一种提高有效微珠比例的dELISA样品及其制备与检测方法与流程

技术特征：
1.一种提高有效微珠比例的数字化酶联免疫吸附分析样品的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将捕获物固定于容器内表面的活化位点，并用钝化剂封阻剩余的活化位点，再加入待检测的标志物，与捕获物结合形成捕获物-标志物免疫复合物；(2)使亲和素变体结合于生物素包被的磁性微珠表面，然后使之与生物素标记的检测抗体结合，使亲和素标记的报告物酶分子与磁性微珠表面的生物素结合，形成(检测抗体
n-磁性微珠-报告物酶分子
m
)复合物；其中所述生物素与所述亲和素变体通过可逆的方式结合；(3)将(检测抗体
n-磁性微珠-报告物酶分子
m
)复合物与步骤(1)中固定在容器内表面的捕获物-标志物免疫复合物特异性结合，洗去未发生特异性结合的游离态(检测抗体
n-磁性微珠-报告物酶分子
m
)复合物，得到(捕获物-标志物-检测抗体
n-磁性微珠-报告物酶分子
m
)免疫复合物；(4)解离(捕获物-标志物-检测抗体
n-磁性微珠-报告物酶分子
m
)免疫复合物中亲和素变体与检测抗体和/或磁性微珠上与生物素的连接，得到游离态的(磁性微珠-报告物酶分子
m
)和/或(检测抗体-磁性微珠-报告物酶分子
m
)报告复合物；(5)将步骤(4)中游离态的(磁性微珠-报告物酶分子
m
)和/或(检测抗体-磁性微珠-报告物酶分子
m
)报告复合物装载到微米坑阵列中，使得每个微米坑中只容纳一个(磁性微珠-报告物酶分子
m
)报告复合物，再加入底物，后油封，得到所述数字化酶联免疫吸附分析样品；其中，所述捕获物为抗原或抗体，n和m为不小于1的整数。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述容器的内表面积与磁性微珠截面积比值不小于6.02
×
10
10
。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述捕获物的数量不小于标志物数量的100倍。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，亲和素变体包括但不限于captavidin、tamavidin 2-rev；所述亲和素变体与检测抗体的数量比值范围是2.2
×
10-6-2.2
×
106。5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述(检测抗体
n-磁性微珠-报告物酶分子
m
)复合物与所述捕获物-标志物免疫复合物的数量比值不小于1。6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述容器的材质包括但不限于聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、玻璃；所述钝化剂包括但不限于牛血清蛋白。7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述报告物酶分子包括但不限于辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶中的一种；步骤2)中所述磁性微珠与报告物酶分子以及检测抗体采用a-c中任一种顺序结合：a)磁性微珠先与检测抗体结合再与报告酶分子结合；b)磁性微珠先与报告酶分子结合再与检测抗体结合；c)磁性微珠与报告酶分子、检测抗体共固结合。8.一种根据权利要求1-6任一方法制备得到的数字化酶联免疫吸附分析样品。9.一种使用权利要求7所述样品进行数字化酶联免疫吸附分析的方法，其特征在于，包括以下步骤：
制备若干组标志物浓度不同的数字化酶联免疫吸附分析样品，以及标志物浓度未知的待测数字化酶联免疫吸附分析样品；待所述数字化酶联免疫吸附分析样品酶催化后，记录亮光微米坑数量，根据标志物浓度与亮光微米坑数量建立标准曲线；根据待测数字化酶联免疫吸附分析样品的亮光微米坑数量确定其标志物浓度。10.根据权利要求9所述的数字化酶联免疫吸附分析，其特征在于，适用于肿瘤、传染病等疾病以及食品、环境检测。

技术总结
本发明公开了一种提高有效微珠比例的数字化酶联免疫吸附分析(dELISA)样品及其制备与检测方法。其制备与检测包括将容器内壁的活化、捕获物(Cp)的固定、生物素包被的磁性微珠(MMS)表面固定检测抗体(Ab2)和报告物酶分子(EZ)、(检测抗体


技术研发人员：崔玉峰 王志民 陈夏敏
受保护的技术使用者：上海北昂医药科技股份有限公司
技术研发日：2021.11.18
技术公布日：2022/3/7