一种基于保留指数结合化学衍生化质谱特征二级碎片的氧脂素综合定性方法

1.本发明涉及分析化学领域，是一种基于保留指数结合化学衍生化质谱特征二 级碎片的氧脂素综合定性方法。
技术背景
2.氧脂素(oxylipin)，亦作为作氧化脂质，是由多不饱和脂肪酸(pufa)产 生的重要脂质介质，在动植物细胞信号传导中起关键作用。其主要产物包括过氧 基、羟基、二羟基、三羟基、羰基以及环氧基脂肪酸。高等植物中，氧化脂类的 产生主要是通过c16脂肪酸与c18脂肪酸产生。哺乳动物中，氧化脂类的产生 主要是通过c20脂肪酸产生，膜脂上的脂肪酸经磷脂酶水解脱下，再经一系列 酶催化和非酶催化氧化得到一系列的氧化脂类。氧脂素可以通过三种反应途径产 生，即环氧化酶(cox)、脂氧合酶(lox)、细胞色素p450单加氧酶(cyp450) 或通过非酶途径的自动氧化(auto-oxidation)产生。氧脂素主要包含三类：以亚 油酸(18:2n-6；linoleic acid，la)和α-亚麻酸(18:3n-3；α-linolenic acid，ala) 为代表的类十八烷酸(octadecanoids)；以二高－γ－亚麻酸(20:3n-6； dihomo-γ-linolenic acid，dgla)，花生四烯酸(20:4n-6；arachidonic acid，ara) 和二十碳五烯酸(20:5n-3；eicosapentaenoic acid，epa)为代表的类二十烷酸 (eicosanoids)；以肾上腺酸(22:4n-6；adrenic acid，ada)和二十二碳六烯酸 (22:6n-3；docosahexaenoic acid，dha)为代表的类二十二烷酸(docosanoids)。 脂肪酸与其氧化代谢物一起组成了作用广泛的脂质信号分子群。这类衍生物几乎 参与哺乳动物所有器官、组织和细胞的生理活动，对许多非脊椎动物的免疫、生 殖等生理功能也有着重要影响，对生物具有非常重要的生理意义。氧脂素也是炎 症和氧化应激反应中的主要调节介质，也常作为某些病理状态或癌症的生物标志 物。同时，氧脂素也是食品/保健品保健功能研究的关键影响因素。综上所述， 氧脂素的轮廓分析对于我国疾病研究，药物靶点研究，生命体生物功能研究以及 食品研究方面具有重要借鉴意义。
3.由于氧脂素的不稳定性，氧脂素的检测方法主要是基于液相色谱串联质谱分 析方法(lc-ms)。随着液质联用技术的不断发展，其检测灵敏度和分辨率均得 到了飞速发展。目前，氧脂素定性方法包括利用色谱保留行为结合低分辨质谱的 多反应监测模式(multiple reaction monitoring，mrm)定性，色谱保留行为结 合高分辨二级和多级质谱(ms2和msn)定性。不论是色谱保留行为结合低分辨 mrm定性还是高分辨ms2和msn定性，均依赖于商业标准品。然而目前氧脂素 的商业标准品的数目十分有限且价格昂贵，储藏条件苛刻，各实验室前处理及分 析方法的差异，导致氧脂素色谱保留行为很难统一，方法重现性较差，而且氧脂 素存在大量的同分异构体，导致分子式的推测不具有唯一性。基于氧脂素结构特 征进行定性的软件诸如无供应商的代谢组学和脂质组学软件ms-dial，通过在 少量氧脂质谱碎片数据库进行母离子和碎片离子搜索匹配，从而对氧脂进行定性 分析。目前所使用的数据库仅能对部分氧脂素进行定性分析，且缺乏统一、有效 的氧脂素二级质谱碎
片信息。由于需要特征的二级碎片进行定性分析，氧脂素 lc-ms分析中通常采用负离子检测模式，针对低含量的实际样本，其较低的检 测灵敏度也限制了氧脂素的定性效果。上述存在的这些影响因素也是导致目前没 有系统性、综合性的氧脂素定性分析方法的原因。


