用于3D打印血管化组织和器官的方法与流程

用于3d打印血管化组织和器官的方法
1.本发明涉及一种用于制造包括血管结构的组织和器官的3d打印方法。该方法的新颖、创新的核心特别在于以下几点：
2.1)
3.专门的毛细墨水只在其它墨水类型的液滴附近的已打印液滴的边缘区域内发生反应，从而产生单个细胞层，由这些细胞层形成极其纤细的毛细血管。液滴内部的未交联的细胞被冲洗掉并且形成毛细血管的内部空腔。
4.2)
5.公开了一种新型的打印模型，其特征在于由有序施加的不同细胞类型构建而成并且由空间上切开的内部中空脉管(静脉、动脉和毛细血管)穿过的组织平面。
6.打印模型的特征在于将较大的组织或者器官细分成单个模块并且为了经济的打印流程而简化了打印图像。彼此独立地打印的单个模块被粘合成更高一级的目标结构。
7.3)
8.在装有介质的3d打印室内提供新型的打印机工作台，其确保为已打印的组织供应培养介质，使细胞不会死亡。
9.4)
10.提供可控的打印头供应单元，其为了墨滴按照打印算法的规定混合每单位体积的细胞浓缩物和墨水浓缩物以及(例如由不同墨水罐构成的)墨水的组合物，并且为打印头供应混合过后的墨水。
11.序言：
12.由于其具体的特征和与此相关的优缺点，传统的3d打印系统不具备能够产生能存活的较大组织和器官所需的特性。
13.为了借助于3d打印制造较大的能存活的组织或者器官，特别地，必须确保已打印的细胞的供养。因为通过扩散，只能在约500μm的路程上进行细胞的供养，所以需要同样打印的血管系统。毛细血管系统位于动脉和静脉之间，其单个毛细血管具有仅约10μm的非常小的直径并且还由单细胞的细胞层构建而成。
14.对于迄今为止已知的3d打印技术中的方法，要么虽然能在一个步骤中同时打印不同的细胞类型，但却对此无法达到必需的高打印分辨率(例如熔融沉积成型(fused deposition modeling)或者液滴技术)，要么达到了所需的高打印分辨率，但却无法对此在一个工作步骤内选择性地打印不同的细胞类型(例如立体光刻打印技术)。
15.额外地，存在具体的3d打印系统，例如激光诱导前向转移(laser induced forward transfer)，其中通过激光束，从基质中吸取出单个细胞并且将其引导至收集器基质。在此，既可以达到高打印分辨率，也可以在一个步骤中打印不同的细胞类型。然而，在此可达到的打印速度过低，导致该技术只能用于非常小的结构。
16.另一具体的打印系统是3d立体光刻打印的改进方案，其中也能够打印不同的细胞类型。然而，为此，特别地，必须在具有不同细胞类型的反应槽之间更换待打印的组织。该步骤同样只允许非常少的细胞层，并且是一个相对缓慢的过程，通过其只能打印较小的结构，
诸如微型器官。
17.其它具体的3d打印方法以已打印的组织内的空腔的形式留出用于后续的血管的空间，并且首先用培养介质供养周边的细胞。为了产生真实的毛细血管，这些组织必须被转化成向空腔供应内皮细胞和包围其的肌细胞的机体。该步骤也可以事后在培养箱中完成。如果以此方式，最终也能够在组织里产生毛细血管，那么该过程仍至少持续数天，并且尽管如此，仍未达到相关组织的自然复杂度。除此之外，使用这些技术，只能实现相对较大的脉管直径。
18.另一用可能方案是3d打印支架，由诸如软骨或骨等缓慢生长的细胞产生结构相对简单的组织，事后在支架上繁殖细胞。在这些缓慢生长的组织类型中，由于低新陈代谢速率，有足够的时间事后在机体内形成毛细血管。但是，该操作仅限于诸如骨和软骨等组织类型。对于例如肝脏细胞等更快速生长的简单的细胞类型，可以证明：非常小的组织区域可以成功地移植到肝脏器官中。然而，这些组织区域只能由非常小的结构组成，因为否则不再能够供养细胞。
19.以前所有用3d打印机产生作用良好的组织或者器官的试验要么导致组织单元非常小或者生长非常缓慢，要么导致较大的结构由于缺少明显的毛细血管而只能存活非常短的时间。
20.因此，需要一种3d打印方法，其
[0021]-一方面可以在一个工作步骤内选择性地打印不同的细胞类型，并且
[0022]-另一方面，可以达到立体光刻方法的高打印分辨率。
[0023]-额外地，该方法应具备可真实进行整个器官的打印的打印速度。
[0024]-此外，该新型打印系统应特别地早在打印过程中就通过在此过程中产生的毛细血管，用介质或者其它适合于供养细胞的液体彻底冲洗新形成的组织。
[0025]-特别地，打印方法还应提供新型的打印模型，通过该打印模型，有可能在动脉结构和静脉结构之间形成毛细血管系统，其内流动的液体(例如介质或者血液)可以在毛细血管系统中从动脉流向静脉。
[0026]-在主要实施方案中，新型打印方法的实现需要新型的打印机工作台，因为现有技术中的传统打印机工作台不能在打印过程中为已打印的组织供应培养介质。
[0027]-新型打印方法的实现优选地需要打印头供应单元，其按照打印算法的规定混合期望的细胞密度和打印液滴中所需的墨水浓度。
[0028]
根据本发明的目的通过一种新型的紫外线交联的液滴法得以实现，该方法由于其低粘度墨水而可以利用拟真的的高分辨率打印头，并且额外地通过单个液滴边缘区域内高特异性的、空间受限的反应，将打印分辨率提高至分子水平。
[0029]
迄今为止的用于打印细胞的液滴法涉及一些装置，在这些装置中，以类似于通过挤出机实现的方式，将由水凝胶墨水及位于其中的细胞构成的相对较大的液滴与打印头分离(热地或者压电地，参见图1至图2-7)。通常，对于一种细胞类型墨水，只存在唯一的打印机喷嘴。该喷嘴具有相对较大的直径，因为还处于溶胶状态的水凝胶的粘度仍然相对较高(图1和图2-7)。由此产生的液滴相对较大并且通常包含大量细胞(每个液滴约2000个细胞)。
[0030]
令人惊讶的是，已经证明，通过使用新配制的光敏细胞墨水代替以前所用的水凝
胶，可以显著降低细胞墨水液滴的粘度，使得可以由来自高分辨率的艺术打印领域的打印头对其进行加工。这在以前是不可能的。由此，可以打印几皮升(每个液滴含约20个细胞)的细胞墨水液滴(图8-10)。使用该打印分辨率，已经可以打印直径明显小于以前系统的毛细血管的毛细血管。额外地，证实了，通过将墨水配置为只局限于毛细墨水液滴的边缘区域内发生交联反应，可以再次进一步提高打印分辨率。相反，剩余液滴体积不经受该交联反应，并且随后被冲洗掉或者以其它途径将其清除，以便随后用作毛细血管空腔。通过该新型的打印过程，打印分辨率可以被提高至分子水平或者说单个细胞或者说细胞层的数量级，并且由此达到立体光刻系统的精细度。可用该方法打印的毛细血管可以像人体的毛细血管一样精细。
[0031]
局限于毛细墨滴的边缘区域的交联既可以通过墨水成分实现，也可以通过定向的激光束(或者另一定向的电磁波)实现。在此进行的反应可以是物理的、化学的或者生物的(参见实施例部分)。
[0032]
在整个打印过程中，优选地通过毛细血管结构，用培养介质彻底冲洗所产生的组织。为此，在打印过程中产生特定的打印模型，其在未来的动脉结构和静脉结构之间安排毛细血管的形成。
[0033]
如果要打印整个器官并且稍后将其移植到机体或者患者体内，则可以在移植前的有限时段内，在身体外的专门为此制造的装置中，将器官连接至患者的血液循环。通过该装置，可以检验器官的生理值并且测定最佳移植时间。


背景技术：

[0034]
在德国，高达15,000名患者等待捐赠器官。只有不到1/3的患者才能找到合适的器官。为了研究和药学，在德国每年进行约三百万次动物实验，这些动物实验会由于替代方案而变得多余。3d打印组织的另一领域是继续做出巨大进步的再生医学。
[0035]
3d生物打印可以为这些及其它应用领域提出一种解决方案。通过3d生物打印，用3d打印机制造细胞结构，其中在增材制造中堆叠细胞平面，以便由此形成复杂的三维结构。特别地，诸如熔融沉积成型(fused deposition modeling)、液滴法和立体光刻等技术适合于生物打印。
[0036]
熔融沉积成型是基于挤出的打印方法，其加工热塑性塑料和复合材料以及陶瓷和金属。借此，也可以打印海藻胶或者明胶凝胶中的细胞。该方法的缺点特别地在于低打印分辨率。液滴法加工聚合物溶液、胶体悬浮液和细胞悬浮液。液滴法的分辨率虽然高于熔融沉积成型的分辨率，但仍不足以打印血管结构。相反，由于使用精细的激光束，立体光刻具备迄今为止可实现的最高分辨率。其加工可光硬化的粘性聚合物溶液，该聚合物溶液暴露于定向的电磁射束，以在空间上交联溶液。其缺点在于：始终只能在反应槽内打印唯一的细胞类型。如果要添加另一细胞类型，则优选地必须更换反应浴。
[0037]
在现有技术中描述了市场领导者organovo的喷墨生物打印，其产生分别包括10,000到30,000个单个细胞的墨滴(来源：organovo)。organovo公司利用生物打印来特别地制造肝脏组织。通常将3d打印的组织部分植入到受损的器官中，这些3d打印的组织部分在其作用方式上支持现有肝脏并且由此延长该器官的寿命，直至找到合适的供体。
[0038]
在挤出式生物打印中，借助于机械压力，从小针头中喷出生物墨水。由此，逐层地
打印整个细胞结构。例如，envisiontec gmbh公司的生物打印机就利用该方法。工作速度比较快，但可惜打印分辨率非常低。
[0039]
例如，cellbricks公司和tissuse公司(“organ on a chip”)使用立体光刻技术。因为借助于激光束交联水凝胶，所以其提供最高的打印分辨率。然而，通过该方法，始终只能打印一种细胞类型。为了组合由多种细胞类型构成的组织，优选地，必须通过不同的反应槽更换所产生的组织，这会延缓该过程并且所打印的组织只能达到很小的尺寸。
[0040]
除了这些最常用的方法，还存在一系列得自修改的方法：
[0041]
一些技术旨在，在细胞培养过程中，在较大的已打印的静脉和动脉之间自行形成非常精细的毛细血管(直径最高为10μm那么小)(yu等，2014)。这样做的问题是：必须用更长的时间使所打印的组织完全成熟。将组织保持在细胞培养物中的时间越长，出现人为产物的可能性越大。
[0042]
又一解决途径是用聚合物打印软管状的结构，该聚合物随后再次被解聚并且被冲洗掉，并且应由此释放用于形成血管系统的空腔(kolesky等，2014；lee等，2014a,b)。然而，该解决途径是不充分的并且在以下两点上区别于此处公开的新方法：1)它是没有内皮细胞和极其纤细的分支的软管，需要更长期的培养(包括可预期的人为产物)，并且2)打印分辨率过低，无法产生真实的毛细血管系统。
[0043]
