一种具有酸敏感的抗菌涂层及其制备方法和用途与流程

1.本发明属于复合抗菌材料领域，具体涉及一种具有酸敏感的抗菌涂层及其制备方法和用途。


背景技术：

2.随着人口老龄化加快、交通事故频发和生活水平的提高，全球对于先进生物材料的需求正在持续增长，尤其是骨科内植物，骨科内植物是指用以替代、支撑骨缺损以及置换关节的植入性医疗器械，常见的骨科内植物包括接骨螺钉、接骨板、人工关节、牙科种植体等，每年相关的手术量非常巨大。仅2018年，我国髋膝人工关节置换的手术量就高达70万例，牙种植体植入超过200万颗。其中应用最广泛的材料是钛金属及其合金，具有良好的生物相容性、力学性能和耐腐蚀性等特点，备受青睐。但随着时间的推移，钛基内植物的失效问题逐渐凸显了出来。对牙科种植体和髋关节置换内植物的相关研究显示，失败率可以达到5-20％，全球每年有至少数十万患者受到影响。而内植物一旦失效，通常需要一次或多次额外手术才能治愈，不仅给患者精神和躯体带来巨大痛苦，而且会显著增加其经济负担。
3.钛基内植物植入体内后面对的主要挑战是细菌感染，细菌感染是由于细菌在内植物与宿主骨之间的界面聚集生长，分泌主要成份为蛋白质、多糖和dna的胞外聚合物，从而形成生物被膜，使得这些细菌比体内的浮游态细菌更难根除。因此，内植物表面的生物被膜一旦形成，造成的感染很难通过常规口服或者注射抗生素进行治疗。
4.曾有人尝试在内植物上构建抗菌表面，以减少内植物感染。目前大部分抗菌表面按照其作用机理可分为抗粘附表面和杀菌表面。抗粘附表面主要通过优化设计材料的物理拓扑结构、亲疏水性能及化学基团等得以实现。材料表面的物理拓扑结构提高了其表面粗糙度和表面能，可以显著抑制细菌在其表面的粘附和生长。利用聚合物的亲水性能，可有效地阻止细菌在其表面的粘附。采用表面引发原子转移自由基聚合在钛基表面构建亲水的聚合物刷，显著提高了钛基的抗菌性能。而杀菌表面则是通过在表面固定杀菌剂，如聚阳离子等聚合物，抗生素，金属离子等，杀死粘附在表面的细菌。
5.虽然围绕钛基内植物的表面改性已经发表了大量的研究成果，但是，目前已构建的各类功能表面大多数仍难以实现临床转化，主要的原因包括：(1)抗生素与银离子难以固定在内植物表面，同时抗生素会导致细菌耐药性，而银离子因为潜在的细胞毒性很难获得药监系统的批准。(2)合成涂层的抗菌活性难以长期保持，需要发挥作用时或已失效。在内植物植入人体后，合成涂层的活性成分会逐渐降解和释放，当其在周围环境中的浓度降低至最小抑菌浓度以下时，内植物表面将再次变得易于被细菌感染；大部分功能涂层是通过物理和/或化学方式构建，植入体内后容易受各种理化因素影响而失效。(3)内植物表面抗菌功能构建后的“闲置浪费”问题。表面改性的原料及构建费用较高，程序复杂，临床转化还需要相应批量处理的设备和人员，必将提高医疗器械厂家生产成本；感染的发生率有限，大部分患者不会应用到相关功能，并非“必选项”；目前尚无有效“按需”表达的设计。
6.因此，研究可以长期、稳定固定于钛基内植物表面，无毒且具有良好抗菌性和生物
相容性的原料，构建可“按需表达”生物活性的涂层，对于实现其临床转化具有重要的意义。


技术实现要素：

7.为了克服现有技术中遇到的问题，本发明提供了一种具有酸敏感的抗菌涂层及其制备方法和用途。本发明研发了ph值驱动正负电荷转换的聚合物，用以遮蔽抗菌聚合物的正电荷，暂时隐藏其抗菌功能；在细菌感染条件下，通过ph值的梯度变化诱发抗菌聚合物的电荷反转，“按需”表达内植物表面的抗菌功能。