技术实现要素：

4.本发明针对现有氧脂素定性技术的缺陷，提供一种基于保留指数结合化学衍 生化质谱特征二级碎片的氧脂素定性方法。该方法通量高，操作简单，覆盖范围 广，能够实现生物样本中氧脂素的综合定性，以及能够推广到医学、生物、食品 样本中氧脂素的定性分析。
5.本发明为解决上述提出的问题所采用的技术方案为：
6.一种基于保留指数结合化学衍生化质谱特征二级碎片的氧脂素定性方法，主 要包括如下步骤：
7.第一步，采用衍生试剂对氧脂素标准品进行化学衍生化反应，氧脂素转化为 带正电荷的衍生产物；
8.第二步，将第一步所得氧脂素标准品的衍生产物在正离子模式下进行质谱分 析，氧脂素衍生物在质谱碰撞诱导裂解中丢失固定质量数的中性基团产生特征二 级碎片，通过特征二级碎片的叠加能够特异性的检测到氧脂素衍生物的准分子离 子峰；
9.第三步，根据第二步确定的特征二级碎片推导出不同类别氧脂素的质谱碎裂 方式及中性基团丢失后产生的特征二级碎片，即中性基团丢失规律；
10.第四步，采用校正剂对氧脂素标准品的衍生产物的保留时间(retention time， rt)进行校正，将保留时间转化为保留指数(retention index，ri)；
11.第五步，将待测生物样本采用衍化试剂进行化学衍生化反应后，在正离子模 式下进行质谱分析，所得谱图根据第三步确定的特征二级碎片和第四步确定的保 留指数，对其中所含有的氧脂素进行定性分析。
12.按上述方案，第一步和第四步中衍生试剂和衍生化反应的条件相同。
13.按上述方案，所述衍生试剂为一端含有一个氨基(-nh2)，另一端含有一 个叔胺基的化合物，通式表示为：nh
2-(ch2)n-nr2，其中，n取值范围是2～4，r 基团为碳数少于2的烷基。进一步地，所述衍生试剂优选为n，n-二乙基-1，3
‑ꢀ
丙二胺(n,n-diethyl-1,3-diaminopropare,depa)。
14.按上述方案，化学衍生化反应的过程为：将氮吹干的氧脂素标准品或者氮吹 干的待测生物样本提取液，依次加入缩合剂和催化剂，再加入衍生化试剂，采用 溶剂定容，混匀后室温反应20-40s即可完成衍生化反应。该衍生化反应的反应效 率高达99％以上，反应完后无需清洗多余衍生化试剂，即可进行后续质谱分析步 骤。其中，衍生化反应中，优选以n，n，n’，n
’‑
四甲基-o-(7-氮杂苯并三唑-1
‑ꢀ
