一种海洋生物制取复合降血压肽的方法与流程

1.本发明属于水产蛋白质加工技术领域，尤其涉及一种海洋生物制取复合降血压肽的方法。


背景技术：

2.目前，治疗高血压的化学合成降压药物有卡托普利、依那普利等，这些药物的降血压效果显著，但需要长期服用，且有一定的副作用，如引起咳嗽、丧失味觉、肾脏损伤等，因此，研发更加安全、高效的降压药物，对高血压的预防和治疗显得尤为必要。血管紧张素转换酶(angiotension converting enzyme，ace)是一种膜结合的含锌二肽羧基肽酶，它能够催化血管紧张素ⅰ转化成具有强烈血管收缩作用的血管紧张素，同时能使具有血管扩张作用的缓激肽失活，导致血压上升，因此，通过抑制ace的活性，减少血管紧张素ⅱ的生成，能够降低血压，ace抑制肽因具有与血管紧张素相似的结构，能够与ace结合位点结合，竞争性抑制血管紧张素的合成，从而起到降低血压的作用，天然来源的ace抑制肽因具有安全性高、易吸收、无副作用等特点，受到人们广泛关注，酶法降解是制备ace抑制肽的最主要的方式，酶解制得的ace抑制肽因具有安全性高、毒副作用小且可长期使用而备受关注。
3.海洋中含有大量的鱼类，海洋水产品产量约占水产总产量的57.72％，其中，鱼类的数量占绝对优势，中国海洋鱼类有1700多种，经济鱼类约300种，最常见而产量较高的经济鱼类约60～70种，每年的海洋鱼类肉产品产量丰富，鱼鳞是水产品加工过程中产生的废弃物，占到鱼体重的1％～5％，含有丰富的蛋白质(约占鱼鳞的50％～70％)，但并未得到很好的开发利用，据不完全统计，我国每年废弃的鱼鳞达30万t，造成了极大的资源浪费和环境污染。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种海洋生物制取复合降血压肽的方法，该方法能够制取ace抑制肽。
5.本发明提供了一种海洋生物制取复合降血压肽的方法，包括以下步骤：
6.将三文鱼去头、去鳍、去内脏后清洗干净，保留鱼鳞和鱼肉；将鱼肉切碎；
7.对鱼鳞进行脱脂脱钙处理，清洗并过滤；对切碎鱼肉进行脱脂脱钙处理，清洗，过滤，干燥后粉碎；
8.分别加入蒸馏水搅拌，调节ph值，分别加入碱性蛋白酶进行酶解；
9.将酶解后的溶液分别进行灭酶处理后，离心过滤去除沉淀物，将上层清液抽真空震荡后浓缩，冷冻干燥。
10.在本发明中，所述脱脂脱钙处理中，鱼鳞采用0.38～0.42wt％氢氧化钠溶液以料液比为1：4.5～5.5(kg/l)浸泡11～13h进行脱脂；然后采用0.8～1.2wt％hcl溶液以料液比1:9～11(kg/l)浸泡1.5～2.5h进行脱钙，流水冲洗2.5～3.5h，55～65℃下烘烤22～26h。
11.在本发明具体实施例中，鱼鳞采用0.4％氢氧化钠溶液浸泡12h(料液比为1:5(m/
v)，除去鱼鳞中的脂肪、杂蛋白等，然后用浓度为1％hcl溶液浸泡，料液比为1:10(m/v)，搅拌2h进行脱钙处理，再用流水冲洗3h。
12.在本发明中，所述脱脂脱钙处理中，搅拌条件下，切碎鱼肉在45～55℃下，采用92～97％乙醇以料液比1:3.5～4.5(kg/l)浸泡，每隔4h更换一次，重复操作4～5次。
13.在本发明具体实施例中，所述脱脂脱钙处理步骤中，在鱼肉中以1:4(m/v)比例加入95％乙醇溶液，在环境温度为50℃的情况下，去除过程中不断搅拌，每隔4h过滤更换95％乙醇溶液，重复搅拌并更换乙醇溶液操作4次，真空干燥。
14.在本发明中，脱脂脱钙后鱼鳞酶解的过程包括：