8.本发明提供了一种具有酸敏感的阴离子聚合物，该阴离子聚合物由阴离子单体、阳离子单体为原料聚合而成；
9.所述阴离子单体为带有羧基或酸酐的丙烯酸酯类单体；
10.所述阳离子单体为带有氨基、叔胺或季铵盐的丙烯酸酯类单体。
11.进一步地，所述阴离子单体和阳离子单体的摩尔比为0.5-0.9：0.1-0.5；
12.优选地，所述阴离子单体和阳离子单体的摩尔比为0.6-0.8：0.2-0.4；
13.更优选地，所述阴离子单体和阳离子单体的摩尔比为0.6-0.7：0.29-0.38。
14.进一步地，所述阴离子单体选自丙烯酸、甲基丙烯酸、顺丁烯二酸中的一种；
15.和/或，所述阳离子单体选自甲基丙烯酸二甲氨乙酯、甲基丙烯酸二乙基氨基乙酯或甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵中的一种；
16.优选地，所述阴离子单体选自丙烯酸或甲基丙烯酸；
17.和/或，所述阳离子单体选自甲基丙烯酸二甲氨乙酯或甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵。
18.本发明还提供了一种制备前述的阴离子聚合物的方法，它包括如下步骤：以阴离子单体和阳离子单体为原料，在引发剂作用下，通过自由基聚合的方法制备得到阴离子聚合物；
19.优选地，它包括如下步骤：将阴离子单体，阳离子单体和引发剂混合，加入反应溶剂，抽真空通氮气除去体系氧气，聚合反应，即得；
20.更优选地，所述引发剂选自偶氮二异丁氰或偶氮二异丁酸甲酯中的一种；
21.和/或，所述反应溶剂为二甲基亚砜、二甲基乙酰胺、四氢呋喃、异丙醇、甲醇、二甲基甲酰胺中的一种或多种的混合物；
22.和/或，所述阳离子单体和引发剂的摩尔比为0.1-0.5：0.005-0.03；
23.和/或，所述聚合反应的温度为50～100℃；和/或，所述聚合反应的时间为8～24小时；
24.和/或，所述聚合反应后还包括提纯，所述提纯包括如下步骤：将反应液冷却至室温后加入有机溶剂沉淀出聚合物，干燥，即可；
25.进一步优选地，所述反应溶剂为二甲基亚砜或二甲基乙酰胺；
26.和/或，所述阳离子单体和引发剂的摩尔比为0.2-0.4：0.005-0.02；
27.和/或，所述每100ml反应溶剂中，阴离子单体，阳离子单体和引发剂的总质量为5～50g；
28.和/或，所述聚合反应的温度为60～100℃；和/或，所述聚合反应的时间为10～15小时；
29.和/或，所述有机溶剂为丙酮或丙酮和乙醚混合液；所述丙酮和乙醚混合液中，丙酮和乙醚的体积比为(0.3～0.7)：(0.3～0.7)；
30.更进一步优选地，所述阳离子单体和引发剂的摩尔比为0.29-0.38：0.01-0.02；
31.和/或，所述每100ml反应溶剂中，阴离子单体，阳离子单体和引发剂的总质量为20g；
32.和/或，所述聚合反应的温度为60℃；和/或，所述聚合反应的时间为12小时；
33.和/或，所述丙酮和乙醚混合液中，丙酮和乙醚的体积比为1：1。
34.本发明还提供了前述的阴离子聚合物在制备抗菌涂层中的用途；
35.优选地，所述抗菌涂层为酸敏感的抗菌涂层。
36.本发明还提供了一种具有酸敏感的抗菌涂层，该抗菌涂层的最外面一层为前述的阴离子聚合物；
