一种哺乳动物疾病检测用试纸及其制备方法与应用

1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种哺乳动物疾病检测用试纸及其制备方法与应用。


背景技术：

2.随着生活水平的提高，人们越来越注重精神追求，越来越多的人选择饲养宠物以丰富自己的情感。猫狗等哺乳动物是人们常作为宠物饲养的对象，截止2020年，仅宠物猫狗的数量就已经突破1亿只。但在饲养宠物的过程中，宠物难免会生病。因此，为了让宠物更长久的陪伴主人，发展高效的宠物疾病检测手段显得非常重要。
3.目前，宠物疾病的检测方法主要集中在酶联免疫吸附法(elisa)、化学发光技术、胶体金技术、荧光层析技术、pcr技术等。其中elisa、化学发光技术、荧光层析技术、pcr技术都需要用到基于实验室的大型仪器，价格昂贵且耗时长。而胶体金技术由于简单、快捷、廉价的优点而广泛使用。但是较低的灵敏度限制了该方法在低含量目标物检测上的应用。因此，开发一种兼顾快速、方便和灵敏的宠物等哺乳动物疾病检测设施具有重要意义。


技术实现要素：

4.本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种哺乳动物疾病检测用试纸，能够方便和灵敏的实现哺乳动物的疾病检测。
5.本发明还提出一种上述试纸的制备方法。
6.本发明还提出一种上述试纸的应用。
7.根据本发明的一个方面，提出了一种哺乳动物疾病检测用试纸，包括底板，底板上依次组装的样品垫、结合垫、检测垫和吸水垫，所述结合垫上设有含酶-待测物抗体或酶-待测物抗原的结合物涂层；所述检测垫上设有检测线t线和质控线c线，t线上包被能够与待测物抗体/抗原结合的抗原/抗体，c线上包被有不能识别待测物但可识别结合物的抗原或抗体；
8.其中，所述酶选自天然酶或人工模拟酶中的至少一种，所述天然酶包括辣根过氧化物酶(hrp)，所述人工模拟酶包括与所述辣根过氧化物酶具有类似活性的材料。
9.根据本发明的一种优选的实施方式，至少具有以下有益效果：本发明方案将酶-待测物抗体抗原结合物等成分巧妙地制备成试纸形式，首次将酶促反应用于动物疾病快速检测技术中，利用该试纸进行检测使得使用、携带更方便，本方法以人工模拟酶或天然酶标记抗原抗体喷涂于结合垫，以捕获抗体抗原涂覆在检测线，当样品滴加在样品垫，通过毛细管层析作用，酶标记抗原抗体被捕获在检测线上，进而在检测线上添加酶促反应底物时，检测线便会出现明显的颜色变化。此方法通过酶促反应放大检测信号，相对于传统的胶体金法和荧光法，可显著提高检测方法的灵敏度。免疫反应结束后，以h2o2存在下的3,3',5,5'-四甲基联苯胺等为显色底物，通过产物的颜色信号定性或结合相应的仪器定量检测待测物，通过该试纸可在15min内对各种猫、狗等多种哺乳动物物疾病进行检测，尤其适宜于宠物医
院或家庭现场检测，通过肉眼即可进行初步定性判断，也可通过智能手机等便携式装置得到准确的检测数据。
10.在本发明的一些实施方式中，所述人工模拟酶包括贵金属、金属氧化物、非金属、非金属氧化物或金属-有机框架材料中的至少一种。纳米酶相对于天然酶，稳定性更好，成本更低廉且制备过程操作更简便。
11.在本发明的一些实施方式中，所述人工模拟酶包括碳纳米管、氧化石墨烯或碳纳米点中的至少一种。
12.在本发明的一些实施方式中，所述人工模拟酶表面带有羧基、氨基、醛基或环氧基中的至少一种。也可以不带基团。
13.在本发明的一些实施方式中，所述人工模拟酶的尺寸在1～1000nm。
14.在本发明的一些优选的实施方式中，所述哺乳动物选自猫或狗中的至少一种。
15.在本发明的一些优选的实施方式中，所述疾病包括犬瘟热病毒感染、犬细小病毒感染、犬冠状病毒感染、猫瘟热病毒感染、猫杯状病毒感染或猫疱疹病毒感染中的至少一种。待测疾病可以是常见宠物疾病，待测物可以是病毒抗原，也可以是抗体、犬c反应蛋白等蛋白分子。
