一种低温下保存效期长的可计数菌株的制备方法与流程

1.本发明涉及一种可计数菌株的制备方法，特别是一种低温下保存效期长的可计数菌株的制备方法。


背景技术：

2.自然环境中存在着多种微生物，且数量巨大，对地球上的物质循环、能量流动及人类的生产、生活具有重要影响。随着对各种微生物功能特性认知的加深，人类对微生物开发利用的速度在逐年增大。目前在食品工业中广泛应用的各种乳酸菌、酵母菌，在医药领域开发应用的各类病毒疫苗、在农业种养殖领域应用的各种芽孢菌类、在污水处理领域应用的脱氮菌等，已对社会的发展及人类健康做出了巨大的贡献。
3.本方案提及的病原微生物试验菌属于第三类病原微生物，在微生物实验室中应用广泛，可用于食品、药品、医疗器械、中药制剂、化药、原料、辅料等的微生物无菌检查和限度检查中的方法适用性试验验证，培养基适用性检查、控制菌的阳性对照、抑菌效力检查等试验中，《中国药典》中还对试验菌株含菌量的加入有相应的要求。
4.传统和公认的菌液制备方法需要经过多个步骤，每次实验前的菌液制备过程繁琐，耗时长；且制成的菌液无法限制菌落的繁殖和死亡，实验前的短期保存时含菌量会较制备时增加或者减少，菌落数量保存不稳定，只能置于2-8℃下24小时内使用，因此每次实验时需要先接种新鲜培养物来制备菌悬液，再经过计数后才能使用到实验中，而且较难准确预估制备的菌液含菌量浓度，导致后续的实验结果很难将一个实验中同时用到的多株试验菌的加入菌数控制在药典要求范围内，菌数控制准确性困难，实验一次成功率不高。
5.因此，现有的菌液制备方法，存在菌液制备过程繁琐、耗时长且菌数控制准确性困难的问题。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于，提供一种低温下保存效期长的可计数菌株的制备方法。本发明具有一次制备即可长期使用、方便准确控制得到菌落数量和使用时仅稀释即可马上进行实验的特点。
7.本发明的技术方案：一种低温下保存效期长的可计数菌株的制备方法，包括以下步骤：
8.(1)接种新鲜培养物：
9.取铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌和沙门菌接种于胰酪大豆胨琼脂培养基平板上进行培养，取白色念珠菌接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上进行培养，取黑曲霉接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基斜面上进行培养；
10.(2)制备可计数菌悬液：
11.a、分别挑取新鲜培养且生长良好的铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、沙门菌、白色念珠菌的单菌落10～20个，充分磨匀于无菌的15～20％甘油
水溶液中，得菌悬液；
12.b、取新鲜培养且孢子丰富的黑曲霉斜面6～10只，采用15～20％甘油水溶液将黑曲霉孢子洗脱，得孢子菌悬液；
13.(3)将菌悬液和孢子菌悬液分别混匀后分装，低温保存，即得到保存效期长的可计数菌株。
14.前述的一种低温下保存效期长的可计数菌株的制备方法中，所述步骤a具体为，分别挑取新鲜培养且生长良好的铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、沙门菌、白色念珠菌的单菌落挑取15个左右，充分磨匀于150～200ml无菌的15％甘油水溶液中。
15.前述的一种低温下保存效期长的可计数菌株的制备方法中，所述步骤b具体为，取新鲜培养且孢子丰富的黑曲霉斜面8只，采用15％甘油水溶液将黑曲霉孢子洗脱，得孢子菌悬液。
16.前述的一种低温下保存效期长的可计数菌株的制备方法中，所述步骤(1)中，铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌和沙门菌的培养温度为30～35℃，培养时间为18～24小时；白色念珠菌的培养温度为20～25℃，培养时间为2～3天；黑曲霉的培养温度为20～25℃，培养时间为5～7天或直到获得丰富的孢子。
17.前述的一种低温下保存效期长的可计数菌株的制备方法中，所述步骤(3)中低温保存的温度≤-36℃。
18.前述的一种低温下保存效期长的可计数菌株的制备方法中，从步骤(2)开始至分装结束，操作时间小于1h。
19.前述的一种低温下保存效期长的可计数菌株的制备方法中，所述的可计数菌株采用10倍或100倍递增稀释法，直至菌落数量在30～300cfu之间，进行计数。
