一种出芽短梗霉利用无氮培养基生产黑色素的方法与流程

1.本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种出芽短梗霉利用无氮培养基生产黑色素的方法。


背景技术：

2.黑色素包括天然黑色素和人工合成黑色素两类，其中天然黑色素是由酪氨酸、多酚及相关化合物代谢产生的，或者由花色素与糖以糖苷键结合而成的一类异源多聚芳香族化合物，广泛存在与动植物及微生物中，为生物体提供结构性强度或保护生物免受紫外线、电离辐射、重金属污染、低温或高温等环境胁迫的伤害，具有重要的生理作用。除此之外，黑色素在农业、轻工业、食品、医药等领域具有广泛应用。例如，在农业领域，可以作为某些对紫外线敏感的生物杀虫剂的光保护剂；在轻工业领域，可以作为化妆品添加剂用于抗紫外辐射、清除自由基、抗氧化等，作为特种塑料和特种玻璃的着色剂用于防辐射；在食品领域，可以作为酒类、饮料类、婴儿保健品及大众食品的天然色素添加剂；在医药领域，可以用于抗毒解毒、提高抗辐射能力、提高免疫力等。
3.由于黑色素具有广泛的应用前景和价值，而利用微生物生产黑色素相较于化学合成和动植物提取法，具有生产条件温和、工艺简单、成本低等优点，目前，已有多种细菌、酵母菌、以及丝状真菌被报道可用于生产黑色素。其中，出芽短梗霉（aureobasidium pullulan）是一种极具应用开发价值的黑色素生产菌种。出芽短梗霉是一种具有酵母型和菌丝型的多形态真菌，在世界各地广泛分布。通常大多数出芽短梗霉会产生黑色素，从而俗称黑酵母真菌。因此，国内外研究人员针对出芽短梗霉生产黑色素的研究日益增多。
4.在利用出芽短梗霉生产黑色素的研究方面，检索到相关的文献如下：1、申请号为201110425459.2的中国专利文献，公开了一种出芽短梗霉联产普鲁兰多糖和黑色素的方法，利用出芽短梗霉（a. pullulan）作为生产菌株；发酵培养基组成为：蔗糖 180 g/l，蛋白胨 5 g/l，k2hpo
4 5 g/l，nacl 5 g/l，mgso4·
7h2o 0.5 g/l，feso
4 0.01 g/l；在30 l发酵罐中采用阶段控温策略（前24 h发酵温度为32℃，后将发酵温度调整为27℃），发酵4天后从发酵液中获得3.4 g/l的黑色素粗品。
5.2、申请号为201110429965.9的中国专利文献，公开了一种生产黑色素的诱变菌株出芽短梗霉及其培养方法和应用，所用菌株为出芽短梗霉（a. pullulan）；发酵培养基组成为：蔗糖30 g/l，丁二酸铵3 g/l，丁二酸50 g/l，k2co
3 0.4 g/l，k2hpo
4 0.1 g/l，mgso4·
7h2o 0.1 g/l，znso4·
7h2o 0.005 g/l，玉米浸出液0.5 g/l；利用三角瓶发酵6天，黑色素产量为8 g/l。
6.3、申请号为201110425750.x的中国专利文献，公开了一种新型天然黑色素的生产方法，所用菌株为出芽短梗霉（a. pullulan）；发酵培养基组成为：葡萄糖80 g/l，土豆汁800 g/l，牛肉膏5 g/l，feso
4 0.05 g/l；利用10 l发酵罐发酵4天，黑色素产量为10.74 g/l。
7.4、申请号为201110426527.7的中国专利文献，公开了一种利用氧化胁迫提高出芽
短梗霉黑色素产量的方法，所用菌株为出芽短梗霉（a. pullulan）；发酵培养基组成为：葡萄糖40 g/l，土豆汁400 g/l，牛肉膏1 g/l，feso
4 0.02 g/l，h2o
2 15 mmol/l；利用10 l发酵罐发酵5天，黑色素产量为12.86 g/l。
8.5、申请号为201510703927.6的中国专利文献，公开了一种耐辐射出芽短梗霉及其在制备黑色素中的应用，所用菌株为出芽短梗霉（a. pullulan）；发酵培养基组成为：葡萄糖10.3 g/l，酵母浸粉2.02 g/l，硫酸铵2 g/l，nacl 0.5 g/l，利用三角瓶发酵4天，黑色素产量为0.53 g/l。
9.通过分析上述公开专利及相关文献报道，利用出芽短梗霉（a. pullulan）发酵生产黑色素，产量较高的可达12 g/l以上。但是，使用的培养基的营养成分都十分丰富和复杂，特别是大量有机氮源（例如蛋白胨、牛肉膏、酵母浸粉、土豆汁、玉米浸出液等）的使用不仅增加了生产成本，也极易引起规模化生产过程中发酵罐内的泡沫问题，严重时会导致发酵失败。