另一解决途径是双元打印：首先用立体光刻系统(其具有高分辨率，但是只能打印唯一的细胞类型)打印血管网络。随后，所打印的血管结构被转移至另一3d打印系统(其分辨率不高，但可以打印不同的细胞类型)，在其中打印剩余的组织细胞(yu等，2014)。为此，特别地，必须将已打印的血管结构从其中一个3d打印系统的反应容器中取出并且转移至另一3d打印系统的反应容器中。与此处公开的方法的特别区别在于：1)不能打印单细胞的细胞层，在更换时，这些结构会过于脆弱，并且2)需要两种不同的打印机，在更换时，污染的风险提高。
[0044]
为了能够实现此处公开的方法，在优选的实施方案中，特别地需要打印机工作台，其能够为已打印的组织供应培养介质，细胞由此不会供应不足或者死亡。此外，打印机工作台优选地必须位于装满液体的打印室内。
[0045]
传统3d打印方法的打印机工作台和打印室是对此不可用的。举例而言，大多3d打印系统(例如fdn、sls、bj等)在干燥的打印室内具有干燥的打印机工作台并且不具备任何容纳液体的可能性。
[0046]
虽然少量3d打印机类型具备装满液体的打印室(例如sla)，但并不存在包括额外的液体入口和出口的用于已打印的组织的供应系统，如在3d打印包括血管结构的组织和器官时所需的。
[0047]
此处公开的新型打印系统基于液滴法，并且在下文中列举的多个方面上区别于之前的液滴系统：
[0048]
1)利用了新型的光敏生物墨水，这些光敏生物墨水是低粘度的，从而不会堵塞拟真的艺术打印机的精细打印头。以前的墨滴包含约2000到3000个细胞并且由水凝胶构成(organovo)。水凝胶成分是液滴相对较大的原因，因为即便在溶胶状态下，其粘度也相对较高。此处公开的方法中产生的小液滴非常小、粘度低并且包含约20个或更少的细胞。通过艺术打印的打印头具备约160个或更多个喷嘴，而不是每种墨水类型仅一个喷嘴(如至今所应
用的)，实现已打印的细胞团。
[0049]
与此同时，墨水具有的配比使得直接交联并且由此防止液滴化开成为可能。液滴法中迄今为止存在的光敏水凝胶利用通过打印头外部的光源触发并且持续数分钟的较长时间的硬化。在此处公开的新型方法中，电磁波(例如可见光、ir、uv)源直接位于打印头内并且既可以是刚性的，也可以是定向的。
[0050]
2)
[0051]
此处公开的新型打印系统内的具体生物墨水(毛细墨水)只限于在液滴边缘区域内或者说在邻接其它墨水的液滴的区域内选择性地交联。该选择性交联可以由墨水的成分触发，或者由定向的电磁辐射触发。交联类型可以是生物的、化学的或者物理的。不在边缘区域内的特殊生物墨水的液滴成分被冲洗掉或者被以其它方式清除掉，由此形成用于所产生的毛细血管的必要空腔。
[0052]
在此过程中被冲到周围组织中的、未交联的毛细细胞(例如内皮细胞)例如变成稍后的新毛细结构的起点或者在组织分化过程中消失。
[0053]
通过这一过程，有可能获得一种打印分辨率，其中仅有针对性地交联单个分子或者单个细胞。迄今为止，只有高分辨率的立体光刻方法具有交联单个细胞的特性。在这种情况下，液滴大小优选地处于一飞升到10微升之间的量级内。
[0054]
由此产生的打印图像获得之前未能达到的新的品质，其中
[0055]-一方面，能够拟真地同时打印不同的墨水类型(例如肌细胞、神经细胞、结构墨水、毛细墨水)，并且其中
[0056]-另一方面，通过毛细墨水的选择性受限的边缘交联，打印分辨率高到形成单个细胞层(例如内皮细胞)。
[0057]
3)
[0058]
通过早在打印过程中就形成耐负荷血管系统，有可能早在打印过程中就为所产生的组织或者器官充分供应营养物质。对此所需的泵系统的接口首先由打印机工作台和位于其上的印刷板(图2-7)提供。为了产生对于每种组织构造而言单独的、还更精细的脉管和毛细血管接口，从这些接口开始打印单独的接口。在这种情况下，在优选的实施方案中，可以利用毛细墨水和组织墨水，或者首先利用结构墨水。
[0059]
如果在这种情况下利用了结构墨水，则可以实现结构墨水与细胞墨水之间的梯度过渡，由此对系统进行稳定化。迄今为止，还没有任何其中存在用于已打印细胞的这种供应系统的液滴技术。
[0060]
在成功打印后，可以在培养箱中继续培养可取出的印刷箔(制成的打印品位于其上并且该印刷箔具备用于液体的入口接口和出口接口(图19)。
[0061]
4)
[0062]
公开了一种新型的复杂打印模型，其使得在动脉结构和静脉结构之间形成毛细血管成为可能，在其中，其内流动的液体(例如介质或者血液)从动脉区域流入静脉区域。迄今为止，这种打印模型是未知的，并且由于目前的现有技术，还不能实现这种打印模型。
[0063]
因此，该打印模型是唯一的，因为能够在唯一的打印过程中有序地打印不同的细胞类型并且同时有序地产生仅若干分子那么大的结构。
[0064]
优选地，该打印模型的特征在于以下特性：
[0065]-用于针对所使用的细胞类型(墨水类型)并且针对毛细血管和动脉及静脉结构的距离和大小计算打印图像的特定算法。在这种情况下，算法一方面取决于待打印的模块的最佳毛细血管供应的需求，另一方面取决于相应组织构造的生理学和解剖学需求。
[0066]-由不同的组织类型和脉管构成的组织/器官被细分成单个模块，这些模块又被细分成打印平面(切片)。模块中的打印平面上不同的已打印细胞类型在此对应于其在相应组织或者器官内的脉管位置或者组织位置。
[0067]-优选地，产生了毛细血管内径为5微米或更大的综合毛细血管系统。在每个单个打印平面上，毛细血管相互间的距离优选地为约50微米。在打印结束后，其内流动的液体从动脉流向静脉。
[0068]-单个打印平面的总和形成单个模块。该模块优选地具备升脉管和降脉管(图15和图16)，二者通过位于其间的扇形辐射的较小的毛细血管相互连接。用于动脉输入和静脉输出的接口来自升脉管和降脉管。由此产生的微循环呈现已打印的组织中最小的供应单元。
[0069]-组合基础模块并将其粘合成更大的组织或者器官。来自微循环的升脉管和降脉管在此合并成输入和输出的主脉管。
[0070]
5)
[0071]
提供一种新型的打印机工作台，其能够在装有介质的打印室的z方向上移动并且具有供应接口，通过这些供应接口，可调节地为已打印的组织供应介质。
[0072]
6)
[0073]
提供一种打印头供应单元，在其中可调节地混合细胞密度和墨水浓度。按照打印机算法的规定，组合所混合的用于打印头的墨水。原则上，在方法中存在组织墨水、毛细墨水和结构墨水，其中还可以出现其它墨水类型。


技术实现要素：

[0074]
需要一种3d打印方法，其
[0075]-可以在一个工作步骤内选择性地打印不同的细胞类型，并且
[0076]-达到立体光刻方法的高打印分辨率。
[0077]-额外地，该方法应具备可真实进行整个器官的打印的打印速度。
[0078]-此外，该新型打印系统应优选地早在打印过程中就通过在此过程中产生的毛细血管，用介质或者其它适合于供养细胞的液体彻底冲洗新形成的组织(图16)。
[0079]-优选地，该打印方法还应提供一种新型的打印模型，通过该打印模型，有可能在动脉结构和静脉结构之间形成毛细血管系统，其内流动的液体(例如介质或者血液)可以在毛细血管系统中从动脉流向静脉。
[0080]-打印系统应特别地具备一种装置，其保证墨滴中每单位体积的细胞浓度足够高，而细胞不会在此过程中在打印头中凝结。
[0081]
该方法的优选流程为：
[0082]-在液滴打印机中提供包括细胞和交联分子的至少一种毛细墨水和另一生物墨水；
[0083]-在反应平面上施加至少一滴毛细墨水和生物墨水；
[0084]-使电磁波与反应平面上的这些液滴内的交联分子接触；
[0085]-并且借助于电磁波在液滴内的无定向或者定向移动，激活交联分子，由此形成交联结构并且由此获得血管结构。
[0086]-提供至少一种毛细墨水，其只在与其它墨水液滴相邻的液滴的边缘区域内交联
[0087]-冲洗掉或者清除毛细墨水的未交联的液滴成分
[0088]-提供可通过电磁波交联的低粘度生物墨水，其可由拟真打印机的高分辨率打印头进行加工并且直接在电磁波的影响下进行交联
[0089]-在包括培养介质的打印机内提供已打印的细胞的供应系统(通过打印机工作台提供)；其它优选的流程为：
[0090]-提供打印头供应单元，其优选地按照打印算法的规定调节墨滴中的细胞密度和墨水浓度并且将混合过的墨水引导至打印头。
[0091]-在装有介质的3d打印室内提供新型的打印机工作台，其确保为已打印的组织供应培养介质，细胞由此不会死亡
[0092]-提供用于针对所使用的细胞类型(墨水类型)并且针对毛细血管和动脉及静脉结构的距离和大小计算打印图像的特定算法。在这种情况下，算法一方面取决于待打印的模块的最佳毛细血管供应的需求，另一方面取决于相应组织构造的生理学和解剖学需求。
[0093]-单个打印平面的总和优选地形成单个模块。该模块具备至少一个升脉管和降脉管，其通过扇形的毛细血管相互连接。用于动脉输入和静脉输出的接口来自升脉管和降脉管。所产生的微循环呈现已打印的组织中最小的供应单元。
[0094]-组合单个模块并将其粘合成更大的目标结构，输入和输出的脉管在此组成共同的连接脉管。
[0095]
通过高分辨率的液滴打印机和用于应用电磁波的装置(优选激光器、紫外线灯或者二极管)，实现根据本发明的3d打印方法。在此使用的墨水是低粘度墨水，其可由拟真艺术打印机的高分辨率打印头进行加工并且直接在电磁波的影响下进行交联，优选地在一秒内进行交联。墨滴的体积可以为1飞升到10微升。
[0096]
根据本发明的3d打印方法还包含至少一种毛细墨水，其在液滴的边缘区域内或者说在邻接其它墨水的液滴的区域内选择性地交联。该选择性交联要么由(毛细墨水和/或邻接的生物墨水的)墨水成分引起，要么由在毛细墨滴的边缘区域内交联单个细胞的定向电磁波引起。毛细墨水的未交联区域被冲洗掉或者被以其它方式清除掉，并且形成用于毛细血管系统和血管系统的空腔。
[0097]
通过选择性地在空间上局限于毛细墨滴边缘区域的交联，不仅可以激活单个细胞，甚至还可以激活单个分子来进行交联反应或者形成另外的层。通过该过程达到的打印分辨率还高于立体光刻方法的约为20nm的打印分辨率。
[0098]
毛细墨滴的边缘区域内的示例性反应可以为：
[0099]-硫醇-烯反应
[0100]-键锁反应
[0101]-亲核开环
[0102]-分子和颗粒的自组装
[0103]-毛细墨水和/或生物墨水的细胞上的选择性因子
[0104]-自由基的或者阳离子的聚合反应
[0105]-抗体反应
[0106]-与点击化学组分的反应(例如环化加成等)
[0107]-其它过程，其中有可能的是，两个相邻的边缘区域可以进行空间上受限的反应或者相互间的交互作用，或者其中出现“自组装的”过程。