基)六氟磷酸脲(1-[bis(dimethylamino) methylene]-1h-1,2,3-triazolo[4,5-b]pyridinium 3-oxid hexafluorophosphate,hatu) 和1-羟基苯并三氮唑水合物(1-hydroxybenzotriazole hydrate,hobt)为缩合剂， 三乙胺(triethylamine，tea)为催化剂，depa为衍生试剂，溶剂采用乙腈等有 机溶剂，反应温度常温即可，最适反应时间为超声反应30s。进一步优选地，衍 生化反应中，depa与氧脂素的摩尔比大于＞500，depa和hatu、hobt、tea 四者的摩尔比为1：1：1：2。
[0015]
进一步优选地，最佳衍生化反应的反应条件为：用乙腈配置储备液haut(20 μmol/ml)，hobt(20μmol/ml)，tea(20μmol/ml)以及depa(20μmol/ml)； 将氮吹干的氧脂素标准品或者氮吹干的生物样本提取液，依次加入缩合剂和催化 剂(2μl haut，2μl hobt，4μl tea)，随后加入衍生试剂(2μl depa)， 最后加入溶剂乙腈使得总反应体积为100μl，适当涡旋混匀后于室温条件下超声 反应30s即可完成衍生化反应，反应式如下所示。
[0016][0017]
按上述方案，第二步中，丢失的中性基团主要为nh-(ch2ch3)2(质量数为 73da)和-h2o-nh-(ch2ch3)2(质量数为91da)；根据氧脂素不同种类结构， 中性基团还有-(h2o)
2-nh-(ch2ch3)2或者-(h2o)
3-nh-(ch2ch3)2(质量数分别为 109和127da)，前列腺素d、f(pgd,pgf)等含环类氧脂素衍生产物丢失的-h2o 峰，还包括过氧基氧脂素衍生产物产生的特殊中性丢失基团nh-(ch2ch3)2、
ꢀ‑
h2o-nh-(ch2ch3)2、-oh-c
x-1hy
、-oh-c
x-1hy-nh-(ch2ch3)2、-ooh-c
xhy
、
ꢀ‑
ooh-c
xhy-nh-(ch2ch3)2。
[0018]
按上述方案，第三步中，由于标准品有限，所以标准品可能不包括待测生物 样本中所有的氧脂素，但是可以根据第二步中标准品衍生产物产生特征二级碎片 的规律，推导出不同类别氧脂素的碎裂方式及中性丢失后产生的特征二级碎片， 即中性丢失规律，如表1所示。通过研究已有的65种氧脂素衍生化标准品的质谱 二级碎裂方式，全部会在质谱碰撞诱导裂解中会产生一个固定质量数的中性基团 nh-(ch2ch3)2，其特征二级碎片为[m-73]