16.在本发明的一些优选的实施方式中，所述样品垫的材质为玻璃纤维、聚酯膜或滤纸中的至少一种。
17.在本发明的一些优选的实施方式中，所述结合垫的材质为玻璃纤维或聚酯膜。
18.在本发明的一些优选的实施方式中，所述检测垫的材质为疏水性多孔材料。
19.在本发明的一些更优选的实施方式中，所述检测垫的材质为硝酸纤维素膜。
20.根据本发明的另一个方面，提出了上述试纸的制备方法，包括如下步骤：
21.对样品垫、结合垫和检测垫进行处理，并依次组装样品垫、结合垫、检测垫和吸水垫，其中，所述结合垫的处理过程包括如下步骤：用磷酸盐(pbs)缓冲液i浸泡，干燥后，喷涂或涂覆混合液，所述混合液中含酶及待测抗原或含酶及待测抗原。
22.根据本发明的一种优选的实施方式的制备方法，至少具有以下有益效果：本发明方案制备方法操作简便，使用的试剂均为常见试剂，成本低廉，反应条件温和，适合工业化大规模生产。
23.在本发明的一些实施方式中，所述pbs缓冲液i中含有蔗糖、tween-20、封闭剂和聚乙烯吡咯烷酮(pvp)。
24.在本发明的一些优选的实施方式中，所述pbs缓冲液i中含有如下质量占比的成分：1～3％蔗糖、0.1～1％tween-20、1～3％封闭剂和0.01～0.1％聚乙烯吡咯烷酮(pvp)。
25.在本发明的一些更优选的实施方式中，所述pbs缓冲液i中含有如下质量占比的成分：2％蔗糖、0.5％tween-20、2％封闭剂和0.05％聚乙烯吡咯烷酮(pvp)。
26.在本发明的一些实施方式中，所述样品垫的处理过程包括如下步骤：用含有吐温-20(tween-20)、封闭剂和聚乙烯吡咯烷酮(pvp)的磷酸盐(pbs)缓冲液ii浸泡样品垫，然后干燥。
27.在本发明的一些更优选的实施方式中，所述封闭剂选自牛血清白蛋白(bsa)。
28.在本发明的一些实施方式中，所述检测垫的处理过程包括如下步骤：将含能够与待测物抗体/抗原结合的抗原/抗体的溶液喷涂或涂覆于检测垫的一端，形成t线；将含不能
识别待测物但可识别结合物的抗原/抗体喷涂或涂覆于检测垫的另一端，形成c线。
29.根据本发明的再一个方面，提出了上述试纸在制备哺乳动物疾病检测用试剂盒中的应用。
30.根据本发明的一种优选的实施方式的应用，至少具有以下有益效果：将上述试纸制备成试剂盒的形式，使用和携带都较为方便，且本发明方案通过酶促反应来进行检测，可以显著放大检测信号，相对于胶体金试纸，灵敏度可提高2个数量级以上，相对于时间分辨荧光试纸，灵敏度可提高1个数量级以上。
31.本发明还提出了一种检测试剂盒，包括上述试纸或上述方法制得的试纸。
32.在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒还包括双氧水和显色底物。
33.在本发明的一些优选的实施方式中，所述显色底物包括邻苯二胺(opd)或3,3',5,5'-四甲基联苯胺(tmb)。通过显色底物的颜色信号，即可实现定性，也可结合相应的仪器实现定量检测待测物。
附图说明
34.下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：
35.图1为本发明实施例1～3制备的试纸的结构示意图；
36.图2为本发明实施例1～3制备的试纸的检测原理图；
37.图3为本发明实施例1制备的试纸测得的病毒浓度与峰面积关系曲线图；
38.图4为本发明实施例2制备的人工模拟酶ptpd的透射电镜(tem)图；
39.图5为本发明中对比例1、实施例2制备的人工模拟酶及加入人工模拟酶显色底物与不同浓度待测物的显色结果图；
40.图6为本发明实施例2制备的试纸测得的病毒浓度与峰面积关系曲线图；
41.图7为本发明实施例3制备的人工模拟酶fe3o4的透射电镜(tem)图；
42.图8为本发明中对比例1、实施例3制备的人工模拟酶及加入人工模拟酶显色底物与不同浓度待测物的显色结果图；
43.图9为本发明实施例3制备的试纸测得的病毒浓度与峰面积关系曲线图；