37.优选地，所述抗菌涂层是前述的阴离子聚合物和阳离子聚合物进行层层自组装制备而得；
38.更优选地，所述阳离子聚合物为聚乙烯亚胺、聚赖氨酸、聚组氨酸、壳聚糖、季铵化壳聚糖或胶原中的一种；
39.进一步地优选地，所述阳离子聚合物为聚乙烯亚胺、壳聚糖或季铵化壳聚糖。
40.本发明还提供了一种具有酸敏感的抗菌金属材料，所述抗菌金属材料是表面具有前述的抗菌涂层的金属材料；
41.优选地，所述金属为钛金属。
42.本发明还提供了一种制备抗菌钛金属的方法，它包括如下步骤：
43.(1)利用多巴胺对钛金属表面进行处理；
44.(2)将处理后的钛金属浸没于阳离子聚合物溶液中反应；
45.(3)将阳离子聚合物改性的钛金属浸没于前述的阴离子聚合物溶液中反应；
46.(4)重复步骤(2)和步骤(3)，使钛金属表面最外面一层是阴离子聚合物，即得；
47.优选地，步骤(1)中，所述利用多巴胺对钛金属表面进行处理为将钛金属浸没在多巴胺盐酸盐溶液中反应。
48.进一步地，
49.步骤(1)中，所述多巴胺盐酸盐溶液的溶剂为水或者缓冲溶液；和/或，步骤(1)中，所述多巴胺盐酸盐溶液的ph值为7.0-9.0；和/或，步骤(1)中，所述反应的温度为室温；和/或，步骤(1)中，所述反应时间为1-12小时；和/或，步骤(1)中，所述反应后用水清洗；
50.和/或，步骤(2)中，所述阳离子聚合物为聚乙烯亚胺、聚赖氨酸、聚组氨酸、壳聚糖、季铵化壳聚糖或胶原中的一种；和/或，步骤(2)中，所述阳离子聚合物溶液所用的溶剂为水或者缓冲溶液；和/或，步骤(2)中，所述阳离子聚合物溶液的ph值为5.0-9.0；和/或，步骤(2)中，所述反应的温度为室温；和/或，步骤(2)中，所述反应时间为5-60分钟；和/或，步骤(2)中，所述反应后用水清洗；
51.和/或，步骤(3)中，所述阴离子聚合物溶液所用的溶剂为水或者缓冲溶液；和/或，步骤(3)中，所述阴离子聚合物溶液的ph值为5.0-9.0；和/或，步骤(3)中，所述反应的温度为室温；和/或，步骤(3)中，所述反应时间为5-60分钟；和/或，步骤(3)中，所述反应后用水清洗；
52.和/或，步骤(4)中，所述重复步骤(2)和步骤(3)的重复次数为4-100次；
53.优选地，
54.步骤(1)中，所述缓冲液为tris缓冲液；和/或，步骤(1)中，所述多巴胺盐酸盐溶液的浓度为1～5mg/ml；和/或，步骤(1)中，所述多巴胺盐酸盐溶液的ph值为7.4-8.4；和/或，步骤(1)中，所述反应时间为1-4小时；
55.和/或，步骤(2)中，所述阳离子聚合物为聚乙烯亚胺、壳聚糖或季铵化壳聚糖；和/或，步骤(2)中，所述阳离子聚合物溶液的浓度为0.1-20mg/ml；和/或，步骤(2)中，所述阳离子聚合物溶液的ph值为7.0-8.0；和/或，步骤(2)中，所述反应时间为5-15分钟；
56.和/或，步骤(3)中，所述阴离子聚合物溶液的浓度为0.1-20mg/ml；和/或，步骤(3)中，所述阳离子聚合物溶液的ph值为7.0-8.0；和/或，步骤(3)中，所述反应时间为5-15分钟；
57.和/或，步骤(4)中，所述重复步骤(2)和步骤(3)的重复次数为4-40次；
58.更优选地，
59.步骤(1)中，所述多巴胺盐酸盐溶液的浓度为2mg/ml；
60.和/或，步骤(2)中，所述阳离子聚合物溶液的浓度为0.5-5mg/ml；和/或，步骤(2)中，所述阳离子聚合物溶液的ph值为7.4；