，根据氧脂素所含官能团的不同，例 如环氧基，三羟基，二羟基，羟基，过氧基以及前列腺素等具有五元环的含环类 化合物还会产生中性基团-h2o，-h2o-nh-(ch2ch3)2，-(h2o)
2-nh-(ch2ch3)2或 者-(h2o)
3-nh-(ch2ch3)2的中性基团，其主要特征二级碎片主要为[m-18]

， [m-91]

，[m-109]

，[m-127]

。但是，过氧基氧脂素衍生产物除了具有上述[m-73]

以及[m-91]

的二级碎片以外，还包括因过氧基官能团位置不同而产生α-裂解的 特殊中性丢失基团nh-(ch2ch3)2、-h2o-nh-(ch2ch3)2、-oh-c
x-1hy
、
ꢀ‑
oh-c
x-1hy-nh-(ch2ch3)2、-ooh-c
xhy
、-ooh-c
xhy-nh-(ch2ch3)2，其特征二 级碎片为5 (12x y)/78 (12x y)、33 (12x y)/106 (12x y)(x、y分别为过氧基氧 脂素中-ooh所连接碳的邻近碳到甲基端碎裂中性部分的碳原子和氢原子数目)， 因此对于过氧基氧脂素的过氧基位置异构体可以以此作为结构预测与判断的依 据。
[0019]
按上述方案，第四步中，校正剂采用与氧脂素结构类似的c6～c17饱和脂肪 酸(saturated fatty acid,sfa)，通过公式1对氧脂素标准品的保留时间进行校正 处理；
[0020]
公式1：
[0021][0022]
其中：riox：氧脂素衍生化产物的保留指数
[0023]
n:氧脂素衍生化产物洗脱之前的校正剂的碳数
[0024]
tx：氧脂素衍生化产物的保留时间
[0025]
tbx：氧脂素衍生化产物洗脱之前的校正剂的保留时间
[0026]
tax：氧脂素衍生化产物洗脱之后的校正剂的保留时间
[0027]
δn：氧脂素衍生化产物洗脱前后的校正剂的碳数差。
[0028]
按上述方案，第四步中，由于标准品有限，所以标准品可能不包括待测生物 样本中所有的氧脂素。针对没有标准品的氧脂素，只能预测过氧基的氧脂素，而 且仅仅依赖于推测的中性基团丢失规律即可推测出其-ooh位置异构体，不依赖 于分析物的色谱保留行为。
[0029]
按上述方案，第五步中，所述待测生物样本为小鼠肝脏，srm1950血浆等。
[0030]
本发明的主要技术构思如下：
[0031]
第一步中，衍生试剂中的氨基能够与氧脂素中的羧基发生酰胺化反应，从而 在氧脂素中引入衍生试剂另一端的带正电荷的叔胺基基团，成功地实现了氧脂素 由负离子检测模式转变为正离子检测模式，从而提高了电离效率，减少了电离抑 制，极大提高了质谱检测灵敏度。
[0032]
第二步中，氧脂素衍生物在正离子模式下进行质谱分析时，所有的氧脂素衍 生物在质谱碰撞诱导裂解中会丢失一对固定质量数的中性基团(中性基团为 nh-(ch2ch3)2，质量数为73da以及-h2o-nh-(ch2ch3)2，质量数为91da)，根 据氧脂素不同种类结构，还可能会丢失-(h2o)
2-nh-(ch2ch3)2或者
ꢀ‑
(h2o)
3-nh-(ch2ch3)2的中性基团(质量数分别为109和127da)，前列腺素d以 及f(pgd,pgf)丢失的-h2o峰，因为其检测信号强度高于其它化合物，也可 以用作这类物质的定性分析。此外，过氧基化合物除了产生上述这些特征碎片外， 还会产生因过氧基官能团位置不同而产生α-裂解的特殊中性丢失碎片5 (12x y)/78 (12x y)、33 (12x y)/106 (12x y)，x,y分别为过氧基氧脂素中
ꢀ‑
ooh所连接碳的邻近碳到甲基端碎裂中性部分的碳原子和氢原子数目)。因此 采用质谱mrm扫描模式，通过[m-73]

，[m-91]

，[m-109]

，[m-127]

等特征二 级碎片的叠加能够特异性的检测到各类氧脂素衍生物的准分子离子峰，进而实现 氧脂素的定性分析。
[0033]
第三步中，在前述标准品化学衍生化质谱特征二级碎片的基础上，推导出不 同类别氧脂素的质谱碎裂方式及中性丢失后产生的特征子离子碎片，即中性基团 丢失规律。针对过氧基氧脂素，可以实现不同过氧基官能团位置的结构预测。
[0034]
第四步中，为了避免因系统造成的保留时间漂移以及降低氧脂素假阳性的检 出，本发明利用了保留指数对氧脂素衍生产物的保留时间进行了校正，使用与氧 脂素结构类似的c6～c17饱和脂肪酸(saturated fatty acid,sfa)作为校正剂对氧 脂素的保留时间通过公式1进行校正处理。本方法中所使用的饱和脂肪酸为内源 性饱和脂肪酸，衍生化后校正剂采用[m-73]

