一种基于CD63抗体偶联磁珠的外泌体分离方法与流程

一种基于cd63抗体偶联磁珠的外泌体分离方法
技术领域
1.本发明属于外泌体分离技术领域，涉及一种基于cd63抗体偶联磁珠的外泌体分离方法。


背景技术：

2.外泌体是能被几乎所有细胞主动分泌至细胞外的微小囊泡，具有脂质双分子层结构，体积为30-150nm，呈典型的杯状形态。通常包含蛋白质、脂质、mrna、microrna等功能分子，稳定且广泛存在于血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁等体液中。外泌体参与细胞间物质交换和信息传递，调节免疫反应、肿瘤侵袭、细胞增殖等生物学行为。
3.建立从体液中富集外泌体的有效的方法可以帮助更好地了解外泌体的分子组成及生理功能，对外泌体进行相关功能分析，有助于了解多种疾病的发生机制，用于诊断及预后评估。
4.目前，外泌体分离技术主要有超速离心法、超滤法、聚合物沉淀法、尺寸排阻色谱法，以及基于免疫亲和的分离技术。超速离心法是目前外泌体分离的“金标准”方法，可对大体积体液样品进行分离且产量较高，但设备成本昂贵，操作复杂、耗时较长，且外泌体结构与功能易受到破坏。超滤法操作简单，富集效率高，但由于小于膜孔孔径的蛋白质及其它分子均可通过滤膜，会导致分离出的外泌体纯度不足，且膜孔堵塞也会影响外泌体的分离效率。聚合物沉淀法利用聚合物“劫持”水分子的特性以降低外泌体的溶解度，结合低速离心或其它辅助手段以实现外泌体富集，可处理大剂量样品，但所获得的外泌体纯度不高。
5.免疫亲合法富集提取的外泌体纯度最高，避免了尺寸、密度等固有特性对分离方法的限制，能够选择性富集特定的外泌体亚型，更有利于后续研究。其中，免疫磁珠法通过在磁珠表面修饰特异性捕获抗体以识别并结合外泌体表面的特定蛋白，从而实现对外泌体的高纯度捕获，基于免疫磁珠法的试剂盒已应用于实验室研究，但普遍存在的问题在于难以回收捕获在免疫磁珠表面的外泌体，限制了该方法在药物递送等外泌体工程化改造、外泌体疗法等方面的应用，可能干扰下游功能研究。
6.可见，现有技术缺乏一种分离简便、纯度高、不影响外泌体形态结构和生理功能的分离技术。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于解决现有技术中外泌体分离方法分离纯度低、影响外泌体功能分析及工程化应用的缺陷问题，提供一种基于cd63抗体偶联磁珠的外泌体分离方法，可获得高纯度的外泌体，不影响外泌体的结构形态和生理功能，操作简单快速。
8.为达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
9.一种基于cd63抗体偶联磁珠的外泌体分离方法，包括以下步骤：
10.s1：在streptactin磁珠的表面修饰cd63抗体，得到cd63抗体偶联磁珠；
11.s2：过滤待测细胞培养上清液样本，将过滤后的待测细胞培养上清液样本与cd63
抗体偶联磁珠混合并孵育，得到孵育后的混合物；
12.s3：分离s2中孵育后的混合物，得到磁吸附物和分离液；
13.s4：洗涤磁吸附物，将洗涤后的磁吸附物与洗脱缓冲液混合并孵育，使固液分离，收集外泌体提取液。
14.本发明的进一步改进在于：
15.所述s2中，待测细胞培养上清液样本与cd63抗体偶联磁珠的质量比为500μl：0.3～0.5mg。
16.所述s2中，待测细胞培养上清液样本与cd63抗体偶联磁珠孵育的时间为10-15min，孵育温度为4℃。
17.所述s4中，洗涤磁吸附物的次数为2-3次。
18.所述s4中，洗涤后的磁吸附物与洗脱缓冲液的质量比为0.5mg：0.5～1ml。
19.所述s4中，磁吸附物与洗脱缓冲液孵育时间为10min。
20.所述s4中，将洗涤后的磁吸附物与洗脱缓冲液混合并孵育使固液分离时，洗脱缓冲液洗脱的次数为2-3次。
21.所述s2和s4孵育时有震荡。
22.借助于strep tactin与strep tag ii间的特异性识别作用，偶联streptag ii标签的cd63抗体被修饰在streptactin磁珠表面。
23.所述洗脱缓冲液为浓度50mm的脱硫生物素溶液。
24.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
