内皮细胞-平滑肌细胞共培养的单流道微芯片模型的构建方法与流程

1.本发明属于微流控技术领域，具体涉及一种内皮细胞-平滑肌细胞共培养的单流道微芯片模型的构建方法。


背景技术：

2.心脑血管疾病是一类严重威胁人类健康的非传染性疾病，动脉血管狭窄是引起心脑血管疾病的因素之一，常见于冠状动脉粥样硬化等疾病中。血管内皮细胞与平滑肌细胞是血管壁的重要组成成分，在血管中扮演重要的角色，它们之间通过直接接触以及分泌物互相影响，联系密切。对于冠状动脉粥样硬化及其他心脑血管疾病的研究具有重要意义。
3.血管瘤、血管狭窄、动脉粥样硬化以及主动脉夹层等疾病的形成和发展与血液动力学参数的异常改变关系密切，如壁面切应力、剪应力梯度、振荡剪切指数。尤其是异常的血流剪切作用对内皮细胞及平滑肌细胞形态、功能以及基因表达的影响。
4.动脉血管壁从内向外依次为内膜、中膜和外模。内皮细胞是内膜的主要组成成分，其构成通透性屏障控制大分子物资的进出，同时具有一定的内分泌功能，其分泌的舒血管物质与缩血管物质相互制约，保持着动态平衡。血管平滑肌细胞是中膜的组成成分，其收缩与舒张可调节器官与组织的血流量。异常的血液流动引起的力学刺激改变将导致内皮形态改变以及分泌功能障碍。影响其接受信号因子，同样影响平滑肌细胞的级联信号的传导，很有可能诱发人体产生血管栓塞、动脉硬化等疾病。为了更好地研究流动剪切与内皮细胞形态和功能的相关性，在体外构建一个合适的模型至关重要。因此对于血管壁内皮细胞与血管壁平滑肌细胞的联合培养、细胞形态、分泌功能的研究显得尤为重要。
5.然而传统的培养方法虽然可以培养血管内皮细胞并模拟血管内皮细胞的生存环境但无法真实的模拟体内的生存尺寸，也无法观察判断血流剪切力对血管内皮细胞与平滑肌细胞形态与功能的改变。此外，动物模型虽然能够通过外界干预的手段诱导流动异常改变，进而考察血管内皮细胞形态和功能的改变，但是动物体内实验的流动存在不可操控、个体差异性，同时受到动物伦理等多方面的制约。
6.微芯片通道技术，可实现流动环境的连续可控、培养单元的相互连通，以及三维细胞培养，利用微芯片通道取代临床前动物实验进行药代动力学的研究已逐渐成为新的研究热点。微芯片通道模型采用光刻或软光刻的技术，将生化实验室中涉及的基本操作单元集中在一块微小的芯片上，微通道芯片技术相对于传统的动物实验相比成本更低，实验的周期短，微通道芯片技术的操作更加简单。结构改变和流动控制相对容易，易于实现不同结构诱导的流动剪切刺激的改变。细胞形态的观测更加直接便捷，通过引入适当的生物抗体，可以实现细胞功能的检测。更为重要的是微尺度下流体独有的效应能够有效地提高微通道分析速率及准确性。此外，微通道芯片实验可以避免动物实验中的动物与人类非同源时带来的研究误差。
7.但大多实验状态下的基于微通道芯片培养的细胞只能满足单层培养，培养种类单
一，无法模拟不同细胞之间的相互作用关系，无法在血流动力学下同时模拟多种细胞形态、功能、分泌物质的变化。无法得出多种细胞在体内的真实物理环境及生理表现。因此构建一种基于血流动力学，同时模拟两种细胞之间形态、功能关系的模型显得格外重要。
8.专利申请：一种基于背面发散式光刻技术的弧形截面血管网络微通道模板及制作方法，申请号cn201911268757.8。其主要问题存在于：该专利所声明的制作方法虽然可以制作高度不一致的血管模型，但是该模型仅仅从物理外观上模拟了血管网络，无法在生理基础上模拟真实的血管内部环境，无法模拟不同血管细胞之间的相互作用。
9.专利申请：一种动态检测力学微环境中细胞黏附的实验装置，申请号cn202110451602.9。其主要问题存在于：该专利虽然能够精确地调整流体剪切力的强度、方向、角度及模式并对内皮细胞或肿瘤细胞进行动态的观察，但是无法同时对内皮细胞和肿瘤细胞进行模拟，因而无法模拟两细胞彼此之间的影响，进而无法得出两细胞之间的细胞因子浓度。