作为特征二级碎片通过mrm进行定 性分析。在图2a中，在不同色谱条件下，同一标准品的保留时间差别很大，但 校正处理后，保留时间转化为保留指数，方法的重现性显著提高，如图2b所示。
[0035]
第五步中，通过标准品以及过氧基氧脂素的结构预测信息，将上述方案用于 生物样本(如小鼠肝脏或srm1950血浆等)中氧脂素的定性分析。
[0036]
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
[0037]
本发明提供了一种新颖、高效的氧脂素定性方法，利用化学衍生化技术有效 提高了lc-ms-mrm模式的检测灵敏度，利用保留指数校正有效改善了氧脂素的 色谱保留时间漂
移以及假阳性检出的情况。发明人经过分析研究，发现不同种类、 不同官能团的氧脂素会产生不同中性丢失和特征子离子，尤其是过氧基氧脂素可 以实现对过氧基基团位置异构体的结构预测，利用该特点可以实现对氧脂素的定 性。同时，利用有限标准品，摸索其色谱行为规律以及质谱碎裂规律，推导出不 同类别氧脂素的碎裂方式及中性丢失后产生的质谱特征二级碎片，并进行验证， 最后实现生物样本中氧脂素的高通量、高准确性的定性分析。
附图说明
[0038]
图1是65种混合标准品(50nm)衍生前后的mrm图：a为混合标准品衍生化 后正离子模式下的mrm图，b为相同浓度下混合标准品不衍生的负离子模式下 mrm图，c为a中混合标准品衍生化后负离子模式下的mrm图；
[0039]
图2是15种eet/hete标准品在不同色谱条件下保留时间(a)与保留指数(b) 图；
[0040]
图3是hepe类的二级质谱图以及lc-ms-mrm特征离子对叠加图：a为标准 品hepe类的二级质谱图，b为标准品hepe类lc-ms-mrm特征离子对叠加图； c为srm1950血浆样本hepe类lc-ms-mrm特征离子对叠加图，d为小鼠肝脏样 本hepe类lc-ms-mrm特征离子对叠加图。
[0041]
本发明中用到的脂质缩写说明：
[0042]
饱和脂肪酸(sfa)、前列腺素(pg)、白三烯(lt)、血栓素(tx)、 脂氧素(lx)、消退素(rvd)、保护素(pd)、羟基二十碳四烯酸(hete)、 羟基十八碳三烯酸(hotre)、二羟基二十碳四烯酸(dihete)、过氧基十八 碳一烯酸(hpome)、过氧基二十碳四烯酸(hpete)、环氧基二十碳三烯酸 (eet)、二羟基二十碳三烯酸(dihetre)、羰基十八碳二烯酸(oxoode)、 羰基十八碳三烯酸(oxootre)、羟基十八碳二烯酸(hode)、过氧基十八碳 二烯酸(hpode)、过氧基十八碳三烯酸(hpotre)、环氧基十八碳一烯酸 (epome)、二羟基十八碳一烯酸(dihome)、三羟基十八碳一烯酸(trihome)、 二羟基十八碳二烯酸(dihode)、羟基二十碳五烯酸(hepe)、羟基二十二 碳六烯酸(hdha)、己酸(c6)、葡萄花酸(c7)、辛酸(c8)、壬酸(c9)、 癸酸(c10)、十一酸(c11)、月桂酸(c12)、十三酸(c13)、肉豆蔻酸(c14)、 十五酸(c15)、棕榈酸(c16)、珠光脂酸(c17)。
具体实施方式
[0043]
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不 背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的常规修改或 替换均属于本发明的范围。为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方 案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
[0044]
1.下述实施例中，衍生化标准品制备方法及仪器参数如下：
[0045]
1)将氧脂素标准品用甲醇配成1μmol/l的贮存溶液，稀释至50nmol/l备用； 用乙腈配置储备液haut(20μmol/ml)，hobt(20μmol/ml)以及tea(20 μmol/ml)以及depa(20μmol/ml)；
[0046]
2)分别取5μl的氧脂素标准品溶液(终浓度为50nmol/l)，氮气吹干后依 次加入2μl haut，2μl hobt和4μl tea，再加入2μl depa，最后加入反应 溶剂乙腈使得总反应体积为100μl，适当涡旋混匀后于室温条件下超声反应30s 即制得depa衍生化标准品；
[0047]
3)将步骤2)中制备的衍生化标准品进行液相色谱-质谱分析，仪器分析参 数如下所示：
[0048]