61.和/或，步骤(3)中，所述阴离子聚合物溶液的浓度为0.5-5mg/ml；和/或，步骤(3)中，所述阳离子聚合物溶液的ph值为7.4。
62.本发明还提供了前述的阴离子聚合物、前述的抗菌涂层或前述的抗菌金属材料在制备抗菌生物材料中的用途；
63.优选地，所述生物材料为内植物；
64.更优选地，所述内植物为骨科内植物。
65.由于细菌膜表面带有负电荷，带有正电荷的聚合物可以中和细菌膜表面的电荷，引发细菌膜的破裂，起到杀菌功能。
66.研究表明细菌感染后，随着细菌数量增加，形成生物膜，会导致环境的ph值下降，呈酸性。如论文《self-defensive antibacterial layer-by-layer hydrogel coatings with ph-triggered hydrophobicity》(yiming lu等.biomaterials.2015,45:64-71)中发现在细菌培养过程中，随着培养时间增加，细菌增多，培养环境逐渐从中性环境变为酸性环境。
67.本发明首先合成了一种具有酸敏感的阴离子聚合物，这种聚合物在酸性条件下实现电荷的反转，由阴离子聚合物转变为阳离子聚合物。这种转变赋予了由这种阴离子聚合物制备的层层自组装涂层优异的抗菌效果。该涂层是一种具有酸敏感的抗菌涂层，与现有技术相比，其显著优点在于所制备的酸敏感的抗菌涂层在中性条件下不具备抗菌性能，一旦发生细菌感染，特别是形成了生物膜以后，环境的ph值呈酸性时，涂层体现出优异的抗菌效果。这种酸敏感的抗菌涂层可以保证抗菌性能的长效性，使抗菌性能按需表达，避免了抗菌性能的不必要“浪费”。
68.显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
69.以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说
明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
70.图1为不同ph值条件下阴离子聚合物的ζ电位。
71.图2为不同ph值条件下钛金属以及涂层改性后的钛金属表面对于金黄色葡萄球菌的杀菌效果。
具体实施方式
72.本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。
73.实施例1、可制备具有酸敏感的抗菌涂层的阴离子聚合物的制备
74.首先合成可制备具有酸敏感的抗菌涂层的阴离子聚合物，具体合成方法如下：
75.将丙烯酸、甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵和偶氮二异丁氰按照摩尔比0.7：0.29：0.01的比例加入反应瓶中，再加入二甲基亚砜作反应溶剂，溶液浓度为20wt％(即每100ml二甲基亚砜中，丙烯酸、甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵和偶氮二异丁氰的总质量为20g)，经过抽真空通氮气的循环除去体系中的氧气，然后升温至60℃引发聚合，聚合反应12小时后停止加热，冷却至室温后加入过量丙酮沉淀出聚合物，反复沉淀3次，真空条件下烘干，得到阴离子聚合物1。
76.实施例2、可制备具有酸敏感的抗菌涂层的阴离子聚合物的制备
77.首先合成可制备具有酸敏感的抗菌涂层的阴离子聚合物，具体合成方法如下：