25.本发明公开了一种基于cd63抗体偶联磁珠的外泌体分离方法，在streptactin磁珠的表面修饰cd63抗体，可分离体液样本中几乎所有的外泌体颗粒，有效克服常规的外泌体富集技术存在的对脂蛋白等杂质共分离的缺陷，极大提升富集外泌体的纯度，并且不会影响外泌体的结构形态，分离特异性强，重复性好，提高了对外泌体的捕获效率，并在温和条件下无损释放捕获的外泌体，以达到回收外泌体用于后续研究的目的。
26.进一步的，本发明借助于strep tactin与strep tag ii间的特异性识别作用，偶联streptag ii标签的cd63抗体被修饰在磁珠表面，streptag ii及其偶联物(外泌体)将被脱硫生物素竞争取代，从而实现对捕获外泌体的无损释放，解决了利用免疫亲和磁珠法捕获的外泌体无法与磁珠分离，进而影响下游应用的问题。
附图说明
27.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
28.图1为本发明的实施例中外泌体透射电镜观察图像图。
具体实施方式
29.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是
本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。
30.因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
31.应注意到：相似的标号和字母在下面的附图中表示类似项，因此，一旦某一项在一个附图中被定义，则在随后的附图中不需要对其进行进一步定义和解释。
32.在本发明实施例的描述中，需要说明的是，若出现术语“上”、“下”、“水平”、“内”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，或者是该发明产品使用时惯常摆放的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”等仅用于区分描述，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
33.此外，若出现术语“水平”，并不表示要求部件绝对水平，而是可以稍微倾斜。如“水平”仅仅是指其方向相对“竖直”而言更加水平，并不是表示该结构一定要完全水平，而是可以稍微倾斜。
34.在本发明实施例的描述中，还需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，若出现术语“设置”、“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
35.下面结合附图对本发明做进一步详细描述：
36.本发明实施例公开了一种基于cd63抗体偶联磁珠的外泌体分离方法，包括以下步骤：
37.(1)将待测细胞培养上清液样本过滤，得到过滤细胞培养上清液样本，并将过滤细胞怕培养上清液样本与cd63抗体偶联磁珠混合，4℃下孵育10～15min；
38.其中，过滤细胞培养上清液样本的体积与cd63抗体偶联磁珠的质量之比为500μl：0.3～0.5mg，更优的比例为500μl：0.5mg。
39.cd63抗体偶联磁珠与待测样本的孵育时间为15min；
40.同时，借助于strep tactin蛋白与strep tag ii间的特异性识别作用，偶联strep tag ii标签的cd63抗体被修饰在strep tactin磁珠表面。
41.(2)以外置磁场分离所述步骤(1)孵育后的混合物，得到磁吸附物和分离液，孵育时还伴随振荡，以使外泌体与cd63抗体偶联磁珠充分接触。
42.(3)以洗涤缓冲液洗涤所述磁吸附物，其中，洗涤的次数为2～3次，更优的次数为3次。
43.(4)将洗涤后的磁吸附物与洗脱缓冲液混合，孵育10min，固液分离，液体部分为外泌体提取液，孵育时还伴随振荡。
44.其中，洗涤后的磁吸附物的质量与洗脱缓冲液的体积比为0.5mg：0.5～1ml，更优的比例为0.5mg：1ml；
45.洗脱的次数为2～3次，更优的比例为3次。
46.本发明实施例中的洗脱缓冲液为浓度50mm的脱硫生物素溶液。
47.本发明实施例中的洗涤缓冲液组分为0.1m tris-cl，0.15m nacl和1mm edta。
