一种具有抑菌活性的蛋白质多肽类物质的制备方法与流程

1.本发明涉及多肽制备技术领域，具体而言，涉及一种具有抑菌活性的蛋白质多肽类物质的制备方法。


背景技术：

2.辣木(moringaoleifera)为辣木科辣木属多年生热带落叶乔木，在我国的热带和亚热带地区如云南、福建、广东等地被广泛种植[1]。辣木以高蛋白质、高钙、高维生素以及具有特殊的营养保健作用，而著名，辣木叶、籽是辣木中营养成分和经济价值较高的部位，据报道，辣木叶片干粉中含有27.5％的粗蛋白、2.30％钙及0.41％维生素a，辣木籽干粉中更是含有37.80％的粗蛋白。
[0003]
然而，由于辣木籽蛋白中多肽含量较低，现有制备手段不能有效提取活性多肽，造成提取含量较小，不能充分利用辣木籽易造成资源浪费；而且，辣木籽多肽的抑菌种类较少，仅对革兰氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等少数菌种有抑制效果，不具备广谱抑菌功效。


技术实现要素：

[0004]
本发明提出了一种具有抑菌活性的蛋白质多肽类物质的制备方法，解决了现有制备手段不能有效提取活性多肽，辣木籽多肽不具备广谱抑菌功效的问题。
[0005]
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种具有抑菌活性的蛋白质多肽类物质的制备方法，包括以下步骤：(1)称取适量脱脂辣木籽粉,加入nacl溶液，在30-40℃条件下水浴搅拌，静置冷却，获取上清液并调节ph至9-11，静置离心后，在沉淀物中加入超纯水溶解后透析，脱盐处理33-40h，低温冷冻后经真空冷冻干燥得到辣木籽蛋白粉；(2)称取适量辣木籽蛋白粉放入烧瓶中，加入蒸馏水，辣木籽蛋白粉与蒸馏水的质量比为30-40:1，再选取蛋白酶，以酶底质量百分比2.0-3.0％为酶添加量，调节ph至6.5-7.5，酶解温度控制在40-50℃，酶解时间3-5h，在80-90℃灭酶10-15min，离心，取上层清液经浓缩后冷冻干燥，获得辣木籽多肽提取物；(3)取辣木籽多肽提取物放入烧瓶中，加入蒸馏水，配制成质量分数为4-6％的多肽溶液，向多肽溶液中加入硝酸银溶液，多肽溶液和硝酸银溶液的质量比为2-3:1，再加入抗坏血酸，混合均匀后于40-45℃水浴中反应55-65min，然后加入无水乙醇沉淀，经离心并干燥后获得辣木籽多肽螯合银粉末，置于-20℃条件下保存；(4)将辣木籽多肽螯合银粉末和精油按质量比(60-70):(40-30)均匀混合，获得蛋白质多肽类物质。
[0006]
优选的，在步骤(2)中，所述取上层清液经浓缩后，还包括：将浓缩液装于截留分子质量为100u的透析袋中，以蒸馏水为透析液，置于3-4℃冰箱中透析10-12h，每4h更换一次透析液，获得透析后的辣木籽多肽液。
[0007]
优选的，所述硝酸银溶液的制备方法包括如下步骤：1)通过电解法得到质量分数在99.9％以上的银；2)将提纯过的银和硝酸反应，得到硝酸银溶液；3)利用分子筛技术，过滤硝酸银溶液即可。
[0008]
优选的，所述蛋白酶包括胃蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶及贯筋藤蛋白酶中的一种或多种。
[0009]
优选的，所述精油为牛至、肉桂、百里香和茶树精油中的一种或多种。
[0010]