20.与现有技术相比，本发明可计数菌悬液的制备方法简单快捷，加入了甘油保护试验菌，于-36℃下冷冻保存，使得菌落处于休眠状态而不会死亡和繁殖；对制得的可计数菌株作保存效期稳定性试验考察，证明了菌株在-36℃下保存27个月，其含菌量和生物学活性仍均在稳定的可控范围内，有效保存时间长；在需要用于实验时，按照本次制备首次计数后确定的菌落数量，结合实验要求加入的菌落数量，得到稀释方法，进行实验即可，方便准确控制菌数，生物活性稳定，计数准确，提高工作效率和实验成功率。可用于微生物实验室日常方法适用性试验的验证、抑菌效力检查验证和控制菌阳性对照等的使用。
21.即本发明制得的可计数菌悬液，一次性制备冷冻条件下可在2年内使用，且由于菌落数量稳定，菌数可以通过前期制备首次计数后便可知整批分装的每小瓶菌落数量，每次使用时仅需要稀释至需要的浓度便可知道稀释后的菌液中菌落数量，即可马上进行实验，不用每次实验的时候都重复的去从培养新鲜菌落开始，然后菌液制备后再计数，才能进行实验，大大缩短每次实验的时间。
22.因此，本发明具有制备方便快捷、保存周期长、方便准确控制得到菌落数量和使用时仅稀释即可马上进行实验的特点。
具体实施方式
23.下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不作为对本发明限制的依据。
24.实施例：
25.一种低温下保存效期长的可计数菌株的制备方法，包括以下步骤：
26.(1)接种新鲜培养物：
27.取标准储备菌株(瓷株1代)的铜绿假单胞菌〔cmcc(b)10104〕、金黄色葡萄球菌〔cmcc(b)26003〕、枯草芽孢杆菌〔cmcc(b)63501〕、大肠埃希菌〔cmcc(b)44102〕和沙门菌〔cmcc(b)50094〕划线接种于胰酪大豆胨琼脂培养基平板上进行培养，培养温度为33℃，培养时间为18～24小时；取标准储备菌株(瓷株1代)的白色念珠菌〔cmcc(f)98001〕接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上进行培养，培养温度为23℃，培养时间为2～3天；取标准储备菌株(瓷株1代)的黑曲霉[cmcc(b)98003]接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基斜面上进行培养，培养温度为23℃，培养时间为5～7天，待其斜面长出丰富的孢子。
[0028]
上述菌株均为《中国药典》四部通则1100生物检查法中，1101无菌检查法、1105非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法、1106非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法、1108中药饮片微生物限度检查法、1121抑菌效力检查法中规定使用到的试验菌株。
[0029]
以上菌株均为中国食品药品检定研究院提供的0代干燥菌种。
[0030]
(2)制备可计数菌悬液：
[0031]
a、挑取新鲜培养且生长良好的铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、沙门菌、白色念珠菌的单菌落15个左右，充分磨匀于200ml无菌的15％甘油水溶液中，得到浓度为105～106/ml的菌悬液，若需要浓度为107～108/ml的菌液浓度(例如：用于抑菌效力检查，要求每1g或1ml供试品中接种菌落数量为105～106cfu且接种菌液的体积不得超过供试品体积的1％)，可挑取更多单菌落制得菌悬液；
[0032]
15％甘油水溶液的制备方法为：称取甘油30克，加入纯化水170ml，混匀后于121℃湿热灭菌30min。
[0033]
b、取新鲜培养且孢子丰富的黑曲霉斜面8只，采用15％甘油水溶液将黑曲霉孢子洗脱，收集得到浓度为105～106/ml的孢子菌悬液，若需要浓度为107～108/l的菌液浓度(例如：用于抑菌效力检查,同上)，可采用洗脱孢子后的孢子菌悬液再重复去洗脱新的黑曲霉孢子斜面，制得含菌量较高的孢子菌悬液；
[0034]
(3)将菌悬液和孢子菌悬液分别混匀后分装于无菌玻璃瓶中，分装时充分混匀确保本批次每个无菌玻璃瓶中的试验菌含菌数量相对一致，每个无菌玻璃瓶中装入1ml，分装结束后马上置于-36℃下冷冻保存，得到保存效期长的可计数菌株。从步骤(2)开始至冷冻保存，操作时间小于1h，避免菌落数量因微生物繁殖等产生变化。
[0035]
分装采用的无菌玻璃瓶可先于121℃下湿热灭菌30min后，烘干备用。
[0036]
保存效期稳定性试验：
[0037]
1、材料与方法