[0108]
因为相应的组织打印所需的墨滴中的墨水成分针对细胞密度和墨水浓度可变并且由打印算法决定，
[0109]
所以，本发明的一个目的或者一个方面在于，提供一种连接在打印头上游的打印头供应单元(图8)。在该打印头供应单元内，细胞罐中培育的细胞通过泵，被泵入到细胞浓缩器中。在此，增浓细胞密度并且分离多余的介质。定义的细胞浓度被通过细胞计数器传递至混合单元。同样地，从用于墨水浓缩物的罐中，将特定的体积导入到该混合单元中。混合单元根据所需组织类型的打印算法的规定混合墨水，并且将其传递至打印头。打印头供应单元的数量取决于所需墨水的数量并且可以变化。然而，也可以不按照打印算法的规定混合墨水。
[0110]
为了保持已打印的组织存活，例如会需要早在打印过程期间就将其连接至供应循环。此外，在打印过程中，所打印的组织必须优选地位于装有介质的打印室内，其由此不会干燥。传统的打印机工作台没有这种供应系统。因此，本发明的一个目的或者一个方面在于，提供一种打印机工作台，其在打印过程中通过介质流入和介质流出，为组织供应培养介质(图2-7)。
[0111]
用于介质流入和介质流出的液体例如被从外部穿过可调节的泵系统，引向打印机。泵的输送方向在此是可逆的。特别地，通过软管系统，实现输入，该软管系统通过接口连接(例如鲁尔接口)连接至打印机工作台底座。介质经由打印机工作台底座的枢轴，穿过打印机工作台，被引导至印刷板。在打印机工作台底座与印刷板之间有可替换的硅胶隔膜，其将装有介质的打印室与底板分隔并且对介质进行密封(图2-7)。硅胶隔膜对于密封而言是必要的，因为打印室的底板被螺旋测微计的销穿透并且允许打印机工作台上下行驶。
[0112]
根据经验，诸如滑动环密封等传统密封系统是潜在的污染源。通过可拆卸的硅胶隔膜实现的该问题的新型解决方案具有易于清洁和消毒的优点。此外，可以价格低廉地对其进行更替。通过其高延伸性，可自由选择打印机工作台设定。硅胶隔膜同时用作底板与打印室壁之间的密封件。
[0113]
为了能够毫无问题地更换(打印室内的)打印机工作台，(打印室外的)打印机工作台底座特别地具备吸引打印机工作台的磁体。通过磁力，打印机工作台底座的连接枢轴同样被压入到印刷板的反向钻孔的密封件内并且被密封。根据本发明的该优选解决方案使得更换打印机工作台时的操作极其简单。
[0114]
为了能够充分地对其进行供应，待打印的组织应被大量脉管穿透(图15)。为了能够提供对此所需的打印模型，特别地需要一种针对所使用的细胞类型(墨水类型)并且针对毛细血管和动脉及静脉结构的距离和大小的特定算法。在这种情况下，特别地，该算法一方面取决于待打印的模块的最佳毛细血管供应的需求，另一方面取决于相应组织构造的生理学和解剖学需求。由不同的组织类型和脉管构成的组织/器官被特别地细分为单个模块，这些单个模块又被细分为打印平面(切片)。模块中的打印平面上不同的已打印细胞类型在此对应于其在相应组织或者器官内的脉管位置或者组织位置。特别地，产生了毛细血管内径
为约10微米或更大的综合毛细血管系统。在每个单个打印平面上，毛细血管相互间的距离优选地为约50微米。在打印结束后，其内流动的液体从动脉流向静脉(图15)。
[0115]
单个打印平面的总和形成单个模块。该模块优选地具备升脉管和降脉管，二者通过位于其间的扇形的较小的毛细血管相互连接。用于动脉输入和静脉输出的接口来自升脉管和降脉管。由此产生的微循环呈现已打印的组织中最小的供应单元。组合单个模块并将其粘合成更大的目标结构。
[0116]
脉管被打印于其上的、脉管系统优选地所需的连接开口位于被紧固在打印机工作台上的印刷板上(图2-7)。该印刷板的功能是将来自打印机工作台的两个主接口的介质分配至单独所需的辅助接口。因为每个组织都是解剖学上各不相同地构建而成的，所以应为了每个打印过程单独地创建板。每个印刷板都在准备阶段通过3d打印(例如fdm、sls、bj等)制成。用于打印的数据同样来自用于布置打印机的系统算法。印刷板对应于为打印单独创建的工作设备并且优选地由聚合物制成。
[0117]
在印刷板上施加有优选地由可生物分解的或者说可吸收的聚合物制成的印刷箔，其具备与印刷板相同的接口。印刷箔有利于轻松且非破坏性地将组织从印刷板上揭下。由于聚合物的生物可分解性，印刷箔在短时间内在体内分解(图2-7)。
[0118]
为了能够使已打印的组织毫无问题地在通用温育器中熟化，打印机工作台连同印刷板(可选地只有印刷板)被转移至存放在温育器中的培养箱器皿中(图19)。该培养箱器皿特别地由装有介质的槽连同待放置的盖板构成。在槽的底部固定地安装有底座，在其上可更换地安置有结构相同的打印机工作台底座。通向打印机工作台底座的输入和输出的介质软管通过开口被引入培养箱器皿中。打印机工作台连同印刷板、印刷箔和已打印的组织借助于磁力安放在打印机工作台底座的枢轴上(不含硅胶隔膜)(图19)。
[0119]
其它实施方案：
[0120]
在本发明的一种优选实施方案中，液滴大小处于1飞升到10微升的范围内。有利地，该液滴大小允许在硫醇-烯反应中极好地实现发明目的。液滴内部的硫醇改性的分子在这些条件下不发生交联并且被冲洗掉。
[0121]
在另一优选的实施方案中，毛细墨水具备硫醇改性的分子，包围其的生物墨水具备烯丙基改性的分子和用于触发交联反应的光引发剂。该交联反应在生物墨水内发生在烯丙基改性的分子之间。毛细墨水的硫醇改性的分子只选择性地在边缘区域内与烯丙基改性的分子交联。
[0122]
在另一优选的实施方案中，叠氮化物和炔烃的铜(i)催化的1,3-偶极环化加成引起毛细墨水边缘区域内的交联反应，其中叠氮化物改性的分子和炔烃改性的分子只在毛细墨滴与生物墨水的边界区域内才相遇。
[0123]
在另一优选的实施方案中，毛细墨水包含环氧基改性的分子，这些分子可以引起与来自生物墨水的分子的oh基团或者nh2基团的亲核开环，或者由于来自生物墨水的组分而经历酸催化的或者碱催化的开环。
[0124]
在另一优选的实施方案中，毛细墨水和生物墨水包含在边界区域内形成自组装结构的分子，例如通过离子、适体或者其它倾向于自组装的结构。
[0125]
在本发明的另一优选的实施方案中预设了，细胞包含选择性因子，这些细胞通过该选择性因子，借助于电磁波在液滴内的定向移动选择性地交联。
[0126]
可通过电磁波交联的新型低粘度的生物墨水和毛细墨水由以下组分构成：a)相应的细胞类型(可选地包括用于该细胞类型的选择性因子)和交联分子。额外地，生长因子、信号分子、用于构建刺激传导的粒子或者其它分子也可以是墨水的成分。
[0127]
通过选择性起作用的能量源，可以从包括不同细胞的混合物的液滴中触发交联反应或者聚合反应，其中只涉及分别预期的细胞类型。优选地，可以去除未交联的细胞。举例而言，仅5皮升(约20到200个细胞)的小液滴可以由血管内皮细胞和成肌细胞的混合物构成。在一种优选的实施方案中，随后通过纳米精度的激光束，从该混合物中形成精细毛细血管的环。通过激光器1的特定能量输入，在混合物中优选地仅交联位于环内侧上的内皮细胞。在该优选的实施方案中，通过激光器2的另一特定能量输入，在环的外侧上仅交联邻接的成肌细胞(图13和图14)。
[0128]
在另一优选的实施方案中预设了，借助于激光器，去除血管结构内部未交联的细胞。
[0129]
优选地，还交联由特别地均质的细胞类型构成的生物墨水，以便例如打印更大的均质组织区域。
[0130]
在一种优选的实施方案中，待交联的细胞被包括在正在形成网络中。
[0131]
在另一实施方案中，细胞本身相互交联或者与网络交联。其为此具备锚定在细胞膜中的交联分子。
[0132]
令人惊奇地，通过相对快速的打印过程，有可能相对迅速地将已打印的组织转移至培养箱，在该培养箱中，通过环境因子(例如化学的、分子生物的负荷或者通过流动负荷)，触发另外的熟化。
[0133]
优选地，在特定位置处打印其它可交联的墨水，其担负用于组织的支撑功能，携带对于细胞的生理机能而言是重要的因子，或者携带生长因子、标志物、信号分子、受体或者其它结合位点(键锁原理，schl
ü
ssel-schloss-prinzip)。
[0134]
类似于用于拟真艺术打印品的喷墨打印机，打印头优选地具备大量喷嘴，这些喷嘴适应于墨水的相应流变性。打印机还优选地具备一个或更多个无定向或定向电磁波源，通过其触发交联反应。
[0135]
在一种优选的实施方案中，利用拟真艺术打印品的打印头，额外地用一个或更多个电磁波源对其进行改进。
[0136]
在另一实施方案中，利用一种由多个模块组成的打印头，其中每个模块都对应一个包括一个或更多个电磁波源的用于拟真艺术打印品的打印头。
[0137]
在本发明的另一方面中，其涉及一种新的打印头构造(参见图9至图12)并且涉及一种新的打印过程，在其中利用不同的能量源来选择性地触发不同的反应(图9-12)。
[0138]
图13和图14示意性地示出了，如何能够通过不同的光引发剂，借助于特定波长的光，使特定的细胞相互交联。激光器、二极管或者其它能量源可以用作能量源(参见实施例部分)。
[0139]
在一种优选的实施方案中，在打印过程期间供养已打印的组织。存在于底板上的用于培养介质的接口通过结构墨水，被单独地扩展至待打印的组织。从底板上的接口开始，用结构墨水，打印直径更小的、更精细的接口。
[0140]
在另一实施方案中，打印头装备有气泡技术、压电技术或者其它打印头技术。
[0141]
在一种实施方案中，电磁波源是无定向的源，例如二极管、激光器、紫外线灯或者其它源。
[0142]
在另一实施方案中，电磁波源是可180
°
枢转的透镜。能量源是可控并且可移动的，使得激光束可以映射任意预编程的形状。在另一实施方案中，在外部光源中生成光线，该光线通过光导线缆传输至出口位置。
[0143]
在一种实施方案中，电磁波的波长处于紫外线范围内、可见范围内或者红外光谱内。
[0144]
在一种优选的实施方案中，存在有抽吸装置或者压缩空气装置来清除冲刷出的、未交联的墨水材料。
[0145]
在一种实施方案中，真空是可控的并且只有在抽吸装置被降下时才被激活。抽吸装置与待打印的对象之间的距离由激光器控制(图11和图12)。
[0146]
在另一实施方案中，不需要任何额外的装置来清除被冲洗掉的墨水材料或者说细胞材料，因为被冲洗掉的细胞在周围组织中形成新毛细血管的起点，或者在周围组织分化时被一同嵌入或者消失。
[0147]
在另一实施方案中，未交联的墨水材料被定向的激光束破坏。
[0148]
在另一实施方案中，未交联的细胞、细胞碎片或者墨水被装置冲洗掉并且漏到反应室内。