78.将甲基丙烯酸、甲基丙烯酸二甲氨乙酯和偶氮二异丁酸甲酯按照摩尔比0.6：0.38：0.02的比例加入反应瓶中，再加入二甲基乙酰胺作反应溶剂，溶液浓度为20wt％(即每100ml二甲基乙酰胺中，甲基丙烯酸、甲基丙烯酸二甲氨乙酯和偶氮二异丁酸甲酯的总质量为20g)，经过抽真空通氮气的循环除去体系中的氧气，然后升温至60℃引发聚合，聚合反应12小时后停止加热，冷却至室温后加入过量丙酮/乙醚混合溶剂(丙酮/乙醚混合溶剂中丙酮和乙醚的体积比为1：1)沉淀出聚合物，反复沉淀3次，真空条件下烘干，得到阴离子聚合物2。
79.实施例3、在钛金属上制备具有酸敏感的抗菌涂层
80.在钛金属上制备具有酸敏感的抗菌涂层包括以下步骤：
81.(1)将多巴胺溶于三羟甲基氨基甲烷的缓冲溶液(tris缓冲液)中，浓度为2mg/ml，调节ph值8.4，将钛金属浸没其中，室温反应3小时，然后用水清洗1小时，直接进行下一步。
82.(2)将聚乙烯亚胺溶于水中，浓度为0.5mg/ml，调节ph值7.4，将步骤(1)所得钛金属浸没其中，室温反应15分钟，然后用水清洗5分钟，直接进行下一步。
83.(3)将合成例1中的阴离子聚合物1溶于水中，浓度为0.5mg/ml，调节ph值7.4，将步骤(2)所得钛金属浸没其中，室温反应15分钟，然后用水清洗5分钟，直接进行下一步。
84.(4)重复步骤(2)和步骤(3)，累计重复20次，并保证最后一层是阴离子聚合物1，室温晾干后即可得到具有酸敏感的抗菌涂层。
85.实施例4、在钛金属上制备具有酸敏感的抗菌涂层
86.在钛金属上制备具有酸敏感的抗菌涂层包括以下步骤：
87.(1)将多巴胺溶于三羟甲基氨基甲烷的缓冲溶液(tris缓冲液)中，浓度为2mg/ml，调节ph值8.4，将钛金属浸没其中，室温反应3小时，然后用水清洗1小时，直接进行下一步。
88.(2)将壳聚糖溶于水中，浓度为0.2mg/ml，调节ph值7.4，将步骤(1)所得钛金属浸没其中，室温反应15分钟，然后用水清洗5分钟，直接进行下一步。
89.(3)将合成例1中的阴离子聚合物1溶于水中，浓度为0.2mg/ml，调节ph值7.4，将步骤(2)所得钛金属浸没其中，室温反应15分钟，然后用水清洗5分钟，直接进行下一步。
90.(4)重复步骤(2)和步骤(3)，累计重复40次，并保证最后一层是阴离子聚合物1，室温晾干后即可得到具有酸敏感的抗菌涂层。
91.实施例5、在钛金属上制备具有酸敏感的抗菌涂层
92.在钛金属上制备具有酸敏感的抗菌涂层包括以下步骤：
93.(1)将多巴胺溶于三羟甲基氨基甲烷的缓冲溶液(tris缓冲液)中，浓度为2mg/ml，调节ph值8.4，将钛金属浸没其中，室温反应3小时，然后用水清洗1小时，直接进行下一步。
94.(2)将季铵盐壳聚糖溶于水中，浓度为0.5mg/ml，调节ph值7.4，将步骤(1)所得钛金属浸没其中，室温反应15分钟，然后用水清洗5分钟，直接进行下一步。
95.(3)将合成例2中的阴离子聚合物2溶于水中，浓度为0.5mg/ml，调节ph值7.4，将步骤(2)所得钛金属浸没其中，室温反应15分钟，然后用水清洗5分钟，直接进行下一步。
96.(4)重复步骤(2)和步骤(3)，累计重复30次，并保证最后一层是阴离子聚合物2，室温晾干后即可得到具有酸敏感的抗菌涂层。
97.以下通过具体试验例证明本发明的有益效果。
