌体的免疫测定以获得它们的色谱图(参见图7，a)。在更换使用不含ca
2
的转运溶液洗脱后(在第35个级分后)，尽管重复实验，cd63 外泌体仍被分离出并形成单个独立的峰。而且，发现形成cd63 外泌体的峰的级分数和来自外泌体的特定信号的强度非常相似。特别地，色谱图上来自回收的外泌体峰中第37、38和39号级分中存在的cd63 外泌体的免疫测定信号显示出≤9.4％的平均变异系数(cv)，表明具有高再现性(图7，b)。
[0102]
更具体而言，首先，如上获得免疫亲和色谱图，并按相同的分离操作规程回收和分析每个洗脱液级分中存在的外泌体。此过程重复三次。获得了构成分离的外泌体的每个峰的主要级分中存在的cd63 外泌体的免疫测定结果。使用测得的信号之间的变异系数(cv)作为评价分离测试的再现性的指标。用于分离的凝胶柱填充有tris-hcl缓冲液并在不用时储存于4℃。
[0103]
评价实施例3：实施例3的富集性能评价
[0104]
图8示出了使用基于开关样结合的本发明的亲和分离系统和方法从样本分离和富集cd63 外泌体的过程中免疫磁性分离的结果。
[0105]
为了测试实施例3的富集性能，对其他标准外泌体标准样本(1、3或5μg/ml)重复进行磁性分离，然后如上所述对cd63 外泌体进行夹心酶联免疫吸附测定。结果在图8，a中以黑条示出。磁性富集前原始标准样本中cd63 外泌体的免疫测定结果在图8，a中以白条示出。对比磁性分离前后样本的结果，由磁性富集产生的信号的强度平均增加约3.7倍。将原始标准样本的免疫测定的剂量响应通过log-logit转换线性化以确定分离出的外泌体的富集比，并由其确定富集的cd63 外泌体的浓度(图8，b)。特别地，基于cd63 外泌体，3μg/ml外泌体样本被富集至22μg/ml，这对应于大约7.9倍的富集效率。
[0106]
分离前后外泌体样本的浓度通过与用标准试剂进行免疫测定所得到的结果进行比较来确定。首先，将标准外泌体标准试剂用酪蛋白-tris稀释来制备外泌体标准样本(1-100μg/ml)。将抗-cd63抗体(5μg/ml；100μl)铺在微孔中以进行免疫测定，于37℃下温育1小时，并用捕获结合物固定在孔的内表面上。洗涤后，在与上述相同的条件下用酪蛋白-tris封闭剩余的表面。将外泌体样本(每个100μl)铺在不同的孔中并于37℃下温育12小时。按上述elisa操作规程进行随后的过程。
[0107]
评价实施例4：实施例3的免疫磁性分离的再现性评价
[0108]
图9示出了在重复图8的免疫磁性分离时外泌体分离的再现性。
[0109]
实施例3中基于开关识别材料的磁性富集技术使得能够在“ca
2
开启”条件下捕获靶标外泌体，依次在“ca
2
关闭”条件下回收外泌体，再生预处理磁珠，并重复使用预处理磁珠进行新样本的分离和富集。为了评价预处理珠子实际的重复使用的富集性能再现性，以磁性方式分离和富集不同浓度的外泌体标准样本(1、3和5μg/ml；收集自标准人血浆)，并使用重复使用的预处理珠子重复同一过程两次。通过cd63 外泌体的夹心酶联免疫吸附测定法分析分离出的外泌体样本的浓度。结果在图9，a中示出。参考图9，a，在使用预处理珠子分离和富集样本时，cd63 外泌体的浓度响应图案非常相似。在实践中，发现基于外泌体浓度的分离样本中cd63 外泌体的富集具有很高的重现性，基于来自免疫测定的信号值，平均cv为8.3％(参见图9，b)。
[0110]
这里，标准样本(1、3和5μg/ml)通过用结合溶液稀释来自健康对象的外泌体标准试剂制备。磁珠在不用时浸没在酪蛋白-tris中并储存于4℃。
[0111]
评价实施例5：实施例2和3中分离出的cd63 外泌体的表征
[0112]
图10示出了使用基于开关样结合的本发明亲和分离系统和方法分离出的cd63 外泌体的物理表征的结果。图11示出了使用基于开关样结合的本发明亲和分离系统和方法分离出的cd63 外泌体样本的外泌体表面标志物的免疫化学表征的结果。
[0113]
外泌体的两个特征(包括微囊泡的形貌和不同类型表面蛋白的分布)实际上是通过实施例2和3中分离的cd63 外泌体亚群的形貌表征和表面蛋白的免疫测定来确定的。对于形貌表征，测量了通过本发明方法分离出的外泌体的形貌。为此，使用扫描电子显微镜(sem)观察图像并通过动态光散射(dls)测量尺寸分布。通过蛋白质印迹法确定外泌体蛋白的分布。分离后的回收率通过酶联免疫吸附测定法(elisa)测量。