[0149]
在一种实施方案中，通过熏蒸喷嘴，在打印平面上方产生气体气氛(例如惰性气体、co2等)。
[0150]
在一种实施方案中，电磁波源的波长和波束宽度是可调制的。打印机具备一个或更多个用于针对性定向的电磁射束的可调制的源。
[0151]
在另一实施方案中，优选地使用飞秒激光器。
[0152]
在一种实施方案中，在打印过程中，通过培养介质，调节气体含量(例如co2/o2)、ph值和其它重要的细胞培养参数。额外地，也通过反应室内的气体含量，调节气体交换。
[0153]
在一种实施方案中，“颠倒地”或者“自上而下地”进行该方法。
[0154]
在一种实施方案中，打印机的反应器皿可选地作为一次性插入物装入到打印机中，并且可以在打印后被取出。在打印后，组织或者器官处于可以与患者接触或者被转移至细胞培养物中的状态。反应器皿具备用于供养组织的培养介质或者血液的流入和流出的接口。
[0155]
在一种实施方案中，反应器皿被冷却。
[0156]
在一种在患者体内的应用方式中，反应器皿在体外与其血液循环相连。由于所提供的患者典型的生长因子和分化因子并且由于还在分化的血管系统内的血压，出现进一步的熟化。在该阶段中，可选地将样品从系统中取出，以便监控组织或者器官的熟化程度(分化程度)并且测定移植的最佳时间。为了该采样，反应器皿具备另外的接口。
[0157]
结合根据本发明的方法，有利的是，在3d打印之前，用分子使特定的细胞类型特异性地杂交，以使混合物中的细胞可选择性地响应。连接在此由选择性因子和锚定分子构成。选择性因子应优选地触发横向交联。锚定分子优选地用于对接细胞膜。如果其化学和物理特性允许，则选择性因子也可以直接在没有锚定分子的情况下键合至细胞表面。空间上受控的、在其波长及其频率方面专门定向的电磁波能量束照射特定细胞类型的选择性因子，
并且例如通过裂解保护基团、激活光引发剂、激活反应物或者激活键锁组分而将其激活。该交联反应不涉及其它细胞类型。(图13和图14，参见实施例部分)。
[0158]
在一种实施方案中，选择性因子作为锚定分子具备亲脂分子，例如全氟化碳或者脂质。在另一实施方案中，选择性因子作为锚定分子具备阳离子的分子区域或者具有正部分电荷的分子区域。在另一实施方案中，选择性因子作为锚定分子具备肽化合物，例如细胞穿透肽或者多核苷酸。
[0159]
结合根据本发明的教导，使用了新型的生物墨水：
[0160]
不同于以前利用的包括含在其中的长链大分子的传统液滴法的高粘度生物墨水，此处公开的方法的新型生物墨水是非常低粘度的并且包含光引发剂。其包含非常短链的、较小的交联分子，其直接在与电磁波接触后发生交联。在该优选的实施方案中，这些分子具备烯丙基改性或者硫醇改性。
[0161]
在另一实施方案中，熏蒸打印室。
[0162]
在另一实施方案中，并非与印刷板成10-90
°
的角度，而是与之平行地(0-10
°
)打印毛细血管。
[0163]
在另一实施方案中，已经在成环之前冲洗毛细血管。
[0164]
打印的一般流程——理论基础和优选的实施方案：
[0165]
此处公开的发明描述了一种用于3d打印器官和组织的方法。较大的打印区域被划分成单个模块，(在相同或不同打印机上)彼此独立地打印，并且随后被组合并且(例如使用纤维蛋白黏合剂)粘合成目标器官或者目标组织。在这种情况下，单个模块的输入和输出脉管被联合成输入或输出主脉管。单个模块是具有定义边长的、优选立方体的构成物。
[0166]
组织或器官虽然在构造上是相同的，但并非完全一致的。即便对于相同物种，每个个体也都与其它个体稍有不同。这不仅表现在大小上，还表现在个体发育上。例如，相较于非运动员，运动员的肌肉由于较高的需氧量毛细血管明显更发达。身体适应于环境条件，因此绝不会是完全一致的，并且经历持续的构建和分解。
[0167]
因此，起决定性作用的是组织的功能，而非患者组织的精确解剖学复制。因此，在此公开了一种模块系统，其实现组织的功能，但是被尽可能地简化且系统化，使得能够经济地进行组织的3d打印。
[0168]
组织或者器官的基石是定义边长的立方体单个模块(1)(图15-图18)。为了供应可以由一种到更多种细胞类型构成的并且因此也可以形成诸如器官等功能性组织的组织，在其中一侧上由稍后形成动脉的升脉管(2)进行供应。位于相对侧上的降脉管(3)形成静脉。较小的脉管(4)分别扇形地从这些脉管中散开，在另一侧上延伸至相对脉管的高度并且相互平行地伸长(图2)。较小的脉管(4)通过桥接脉管(6)相互连接，其稍后形成毛细血管，闭合“血液循环”并且形成微循环(图15-图18)。
[0169]
微循环(图15)呈现了已打印的组织中的最小供应单元。在此，介质通过升脉管(动脉)(2)，被引导至属于升支的小脉管(4)。介质从较小的脉管，通过桥接脉管(6)，流入位于其下的、属于降支并且接入降脉管(3)的较小脉管(4)。
[0170]
因为在用毛细墨水打印脉管时，每滴有许多细胞打印，并且只有处于边缘区域的细胞才能与周围组织交联，所以必须冲洗掉多余的细胞。为此并且为了供应已打印的细胞，在每次完成微循环后，其都在短时间内被介质彻底冲洗。在每次冲洗过程中，位于最后的微
循环下方的微循环也被一同冲洗并且供应细胞。介质流将未交联的细胞冲洗掉。水平伸长的脉管对此不是最佳的，因此已打印的脉管都与印刷板成10到90度的角度伸长。
[0171]
升脉管和降脉管(图15、图16)(2和3)以90
°
的角度升高。脉管扇(5)能够以10-90
°
的角度升高。以直至单个模块的中心上升并且随后下降的方式进行打印，使得较小的脉管始终相对于印刷板上升地伸长。由此，对于未完成打印的脉管，可以很好地冲洗掉多余的细胞。如果微循环(7)闭合，则介质可以通过降脉管流走(图15和图16)。
[0172]
以定义的间距打印脉管扇(图15和图16)，其中升脉管和降脉管的脉管扇交替地在彼此下方伸长。每一个升脉管(2)和降脉管(3)的脉管扇通过桥接脉管(6)相互连接并且形成微循环(7)(图15和图16)。重复该过程一段时间，直至装满单个模块。为了打印组织或者器官，打印由多个单个模块构成的组织模块(图17)(8)。在其定向上交错地(图7)、齐平并排地在印刷板上打印单个模块，从而得到具有定义边长和厚度的组织模块。可以时间上平行地在不同的打印机上打印器官模块，并且借助于黏合剂(例如纤维蛋白黏合剂)，将其连接成更大的组织单元或者器官单元(图5)。
[0173]
为了能够将组织模块连接至身体的循环，优选地，必须打印组织闭合模块(8)(图15和图17)和组织连接模块(9)(图15和图17)。
[0174]
组织闭合模块(8)由一种组织模块构成，其中在单个模块中，升脉管和降脉管向上逐渐变细并且由此封闭，并且通过多个细胞层(10)闭合。
[0175]
连接模块(9)必须优选地将单个模块的单个脉管聚集成更大的脉管，并且在此过程中考虑到解剖学和外科学规定。在此过程中，输入脉管和输出脉管在不同的平面上伸长至连接脉管(9)。升脉管和降脉管又通过桥接脉管相互连接，以供应组织(图15、图17)。
[0176]
打印过程的一般说明(图1-图12)：
[0177]
为了实现经济的打印过程，待打印的组织优选地被细分成单个组织模块，这些组织模块又由单个模块组成。由单个模块构成的组织模块以及单个模块形成由整个组织或器官的定义平面连同其不同的细胞类型和脉管构成的横截面。借助于特定算法，实现该细分。通过打印单个平面(组织剖面)，又产生三维组织。
[0178]
对应于组织模块的规定，由聚合物打印包括供应开口的印刷板。
[0179]
同样地，由可生物分解的聚合物打印印刷箔，其与印刷板一同固定在打印机工作台上并且被装入到打印室内。
[0180]
装满并连接毛细墨水、组织墨水和结构墨水的罐。
[0181]
在为此进行装修并且经认证的外部实验室内繁殖必需的细胞类型，并且为了打印过程而对细胞类型进行预浓缩并且将其在罐内运输至打印机。
[0182]
用于介质流入和流出的容器被装满，并且输入和输出软管被连接至打印机工作台底座上的对应接口。通过具备引流和回流的泵系统，对入口和出口进行供应。打印机室同样装有介质，该介质可以通过流入和流出系统而被保持恒定。现在可以启动打印过程，印刷板驶入其初始位置。
[0183]
首先，用结构墨水，将脉管接口打印到印刷板上的印刷箔上。之后，打印机逐平面地进行打印，并且在此过程中逐层地形成单个组织区域和脉管，并且在此过程中下沉到打印机室的介质内，直至完成组织模块。在这种情况下，对打印过程进行编程，使得在始终重复的循环中，在达到组织的特定高度后，进入短暂的冲洗过程，以便冲洗掉多余并且未交联
的细胞。在不同的实施方案中都可以存在该冲洗程序。优选地，在定义数量的打印过程后，冲洗一次升支，随后在另一定义数量的打印过程后，冲洗降支。始终交替，直至组织模块打印完成。通过交替的冲洗过程，可以冲洗流入和流出的脉管，而不会使脉管超载。
[0184]
当单个模块打印完成时，可以借助于印刷箔，毫无问题地将其从打印机工作台上揭下。通过黏合剂(例如纤维蛋白黏合剂)，将已打印的单个模块组合成完整的组织或者器官。单个模块的输入和输出的脉管被联合成输出和输出的更大的脉管。
[0185]
在进行运输之前，通过打印在组织中的动脉和静脉循环，可以继续为组织供应介质并且在培养箱中再熟化许多天。
[0186]
以肝脏为例的单个模块(图15、图16、图17、图18)：
[0187]
肝脏由约一百万到一百五十万个直径为1-2mm的肝小叶构成。两个脉管结束在肝脏中，即用于为组织供应氧气和营养物质的肝动脉和将血液连同所摄取的营养物质和毒素从胃和肠中运出来的门静脉。汇合成腔静脉的静脉以及胆总管发自肝脏。
[0188]
单个模块在此由直径为2mm的单个六边形肝小叶(1)(图17a)形成。肝小叶被并排布置成5列并且每列5行高(图15d)。通过将肝小叶布置在分别以半个肝小叶偏移每个第二行的多行内，其可以在形成组织模块时相互啮合。
[0189]
单个六边形肝小叶在每个角处有3个脉管(动脉(2)、门静脉(4)、胆总管)并且在中间具有静脉(5)。所有四个脉管又形成微循环(图2)。
[0190]
分别对于单个角脉管，肝小叶被细分成6个区段(6)，其被微循环流经并且形成脉管扇(7)(图4)。两个输入脉管(即动脉和门静脉)在微循环中相互平行地通向静脉。静脉与之反向地从中间延伸出，其在输入脉管下方伸长，这三个脉管由此形成三角形。动脉和门静脉又通过脉管桥与静脉相连并且形成微循环。胆总管位于脉管三角形的中心。
[0191]
肝模块的打印过程(图17、图18)：
[0192]