技术实现要素：

10.本发明要解决的技术问题是提出一种可以在微流动通道内实现内皮细胞与平滑肌细胞共同培养的物理模型的制作方法。该模型的提出克服了单一微通道内内皮细胞与平滑肌细胞无法共同生长的难题，可以解决在同一流动刺激下实时同步观测两种细胞形态、功能检查、以及细胞间相互作用等技术问题。
11.本发明的技术方案如下：
12.一种内皮细胞-平滑肌细胞共培养的单流道微芯片模型的构建方法，包括以下步骤：
13.步骤1、绘制包含血管区域1及其周围限位孔结构2的结构模型；形状和宽度根据所模拟的血管结构和直径确定；
14.步骤2、纯黑色填充于结构模型之外的区域；
15.步骤3、根据步骤2得到的模型利用光刻技术制作阳模1#3和阳模2#4，二者血管尺寸及形状相同，阳模2#4中血管高度高于阳模1#3；
16.步骤4、按照质量比a:b＝1：1混合配制ab双组份透明硅橡胶溶液；充分混合后抽真空至硅橡胶溶液成无色透明；
17.步骤5、清洁阳模；
18.步骤6、抽真空后的硅橡胶溶液浇筑在阳模2#4上至硅胶液固化取下阳模2#4，得到硅胶模片5；
19.步骤7、硅胶膜片5与阳模1#3配合，硅胶模片5与阳模1#3的血管区域1之间插入进口微管6和出口微管8，形成微通道i7；
20.步骤8、对微通道i7内表面进行灭菌处理，并进行消毒和灭菌；利用高温高压设备对微通道模型内表面进行灭菌处理，并放置在紫外光下进行消毒和灭菌；
21.步骤9、利用微泵将生物试剂注入微通道i7中直至生物试剂充满微通道i7，对微通道模型血管内壁进行浸润处理；步骤10、微通道i7置于37℃细胞孵箱内干燥10～15分钟使其内表面干燥，以增强硅胶表面与细胞的联接能力，使得内皮细胞与平滑肌细胞在微通道模型表面更易贴附生长；
22.步骤11、将平滑肌细胞与bd-matrixgel基质胶溶液混合均匀得到平滑肌细胞-基质溶液，其中平滑肌细胞的密度大于1
×
107个/ml；以2-10μl/min的流速将平滑肌细胞-基质溶液注入到微通道i7内，直至其充满整个微通道i7；
23.步骤12、将平滑肌细胞-基质溶液于恒温箱保持32-42℃的恒定环境中，保持10-40min后，形成具有一定弹性的基质胶凝内平滑肌细胞层15；
24.步骤13、取下阳模1#3，将带有进出口的盖玻片13与含有基质胶凝内平滑肌细胞层15的硅胶膜片5贴合形成微通道ii14；
25.步骤14、配制内皮细胞密度大于1
×
107个/ml的内皮细胞培养液，将其注入到微通道ii14内，内皮细胞将在自身重力作用下发生贴壁生长，最终在单一通道内形成内皮细胞与平滑肌细胞共生且直接接触的双层细胞微通道模型；
26.所述阳模1#3和阳模2#4高度分别为50微米和100微米，二者均为玻璃基底。
27.所述步骤4中负压维持在0.8-0.98bar之间，维持30-50分钟直至硅胶溶液变成无色透明。
28.所述步骤5中，利用等离子清洗机对阳模进行清洗，清洗时间为1-3min，清洗次数为1-2次。
29.所述步骤9中，所采用的生物试剂是纤连蛋白溶液，浓度为40μg/ml，注入纤连蛋白溶液的流速为1-2μl/min。
30.所述步骤14中的内皮细胞培养液为质量百分比10％胎牛血清的dmem培养基悬液，注入含有内皮细胞的培养液的速度为2-10μl/min。所述注入操作时将含单微通道的芯片9上的出口微管8连接溶液回收瓶，进口微管6连接微注射器12，微注射器12的注入速度由微泵11控制。
31.本发明的有益效果：
32.1、在单一微通道内部的内皮细胞与平滑肌细胞的双层复叠式结构可以更加真实的模拟人体血管中内皮细胞-平滑肌细胞的物理接触；改善了传统微通道模型制作中，无法使内皮细胞与平滑肌细胞直接物理接触的技术难题；
33.2、通过模拟生理状态相同的流动剪切刺激下观测内皮细胞与平滑肌细胞形态和功能的变化；
34.3、实现在相同的流动剪切刺激下观测内皮细胞与平滑肌细胞之间的相互作用及其代谢产物，显著地提高了模型的临床应用价值。
附图说明
35.图1是设计的血管模型示意图；
36.图2是阳模1#示意图；
37.图3是阳模2#示意图；
38.图4是硅胶膜片成型过程；
39.图5是由阳模2#与硅胶膜片配合形成的微通道i示意图；
40.图6是基于微泵注射的微通道内溶液注射示意图；