技术实现要素：

10.本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种出芽短梗霉利用无氮培养基生产黑色素的方法，本发明是以出芽短梗霉（aureobasidium pullulans）gxz-6，保藏编号为cctcc no：m 2017517为生产菌种，以葡萄糖为底物，辅以kcl和mgso4·
7h2o组成无氮培养基，在30℃条件下，采用分批发酵方式生产黑色素，生产得到的黑色素产量可达到4.6 g/l。利用这种无氮培养基发酵生产黑色素，原料成本低、生产过程中不易产生泡沫、操作简便，极具工业生产潜力。
11.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种出芽短梗霉利用无氮培养基生产黑色素的方法，包括如下步骤：（1）菌种活化将出芽短梗霉（aureobasidium pullulans）gxz-6接种于pda固体斜面培养基（马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水定容至1l，自然ph），25~30℃培养36~48h；所述出芽短梗霉（aureobasidium pullulans）gxz-6的保藏编号为cctcc m 2017517，保藏日期为2017年9月20日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学。
12.（2）种子液制备将整个pda固体斜面培养基上的菌落接入装有50ml液体种子培养基的250ml三角瓶中，摇床转速180~220rpm，25~30℃培养36~48h至菌株对数生长中期，以此作为一级种子液；将50ml一级种子液接入装有250ml液体种子培养基的3l三角瓶中，摇床转速180~220rpm，25~30℃培养36~48h至菌株对数生长中期，以此作为二级种子液；所述液体种子培养基浓度组成为：葡萄糖80~100g/l，kcl 0.1~1g/l，mgso4·
7h2o 0.1~1g/l，自然ph，蒸馏水配制。
13.（3）液体发酵将二级种子液按接种量5~15%（v/v）接入装有液体发酵培养基的5l发酵罐中，发酵罐装液量为3.5~4l，转速200~400rpm，通气量0.5~1vvm，25~30℃发酵4~7天；所述液体发酵培养基浓度组成为：葡萄糖100~140g/l，kcl 0.2~2g/l，mgso4·
7h2o 0.2~2g/l，自然ph，蒸馏水配制。
14.（4）黑色素产量测定将发酵液离心弃上清，收集沉淀，沉淀物包含菌体和胞外黑色素；将沉淀物均匀分散于0.5 m naoh溶液中，经超声波细胞破碎仪破壁处理后，沸水浴20min，冷却后离心去除沉淀物，收集上清液；将上清液与6 m hcl按体积比2：1混合，静置2h后，离心收集沉淀，冷冻干燥后得到黑色素。利用称重法测定黑色素产量。
15.与现有技术相比，本发明的有益效果是：出芽短梗霉（aureobasidium pullulans）gxz-6可在无氮源培养基中生产黑色素，本发明采用分批发酵方式生产黑色素的产量可达到4.6g/l。相较于已公开的出芽短梗霉发酵生产黑色素的技术而言，本发明利用这种无氮培养基发酵生产黑色素的方法，具有培养基简单、原料成本低、生产过程中不易产生泡沫、操作简便的显著优势。上述有益效果表明本发明技术极具工业生产潜力。
附图说明
16.图1为本发明实施例3步骤（3）中液体发酵过程图；图2为采用本发明一种出芽短梗霉利用无氮培养基生产黑色素的方法生产得到的黑色素产品图。
具体实施方式
17.下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式并不局限于实施例表示的范围。
18.实施例1一种出芽短梗霉利用无氮培养基生产黑色素的方法，包括如下步骤：（1）菌种活化将出芽短梗霉（aureobasidium pullulans）gxz-6接种于pda固体斜面培养基（马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水定容至1l，自然ph），30℃培养48h；所述出芽短梗霉（aureobasidium pullulans）gxz-6的保藏编号为cctcc m 2017517，保藏日期为2017年9月20日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学。
19.（2）种子液制备将整个pda固体斜面培养基上的菌落接入装有50ml液体种子培养基的250ml三角瓶中，摇床转速220rpm，30℃培养48h至菌株对数生长中期，以此作为一级种子液；将50ml一级种子液接入装有250ml液体种子培养基的3l三角瓶中，摇床转速220rpm，30℃培养48h至菌株对数生长中期，以此作为二级种子液；所述液体种子培养基浓度组成为：葡萄糖100g/l，kcl 1g/l，mgso4·