为了实现经济的打印过程，待打印的组织被细分成单个组织模块，这些组织模块又由单个模块组成。由单个模块构成的组织模块和单个模块形成由整个组织或器官的定义平面连同其不同的细胞类型和脉管构成的横截面。
[0193]
该单个模块通过算法，被进一步细分成多个连续的平面(切片)。每个平面随即形成具有不同细胞类型和图案的二维打印图像。通过打印这些平面(切片)，又产生三维组织。
[0194]
对应于肝模块的规定，由聚合物打印包括供应开口的印刷板。供应开口是单个肝小叶的输入和输出脉管(动脉、门静脉、静脉、胆总管)。
[0195]
同样地，由可生物分解的聚合物(优选聚羟基丁酸酯，phb)打印印刷箔，包括供应开口，其与印刷板一同固定在打印机工作台上并且被装入到打印室内。
[0196]
装满用于毛细墨水、组织墨水和结构墨水的容器。连接用于肝细胞、内皮细胞、胆管细胞和上皮细胞的罐。
[0197]
在准备阶段中，由为此进行装修并且经认证的外部实验室繁殖对于相应打印而言必需的细胞类型，并且为了打印过程将其进行预浓缩并且在相应罐内运输至打印机。
[0198]
用于介质流入和流出的容器被装满，并且输入和输出软管被连接至打印机工作台底座上的对应接口。通过具备引流和回流的泵系统，对入口和出口进行供应。
[0199]
打印机室同样装有介质，该介质可以通过流入和流出系统而被保持恒定。
[0200]
现在可以启动打印过程，印刷板驶入其初始位置。所有过程的安排都通过为此编
程的算法进行，这些算法在其方面也再次收到打印机的控制信号并且对其进行进一步处理。
[0201]
打印机现在逐平面地进行打印，并且在此过程中逐层地形成单个组织区域，并且在此过程中下沉到打印机室的介质内，直至完成组织模块。对打印过程进行编程，使得在达到组织的特定打印高度后，进入短暂的冲洗过程，以便冲洗掉多余并且未交联的细胞。在此对打印进行编程，使得冲洗过程随着所完成的打印平面的数量提高而延长，以便将冲洗掉的细胞运送至打印室内。
[0202]
该冲洗程序可以在不同的实施方案中发生。在一种优选的实施方案中，冲洗一次升支，随后在另一定义数量的打印过程后，冲洗降支。始终交替，直至组织模块打印完成。通过交替的冲洗过程，可以冲洗流入和流出的脉管，而不会使脉管超载。
[0203]
在肝模块打印完成后，可以借助于印刷箔，毫无问题地将其从打印机工作台上揭下。
[0204]
当打印了所有组织必需的肝模块以及组织闭合模块和组织连接模块时，使用黏合剂(例如纤维蛋白黏合剂)来将其组合成完整的组织或者器官。
[0205]
在进行运输之前，通过打印在组织中的动脉和静脉循环，可以继续为组织供应介质并且在培养箱中再熟化许多天(图19)。
[0206]
示例：
[0207]
示例1)至4)对应于为了阐述而在“

技术实现要素：
”部分中描述过的示例。紧接着，通过更多实施例对其进行补充：
[0208]
在示例中列举的附图标记特别地涉及具体的附图。
[0209]
1)打印的一般流程——理论基础和优选的实施方案：
[0210]
图15：
[0211]
此处公开的发明描述了一种用于3d打印器官和组织的方法。较大的打印区域被划分成单个模块，(在相同或不同打印机上)彼此独立地打印，并且随后被组合并且(例如使用纤维蛋白黏合剂)粘合成目标器官或者目标组织。在这种情况下，单个模块的输入和输出脉管被联合成输入或输出主脉管。单个模块是具有定义边长的、优选立方体的构成物。
[0212]
组织或器官虽然在构造上是相同的，但并非完全一致的。即便对于相同种类，每个个体也都与其它个体稍有不同。这不仅表现在大小上，还表现在个体发育上。例如，相较于非运动员，运动员的肌肉由于较高的需氧量毛细血管明显更发达。身体适应于环境条件，因此绝不会是一致的，并且经历持续的构建和分解。
[0213]
因此，起决定性作用的是组织的功能，而非患者组织的精确解剖学复制。因此，在此公开了一种模块系统，其实现组织的功能，但是被尽可能地简化且系统化，使得能够经济地进行组织的3d打印。
[0214]
组织或者器官的基石是定义边长的立方体单个模块(1)(图15a)。为了供应可以由一种到更多种细胞类型构成的并且因此也可以形成诸如器官等功能性组织的组织，在其中一侧上由稍后形成动脉的升脉管(2)进行供应。位于相对侧上的降脉管(3)形成静脉。较小的脉管(4)分别扇形地从这些脉管中散开，在另一侧上延伸至相对脉管的高度并且相互平行地伸长(图15b)。较小的脉管(4)通过桥接脉管(6)相互连接，其稍后形成毛细血管，闭合“血液循环”并且形成微循环(7)(图15c和图15d)。
[0215]
微循环呈现了已打印的组织中的最小供应单元。在此，介质通过升脉管(动脉)(2)，被引导至属于升支的小脉管(4)。介质从较小的脉管，通过桥接脉管(6)，流入位于其下的、属于降支并且接入降脉管(3)的较小脉管(4)。
[0216]
因为在用毛细墨水打印脉管时，每滴打印许多细胞，并且只有处于边缘区域的细胞才能与周围组织交联，所以必须冲洗掉多余的细胞。为此并且为了供应已打印的细胞，在每次完成微循环后，其都在短时间内被介质彻底冲洗。在每次冲洗过程中，位于最后的微循环下方的微循环也被一同冲洗并且供应细胞。介质流将未交联的细胞冲洗掉。水平伸长的脉管对此不是最佳的，因此已打印的脉管都与印刷板成10到90度的角度伸长。
[0217]
升脉管和降脉管(2和3)以90
°
的角度升高。脉管扇(5)能够以10-90
°
的角度升高。以直至单个模块的中心上升并且随后下降的方式进行打印，使得较小的脉管始终相对于印刷板上升地伸长。由此，对于未完成打印的脉管，可以很好地冲洗掉多余的细胞。如果微循环(7)闭合，则介质可以通过降脉管流走(图15f)。
[0218]
以定义的间距打印脉管扇，其中升脉管和降脉管的脉管扇交替地在彼此下方伸长。每一个升脉管(2)和降脉管(3)的脉管扇通过桥接脉管(6)相互连接并且形成微循环(7)(图15d)。重复该过程一段时间，直至装满单个模块。为了打印组织或者器官，打印由多个单个模块构成的组织模块(8)。在其定向上交错地(图15g)、齐平并排地在印刷板上打印单个模块，从而得到具有定义边长和厚度的组织模块。可以时间上平行地在不同的打印机上打印器官模块，并且借助于黏合剂(例如纤维蛋白黏合剂)，将其连接成更大的组织单元或者器官单元(图15e)。
[0219]
为了能够将组织模块连接至身体的循环，特别地，必须打印组织闭合模块(8)(图15g)和组织连接模块(9)(图15h)。
[0220]
组织闭合模块(8)由一种组织模块构成，其中在单个模块中，升脉管和降脉管向上逐渐变细并且由此封闭，并且通过多个细胞层(10)闭合。
[0221]
连接模块(9)必须优选地将单个模块的单个脉管聚集成更大的脉管，并且在此过程中考虑到解剖学和外科学规定。在此过程中，输入脉管和输出脉管在不同的平面上伸长至连接脉管(11)。升脉管和降脉管又通过桥接脉管相互连接，以供应组织。
[0222]
2)打印过程的一般说明：
[0223]
为了实现经济的打印过程，待打印的组织被细分成单个组织模块，这些组织模块又由单个模块组成。由单个模块构成的组织模块以及单个模块形成由整个组织或器官的定义平面连同其不同的细胞类型和脉管构成的横截面。借助于特定算法，实现该细分。通过打印单个平面(组织剖面)，又产生三维组织。
[0224]
对应于组织模块的规定，由聚合物打印包括供应开口的印刷板。
[0225]
同样地，由可生物分解的聚合物打印印刷箔，其与印刷板一同固定在打印机工作台上并且被装入到打印室内。
[0226]
装满并连接用于毛细墨水、组织墨水和结构墨水的罐。
[0227]
在为此进行装修并且经认证的外部实验室内繁殖必需的细胞类型，并且为了打印过程而对细胞类型进行预浓缩并且将其在罐内运输至打印机。
[0228]
用于介质流入和流出的容器被装满，并且输入和输出软管被连接至打印机工作台底座上的对应接口。通过具备引流和回流的泵系统，对入口和出口进行供应。打印机室同样
装有介质，该介质可以通过流入和流出系统而被保持恒定。现在可以启动打印过程，印刷板驶入其初始位置。
[0229]
首先，用结构墨水，将脉管接口打印到印刷板上的印刷箔上。之后，打印机逐平面地进行打印，并且在此过程中逐层地形成单个组织区域和脉管，并且在此过程中下沉到打印机室的介质内，直至完成组织模块。在这种情况下，对打印过程进行编程，使得在始终重复的循环中，在达到组织的特定高度后，进入短暂的冲洗过程，以便冲洗掉多余并且未交联的细胞。在不同的实施方案中都可以存在该冲洗程序。优选地，在定义数量的打印过程后，冲洗一次升支，随后在另一定义数量的打印过程后，冲洗降支。始终交替，直至组织模块打印完成。通过交替的冲洗过程，可以冲洗流入和流出的脉管，而不会使脉管超载。
[0230]
当单个模块打印完成时，可以借助于印刷箔，毫无问题地将其从打印机工作台上揭下。通过黏合剂(例如纤维蛋白黏合剂)，将已打印的单个模块组合成完整的组织或者器官。单个模块的输入和输出的脉管被联合成输出和输出的更大的脉管。
[0231]
在进行运输之前，通过打印在组织中的动脉和静脉循环，可以继续为组织供应介质并且在培养箱中再熟化许多天。
[0232]
3)以肝脏为例的单个模块(图17)
[0233]
肝脏由约一百万到一百五十万个直径为1-2mm的肝小叶构成。两个脉管结束在肝脏中，即用于为组织供应氧气和营养物质的肝动脉和将血液连同所摄取的营养物质和毒素从胃和肠中运出来的门静脉。联合成腔静脉的静脉以及胆总管发自肝脏。
[0234]
单个模块在此由直径为2mm的单个六边形肝小叶(1)(图17a)形成。肝小叶被并排布置成5列并且每列5行高(图17d)。通过将肝小叶布置在分别以半个肝小叶偏移每个第二行的多行内，其可以在形成组织模块时相互啮合。
[0235]
单个六边形肝小叶在每个角处有3个脉管(动脉(2)、门静脉(4)、胆总管)并且在中间具有静脉(5)。所有四个脉管又形成微循环(图17b)。
[0236]
分别对于单个角脉管，肝小叶被细分成6个区段(6)，其被微循环流经并且形成脉管扇(7)(图17d)。两个输入脉管(即动脉和门静脉)在微循环中相互平行地通向静脉。静脉与之反向地从中间延伸出，其在输入脉管下方伸长，这三个脉管由此形成三角形。动脉和门静脉又通过脉管桥与静脉相连并且形成微循环。胆总管位于脉管三角形的中心。
[0237]
4)肝模块的示例性打印过程(图17、图18)：
[0238]
为了实现经济的打印过程，待打印的组织被细分成单个组织模块，这些组织模块又由单个模块组成。由单个模块构成的组织模块和单个模块形成由整个组织或器官的定义平面连同其不同的细胞类型和脉管构成的横截面。