液相仪器是岛津高效液相色谱仪lc-20ad(shimadzu corporation,kyoto, japan)，液相条件是：色谱柱采用zorbax eclipse plus c18 column(4.6
×
150mm,5 μm,安捷伦)。流动相a为水(0.2％甲酸)，流动相b为乙腈(0.2％甲酸)。梯度 系统为：0-2min，维持25％流动相b；2-4min，将流动相b从25％提高到35％； 4-20min，将流动相b从35％提高到60％；20-22min，将流动相b从60％提高到99％； 22-26min，将流动相b稳定在99％；26-28min，将流动相b从99％降低到60％。 28-30min，将流动相b从60％降低到25％。30-35min，将流动相b稳定在25％。 柱温45℃，进样盘温度4℃，流速为0.5ml/min。进样体积为10μl。
[0049]
质谱仪采用四极杆-线性阱复合型质谱仪4000qtrap(applied biosystems)， 配turbo v
tm
电喷雾(esi)离子源，采用mrm扫描模式在正离子下扫描，离子 源温度均为550℃，离子源电压分别为： 5500v；去簇电压(declustering potential， dp)为： 75v；碰撞能(collision energy，ce)分别为： 35v，气帘气压力均 为：35psi；离子源气体1(ion source gas 1，gs 1)：40psi；离子源气体2： 45psi；质量范围：50-550m/z。
[0050]
2.下述实施例中，生物样本前处理过程如下：
[0051]
取(血浆20μl/小鼠肝脏2mg)加入1ml 10％甲醇水于4℃冰水浴下超声提 取30min后，待spe(spe小柱为：strata-x反相spe小柱8b-s100-ubj， phenomenex)上样。spe步骤：3ml甲醇，3ml水进行活化，上样后，1ml 10％ 甲醇水淋洗，2ml甲醇洗脱。收集洗脱液，氮气吹干，按上述1中步骤2)进行 衍生化，按上述1中步骤3)进行液相色谱-质谱分析。
[0052]
3.下述实施例中，过氧基氧脂素候选物的选择方式如下所示：
[0053]
衍生化氧脂素中性丢失规律如表1所示，利用lipidmaps数据库，建立了22种 过氧基氧脂素的预测mrm离子对(见表2)，按照过氧基氧脂素衍生化产物的中 性丢失规律设定mrm离子对其进行定性分析。
[0054]
表1 7类氧脂素衍生化产物的中性丢失规律
[0055][0056]
注：x,y分别为-ooh所连接碳的邻近碳到甲基端碎裂中性部分的碳原子和氢原子数目。
[0057]
表2衍生化过氧基氧脂素候选物名称
[0058]
[0059][0060]
实施例1
[0061]
本实施例选择单羟基、二羟基、三羟基、环氧基、羰基、过氧基、含环类脂 肪酸类氧脂素65种标准品作为研究对象。
[0062]
首先，根据前述衍生化标准品制备方法制备衍生化氧脂素标准品。然后，将 制备的标准品注射针泵进样，进样流速为20μl/min，进行质谱分析，如图1所示， 氧脂素检测灵敏度经过衍生化后提升极大，提升倍数最高为5112倍(见表3)。 通过质谱检测得到了的65种氧脂素标准品的二级谱图信息以及中性丢失碎片(见 表3)，从而进一步推导并验证了得出了表1中7类氧脂素中性丢失的规律。
[0063]
表3衍生化标准品参数
[0064]
[0065]
[0066]
[0067]
[0068]
[0069][0070]
为了验证本发明方法的重现性，以hete及eet共15种同分异构体为例在不 同色谱条件下进行了验证。本方法中所使用的校正剂为depa衍生化的内源性饱 和脂肪酸(c6～c17)，采用[m-73] 作为特征二级碎片通过mrm进行定性分析 (见表4)。
[0071]
在不同色谱条件下，hete及eet共15种同分异构体的保留时间如表5所示， 按照上述发明方法第四步公式1中计算公式，利用校正试剂对其保留时间进行转 化并得到相应的保留指数。如表5所示，在不同色谱条件下，hete及eet共15 种同分异构体保留时间的相对标准偏差(rsd)为12.9～14.9％，经过校正将其转 化为保留指数后，rsd显著降低，均低于0.5％，这说明经过保留指数的转化后， 方法的重现性显著提高。同时在图2a中，在不同色谱条件下，同一标准品的保 留时间差别很大，但校正处理后，保留时间转化为保留指数，其差异显著减小， 如图2b所示，这再次说明了方法的重现性显著提高。
[0072]
表4衍生化校正试剂参数
[0073][0074][0075]
表5衍生化hete及eet标准品在不同色谱条件下的参数
[0076][0077]
以单羟基类脂肪酸中性丢失规律为例来进行说明。如图3a所示，衍生化后 hepe类的特征质谱二级碎片主要为m/z 358.0(由[m-73]