48.本发明首先将待测细胞培养上清液样本过滤，得到过滤细胞培养上清液样本，将过滤细胞培养上清液样本与cd63抗体偶联磁珠混合，4℃下孵育10～15min。孵育时，待测细胞培养上清液样本中的外泌体与cd63抗体偶联磁珠特异性结合，形成“cd63抗体偶联磁珠-外泌体”。
49.在本发明实施例中，将待测细胞培养上清液过滤的目的为了去除细胞碎片；过滤的滤膜孔径优选为0.22μm；本发明实施例可以采用针筒过滤器进行过滤；其中过滤的滤膜优选为聚丙烯滤膜(ghp)。
50.本发明实施例中，振荡速率优选为300～1000rpm，更优选为500rpm。在本发明实施例中，振荡优选的采用恒温振荡仪进行。
51.4℃孵育结束后，本发明实施例以外置磁场分离4℃孵育后的混合物，得到磁吸附物和分离液。
52.本发明实施例利用外置磁场对磁珠的磁吸附能力，将孵育后形成的“cd63抗体偶联磁珠-外泌体”富集在一起，便于分离。本发明实施例对外置磁场无特殊限定，采用本领域已知的外置磁场即可，例如磁铁。在本发明实施例中，外置磁场优选的设置在盛装所述混合物的容器的底部，也可以设置在其他位置。
53.得到磁分离物后，本发明以洗涤缓冲液洗涤所述磁吸附物，对磁吸附物进行洗涤是为了去除磁吸附物非特异性吸附的杂质，以确保所得外泌体的纯度。
54.本发明实施例对洗涤液的用量无特殊限定，能够完成洗涤即可。
55.洗涤完成后，本发明将洗涤后的磁吸附物与洗脱缓冲液混合，孵育10min，固液分离，液体部分为外泌体提取液。
56.本发明实施例采用洗脱缓冲液以更强的结合亲和力竞争替代streptag ii及其偶联物使“cd63抗体偶联磁珠-外泌体”分离，磁珠由于自身重力变为沉淀，而外泌体则溶于洗脱液中，通过固液分离即可成功完成外泌体与cd63抗体偶联磁珠的分离。
57.在本发明实施例中，孵育的温度优选为2～5℃，更优选为4℃。
58.在本发明实施例中，孵育时还伴随振荡，以使外泌体与cd63抗体偶联磁珠充分分离；
59.利用本发明实施例提供的试剂盒以及分离方法提取外泌体，分离时间仅需45min左右，外泌体的捕获率可达到90％以上，回收率达到50％以上，且外泌体的形态结构及生物学功能不受改变。
60.本发明实施例中的cd63抗体偶联磁珠能够与外泌体表面的cd63蛋白特异性结合，可分离体液样本中几乎所有的外泌体颗粒，有效克服常规的外泌体富集技术存在的对脂蛋白等杂质共分离的缺陷，极大提升富集外泌体的纯度。
61.现有的用于外泌体分离的免疫磁珠主要通过将生物素化的抗体与链霉亲和素磁珠结合从而实现磁珠功能化，以捕获样品中的外泌体，该方法存在的主要问题是链霉亲和素和生物素间结合力极强，难以被打断，导致捕获的外泌体无法温和从磁珠表面脱离。与现有免疫磁珠法不同，本发明独特的基于streptactin蛋白与streptag ii标签间的特殊的可
逆性结合特性，将与streptag ii标签偶联的cd63抗体修饰在streptactin磁珠表面，通过独特的结构设计可实现对外泌体的高效率捕获，并在脱硫生物素存在的条件下温和无损释放捕获的外泌体，可有效解决现有免疫磁分离方法难以实现无损回收外泌体、不利于下游功能学研究及外泌体工程化改造的问题。
62.本发明实施例采用cd63抗体偶联磁珠与外泌体结合，通过外置磁场可快速简便的分离得到cd63抗体偶联磁珠-外泌体。
63.cd63抗体偶联磁珠与过滤后的细胞培养上清液混合孵育后，利用本发明所述试剂盒中的洗脱缓冲液，streptag ii及其偶联物(外泌体)将被脱硫生物素竞争取代，从而实现对捕获外泌体的无损释放，解决了利用免疫亲和磁珠法捕获的外泌体无法与磁珠分离，进而影响下游应用的问题。
64.本发明实施例的检测原理：
65.准备：试剂盒；
66.cd63抗体偶联磁珠；
67.洗涤缓冲液：0.1m tris-cl，0.15m nacl和1mm edta；
68.洗脱液：50mm脱硫生物素溶液。
69.1)用带有0.22μm孔径聚丙烯滤膜的针筒过滤器对待测细胞培养上清液过滤，移除细胞碎片和微囊泡，得到过滤细胞培养上清液样本；
70.2)将过滤细胞培养上清液样品与cd63抗体偶联纳米磁珠按照500μl：0.5mg的比例混合，在4℃恒温上孵育15min，充分富集外泌体；
71.3)利用外置磁场分离孵育后的混合物，固液分离，弃去上清液，得到磁分离物；
72.4)用洗涤缓冲液对磁分离物洗涤3次；