与现有技术相比，本发明的有益效果包括：通过将辣木籽多肽提取物与硝酸银溶液螯合，获得辣木籽多肽螯合银粉末，再与抑菌精油复配获得蛋白质多肽类物质，该蛋白质多肽类物质不仅对革兰氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌具有良好的抑制作用，而且对单增李斯特菌、大肠杆菌也有较好的抑制效果，具有广谱抑菌作用；通过100u的透析袋将辣木籽多肽中大分子多肽和蛋白去除，避免了大分子多肽对抑菌作用的干扰。
附图说明
[0011]
图1为本发明实施例中蛋白质多肽类物质对4种致病菌株的最小抑菌浓度图。
[0012]
图2为本发明实施例中蛋白质多肽类物质对金黄色葡萄球菌影响的生长曲线图。
具体实施方式
[0013]
本发明提供了一种具有抑菌活性的蛋白质多肽类物质的制备方法，包括：
[0014]
步骤1：称取适量脱脂辣木籽粉,加入nacl溶液，在30-40℃条件下水浴搅拌，静置冷却，获取上清液并调节ph至9-11，静置离心后，在沉淀物中加入超纯水溶解后透析，脱盐处理33-40h，低温冷冻后经真空冷冻干燥得到辣木籽蛋白粉。
[0015]
步骤2：称取适量辣木籽蛋白粉放入烧瓶中，加入蒸馏水，辣木籽蛋白粉与蒸馏水的质量比为30-40:1，再选取蛋白酶，以酶底质量百分比2.0-3.0％为酶添加量，调节ph至6.5-7.5，酶解温度控制在40-50℃，酶解时间3-5h，在80-90℃灭酶10-15min，离心，取上层清液经浓缩后冷冻干燥，获得辣木籽多肽提取物。
[0016]
本发明实施例中，蛋白酶包括胃蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶及贯筋藤蛋白酶中的一种或多种。
[0017]
取上层清液经浓缩后，还包括：将浓缩液装于截留分子质量为100u的透析袋中，以蒸馏水为透析液，置于3-4℃冰箱中透析10-12h，每4h更换一次透析液，获得透析后的辣木籽多肽液。
[0018]
步骤3：取辣木籽多肽提取物放入烧瓶中，加入蒸馏水，配制成质量分数为4-6％的多肽溶液，向多肽溶液中加入硝酸银溶液，多肽溶液和硝酸银溶液的质量比为2-3:1，再加入抗坏血酸，混合均匀后于40-45℃水浴中反应55-65min，然后加入无水乙醇沉淀，经离心并干燥后获得辣木籽多肽螯合银粉末，置于-20℃条件下保存。将硝酸银作为银源，有利于螯合物的形成，提高了螯合效率，同时残余的硝酸银易于去除，有利于获得高纯度产物。
[0019]
优选的，硝酸银溶液的制备方法包括如下步骤：
[0020]
1)通过电解法得到质量分数在99.9％以上的银。
[0021]
2)将提纯过的银和硝酸反应，得到硝酸银溶液。
[0022]
3)利用分子筛技术，过滤硝酸银溶液即可。
[0023]
步骤4：将辣木籽多肽螯合银粉末和精油按质量比(60-70):(40-30)均匀混合，获得蛋白质多肽类物质。该精油为牛至、肉桂、百里香和茶树精油中的一种或多种。
[0024]
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显
然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0025]
实施例1
[0026]
一种具有抑菌活性的蛋白质多肽类物质的制备方法，包括：
[0027]
步骤1：称取5g脱脂辣木籽粉,加入300ml 0.2mol/l的nacl溶液，在30℃条件下水浴搅拌，静置冷却，获取上清液并调节ph至9，静置离心后，在沉淀物中加入超纯水溶解后透析，脱盐处理33h，-20℃低温冷冻后经真空冷冻干燥得到辣木籽蛋白粉。辣木籽蛋白粉的蛋白质含量为86.52％，3℃冷藏备用。
[0028]