产生)以及m/z 340(由 [m-91]

产生)，从而推导出单羟基类脂肪酸的中性丢失规律为 nh-(ch2ch3)2/-h2o-nh-(ch2ch3)2(如表1中所示)，并通过表3中其它单羟基 类脂肪酸的产物离子对其进行了验证。如衍生化后hete类单羟基脂肪酸的前体 离子为m/z 433.3，产物离子为m/z 360.3以及m/z 342.3，符合单羟基类脂肪酸的 中性丢失规律。又比如衍生化后hdha类单羟基脂肪酸的前体离子为m/z 457.4， 产物离子为m/z 384.4以及m/z 366.4，也符合单羟基类脂肪酸的中性丢失规律。 说明上述推导的单羟基类脂肪酸的中性丢失规律得到了很好的验证。同理，其它 类衍生化氧脂素中性丢失规律也可通过表3中的衍生化标准品得到验证。
[0078]
实施例2
[0079]
本实施例以实际生物样本为例，对其进行氧脂素综合定性研究。
[0080]
取血浆20μl/小鼠肝脏2mg分别作为血浆样本、肝脏样本，按照前述生物样 本前处理骤进行提取、衍生后，根据表2和表3中氧脂素标准品以及过氧基氧脂素 预测的mrm离子对，再按照仪器参数进行lc-ms-mrm分析。
[0081]
下面将以hepe为例，对实际生物样本中的含有标准品的定性过程进行说明： 首先，hepe作为单羟基类氧脂素，其特征中性丢失片段为nh-(ch2ch3)2/-h2o-nh-(ch2ch3)2，其对应质荷比m/z为73/91，其碎裂方式如图 3a所示。
[0082]
如表6所示，由于肝脏与血浆样本的检测批次不同，所处体系也有一定的变 化，所以造成了一定的保留时间漂移，但是通过衍生化标准品ri校正计算之后， 相对标准偏差由之前的4.21～4.85％下降到0.02～0.13％，这说明本发明定性方法的 重现性明显增高，这极大提高了氧脂素定性的准确性。
[0083]
表6 hepe类化合物在实际样本中的保留时间与保留指数
[0084][0085]
通过特征中性丢失碎片，可以在叠加mrm的情况下，对hepe类氧脂进行定 性分析，其二级特征碎片谱图如图3a所示，图3c，d分别为实际样本srm1950 血浆，小鼠肝脏的衍生化hepe特征中性丢失碎片叠加的lc-ms-mrm图。同时， 利用ri校正后的准确性，对不同实际样本中的hepe进行了准确定性。图3b为标 准品中5-，12-，15-，18-hepe的特征中性丢失筛选出的mrm叠加图，可以看到 [m-91]

的碎片的信号强度明显高于[m-73]

的信号强度。所以在实际生物样本中， 由图3c～d中，由[m-91]

与[m-73]

碎片的强度，可以有效的定位出hepe的对应 色谱峰的位置，以此类推，经过分析，血浆及小鼠肝脏样本中，在与标准品平行 的条件下，可以分别靶向定性58及54种氧脂素。
[0086]
针对缺乏标准品的过氧基氧脂素，基于过氧基氧脂素衍生化产物的中性丢失 规律，对其过氧基位置异构体进行了结构预测，如表3所示，经过分析，血浆和 小鼠肝脏样本中，共可以分别定性出没有标准品的过氧基氧脂素氧脂素14和17 种氧脂素。
[0087]
综上所述，通过本方法共计在血浆，小鼠肝脏样本中分别定性出72和71种氧 脂素。
[0088]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出对于领域普通技术人员来说， 在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干改进和变换这些都属于本发 明的保护范围。