[0114]
扫描电子显微镜(sem)成像。通过sem成像观察在实施例2和3中分离出的cd63 外泌体样本的形貌。为了获得高放大倍率的图像，按标准操作规程从通过免疫亲和色谱法或免疫磁性分离法分离的外泌体样本中制备试样。为了测量固态微观结构和形貌，将每个原始样本转移到显微镜载玻片上并盖上盖玻片，将物体浸没在液氮中并通过快速冷冻固定。
取下盖玻片后，通过加入2.5％的戊二醛溶液固定冷冻试样，用tris-hcl缓冲液和去离子水洗涤(各一次)，并用丙酮脱水。然后，用液态二氧化碳进行临界点干燥来除去丙酮。使用tempfix安装胶将样本安装在铝柱上，并使其表面与胶体银接触。在溅射涂覆3nm至5nm厚度的铂后，用hitachi s-4700sem(hitachi；日本东京)观察样本。在每个样本的图像中，观察到直径约100nm的球形颗粒(参见图10，a)。在实践中，外泌体为从各种类型的细胞释放的膜微囊泡并已知具有大约30nm至200nm的直径。
[0115]
动态光散射(dls)分析。为了更准确地测量每个分离的cd63 样本的尺寸分布，在室温下使用粒度分析仪(elsz-1000，otsuka electronics；日本大阪)对外泌体进行dls分析。将外泌体样本(0.5ml)转移到一次性比色皿(bi-scp，brookhaven instruments corporation；美国纽约)中并按制造商的指南进行分析。在根据stokes-einstein方程确定外泌体的尺寸后，表征细胞外囊泡的尺寸分布。结果发现，每个样本中的平均粒径在约186.2nm或约193.8nm的水平(参见图10，b)。从测得的粒度和粒度分布来看，可以确定通过免疫亲和色谱法和免疫磁性分离法分离的样本中存在的颗粒为外泌体。
[0116]
蛋白质印迹法。为了确定不同类型表面蛋白的分布——这是外泌体的一般特征之一，对实施例2和3中分离的cd63 外泌体样本中的四跨膜蛋白蛋白质标志物进行蛋白质印迹法分析。在优化的条件下对外泌体样本进行sds-page分析后，将分离出的蛋白质转移到硝酸纤维素膜，并让对通常大量分布在外泌体表面上的cd9、cd63和cd81特异性的抗体-hrp缀合物与相应的靶标蛋白质反应。更具体而言，首先，用含有150mm nacl、1％triton x-100、0.5％脱氧胆酸钠和0.1％十二烷基硫酸钠(sds)的50mm tris缓冲液(ph 8.0)处理每个外泌体样本。使用8％sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)分离出变性蛋白质并通过电泳转移到硝酸纤维素膜上。在用酪蛋白-pbs封闭剩余表面后，使用抗-cd63、cd9和cd81抗体进行印迹，这些抗体已在先前与hrp化学缀合。最后，加入含有3,3'-二氨基联苯胺(dab)的hrp底物溶液作为显色试剂以在膜上产生比色信号。底物溶液通过向50mm醋酸钠缓冲液(ph 5.0；1ml)中加入0.05％dab(10μl)和3％h2o2(1μl)来制备。
[0117]
染色比色信号证实外泌体的所有四跨膜蛋白蛋白质标志物都在实施例2和3中分离的cd63 外泌体样本中得到了表达(见图11，a)。作为参考，与cd9和cd81条带的比色信号相比，来自cd63的条带信号并不清晰。这受到较宽的条带分布(30kda至60kda)的影响，因为cd63标志物为糖基化蛋白，但更根本的原因在于该评价实验中使用的外泌体标准样本(图11，a；对照)中cd63标志物表达的条带信号低(参见图11，a)。综合以上结果，通过免疫亲和色谱法和免疫磁性分离法分离的样本表现出外泌体的所有一般特征，表明本发明方法成功地分离了cd63 外泌体亚群。
[0118]
分离后cd63 外泌体的回收率。为了确定外泌体分离系统的回收率，在分离前/后对样本中的cd63 外泌体进行定量分析，并使用通过对外泌体标准样本的cd63标志物的免疫测定获得的标准曲线间接测量cd63 外泌体亚群的浓度。标准曲线通过酶联免疫吸附测定法(elisa)，使用对外泌体表面标志物cd63具有特异性的抗体作为免疫测定过程中的捕获和检测结合物而获得(图11，b；左)。分离前/后在相同的条件下对样本进行免疫测定。将所得信号代入标准曲线中以计算外泌体的浓度。在校准体积稀释因子后，计算免疫亲和色谱法和免疫磁性分离法前/后外泌体样本中外泌体的总量以确定分离过程的回收产率(图11，b；右)。发现免疫亲和色谱法和免疫磁性分离法的产率分别为约78.3％和约68.5％，与