[0239]
该单个模块通过算法，被进一步细分成多个连续的平面(切片)。每个平面随即形成具有不同细胞类型和图案的二维打印图像。通过打印这些平面(切片)，又产生三维组织。
[0240]
对应于肝模块的规定，由聚合物打印包括供应开口的印刷板。供应开口是单个肝小叶的输入和输出脉管(动脉、门静脉、静脉、胆总管)。
[0241]
同样地，由可生物分解的聚合物(优选聚羟基丁酸酯，phb)打印印刷箔，包括供应开口，其与印刷板一同固定在打印机工作台上并且被装入到打印室内。
[0242]
装满用于毛细墨水、组织墨水和结构墨水的容器。连接用于肝细胞、内皮细胞、胆管细胞和上皮细胞的罐。
[0243]
在准备阶段中，由为此进行装修并且经认证的外部实验室繁殖对于相应打印而言必需的细胞类型，并且为了打印过程将其进行预浓缩并且在相应罐内运输至打印机。
[0244]
用于介质流入和流出的容器被装满，并且输入和输出软管被连接至打印机工作台底座上的对应接口。通过具备引流和回流的泵系统，对入口和出口进行供应。
[0245]
打印机室同样装有介质，该介质可以通过流入和流出系统而被保持恒定。
[0246]
现在可以启动打印过程，印刷板驶入其初始位置。所有过程的安排都通过为此编程的算法进行，这些算法在其方面也再次收到打印机的控制信号并且对其进行进一步处理。
[0247]
打印机现在逐平面地进行打印，并且在此过程中逐层地形成单个组织区域，并且在此过程中下沉到打印机室的介质内，直至完成组织模块。对打印过程进行编程，使得在达到组织的特定打印高度后，进入短暂的冲洗过程，以便冲洗掉多余并且未交联的细胞。在此对打印进行编程，使得冲洗过程随着所完成的打印平面的数量提高而延长，以便将冲洗掉的细胞运送至打印室内。
[0248]
该冲洗程序可以在不同的实施方案中发生。在一种优选的实施方案中，冲洗一次升支，随后在另一定义数量的打印过程后，冲洗降支。始终交替，直至组织模块打印完成。通过交替的冲洗过程，可以冲洗流入和流出的脉管，而不会使脉管超载。
[0249]
在肝模块打印完成后，可以借助于印刷箔，毫无问题地将其从打印机工作台上揭下。
[0250]
当打印了所有组织必需的肝模块以及组织闭合模块和组织连接模块时，使用黏合剂(例如纤维蛋白黏合剂)来将其组合成完整的组织或者器官。
[0251]
在进行运输之前，通过打印在组织中的动脉和静脉循环，可以继续为组织供应介质并且在培养箱中再熟化许多天。
[0252]
5)打印机构造的扩展变体：
[0253]
打印机由以下部件构建而成：
[0254]-多个打印头，其包括多个用于液滴法的喷嘴和一个或更多个空间上可控的电磁波源，所述电磁波源引起波长、强度和频率方面可调制的能量输入，
[0255]-其中，可调制的电磁波有利于选择性地激活交联反应，
[0256]-装有介质的、可封闭的反应槽，其包括用于介质更换、采样的接口和在打印后可选地改变的、用于介质或者患者血液的输入路径，反应槽可从打印机中取出并且可以用作培养箱，
[0257]-位于反应槽内的底板，其包括用于所产生的血管系统的接口，介质连续地或者间歇地流经该血管系统并且用于供应已打印的组织，
[0258]-多个用于所需墨水的罐，
[0259]-不同的毛细墨水、生物墨水和结构墨水，
[0260]-结构区域(例如支撑结构、细胞外基质或者其它非细胞成分，例如聚羟基烷酸酯、纤维蛋白原、胶原、髓磷脂、葡糖胺、糖脂、肽、糖分子、脂肪酸、键锁分子、用于刺激传导的有机和无机分子等)，
[0261]-特性分子(例如不同生理特性的分子，例如生长因子、转录因子、受体分子、信号分子、rna、dna、分化分子等)，
[0262]-均质的细胞类型(例如肌细胞、肝细胞、神经元等)，
[0263]-由用于打印血管系统的异质细胞类型(例如内皮细胞、肌细胞)构成的混合物，
[0264]-在打印过程中，打印机工作台可上下移动，可选地，打印头可以代替其上下移动或者二者一同上下移动。
[0265]
6)在培养箱中熟化已打印的组织的示例
[0266]
培养箱有利于分化已打印的组织或者器官。在打印后，虽然已经产生具有高细胞密度的组织总体，但细胞还没有达到其最终的组织结构和分化度。组织或者器官被直接打印到稍后用作培养箱的腔室内。可选地，组织或者器官也可以被转移到其它培养箱中。培养箱提供对于分化而言必要的重要分化参数，例如化学或分子生物物质或者流动参数。
[0267]
可选地，可以用培养介质运行培养箱，并且在稍后的时间点，在体外将其与患者的血液循环相连，或者在打印后，立即将培养箱与患者的血液循环相连。在接触患者血液时，必要的分化因子和生长因子到达已打印的结构，并且细胞可以适应身体。
[0268]
7)打印头的示例性构造(图19)
[0269]
打印头由用于生物墨水、毛细墨水和结构墨水的液滴打印的第一分区构成。通常通过压电喷嘴或者气泡喷嘴进行液滴法。在流程和已产生的液滴布置方面，打印过程类似于照片打印机的青色/洋红色/黄色/黑色/灰色/浅灰色/浅洋红色/浅青色系统。代替颜料墨水的是所需量的生物墨水、毛细墨水和结构墨水。
[0270]
在第二分区内，打印头具备一个或更多个无定向或者定向的电磁波源。定向源整体产生选择性的能量源，其在波长、强度和频率方面是可调制的。紫外线灯、发光二极管、激光器或者屏幕通常用作电磁波源。通常使用的电磁波是紫外光、可见光和红外光谱内的波长。
[0271]
用于液滴法和用于提供电磁波的方法的打印头的功能单元也可以被布置为彼此分离。打印头还可以由这种单元的一系列模块构建而成。
[0272]
8)包括底板的反应槽的其它替代结构、介质输入(图1、图2、图3、图4、图5、图6、图7)
[0273]
在打印机的打印室内有可上下移动的打印机工作台，其包括多个用于由介质流经已打印的血管结构的接口。
[0274]
在打印室外，接口与用于维持特定细胞培养参数的外部系统相连。这些参数主要包括温度、ph值、co2含量、o2含量、营养物质、生长因子等。因为已打印的血管结构内未交联的细胞还要以细胞碎片的形式或者作为整个细胞被冲洗掉，所以优选地，必须在其参数方面控制流入打印室的介质并且必要时对其进行净化或者更换。
[0275]
在血管化组织的打印过程中，介质通过接口，被导入到其上打印的血管结构中。这一方面有利于供养所产生的组织，另一方面有利于自由冲洗血管系统的空心结构。介质通过打印机工作台的接口进入血管结构，流经已打印的血管化组织，并且在血管系统的尚敞开的空腔上面对打印头的一侧上方再次渗出。介质要么从此处被动地流回打印机室，或者在打印过程期间被主动地从打印表面上移除(例如冲走或者说吸走)。
[0276]
打印机工作台在打印过程期间始终继续下沉到打印室内，使得已打印的组织在打印室内被介质环绕冲洗。组织最上方约1-5mm的区域从介质中伸出。因为硫醇-烯反应相对于o2不敏感，所以通常不需要用惰性气体(例如氮气、氩气)装满反应槽的装满空气的区域。
[0277]
9)为3d打印机软件提供必要的数字信息
[0278]
根据医学成像方法，获得关于组织和器官的细胞构造的数字数据并且将其编程成3d打印数据。这些方法例如包括：mrt方法或者“disco透明”法。用于测定这些数据的方法对于本领域技术人员而言是已知的。根据这些数据，借助于专门的算法，计算用于经济地打印毛细血管、静脉血管和动脉血管的所需细胞类型以及所需大小和距离所需要的模块的数量。对于经济的打印，不需要原本地复刻生物结构。已经在1)到4)中描述了单个模块的构造。
[0279]
10)新型打印机软件
[0280]
打印机软件处理关于待打印的组织区域的信息并且为了执行而将其转发给打印头和打印机工作台。不同于传统的3d打印机编程，液滴技术(特定墨水的打印模型和液滴大小)和定向电磁波源情况下的经调制的激光技术(所要求的波长、能量强度和频率，空间控制)在此相互组合并且彼此匹配。在此，特定墨水类型向包括组织的反应槽及印刷板上的液滴释放，与为交联所需而以因墨水而异的波长、频率和强度在空间和时间上提供电磁波在空间和时间上的协调起到了中心作用。对于血管结构而言重点是来自细胞混合物的墨滴内的内皮细胞和肌细胞的选择性交联(“使用的保护基团和光引发剂”部分)。
[0281]
11)已打印的组织和器官的熟化，直至移植：
[0282]
包括组织或器官的培养箱具备用于体外结合至患者的血液循环或者结合至提供介质的系统的接口。通过从若干小时开始到若干天的培养，进一步分化3d打印的细胞组构。特别是通过将打印的脉管循环与患者的血液循环相连，为细胞提供重要的发育因子。此外，为了分化，已打印的血管结构的内皮细胞和肌细胞需要由血液或者介质引起的特定脉管内压和特定的流动速度。
[0283]
在熟化阶段中，有可能通过接口，在培养箱中检验特定的生理学数值并且由此监控器官或者组织的熟化。如果已打印的器官或组织的生理学数值在特定范畴内达到天然器官的生理学数值，则可以移植到患者体内。
[0284]
12)新型低粘度墨水的示例性构造：
[0285]
墨水的原理构造由低粘度的短链交联分子、光引发剂和细胞构成。短链交联分子具备至少一个(通常为两个或更多个)官能团，其通常由烯丙基或硫醇基构成并且经历聚合反应或者加成反应。
[0286]
常用的交联分子是甲基丙烯酸酯改性的和硫醇改性的分子，例如甲基丙烯酸酯改性的或者硫醇改性的肽链、聚羟基烷酸酯或者透明质酸。生物墨水和结构墨水要么主要由甲基丙烯酸酯改性的分子(自由基聚合或者加成)构建而成，要么也由甲基丙烯酸酯改性的分子与硫醇改性的分子(硫醇-烯反应)的混合物构建而成。相反，毛细墨水通常由纯硫醇改性的交联分子构建而成，其只在与生物墨水和结构墨水的烯丙基改性的交联分子的相互作用下，在液滴的边缘区域处发生交联。
[0287]
通常使用的光引发剂要么在约380nm的范围内工作，要么与处于红外范围内的光引发剂一同工作。红外范围内的光引发剂是类似于多光子立体光刻(非线性多光子吸收)的立体能量源，其中必须叠加不同的能量源，以触发反应。
[0288]
在打印包括选择性因子的细胞(例如可裂解的用于硫醇基的保护基团)时，使用380nm以下的额外的光引发剂。
[0289]
所使用的光引发剂的示例为：darocur 1173、irgacure 2959和369、基于“p.xiao et al./progress in polymer science，41(2015)32
–
66，s.46”的(ru(phen)3/iod/(tms)3si-h pis)和光引发剂183。用于红外激发的光引发剂是：h-nu-ir 780和h-nu-ir 815。已经证实，还可通过多光子，激活一系列来自可见光范围的光引发剂。