步骤2：称取适量辣木籽蛋白粉放入烧瓶中，加入蒸馏水，辣木籽蛋白粉与蒸馏水的质量比为30:1，再选取胃蛋白酶，以酶底质量百分比2.0％为酶添加量，调节ph至6.5，酶解温度控制在40℃，酶解时间3h，在80℃灭酶10min，离心，取上层清液经浓缩后冷冻干燥，获得辣木籽多肽提取物。
[0029]
取上层清液经浓缩后，还包括：将浓缩液装于截留分子质量为100u的透析袋中，以蒸馏水为透析液，置于3℃冰箱中透析10h，每4h更换一次透析液，获得透析后的辣木籽多肽液。
[0030]
步骤3：取辣木籽多肽提取物放入烧瓶中，加入蒸馏水，配制成质量分数为4％的多肽溶液，向多肽溶液中加入硝酸银溶液，多肽溶液和硝酸银溶液的质量比为2:1，再加入抗坏血酸，混合均匀后于40℃水浴中反应55min，然后加入无水乙醇沉淀，经离心并干燥后获得辣木籽多肽螯合银粉末，置于-20℃条件下保存。将硝酸银作为银源，有利于螯合物的形成，提高了螯合效率，同时残余的硝酸银易于去除，有利于获得高纯度产物。
[0031]
优选的，硝酸银溶液的制备方法包括如下步骤：
[0032]
4)通过电解法得到质量分数在99.9％以上的银。
[0033]
5)将提纯过的银和硝酸反应，得到硝酸银溶液。
[0034]
6)利用分子筛技术，过滤硝酸银溶液即可。
[0035]
步骤4：将辣木籽多肽螯合银粉末和精油按质量比60:40均匀混合，获得蛋白质多肽类物质。该精油为牛至精油。
[0036]
实施例2
[0037]
步骤1：称取5g脱脂辣木籽粉,加入300ml 0.2mol/l的nacl溶液，在35℃条件下水浴搅拌，静置冷却，获取上清液并调节ph至10，静置离心后，在沉淀物中加入超纯水溶解后透析，脱盐处理36h，低温冷冻后经真空冷冻干燥得到辣木籽蛋白粉。辣木籽蛋白粉的蛋白质含量为87.5％，3℃冷藏备用。
[0038]
步骤2：称取适量辣木籽蛋白粉放入烧瓶中，加入蒸馏水，辣木籽蛋白粉与蒸馏水的质量比为35:1，再选取胰蛋白酶，以酶底质量百分比2.5％为酶添加量，调节ph至7，酶解温度控制在45℃，酶解时间4h，在85℃灭酶12min，离心，取上层清液经浓缩后冷冻干燥，获得辣木籽多肽提取物。
[0039]
取上层清液经浓缩后，还包括：将浓缩液装于截留分子质量为100u的透析袋中，以蒸馏水为透析液，置于4℃冰箱中透析11h，每4h更换一次透析液，获得透析后的辣木籽多肽液。
[0040]
步骤3：取辣木籽多肽提取物放入烧瓶中，加入蒸馏水，配制成质量分数为5％的多肽溶液，向多肽溶液中加入硝酸银溶液，多肽溶液和硝酸银溶液的质量比为3:1，再加入抗坏血酸，混合均匀后于42℃水浴中反应60min，然后加入无水乙醇沉淀，经离心并干燥后获得辣木籽多肽螯合银粉末，置于-20℃条件下保存。将硝酸银作为银源，有利于螯合物的形成，提高了螯合效率，同时残余的硝酸银易于去除，有利于获得高纯度产物。
[0041]
优选的，所述硝酸银溶液的制备方法包括如下步骤：
[0042]
7)通过电解法得到质量分数在99.9％以上的银。
[0043]
8)将提纯过的银和硝酸反应，得到硝酸银溶液。
[0044]
9)利用分子筛技术，过滤硝酸银溶液即可。
[0045]
步骤4：将辣木籽多肽螯合银粉末和精油按质量比65:35均匀混合，获得蛋白质多肽类物质。该精油为肉桂精油。
[0046]
实施例3
[0047]
步骤1：称取5g脱脂辣木籽粉,加入300ml 0.2mol/l的nacl溶液，在40℃条件下水浴搅拌，静置冷却，获取上清液并调节ph至11，静置离心后，在沉淀物中加入超纯水溶解后透析，脱盐处理40h，低温冷冻后经真空冷冻干燥得到辣木籽蛋白粉。辣木籽蛋白粉的蛋白质含量为85.8％，3℃冷藏备用。