15.脱脂脱钙鱼鳞中加入蒸馏水，直至料液质量比为6～15％，加热至95～100℃热处理15～30min，调节ph值至8.0～10.0，加入碱性蛋白酶进行酶解；
16.所述酶解的温度为53～57℃，酶解的时间为30～120min。碱性蛋白酶的添加量占脱脂脱钙鱼鳞的1～5wt％，鱼鳞的胶原蛋白水解时间为30～40min，其分子量小于5000的占80％以上。
17.在本发明具体实施例中，在脱脂脱钙鱼鳞中加入蒸馏水，直至料液比为6～15％，将溶液置于100℃温度中热处理20min后，降温至55℃进行酶解，热处理后的溶液中加入碱性蛋白酶，碱性蛋白酶活性为24万u/g，碱性蛋白酶与溶液的比为1％，且控制酶解温度为55℃，碱性蛋白酶的酶解ph值为8.0，碱性蛋白酶的酶解时间2h。
18.随着酶解温度的升高，鱼鳞酶解产物水解度和ace抑制率均呈先上升后下降的趋势，且都在酶解温度为55℃时达到最大值，随着ph值的增大，鱼鳞酶解产物水解度和ace抑制率均呈先升高后下降的趋势，其中，当ph值为7.5～8.0时，鱼鳞酶解产物水解度显著升高，ph值为8.0～8.5变化不明显，继续增大ph值，水解度明显开始下降；ph值为7.5～8.0时，鱼鳞酶解产物ace抑制率显著升高，ph值大于8.0时，ace抑制率明显下降，因此，酶解的温度为55℃，碱性蛋白酶的酶解ph值为8.0，碱性蛋白酶的酶解时间2h。
19.在本发明中，脱脂脱钙后鱼肉粉酶解的过程包括：
20.脱脂脱钙鱼肉粉中加入蒸馏水，直至料液质量比为6～15％，加热至95～100℃热处理15～30min，调节ph值至8.0～10，加入碱性蛋白酶进行酶解；
21.酶解的温度为53～57℃，时间为30～120min。碱性蛋白酶的添加量占脱脂脱钙鱼肉的1～5wt％。鱼肉粉酶解采用的碱性蛋白酶的种类与鱼鳞酶解采用的碱性蛋白酶的种类一样；鱼肉粉酶解采用的碱性蛋白酶的活性为24万u/g。
22.在本发明具体实施例中，蛋白粉酶解处理步骤中，在脱钙鱼肉粉末中加入蒸馏水，直至料液比为10％或15％，将溶液置于100℃中热处理15min后进行酶解，热处理后的溶液中加入碱性蛋白酶，碱性蛋白酶与溶液的比为1％，且控制酶解温度为55℃或50℃，碱性蛋白酶的酶解ph值为9.5，碱性蛋白酶的酶解时间2h。热处理可以改变鱼鳞蛋白的结构进而影响其酶解进程，因而，也会改变蛋白酶酶解的最优条件，100℃处理15min可显著提高鱼鳞的酶解效率。
23.在45～50℃时，酶活性随着温度的升高，ace抑制率增大，在50℃时活性最强，而超过50℃温度继续升高，酶活性反而降低，最佳反应温度为50℃，在ph为8.5～9.5时，ace抑制率随着ph的增大而增加，而在9.5～10.5时，ace抑制率反而随着ph的增加而减小，即碱性蛋白酶的活性与所处环境ph有关，越接近最适ph，酶的活性越强，当ph超过最适ph时，碱性蛋
白酶逐渐失活，因此最适鱼肉粉酶解的温度为50℃，碱性蛋白酶的酶解ph值为9.5，碱性蛋白酶的酶解时间2h。
24.在本发明中，将酶解后的溶液分别进行灭酶处理包括：
25.将酶解后的鱼磷溶液和鱼粉溶液分别置于沸水中灭酶处理8～12min。
26.在本发明中，所述离心处理时，灭酶处理的鱼鳞溶液的离心速率为9500～10500rpm，离心时间为18～23min；
27.灭酶处理的鱼肉溶液的离心速率为3800～4200rpm，离心时间为13～18min。
28.具体实施例中，酶解后的鱼鳞溶液置于沸水中灭酶10min，在10000r/min的状态下对灭酶处理后的溶液离心20min，对溶液进行过滤，去除沉淀物后，通过冷冻干燥后，置于4℃的环境下储藏备用。