41.图7已培养平滑肌细胞层的微通道示意图；
42.图8是单微通道内平滑肌细胞与内皮细胞共同培养的示意图。
43.图中：1血管区域；2限位孔结构；3阳模1#；4阳模2#；5硅胶膜片；6进口微管；7微通道i；8出口微管；9含单微通道的芯片；10溶液回收瓶；11微泵；12微注射器；13盖玻片；14微通道ii；15基质胶凝内平滑肌细胞层；16内皮细胞。
具体实施方式
44.以下结合附图，通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。以下提供了本发明实施方案中所使用的具体材料及其来源。但是，应当理解的是，这些仅仅是示例性的，并不意图限制本发明，与如下试剂和仪器的类型、型号、品质、性质或功能相同或相似的材料均可以用于实施本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
45.首先，利用autocad绘图软件绘制直血管区域1模型，血管的直径宽度为100μm，长度为20mm，在距离血管模型上下左右各10mm位置处设计直径为5mm的圆形限位孔结构2，并纯黑色填除血管区域1及限位孔结构2孔以外的区域充。利用常规的光刻技术根据所绘制的样式制作两个含有设计血管形状的玻璃基底的阳模，阳模1#3和阳模24#高度分别为50μm和100μm。
46.其次，将双组份sylgard pdms184 ab透明硅橡胶溶液按照a:b＝1:1质量比进行混合，充分搅拌10min，溶液内出现大量的汽泡，混合物呈白色。将装有混合物的试剂杯放入真空抽气机中，打开抽气阀，关闭出气阀，维持真空压力为0.98bar，40min后取出，并用小气囊吹出液态硅胶基质中少量剩余气泡，至硅胶液呈透明状。利用等离子清洗机对阳模板进行清洁，清洁2min，反复清洗2次。并将抽真空后的硅胶液浇筑在阳模2#4上，待硅胶液固化后取下阳模板2#4，得到硅胶膜片5。通过圆形限位孔结构2将硅胶膜片5与阳模1#3进行配合，经打孔和插入进口微管6和出口微管8形成含有进出口的微通道i7。
47.接着，将微通道i7放置在紫外光下进行消毒和灭菌。利用微泵11将40μg/ml纤连蛋白溶液以2μl/min的速度注入微通道i7中，使微通道i7内壁得以浸润。再放置在37℃细胞孵箱内干燥10～15分钟使微通道i7内表面干燥。
48.进一步，将细胞密度为107个/mol的平滑肌细胞与matilgel溶液混合均匀，通过微泵11以2μl/min的流速将其注入到微通道i7内。并放在37℃的恒温箱内约30min，至培养基质溶液形成柔软的基质胶，平滑肌细胞将均匀地分散在基质胶中。
49.最后，取下阳模1#3，将带有进出口的盖玻片13与培养了平滑肌细胞的硅胶膜片5贴合，经插入进口微管6和出口微管8形成微通道ii14。将配制细胞密度107个/mol的内皮细胞-质量百分比10％胎牛血清的dmem培养基悬液，通过微泵11以2μl/min的流速将其注入到微通道ii14内。内皮细胞将在自身重力作用下在平滑肌细胞-柔软基质胶壁面贴附生长，最终在单一通道内形成内皮细胞与平滑肌细胞共生且直接接触的双层细胞微通道模型。
50.综上，本发明提供了内皮细胞-平滑肌细胞双层微通道模型的制作方法，通过对平滑肌细胞与内皮细胞的联合培养，可以在更贴近于真实的血管结构，通过模拟生理状态下的血液剪切流动考察内皮细胞-平滑肌细胞的形态和功能的影响。本发明的建模方法，改善了传统微通道模型制作中，无法使内皮细胞与平滑肌细胞直接物理接触的技术难题。同时可以实现在同一流动刺激下内皮细胞-平滑肌细胞的相互作用及其代谢产物，显著地提高了模型的临床应用价值。
51.以上示例性实施方式所呈现的描述仅用以说明本发明的技术方案，并不想要成为毫无遗漏的，也不想要把本发明限制为所描述的精确形式。显然，本领域的普通技术人员根据上述示例做出很多改变和变化都是可能的。选择示例性实施方式并进行描述是为了解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的其它技术人员便于理解、实现并利用本发明的各种示例性实施方式及其各种选择形式和修改形式。本发明的保护范围意在由所附权利要求书及其等效形式所限定。