73.5)将洗涤后的磁分离物与洗脱缓冲液按照0.5mg：1ml的比例混合，在恒温振荡仪上孵育10min进行充分洗脱，重复3次，得到外泌体提取液。
74.进一步的，透射电镜检测提取的外泌体，参见图1，
75.1)重悬外泌体到50μl 2％pfa中，将5μl外泌体悬液加到formvar-carbon载样铜网上；
76.2)将100μl pbs加到封口膜上，用镊子将铜网(formvar膜面朝下)放在pbs液滴上清洗；
77.3)将铜网放在50μl 1％戊二醛液滴上固定5min，随后将铜网放在100μl去离子水上2min清洗；
78.4)将铜网放在50μl草酸双氧铀液滴上负染5min，随后将铜网放在50μl甲基纤维素液滴上10min；
79.5)用滤纸吸去铜网表面的多余液体，空气中干燥5到10min，置于80kv下拍摄透射电镜照片。
80.本发明实施例公开了现有技术中的两种外泌体分离方法：
81.对比例1
82.超速离心法分离外泌体
83.1)将10ml待测细胞培养上清液于4℃以300g离心10min，收集上清液后于4℃以2000g离心10min收集上清液，分别去除细胞和凋亡细胞；
84.2)将上清液于4℃以10000g离心30min，去除细胞碎片并收集上清液；
85.3)收集的上清液在4℃以100000g离心70min，移除上清液，用5ml1xpbs重悬离心管底部沉淀(沉淀为外泌体和蛋白质混合物)；
86.4)外泌体重悬液于4℃以100000g离心70min，吸弃上清液；
87.5)用100μl 1xpbs重悬外泌体沉淀并转移至1.5ml离心管，放置于-80℃保存；
88.6)粒径检测仪器zetaview(纳米颗粒示踪分析仪，nta)测量超速离心法分离前细胞培养上清液外泌体颗粒数及分离后重悬液中的外泌体颗粒数，计算外泌体富集效率。
89.对比例2
90.沉淀法分离外泌体
91.将10ml待测细胞培养上清液于4℃以3000g下离心10min，去除样品中的细胞碎片，上清液转移到新的离心管中；
92.在去除杂质的离心上清液中加入2.5ml外泌体沉淀试剂(exosome concentration solution)，将离心管盖盖紧后，涡旋混匀1min，于4℃静置孵育2h；
93.将孵育后的混合物于4℃以10000g下离心60min，移除上清液；取100μl1xpbs重悬沉淀后，于4℃以12000g离心2min，保留富含外泌体的上清液；
94.将外泌体溶液转移至外泌体纯化柱(exosome purification filter)，于4℃以3000g离心10min，收集纯化柱管底的液体，即为纯化后的外泌体颗粒；
95.粒径检测仪器zetaview(纳米颗粒示踪分析仪，nta)测量沉淀法提取前细胞培养上清液外泌体颗粒数及分离后重悬液中的外泌体颗粒数，计算外泌体富集效率。
96.将现有技术的两种分离方法的分离结果和本发明实施例公开的分离方法的分离结果进行对比，见表1。
97.表1不同外泌体分离方法的对比
[0098][0099][0100]
注：表中的分离时间是从对细胞培养上清液处理到重悬外泌体的时间。
[0101]
本发明实施例还公开了一种实际的试验方法：
[0102]
cd63抗体偶联磁珠捕获荧光标记外泌体
[0103]
用diluent c将pkh26储存液稀释，配置浓度为1μm的染色工作液；
[0104]
在外泌体中加入染料工作液，涡旋混匀1min，在4℃静置孵育10min；
[0105]
向孵育后的外泌体-染料复合物溶液加入1xpbs混匀，超速离心法提取外泌体以去除多余染料；
[0106]
向pkh26标记的外泌体溶液中加入cd63抗体偶联磁珠，按照本发明实施例公开的方法分离并洗脱外泌体；
[0107]
在荧光显微镜下观察磁珠在捕获及洗脱外泌体后的荧光图像。
[0108]
结果显示，磁珠与pkh26标记外泌体孵育后，磁珠表面具有较强的荧光信号，表明外泌体由于抗原-抗体间的强作用力被吸附在磁珠表面；而经过50mm生物素溶液的洗脱，磁珠表面仅存在微弱的荧光信号，证明大多数pkh26标记外泌体已从磁珠表面脱离；结果可以表明cd63抗体偶联磁珠已具备快速捕获和无损释放外泌体的功能。
[0109]
以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。