7h2o 1g/l，自然ph，蒸馏水配制。
20.（3）液体发酵将二级种子液按接种量15%（v/v）接入装有液体发酵培养基的5l发酵罐中，发酵罐装液量为4l，转速400rpm，通气量1vvm，30℃发酵7天；所述液体发酵培养基浓度组成为：葡萄糖140g/l，kcl 2g/l，mgso4·
7h2o 2g/l，自然ph，蒸馏水配制。
21.（4）黑色素产量测定将发酵液离心弃上清，收集沉淀，沉淀物包含菌体和胞外黑色素；将沉淀物均匀分
散于0.5 m naoh溶液中，经超声波细胞破碎仪破壁处理后，沸水浴20min，冷却后离心去除沉淀物，收集上清液；将上清液与6 m hcl按体积比2：1混合，静置2h后，离心收集沉淀，冷冻干燥后得到黑色素。利用称重法测得黑色素产量为3.7g/l。
22.实施例2一种出芽短梗霉利用无氮培养基生产黑色素的方法，包括如下步骤：（1）菌种活化将出芽短梗霉（aureobasidium pullulans）gxz-6接种于pda固体斜面培养基（马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水定容至1l，自然ph），25℃培养36h；所述出芽短梗霉（aureobasidium pullulans）gxz-6的保藏编号为cctcc m 2017517，保藏日期为2017年9月20日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学。
23.（2）种子液制备将整个pda固体斜面培养基上的菌落接入装有50ml液体种子培养基的250ml三角瓶中，摇床转速180rpm，30℃培养36h至菌株对数生长中期，以此作为一级种子液；将50ml一级种子液接入装有250ml液体种子培养基的3l三角瓶中，摇床转速180rpm，25℃培养36h至菌株对数生长中期，以此作为二级种子液；所述液体种子培养基浓度组成为：葡萄糖80g/l，kcl 0.1g/l，mgso4·
7h2o 0.1g/l，自然ph，蒸馏水配制。
24.（3）液体发酵将二级种子液按接种量5%（v/v）接入装有液体发酵培养基的5l发酵罐中，发酵罐装液量为3.5l，转速200rpm，通气量0.5vvm，25℃发酵4天；所述液体发酵培养基浓度组成为：葡萄糖100g/l，kcl 0.2g/l，mgso4·
7h2o 0.2g/l，自然ph，蒸馏水配制。
25.（4）黑色素产量测定将发酵液离心弃上清，收集沉淀，沉淀物包含菌体和胞外黑色素；将沉淀物均匀分散于0.5 m naoh溶液中，经超声波细胞破碎仪破壁处理后，沸水浴20min，冷却后离心去除沉淀物，收集上清液；将上清液与6 m hcl按体积比2：1混合，静置2h后，离心收集沉淀，冷冻干燥后得到黑色素。利用称重法测得黑色素产量为2.2g/l。
26.实施例3一种出芽短梗霉利用无氮培养基生产黑色素的方法，包括如下步骤：（1）菌种活化将出芽短梗霉（aureobasidium pullulans）gxz-6接种于pda固体斜面培养基（马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水定容至1l，自然ph），28℃培养42h；所述出芽短梗霉（aureobasidium pullulans）gxz-6的保藏编号为cctcc m 2017517，保藏日期为2017年9月20日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学。
27.（2）种子液制备将整个pda固体斜面培养基上的菌落接入装有50ml液体种子培养基的250ml三角瓶中，摇床转速200rpm，28℃培养42h至菌株对数生长中期，以此作为一级种子液；将50ml一级种子液接入装有250ml液体种子培养基的3l三角瓶中，摇床转速200rpm，28℃培养42h至菌株对数生长中期，以此作为二级种子液；所述液体种子培养基浓度组成为：葡萄糖90g/l，kcl 0.5g/l，mgso4·
7h2o 0.5g/l，自然ph，蒸馏水配制。
28.（3）液体发酵
将二级种子液按接种量10%（v/v）接入装有液体发酵培养基的5l发酵罐中，发酵罐装液量为3.6l，转速250rpm，通气量0.8vvm，28℃发酵5天；所述液体发酵培养基浓度组成为：葡萄糖120g/l，kcl 0.5g/l，mgso4·
7h2o 0.5g/l，自然ph，蒸馏水配制。
29.（4）黑色素产量测定将发酵液离心弃上清，收集沉淀，沉淀物包含菌体和胞外黑色素；将沉淀物均匀分散于0.5 m naoh溶液中，经超声波细胞破碎仪破壁处理后，沸水浴20min，冷却后离心去除沉淀物，收集上清液；将上清液与6 m hcl按体积比2：1混合，静置2h后，离心收集沉淀，冷冻干燥后得到黑色素。利用称重法测得黑色素产量为4.6g/l。