29.酶解后的鱼肉粉溶液置于沸水中灭酶10min，在4000r/min的状态下对灭酶处理后的溶液离心15min，对溶液进行过滤，去除沉淀物后，通过冷冻干燥后，置于4℃的环境下储藏备用。
30.本发明提供了一种海洋生物制取复合降血压肽的方法，包括以下步骤：将三文鱼去头、去鳍、去内脏后清洗干净，保留鱼鳞和鱼肉；将鱼肉切碎；对鱼鳞进行脱脂脱钙处理，清洗并过滤；对切碎鱼肉进行脱脂脱钙处理，清洗，过滤，干燥后粉碎；分别加入蒸馏水搅拌，调节ph值，分别加入碱性蛋白酶进行酶解；将酶解后的溶液分别进行灭酶处理后，离心过滤去除沉淀物，将上层清液抽真空震荡后浓缩，冷冻干燥。本发明对三文鱼进行预处理后，脱脂脱钙，再采用碱性蛋白酶进行酶解处理，提取得到小分子蛋白肽，制得ace抑制肽，其具有降血压效果。该方法充分利用鱼肉和鱼鳞，不仅能够减少环境污染，还能提高海洋生物的附加值，创造良好的经济与社会效益。
附图说明
31.图1为本发明提供的海洋生物制取复合降血压肽的流程示意图。
具体实施方式
32.为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种海洋生物制取复合降血压肽的方法进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
33.实施例1
34.本发明提供了海洋生物制取复合降血压肽产品配方的方法，所述方法包括：
35.sp1:原料预处理：将新鲜三文鱼去头、去鳍、去内脏后清洗干净后，保留鱼鳞和鱼肉，将鱼肉切碎；
36.sp2:脱脂脱钙处理：分别对鱼鳞和鱼肉进行脱脂脱钙处理，处理后清洗并过滤，对鱼鳞进行烘烤干燥，对鱼肉进行真空干燥，干燥后的鱼鳞和鱼肉分别进行粉碎处理；
37.sp3:蛋白粉酶解处理：分加入蒸馏水搅拌，调节ph值后，分别对鱼鳞和鱼肉的蛋白粉溶液中加入碱性蛋白酶进行酶解；
38.sp4:蛋白复合降血压肽处理：将酶解后的溶液经过灭酶处理后，经离心后过滤去除沉淀物，将上层清液抽真空震荡再进行浓缩后，冷冻干燥。
39.脱脂脱钙处理步骤中，鱼鳞采用0.4％氢氧化钠溶液浸泡12h(料液比为1:5(m/v)，
除去鱼鳞中的脂肪、杂蛋白等，然后用浓度为1％hcl溶液浸泡，料液比为1:10(m/v)，搅拌2h进行脱钙处理，再用流水冲洗3h；脱脂脱钙处理步骤中，在鱼肉中以1:4(m/v)比例加入95％乙醇溶液，在环境温度为50℃的情况下，去除过程中不断搅拌，每隔4h过滤更换95％乙醇溶液，重复搅拌并更换乙醇溶液操作4次，真空干燥后，进行粉碎处理；
40.蛋白粉酶解处理步骤中，在脱脂脱钙鱼鳞中加入蒸馏水，直至料液比为10％，将溶液置于100℃温度中热处理15min后进行酶解，热处理后的溶液中加入碱性蛋白酶，碱性蛋白酶与溶液的质量比为1％，且控制酶解温度为55℃，碱性蛋白酶的酶解ph值为8.0，碱性蛋白酶的酶解时间2h；
41.蛋白粉酶解处理步骤中，在脱钙鱼肉粉末中加入蒸馏水，直至料液比为15％，将溶液置于100℃温度中热处理15min后进行酶解，热处理后的溶液中加入碱性蛋白酶，碱性蛋白酶与溶液的质量比为1％，且控制酶解温度为50℃，碱性蛋白酶的酶解ph值为9.5，碱性蛋白酶的酶解时间2h；
42.蛋白肽制备步骤中：将酶解后的溶液置于沸水中灭酶10min，在10000r/min的状态下对灭酶处理后的溶液离心20min，对溶液进行过滤，去除沉淀物后，通过冷冻干燥后，置于4℃的环境下储藏备用；