98.试验例1、不同ph值条件下本发明阴离子聚合物的ζ电位
99.1、试验方法
100.分别将实施例1和实施例2制备的阴离子聚合物溶于水中，浓度为1mg/ml，用氢氧化钠溶液分别调节溶液ph值为7.4和5.0，然后利用马尔文ζ电位仪测量阴离子聚合物的ζ电位。
101.2、试验结果
102.不同ph值条件下本发明阴离子聚合物的ζ电位结果如图1所示。由图1可知：本发明实施例1和实施例2制备的阴离子聚合物在中性ph值(ph值为7.4)环境下，表面呈负电位，阴离子聚合物1的ζ电位为-18mv，阴离子聚合物2的ζ电位为-20mv；而当ph值降低到5.0左右，即环境呈酸性后，阴离子聚合物表面电位由负转为正，此时阴离子聚合物表面带正电荷，阴离子聚合物1的ζ电位为 10mv，阴离子聚合物2的ζ电位为 8mv。
103.由于细菌膜表面带有负电荷，带有正电荷的聚合物可以中和细菌膜表面的电荷，引发细菌膜的破裂，起到杀菌功能。而本发明阴离子聚合物本来在中性环境下带负电荷，一旦发生细菌感染，特别是形成了生物膜以后，环境的ph值下降，呈酸性，聚合物由负电荷变为正电荷，就可以起到抗菌作用。
104.试验例2、本发明抗菌涂层的抗菌实验
105.1、试验方法
106.抗菌实验包括以下步骤
107.(1)配置不同ph值的缓冲溶液：将三羟甲基氨基甲烷和氯化钠溶于水中，三羟甲基氨基甲烷的浓度是10mm，氯化钠的浓度是0.9wt％，然后调节ph值到7.4，得到ph＝7.4的缓
冲溶液；采用同样得步骤制备ph＝5.0和ph＝6.0的缓冲溶液。
108.(2)将金黄色葡萄球菌接种在肉汤培养基中，37℃培养18小时，得到高细菌密度得菌液。
109.(3)分别用步骤(1)中的三种ph值的缓冲溶液将高细菌密度得菌液稀释至107cfu/ml，然后将稀释后的菌液滴到实施例3～5制备的钛金属表面，再覆盖一层无菌的聚乙烯薄膜防止液体挥发，然后37℃培养6小时。
110.(4)将钛金属连同聚乙烯薄膜一起加入无菌试管中，再加入无菌生理盐水洗脱细菌，最后采用平板技术的方法统计活菌的数量，计算细菌存活率。
111.2、试验结果
112.图2为不同ph值条件下钛金属以及涂层改性后的钛金属表面对于金黄色葡萄球菌的杀菌效果；图2中涂层1为实施例3，涂层2为实施例4，涂层3为实施例5。由图2可知：不管是在中性环境还是酸性环境，未经改性的纯钛金属都不具备抗菌性能。而在钛金属表面制备本技术抗菌涂层后，由图2可知：在中性ph环境下具有该抗菌涂层的钛金属不具备抗菌效果；而当ph值降低，环境为酸性环境后，具有本发明抗菌涂层的钛金属具备优良抗菌效果，且随ph值降低，抗菌效果进一步增强。试验结果说明本发明抗菌涂层在中性条件下不具备抗菌性能，一旦发生细菌感染，特别是形成了生物膜以后，环境的ph值下降，呈酸性，抗菌涂层体现出优异的抗菌效果。
113.综上，本发明首先合成了一种具有酸敏感的阴离子聚合物，这种聚合物在酸性条件下实现电荷的反转，由阴离子聚合物转变为阳离子聚合物。这种转变赋予了由这种阴离子聚合物制备的层层自组装涂层优异的抗菌效果。该涂层是一种具有酸敏感的抗菌涂层，与现有技术相比，其显著优点在于所制备的酸敏感的抗菌涂层在中性条件下不具备抗菌性能，一旦发生细菌感染，特别是形成了生物膜以后，环境的ph值呈酸性时，涂层体现出优异的抗菌效果。这种酸敏感的抗菌涂层可以保证抗菌性能的长效性，使抗菌性能按需表达，避免了抗菌性能的不必要“浪费”。