[0038]
1.1仪器：电子天平、电热恒温鼓风干燥箱、脉动真空灭菌器、生化培养箱、恒温水浴锅、生物安全柜、医用冷藏冷冻箱、显微镜、移液器、红外灭菌器。
[0039]
1.2材料：300ml三角烧瓶、1.5ml小玻璃瓶、90mm平皿、试管、革兰染色液、氧化酶试纸、载玻片、酒精灯、香柏油、接种环、保存盒。
[0040]
1.3培养基：胰酪大豆胨琼脂培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基、(pdp)琼脂培养基、兔血浆、乳糖胆盐发酵培养基、大肠埃希菌生化鉴定条、沙门菌生化鉴定条、三糖铁琼脂培
养基、1％聚山梨酯80-玉米琼脂培养基、念珠菌显色培养基、铜绿假单胞菌显色培养基、麦康凯琼脂培养基、大肠埃希菌显色培养基、木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂。
[0041]
1.4试剂试液：三氯甲烷、1mol/l盐酸、15％甘油水溶液。
[0042]
1.5环境：洁净区温度为18～26℃，湿度为45％～75％，洁净级别为c级，二级生物安全柜。
[0043]
2、效期验证方法
[0044]
2.1计数周期：在存放期为0个月、1个月、3个月、9个月、15个月、24个月、27个月相应规定的时间内，取出菌液进行计数和纯度和特性确认。
[0045]
2.2计数方式：首次(0个月)在制备结束后取0.9ml菌液进行计数，得到0.9ml菌液的含菌量，计算出后面周期计数的稀释方法，在1个月及以后，每次取出可计数菌株10小瓶进行计数，每次从-36℃冰箱中取出的试验菌株待其融化后马上进行稀释，从稀释开始到注入计数用培养基时间控制在1小时内完成，避免冻融后放置时间过长使微生物数量发生变化造成计数不真实。
[0046]
初次平皿计数时，采用10倍递增稀释法进行计数，方便得到本批制备菌悬液的含菌量，后续可根据实际情况采用10倍或100倍等递增稀释法进行稀释，直至菌落数量达到药典计数要求，在30～300cfu之间进行计数。
[0047]
制备计数用的铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、沙门菌平皿倾注不超过45℃的胰酪大豆胨琼脂培养基，待凝固后倒置于33℃培养箱中培养不超过3天，逐日计数，避免菌落蔓延覆盖；白色念珠菌和黑曲霉平皿倾注不超过45℃的沙氏葡萄糖琼脂培养基，待凝固后倒置于23℃培养箱中培养不超过5天，逐日计数，黑曲霉需在培养60小时后开始每隔4小时左右进行点计菌落数情况。
[0048]
2.3计数检测方法：每个周期计数结果均与0个月相比较，每0.9ml(取0.9ml是因为小瓶装1ml，由于瓶子本身粘附损失，取不了完整的1ml，所以选择0.9ml)菌液含菌量降低的lg值不得大于1，便于在菌液稀释方法不发生改变前提下，得到能符合要求的菌悬液含菌量，保证试验的稳定性和可靠性。计数范围选取在30～300之间的稀释级进行计数，每瓶菌液计数结果不能相差1倍以上，但不包括平板菌落数均在10个以下的情况(10个以下平板最小菌落数的允许幅度0-3、1-5、2-7、3-9、4-10、6-13、7-14)。
[0049]
2.4生物学活性确认方法：每个周期的菌株均进行生物学活性确认试验。通过菌落形态观察是否为典型的菌落形态；然后挑取单菌落进行革兰染色、镜检，观察其染色特性及菌形；以及生化试验等确认是否为典型的该试验菌株生物学特征。确认方法见表1。
[0050]
表1菌株生物学确认方法
[0051][0052]
2.5结果判定：当在规定周期内的计数结果和生物学特性确认均符合要求时，便可进入下一周期的试验。若其中有一项不符合要求的，便停止下一周期试验，定该周期的上一周期即为该可计数菌株的保存效期。检测结果见表2。
[0053]
表2检测结果
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[0064][0065]
由以上试验结果可知，本方法制得的可计数菌株，在-36℃低温保存下，在27个月时菌株的含菌量计数和生物学活性均在可控范围内，菌液制备后方便准确控制菌数，得到始终保持较准确的菌落数，便于使用到不同类型的验证试验和阳性对照试验中，提高后续日常实验的工作效率，解决每次实验菌液制备过程存在的菌数控制准确性困难和菌液制备过程繁琐等问题。
[0066]
制得的可计数菌株在未使用前，需持续保持低温冷冻状态，且为一次性使用，冻融后不得重新放回去保存。
[0067]
其他实验室常用到，又需要在试验中加入规定数量的菌株，也可采用本方法进行制备。