43.蛋白肽制备步骤中，将酶解后的鱼鳞粉溶液置于沸水中灭酶10min，在4000r/min的状态下对灭酶处理后的溶液离心15min，对溶液进行过滤，去除沉淀物后，通过冷冻干燥后，置于4℃的环境下储藏备用。
44.实施例2：
45.海洋生物制取复合降血压肽产品配方的方法，所述方法包括如下脱脂脱钙处理步骤，鱼鳞采用0.4％氢氧化钠溶液浸泡12h(料液比为1:5(m/v)，除去鱼鳞中的脂肪、杂蛋白等，然后用浓度为1％hcl溶液浸泡，料液比为1:10(m/v)，搅拌2h进行脱钙处理，再用流水冲洗3h；脱脂脱钙处理步骤中，在鱼肉中以1:4(m/v)比例加入95％乙醇溶液，在环境温度为50℃的情况下，去除过程中不断搅拌，每隔4h过滤更换95％乙醇溶液，重复搅拌并更换乙醇溶液操作4次，真空干燥后，进行粉碎处理；
46.蛋白粉酶解处理步骤中，在脱脂脱钙鱼鳞中加入蒸馏水，直至料液比为10％，将溶液置于100℃温度中热处理15min后进行酶解，热处理后的溶液中加入碱性蛋白酶，碱性蛋白酶与溶液的质量比为1％，且控制酶解温度为55℃，将碱性蛋白酶的酶解ph值为8.0，碱性蛋白酶的酶解时间2h；
47.蛋白粉酶解处理步骤中，在脱钙鱼肉粉末中加入蒸馏水，直至料液比为15％，将溶液置于100℃温度中热处理15min后进行酶解，热处理后的溶液中加入碱性蛋白酶，碱性蛋白酶与溶液的质量比为1％，且控制酶解温度为50℃，碱性蛋白酶的酶解ph值为9.5，碱性蛋白酶的酶解时间2h；
48.蛋白肽制备步骤中：将酶解后的鱼鳞溶液置于沸水中灭酶10min，在10000r/min的状态下对灭酶处理后的溶液离心20min，对溶液进行过滤，去除沉淀物后，通过冷冻干燥后，置于4℃的环境下储藏备用；
49.蛋白肽制备步骤中，将酶解后的鱼肉粉溶液置于沸水中灭酶10min，在4000r/min的状态下对灭酶处理后的溶液离心15min，对溶液进行过滤，去除沉淀物后，通过冷冻干燥后，置于4℃的环境下储藏备用。
50.由以上实施例可知，本发明提供了一种海洋生物制取复合降血压肽的方法，包括以下步骤：将三文鱼去头、去鳍、去内脏后清洗干净，保留鱼鳞和鱼肉；将鱼肉切碎；对鱼鳞进行脱脂脱钙处理，清洗并过滤；对切碎鱼肉进行脱脂脱钙处理，清洗，过滤，干燥后粉碎；分别加入蒸馏水搅拌，调节ph值，分别加入碱性蛋白酶进行酶解；将酶解后的溶液分别进行灭酶处理后，离心过滤去除沉淀物，将上层清液抽真空震荡后浓缩，冷冻干燥。本发明对三文鱼进行预处理后，脱脂脱钙，再采用碱性蛋白酶进行酶解处理，提取得到小分子蛋白肽，制得ace抑制肽，其具有降血压效果。该方法充分利用鱼肉和鱼鳞，不仅能够减少环境污染，还能提高海洋生物的附加值，创造良好的经济与社会效益。
51.ace抑制率的检测
52.上述实施例1和2中，ace抑制率的检测是脱脂脱钙鱼鳞分别溶于适量蒸馏水中，通过0.5mol/lnaoh溶液调节溶液至ph＝7，将ace和hhl分别溶解在ph＝8.3、0.1mol/l的硼酸钠缓冲溶液，然后37℃下保温3分钟后，再加入10ulace溶液，混匀后在37℃下保温30分钟，再加入150ul的1.0mol/l的盐酸溶液以终止反应，然后再加入1.7ml醋酸乙酯，经振荡混匀后，静置5分钟，用移液管吸取1.oml的醋酸乙酯层，置于120℃烘箱烘干，加入1.0ml蒸馏水，混匀后在228nm处测定吸光度。
53.结果分别为58.25％和62.32％。
54.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。