[0048]
步骤2：称取适量辣木籽蛋白粉放入烧瓶中，加入蒸馏水，辣木籽蛋白粉与蒸馏水的质量比为40:1，再选取碱性蛋白酶，以酶底质量百分比3.0％为酶添加量，调节ph至7.5，酶解温度控制在50℃，酶解时间5h，在90℃灭酶15min，离心，取上层清液经浓缩后冷冻干燥，获得辣木籽多肽提取物。
[0049]
取上层清液经浓缩后，还包括：将浓缩液装于截留分子质量为100u的透析袋中，以蒸馏水为透析液，置于4℃冰箱中透析12h，每4h更换一次透析液，获得透析后的辣木籽多肽液。
[0050]
步骤3：取辣木籽多肽提取物放入烧瓶中，加入蒸馏水，配制成质量分数为6％的多肽溶液，向多肽溶液中加入硝酸银溶液，多肽溶液和硝酸银溶液的质量比为3:1，再加入抗坏血酸，混合均匀后于45℃水浴中反应65min，然后加入无水乙醇沉淀，经离心并干燥后获得辣木籽多肽螯合银粉末，置于-20℃条件下保存。将硝酸银作为银源，有利于螯合物的形成，提高了螯合效率，同时残余的硝酸银易于去除，有利于获得高纯度产物。
[0051]
优选的，所述硝酸银溶液的制备方法包括如下步骤：
[0052]
1)通过电解法得到质量分数在99.9％以上的银。
[0053]
2)将提纯过的银和硝酸反应，得到硝酸银溶液。
[0054]
3)利用分子筛技术，过滤硝酸银溶液即可。
[0055]
步骤4：将辣木籽多肽螯合银粉末和精油按质量比70:30均匀混合，获得蛋白质多肽类物质。该精油为茶树精油。
[0056]
应用实施例1
[0057]
采用双层平板打孔法，考察实施例1制备的蛋白质多肽类物质的抗菌作用，发现蛋白质多肽类物质对单增李斯特菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和鼠伤寒沙门氏菌有明显的抑制作用。单增李斯特菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和鼠伤寒沙门氏菌的最低抑菌浓度分别为3.20mg/ml、0.78mg/ml、0.72mg/ml和0.36mg/ml，其中以金黄色葡萄球菌对蛋白质多肽
类物质最为敏感，如图1所示。
[0058]
选取金黄色葡萄球菌为实验对象，考察蛋白质多肽类物质对金黄色葡萄球菌生长曲线的影响，结果如图2所示。在培养至0.5-4.5h范围内，对照组金黄色葡萄球菌菌液od600值基本维持在0.045左右，而添加酶解产物的金黄色葡萄球菌菌液od600值则维持在0.049左右；但培养至4.5-8.0h范围内，随着培养时间的延长，添加蛋白质多肽类物质的菌液od600值呈缓慢下降趋势，而对照组菌液od600值逐渐增大，且上升趋势明显，说明蛋白质多肽类物质对培养至4.5h后的金黄色葡萄球菌产生了有效抑制。
[0059]
综上所述，本发明的有益效果包括：通过将辣木籽多肽提取物与硝酸银溶液螯合，获得辣木籽多肽螯合银粉末，再与抑菌精油复配获得蛋白质多肽类物质，该蛋白质多肽类物质不仅对革兰氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌具有良好的抑制作用，而且对单增李斯特菌、大肠杆菌也有较好的抑制效果，具有广谱抑菌作用；通过100u的透析袋将辣木籽多肽中大分子多肽和蛋白去除，避免了大分子多肽对抑菌作用的干扰。
[0060]
本发明的技术范围不仅仅局限于上述说明中的内容，本领域技术人员可以在不脱离本发明技术思想的前提下，对上述实施例进行多种变形和修改，而这些变形和修改均应当属于本发明的保护范围内。