在严苛条件如酸性ph下回收分离产物的常规分离过程的产率(例如，《50％)相比非常高。这是因为在使用开关识别材料的分离过程中在从溶液除去钙离子时识别材料对cbp的亲和力降低到背景水平，从而导致分离出的外泌体相对高的回收产率和外泌体最少的结构变形。
[0119]
评价实施例6：在使用cd63 外泌体亚群作为诊断样本时的分析性能评价
[0120]
图12示出了基于cd9浓度的cav1校正浓度以补偿外泌体标准样本之间的浓度变化。图13示出了使用本发明的基于开关样结合反应的亲和分离系统和方法分离出的cd63 外泌体作为对黑色素瘤癌诊断的分析样本的潜在效果。
[0121]
靶标标记物的浓度归一化。当使用分离的cd63 外泌体亚群作为诊断样本时，由于cav1 外泌体作为黑色素瘤癌相关标志物的富集效应，故预测了高灵敏度的诊断。然而，当仅仅测量cav1蛋白的表达水平时，由于样本中外泌体的不同浓度，故在准确确定分离效果方面存在局限性。因此，引入了一种通过基于通常存在于外泌体表面上的cd9的校准来归一化标志物的方法，以最大限度地减少性能比较过程中的不确定性。为此，将cav1蛋白特异性抗体和cd9蛋白特异性抗体固定到微量滴定板的不同孔上，在孔中铺上相同的样本，然后温育。使用cd63抗体作为检测抗体进行elisa。结果，获得了与癌症标志物和标准标志物的浓度成比例的信号(参见图12中的条)，并计算了信号的比率(即，cav1/cd9信号比)(参见图12中的线)。当来自健康对象的血浆样本被稀释和分析时(图12，a)，cav1/cd9信号比平均为0.147，其在不同的稀释因子下几乎保持恒定。对于黑色素瘤癌细胞样本(图12，b)，测量到相对高的标志物信号并且cav1/cd9比率平均为0.206，表明cav1表达水平平均比标准样本、高约40％。因此，总外泌体浓度的变化可通过用cd9 外泌体作为标准标志物校准cd63 外泌体亚群中的cav1 外泌体来归一化。
[0122]
为了详尽说明评价实验过程，通过用酪蛋白-tris稀释从标准血浆或黑色素瘤癌细胞系获得的外泌体来制备外泌体标准样本(5μg/ml至100μg/ml)。样本中标志物的浓度测量如下。首先，将对标志物特异性的捕获抗体(5μg/ml；100μl)铺在微孔中并于37℃下温育1小时以进行固定。随后的过程以与上述针对cd63的elisa过程相同的方式进行。测量分析后cd9和cav1产生的信号并计算样本的cav1/cd9信号比。
[0123]
分离的外泌体亚群作为诊断样本的潜力。使用通过免疫测定法测量cav1/cd9信号比的方法测试基于开关识别材料分离的作为诊断样本的cd63 外泌体亚群对黑色素瘤癌症诊断的潜在效果。分离健康外泌体和黑色素瘤癌外泌体标准物(各25μg/ml)以获得cd63 外泌体亚群，并就cav1蛋白的表达水平与分离前进行比较。与分离前大量健康外泌体样本相比，分离前大量癌症外泌体样本的cav1/cd9信号比增加了约40％(图13，a；左)。与通过免疫色谱法分离的健康cd63 外泌体亚群样本相比，通过免疫色谱法分离的癌症cd63 外泌体亚群样本的信号比增加了约4倍(即400％)(图13，a；右)。也就是说，分离的cd63 外泌体亚群样本的使用导致了黑色素瘤癌细胞筛查的潜在灵敏度约10倍的增加。对于通过免疫磁性分离法分离的亚群样本的使用，也发现对黑色素瘤癌细胞筛查的潜在灵敏度的增加(图13，b)。这种效果预计是由于使用cd63 外泌体亚群作为筛查样本，不仅导致cav1 外泌体浓度增加，而且导致cd9 外泌体浓度减少。确实有报道称，癌症样本中cd9 外泌体的浓度降低。
[0124]
评价实施例7：与传统外泌体分离系统的性能比较
[0125]
图14比较了本发明的基于开关样结合的亲和分离系统和目前市售的外泌体分离系统基于通过分离样本的免疫测定确定的cav1/cd9浓度比区分黑色素瘤癌样本与标准样
本的能力。
[0126]
通过与使用目前市售的外泌体分离试剂盒获得的样本进行比较，客观评价了使用实施例2和3中基于开关识别材料的分离系统获得的cd63 外泌体亚群样本对黑色素瘤癌细胞筛查的效果。市售的外泌体分离试剂盒以商品名exoquick
tm
、magcapture
tm
和exoeasy maxi
tm