[0290]
13)提供打印所需的细胞：
[0291]
能够以各种方式提供用于此处公布的新型3d打印方法的细胞。在这种情况下，细胞的起源取决于用其打印的组织或者器官的期望的使用目的。
[0292]
最简单的生成细胞的方式是使用可购买的细胞系。使用这种细胞，可以使打印参数和培养参数最佳化，因为不必为了测试而使用相对成本高昂的诱导干细胞(ips)或者从器官和组织中离析的细胞。
[0293]
另一细胞源是从器官和组织中离析特定的细胞类型。除了用于研究的动物细胞，该方法也已经多样性地用在再生医学中，例如从椎间盘手术的脱垂材料中离析椎间盘软骨细胞。溶解脱垂材料，并且从中离析、繁殖细胞并且另外也将其用在组织的3d打印中。
[0294]
最苛刻的细胞源是生成诱导干细胞(ips)。为此存在不同的既定工作基团的操作方式。ips细胞对于随后要移植到人体内的人体组织和器官的打印是必需的。但是这些细胞和由此打印的结构也可以在细胞培养物中用作用于个体化药物的测试材料。ips细胞通常培育自捐献者的皮肤细胞。皮肤细胞被逆分化成ips细胞、繁殖，并且将其分化成打印所需的细胞类型。这些过程对于广泛的应用而言尚未成熟，但是代表了用于器官和组织的人自体移植的制造的前景。
[0295]
其它细胞材料源是为了特定目的培育的细胞系，其通常以各种方式进行了改性(例如基于dna、基于rna或者蛋白质)。
[0296]
原则上，每种细胞类型(原始或者细胞系)都是可以培育的并且通过此处公开的方法进行打印。
[0297]
13)用于用包含选择性因子的细胞进行打印的示例性墨水(图13、图14)：
[0298]
只在边缘区域内交联毛细墨水的可能方案是使用在液滴内选择性地相互交联的内皮细胞和肌细胞构成的细胞混合物。为了可选择性地由定向激光束激活，这些细胞类型需要特定的选择性因子。该选择性因子例如是官能硫醇基上可裂解的保护基团，其位于相关细胞类型的细胞膜上。通过使用可以在不同波长下裂解的不同保护基团，不同的细胞类型可以在其交联反应上彼此分离。通常，在该应用下，毛细墨水由锚定在细胞膜上的具有保护基团的硫醇改性的交联分子构成，并且由墨水中自由硫醇改性的、受保护的分子构成。额外地，墨水中有烯丙基改性的分子，以便使得硫醇交联反应成为可能。
[0299]
14)墨水的示例性构造和选择性因子(图13、图14)：
[0300]
通过选择性因子，在由激光器确定的空间交联范围内，选择性地实现取决于光的硫醇-烯反应。这些选择性因子例如由闭锁硫醇基的、可光裂解的保护基团构成。由于其不同的分子构造，可通过光的不同波长使这些保护基团裂解。选择在其激发光谱范围内不关联的那些保护基团。
[0301]
为了在被激光器照射的范围内，只选择性地交联来自混合物的特定细胞类型，但不交联其它细胞类型，必须在相关细胞上裂解硫醇基上的保护基团。因此，只有这些细胞和这些交联分子才可进行硫醇-烯反应。紧接着，在该示例中，通过光引发剂启动硫醇交联反
应，该光引发剂的激发光谱高于所使用的所有保护基团的波长，以便不会错误地使其裂解(示例见下文)。
[0302]
15)用包含选择性因子的细胞打印血管系统：
[0303]
因为动脉和静脉之间的精细毛细血管的直径仅为若干微米，但液滴法中的液滴更大，所以选择性地交联由来自细胞混合物液滴的内皮细胞构成的内部单层环。同样地，选择性地交联包围该环的、由来自目标混合物的肌细胞构成的环。为此，内皮细胞或者说肌细胞携带分别可针对不同波长裂解的保护基团作为选择性因子(见下文的示例)。
[0304]
在对应细胞类型上的保护基团选择性裂解后，可以在移除保护基团的细胞处进行硫醇-烯反应。因此，首先通过激光束1，在液滴中为约5到7个内皮细胞和位于其间的、受保护的、硫醇改性的交联分子移除保护基团，以形成环形结构，并且紧接着通过激光束2，使其彼此间环形地交联。激光束2有利于激发光引发剂并且具有高于激光束1和3的波长。
[0305]
由此产生单层的内皮环状物，其内径为约10微米，其内表面由未交联的、被闭锁的细胞构成。紧接着，通过激光束3，为与内皮环相邻的外部肌细胞和受保护的、硫醇改性的交联分子解除保护基团，并且使其通过激光束2相互间交联，以形成外环。激光束1和3在不同波长下使对应的保护基团裂解，而激光束2引起光引发剂的激活，其启动硫醇-烯反应。
[0306]
毛细血管内部的未交联的细胞被更高能量的激光束(激光束4)破坏并且由流入的介质冲洗掉所产生的细胞碎片。
[0307]
16)在墨水包括选择性因子的情况下，所使用的保护基团和光引发剂(图13、图14)：
[0308]
虽然为了具有均质细胞类型的墨水的交联，可以自由选择反应类型并且非选择性地进行，但包括异质墨水的不同细胞类型具备包括特定保护基团的硫醇-烯反应物，该保护基团可针对对应的波长裂解。在这种情况下，必要激活能量的曲线不得重叠(图13)。
[0309]
对于内皮细胞或者说包围其的肌细胞的交联，使用以下可由紫外线裂解的保护基团：
[0310]
325nm：用于肌细胞的(7,8-双(羧甲氧基)香豆素-4基)甲氧羰基
[0311]
400nm：用于内皮细胞的α羧基-4甲氧基-2-硝基
[0312]
(来源：用于硫醇的、可波长选择性裂解的、光不稳定的保护基团，nico kotzur，2009)
[0313]
首先，使用较高的所需波长，裂解保护基团，以便不会错误地激活其它保护基团。对于原本的硫醇-烯反应使用其激发光谱为532nm的光引发剂(ru(phen)3/iod/(tms)3si-h pis)，以便不会错误地使位于其下的保护基团裂解。同样可使用在473nm下受激发的光引发剂183(p.xiao et al./progress in polymer science 41(2015)32
–
66，s.46)。
[0314]
在第一步中，内皮细胞的硫醇基上的保护基团在400nm下裂解(激光束1)。在该范围内，肌细胞的硫醇基仍然具有保护基团。随后，在532nm下激活光引发剂，并且在解除保护基团的基团上触发硫醇-烯反应(激光束2)。通过在空间上引导两个连续的激光束(先是400nm，然后是532nm)，5到12个内皮细胞通常环状地相互交联。
[0315]
在第二步中，肌细胞的硫醇基上的保护基团在325nm下裂解(激光束3)。因为在空间上引导用于内皮细胞范围(400nm和532nm)的激光束不会达到包围内皮细胞的肌环状物的范围，所以在此存在还具有保护基团的细胞混合物的内皮细胞，并且不能参与肌细胞的
移除保护基团的硫醇基的硫醇-烯反应。紧接着，通过在532nm下激活光引发剂，实现位于环状物中的肌细胞的交联(激光束2)。
[0316]
以此方式，可以确保基本上只有期望的细胞类型被嵌入到对应的结构中。
[0317]
对于其它必要的选择性因子，有额外的用于硫醇基的保护基团可用(图13)，例如可在436nm下裂解的基团((7双(羧甲基)氨基)香豆素-4-基)甲氧羰基)。交联过程的实现类似于上文中所描述的。(来源：用于硫醇的、可波长选择性裂解的、光不稳定的保护基团，nico kotzur，2009)
[0318]
通过更高能量的激光束4，破坏毛细血管内部未交联的细胞，并且用介质冲洗掉碎片。
[0319]
17)用选择性因子示例性地制备自体患者细胞
[0320]
从患者中提取出的细胞(例如皮肤细胞)被转化成诱导干细胞(ips)，进行繁殖，被分散成单个类别并且随后被分化成所需的细胞类型。该准备过程不依赖于打印程序，并且在此只示例性地提到，以便描述实现真实3d器官的途径。根据待打印器官的复杂性，该过程可以持续数周到数月。在生产所需的细胞系之后，可以将其冷冻存储，直至要进行打印。可以将冷冻的细胞解冻，将其与选择性因子杂交并且进行打印。对于细胞而言更保险的是：在解冻后在细胞培养物中培养24小时并且随后与其特定选择性因子杂交。
[0321]
通常，为了锚定在细胞膜中，选择性因子与锚定分子相连。所使用的锚定分子通常可通用于所有细胞类型。令人惊奇地，已经表明，全氟化的锚定分子是最有效的。根据经验，这些分子在2分钟内结合至100％的参与细胞。但是，亲脂分子、肽、离子或者抗体也可以用作锚定分子。
[0322]
18)准备包含选择性因子的细胞进行打印：
[0323]
在即将打印时，将毛细血管系统的细胞与其特定选择性因子杂交：首先分开地将所使用的内皮细胞和肌细胞在细胞培养物中为打印准备好，并且与其相应的选择性因子杂交。紧接着，使其在毛细墨水中聚集。
[0324]
关于附图的更多阐述：
[0325]
图1：
[0326]
图1：示例性、示意性打印机构造和作用方式：
[0327]
本发明的基础是传统的拟真压电打印机。
[0328]
新公开了墨水输入的变型(1-5)和打印机工作台的构造(12、13、14、15)。
[0329]
打印机由墨水供应单元(1-5)、压电打印头(15)、打印机工作台(13)、装有介质的打印室(14)和打印机工作台的马达(12)构建而成。额外地，包括输入软管(9)的、用于供应组织的介质罐(8)和废料罐(11)以及输出介质的软管(10)都位于打印机上。
[0330]
单个部件被壳体(6)包围。中央控制单元/计算机/软件(7)位于壳体外部，其与部件1-5、15和12通信(虚线)。
[0331]
图2-7：
[0332]
图2-7：打印机工作台的示例性构造和作用方式：
[0333]
在下文中，公开了一种新的打印机工作台系统。打印机工作台主要由五部分构成：
[0334]
印刷板(7)、包括供应接口的打印机工作台(6)，其可以借助于步进马达(3)和螺旋测微计(2)下沉到打印室内。
[0335]
借助于3d打印机(fdm、sls、slm、sla或者其它打印机)，为器官或者类器官，单独地打印印刷板(7)，因为用于供应组织的开口可能是不同的。区别是由定位、数量和直径引起的。
[0336]
由生物兼容的聚合物制成的印刷板(7)具有用于介质流入和流出(1)的连接开口，传导系统单独地为了组织而从连接开口处在板内延伸并且接入表面上用于供应组织的更多开口内。开口可以是不同地定位的并且也可以具备不同的直径。随即可以在这些开口上打印用于供应组织的脉管。
[0337]
印刷板被螺接在打印机工作台(6)上，打印机工作台由磁性材料制成并且具有其中插入有用于介质流入和流出的连接件(1)的钻孔。在印刷板下方有螺旋测微计的销被低摩擦地装配到其中的打印机工作台底座(5)以及用于介质流入和流出(1)的接口(例如鲁尔接口)。在一种优选的实施方案中，打印机工作台底座(5)的上侧上的流入和流出连接件被设计为枢轴，并且精确地配合打印机工作台的钻孔。在打印机工作台底座的上侧上安置有磁板。打印机工作台和打印机工作台底座通过磁体的力相互连接，由此建立从用于流入和流出的接口到印刷板的连接。钻孔内的密封环防止介质流出。通过磁性连接，还可以毫无问题地将已打印的组织连同印刷板和打印机工作台一同与其它固定安装的部件分离，并且插入到其它供应单元上。