出售。按每个系统的既定操作规程分离出25μg/ml的标准外泌体和黑色素瘤癌外泌体标准物(各1ml)。如上所述，通过elisa测量分离出的外泌体样本中cav1和cd9蛋白的表达水平作为信号。计算并比较作为校准参数的cav1/cd9信号比。结果在图14中示出。参考图14，如上文所提及，与标准样本相比，通过本发明的免疫色谱和免疫磁性分离系统获得的癌症cd63 外泌体亚群样本的cav1/cd9信号比在癌症样本中分别增加了5.5倍和4.1倍。相比之下，无论使用何种试剂盒，在使用市售的分离试剂盒获得的样本与分离前的样本之间，cav1/cd9信号比没有显著差异。相反，与标准样本相比，癌症样本的cav1/cd9信号比降低。
[0127]
这些结果被认为是因为商业外泌体分离试剂盒的分离原理与本发明的分离系统的原理不同。商业试剂盒基于的是使用聚合物如聚乙二醇进行外泌体分离的沉淀方法(exoquick
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，sbi)、使用蛋白质在金属离子的存在下与外泌体表面上的磷脂酰丝氨酸(ps)反应进行外泌体分离的亲和方法(magcaprue
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，wako)以及使用旋转柱进行外泌体分离以缩短分离所需时间的方法(exoeasy maxi
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，qiagen)。
[0128]
大多数商业试剂盒仅用于分离或浓缩大量外泌体群体并且在显著改善诊断灵敏度方面受到限制，这使得其难以应用于癌细胞筛查。另外，可应用靶向特定外泌体表面标志物的常规免疫分离法来提高诊断灵敏度，但在不引入如本发明中使用开关识别材料的创新方法的情况下在外泌体回收产率和保持完好形态的方面没有竞争力。
[0129]
下文将简要描述使用本评价实验中使用的商业试剂盒进行外泌体分离的过程。
[0130]
使用exoquick试剂盒进行外泌体分离。根据制造商的指南分离外泌体标准样本。简言之，将商业外泌体样本(各25μg/ml；1ml)分别转移到微孔中，并向其加入预定量的exoquick外泌体沉淀溶液。混合后，将混合物于4℃下冷藏。将混合物离心并弃去上清液。收集以颗粒形式沉淀的外泌体，重新溶解在缓冲液(500μl)中，并如前所述进行免疫测定以确定cav1/cd9比率。
[0131]
使用magcapture试剂盒进行外泌体分离。根据制造商的操作规程分离相同的外泌体标准样本。简言之，向含有金属离子作为结合促进剂的样本(1ml)中加入包覆有磷脂酰丝氨酸(ps)结合蛋白(一种对外泌体特异性的捕获因子)的磁珠(60μl)。让混合物在搅拌下反应3小时。其后，用洗涤溶液(含有150mm nacl、0.05％吐温20和20mm tris-hcl的2mm cacl2(ph 7.4；1ml))洗涤珠子三次并用洗脱剂(含有150mm nacl和2mm edta的20mm tris-hcl(ph 7.4))洗脱。进行免疫测定以确定回收的外泌体样本的cav1/cd9比率。
[0132]
使用exoeasy maxi试剂盒的外泌体分离。使用另一种商业试剂盒分离外泌体样本。简言之，向等体积的样本中加入随试剂盒提供的xbp缓冲液(1ml)。轻轻混合后，让混合物在室温下静置并预热至室温。将混合物转移到exoeasy旋转柱中，然后离心1分钟。在将xwp缓冲溶液(10ml)加载到柱上后，再进行5分钟的离心以除去加载的缓冲溶液。将旋转柱转移到新的回收管，然后向柱上加载xe缓冲液(500μl)，接着温育1分钟。再离心5分钟后，洗脱外泌体并在管中回收。最后，将洗脱液再次加载到旋转柱上，温育1分钟，并离心5分钟。回收洗脱液并如上所述进行免疫测定以确定cav1/cd9比率。
[0133]
虽然本文已参考具体实施方案描述了本发明，但这些实施方案并不用于限制本发明而是仅出于说明的目的阐述。对于本领域技术人员显而易见的是，可在不脱离本发明的精神和范围的情况下做出修改和改进。
[0134]
对本发明的此类简单的修改和改进属于本发明的范围，本发明的具体范围将由附随的权利要求书明确限定。
[0135]
[附图标记的说明]
[0136]
1：靶标亚群的靶标
[0137]
10：配体
[0138]
20：结合物
[0139]
30：识别材料
[0140]
40：固定构件
[0141]
50：捕获材料
[0142]
c：缀合物
[0143]
p：靶标标记物