[0338]
通过螺旋测微计(2)和步进马达(3)的销，可以将打印机工作台连同印刷板印刷板一同下沉到打印室(硅胶垫上方的空间)内。打印室由底板(8)和由例如不锈钢制成的壁部(9)构成，并且由此形成可以通过输入装置装有介质的空间。已打印的组织被下沉到该介质中，以便对其进行供养或者保护其以防干燥。通过降下已打印的区域，打印平面停留在恒定高度上。通过溢流口，防止由于挤压介质造成溢流。
[0339]
在一种特别的实施方案中，在打印机工作台底座(5)的上方有用于密封的硅胶垫(10)。
[0340]
其在打印机工作台底座(5)上张紧，其中用于流入和流出的枢轴保持未被占用并且够到打印室底板的边缘。通过将打印室壁部(9)拧紧到打印室(8)的底板上，一方面密封打印室，并且打印机工作台底座的下侧通过螺旋测微计的销与打印室分离。通过硅胶垫的高度灵活性，打印机工作台的上下移动可以进一步毫无问题地进行。
[0341]
在另一实施方案中，为了密封打印室，不用硅胶垫，而在螺旋测微计(2)的销与打印室(8)的底板之间安置有密封件(例如滑动环密封件)。
[0342]
在其它实施方案中，可以使用其它结构，以密封打印室。
[0343]
图8：
[0344]
图8：打印头供应单元的示例性构造和作用方式：
[0345]
在此处新公开的打印头供应单元中，细胞罐(2)中培育的细胞通过泵(4)，被泵入到细胞浓缩器(6)中，在细胞浓缩器中提高细胞浓度并且将多余的介质运走(9)。定义的细胞浓度被通过细胞计数器(8)传递至混合单元(7)，墨水浓缩物也可以被引入到其中。墨水浓缩物以定义的体积，通过包括测量单元(5)的泵，被从储备容器(1)中运送到混合单元(7)中。在该混合单元(7)中，用于打印头的墨水被按照根据打印程序的规定混合并且通过控制细胞计数器，被引入到通向压电打印头(12)的软管中。
[0346]
打印头供应单元的数量取决于必需的生物墨水的数量并且可以变化。
[0347]
打印头供应单元一方面受打印机算法的控制，以混合所需的墨水组合物，其另一方面具备一系列传感器，这些传感器为打印机算法提供关于当前混合的墨水的特性的信息，而算法对信息做出反应。
[0348]
图9和图10
[0349]
图9和图10：用于通过倾析器增浓细胞的细胞浓缩器(6)的优选结构实施方案
[0350]
为了增浓细胞，优选地使用以下方法作为细胞浓缩器(6)，这些方法的特色在于持久的运行。通过减少液相、介质，实现细胞的增浓。一方面，可以通过离心力或者通过过滤器特性，实现固相和液相的分离。
[0351]
在这些结构实施方案中，使用流体离心机或者倾析器来增浓细胞。两个系统都按照相同原理，借助于离心力进行工作。
[0352]
在离心机中，借助于离心加速度，实现固相和液相的分离。在离心机的旋转的转筒中，具有更高密度并且由此比液体更重的固体颗粒借助于离心力向外移动。它们在离心机转筒的内壁上形成沉淀物。
[0353]
倾析器转筒具有柱锥形的外形并且其转动速度匹配于相应的分离任务。产物在转筒中达到全速的圆周速度，并且作为圆柱形环抵靠在离心机的转筒罩。包含于产物中的固体由于更高的密度，在离心力的影响下，沉积在转筒内壁上。可以在制造倾析器时使圆柱形转筒部分的长度和圆锥形转筒部分的圆锥角适应于相应的分离任务。
[0354]
图11和图12
[0355]
图11和图12：用于通过动态过滤增浓细胞的细胞浓缩器(6)的优选结构实施方案
[0356]
在错流微过滤时，过滤膜在过滤过程中被包括细胞的介质溢流，使得产生彼此正交的两个主流动方向。主流动方向是穿过过滤膜的过滤流和平行于过滤膜的溢流。通过悬浮液的溢流反作用于过滤过程中滤饼的构造，使得细胞浓缩物可以流走。过滤器特性的效率是通过过滤膜中的孔的数量和孔径大小可变的。特别适合于此的是空心纤维(毛细管膜或者也被称为空心筋)，其有效功率还通过箍缩效应得以加强。常见的空心纤维的内径为约1.5mm(3.0mm到0.1μm也是可能的)，其孔径大小为200到5nm(2000nm到1.0nm也是可能的)。根据应用，成百至上千毛细管被总括在模块中并且被浇注(空心纤维模块)。借助于循环泵，未过滤的产物循环通过毛细管，直至保留物中的沉淀物被浓缩，使得需要排空和净化。(ripperger 1992)，(melin&rautenbach 2007)。
[0357]
图13
[0358]
选择性因子——对于325nm、400nm和436nm的波长可裂解的用于硫醇基的保护基团(来源：用于硫醇的、可波长选择性裂解的、对光不稳的保护基团，nico kotzur，2009)
[0359]
图14
[0360]
包括选择性因子的细胞。浅色细胞代表内皮细胞，深色细胞代表肌细胞。两种细胞类型都以毛细墨滴中的混合物的状态存在，并且可以选择性地通过具有不同波长的两个激光束激活，以进行交联反应。
[0361]
图15
[0362]
图15：组织模块的构造：
[0363]
组织或者器官的基石是定义边长的立方体单个模块(1)(图15a)。为了供应可以由一种到更多种细胞类型构成的并且因此也可以形成诸如器官等功能性组织的组织，在其中
一侧上由稍后形成动脉的升脉管(2)进行供应。位于相对侧上的降脉管(3)形成静脉。较小的脉管(4)分别扇形地从这些脉管中散开，在另一侧上延伸至相对脉管的高度并且相互平行地伸长(图15b)。较小的脉管(4)通过桥接脉管(6)相互连接，其稍后形成毛细血管，闭合“血液循环”并且形成微循环(7)(图15c和图15d)。
[0364]
微循环呈现了已打印的组织中的最小供应单元。在此，介质通过升脉管(动脉)(2)，被引导至属于升支的小脉管(4)。介质从较小的脉管，通过桥接脉管(6)，流入位于其下的、属于降支并且接入降脉管(3)的较小脉管(4)。
[0365]
因为在用毛细墨水打印脉管时，每滴打印许多细胞，并且只有处于边缘区域的细胞才能与周围组织交联，所以必须冲洗掉多余的细胞。为此并且为了供应已打印的细胞，在每次完成微循环后，其都在短时间内被介质彻底冲洗。在每次冲洗过程中，位于最后的微循环下方的微循环也被一同冲洗并且供应细胞。介质流将未交联的细胞冲洗掉。水平伸长的脉管对此不是最佳的，因此已打印的脉管都与印刷板成10到90度的角度伸长。
[0366]
升脉管和降脉管(2和3)以90
°
的角度升高。脉管扇(5)能够以10-90
°
的角度升高。以直至单个模块的中心上升并且随后下降的方式进行打印，使得较小的脉管始终相对于印刷板上升地伸长。由此，对于未完成打印的脉管，可以很好地冲洗掉多余的细胞。如果微循环(7)闭合，则介质可以通过降脉管流走(图15f)。
[0367]
以定义的间距打印脉管扇，其中升脉管和降脉管的脉管扇交替地在彼此下方伸长。每一个升脉管(2)和降脉管(3)的脉管扇通过桥接脉管(6)相互连接并且形成微循环(7)(图15d)。重复该过程一段时间，直至装满单个模块。为了打印组织或者器官，打印由多个单个模块构成的组织模块(8)。在其定向上交错地(图15g)、齐平并排地在印刷板上打印单个模块，从而得到具有定义边长和厚度的组织模块。可以时间上平行地在不同的打印机上打印器官模块，并且借助于黏合剂(例如纤维蛋白黏合剂)，将其连接成更大的组织单元或者器官单元(图15e)。
[0368]
为了能够将组织模块连接至身体的循环，特别地，必须打印组织闭合模块(8)(图15g)和组织连接模块(9)(图15h)。
[0369]
组织闭合模块(8)由一种组织模块构成，其中在单个模块中，升脉管和降脉管向上逐渐变细并且由此封闭，并且通过多个细胞层(10)闭合。
[0370]
连接模块(9)必须优选地将单个模块的单个脉管聚集成更大的脉管，并且在此过程中考虑到解剖学和外科学规定。在此过程中，输入脉管和输出脉管在不同的平面上伸长至连接脉管(11)。升脉管和降脉管又通过桥接脉管相互连接，以供应组织。
[0371]
图16
[0372]
图16：用介质彻底冲洗所产生的毛细血管：
[0373]
在这种情况下，对打印过程进行编程，使得在始终重复的循环中，在达到组织的特定高度后，进入短暂的冲洗过程，以便冲洗掉多余并且未交联的细胞。在不同的实施方案中都可以存在该冲洗程序。优选地，在定义数量的打印过程后，冲洗一次升支，随后在另一定义数量的打印过程后，冲洗降支。始终交替，直至组织模块打印完成。通过交替的冲洗过程，可以冲洗流入和流出的脉管，而不会使脉管超载。
[0374]
图17
[0375]
图17：肝脏器官模块
[0376]
以肝脏为例的单个模块：
[0377]
肝脏由约一百万到一百五十万个直径为1-2mm的肝小叶构成。两个脉管结束在肝脏中，即用于为组织供应氧气和营养物质的肝动脉和将血液连同所摄取的营养物质和毒素从胃和肠中运出来的门静脉。联合成腔静脉的静脉以及胆总管发自肝脏。
[0378]
单个模块在此由直径为2mm的单个六边形肝小叶(1)(图17a)形成。肝小叶被并排布置成5列并且每列5行高(图17c)。通过将肝小叶布置在分别以半个肝小叶偏移每个第二行的多行内，其可以在形成组织模块时相互啮合。
[0379]
单个六边形肝小叶在每个角处有3个脉管(动脉(2)、门静脉(4)、胆总管)并且在中间具有静脉(5)。所有四个脉管又形成微循环(图17b)。
[0380]
分别对于单个角脉管，肝小叶被细分成6个区段(6)，其被微循环流经并且形成脉管扇(7)(图17d)。两个输入脉管(即动脉和门静脉)在微循环中相互平行地通向静脉。静脉与之反向地从中间延伸出，其在输入脉管下方伸长，这三个脉管由此形成三角形。动脉和门静脉又通过脉管桥与静脉相连并且形成微循环。胆总管位于脉管三角形的中心。
[0381]
图18
[0382]
各单个已打印的肝脏器官模块的相互叠加：
[0383]
图19
[0384]
图19：培养箱的示例性构造：
[0385]
组织培养箱由装有介质的槽(1)连同待放置的盖板(2)构成。在槽的底部固定地安装有底座(3)，在其上可更换地安置有结构相同的打印机工作台底座(5)。通向打印机工作台底座的输入和输出的介质软管(4)通过开口被引入培养箱器皿中。打印机工作台连同印刷板、印刷箔和已打印的组织借助于磁力安放在打印机工作台底座的枢轴上。
[0386]
图20和图21：
[0387]
图20和图21：包括无定向和定向电磁辐射源的打印头的示例性构造。