44.图10为本发明实施例1～3制备的试纸在不同ph值下检测效果图；
45.图11为本发明实施例1～3制备的试纸在不同温度值下检测效果图；
46.图12为本发明实施例1～3制备的试纸在存储不同时间后的检测效果图。
47.附图标记：1、底板；2、样品垫；3、结合垫；4、t线；5、c线；6、吸水垫；7、检测垫。
具体实施方式
48.以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到的试剂和材料。
49.本发明的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示意性实施例”、“示
例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
50.本发明的描述中，如无特殊规定，所述“约”的含义是指正负2％。本发明的描述中，如无特殊规定，％均代表质量百分数。
51.实施例1
52.本实施例制备了一种基于天然酶的比色免疫层析检测试纸，该试纸可用于犬细小病毒(cpv ag)的检测。具体制备过程如下：
53.(a)天然酶(hrp)-犬细小病毒抗体(cpv ab1)标记物的制备
54.采用hrp偶联试剂盒(ab102890)制备hrp-cpv ab1，可以通过抗体上的伯胺基团(如赖氨酸)简单、快速地实现抗体与hrp的共价偶联。具体步骤如下：
55.①
所有材料和制备好的试剂在临用前平衡至室温。
56.②
在每10μl待标记的cpv ab1中加入1μl modifier试剂，轻柔混匀。
57.③
打开hrp偶联混合物的瓶盖，用移液枪头吸取抗体样本(已加入modifier试剂)，直接加在冻干粉材料上。用移液枪头吸液体再重新滴定，重复一次或两次，轻柔重悬。
58.④
盖上瓶盖，室温(20℃-25℃)下避光放置3小时。也可延长孵育时间，例如过夜，对偶联效果没有影响。
59.⑤
在每10μl反应中的抗体内加入1μl quencher试剂，轻柔混匀。30分钟后偶联抗体即可使用，无需纯化。
60.偶联抗体储存：在4℃下避光储存，通常可保存长达18个月。
61.(b)试纸条的制备
62.①
样品垫的制备
63.用含有0.05％tween-20、2％bsa、0.05％pvp、0.05％prolin300、0.05％peg2000的0.025m ph 7.4 pbs缓冲液浸泡样品垫，然后置于37℃烘箱中烘干2h。
64.②
结合垫的制备
65.先用含有2％蔗糖、0.5％tween-20、2％bsa、0.05％pvp的0.025m ph 7.4 pbs缓冲液浸泡结合垫，然后置于烘箱中烘干。然后将制备好的探针均匀的喷涂于预处理过的结合垫上，再次置于37℃烘箱烘干。然后将上述制备的hrp-cpv ab1(鼠源)标记物用0.025m ph 7.4 pbs磷酸缓冲液稀释300倍，用喷金仪以0.1μl/mm的喷金量喷涂于预处理过的结合垫上，置于37℃烘箱中烘干2h后，于铝箔袋中封闭保存。
66.③
检测垫的制备
67.将cpv ab2用含有2％蔗糖的0.025m ph 7.4 pbs缓冲液稀释为0.5mg/ml，然后用三维喷条仪均匀的喷涂于检测垫靠近结合垫10mm处形成t线4；
68.将羊抗鼠二抗用含有2％蔗糖的0.025m ph 7.4 pbs缓冲液稀释为0.5mg/ml，然后用三维喷条仪均匀的喷涂于检测垫靠近结合垫15mm处形成c线5。
69.将制备好的检测垫37℃烘干置于铝箔袋中密封保存。
70.④
试纸条的组装
71.在聚氯乙烯(pvc)底板1上依次组装样品垫2、结合垫3、检测垫7和吸水垫6，相邻垫
之间重合2-5mm。组装好后置于切条机上切成4mm宽即得所需试纸条，如图1所示。
72.接着将制备好的试纸条装入相应规格的塑料卡壳中，放置干燥剂后，于铝箔袋中密封保存。
73.实施例2
74.本实施例制备了一种基于人工模拟酶(ptpd纳米酶)的比色免疫层析检测试纸，该试纸可用于犬细小病毒(cpv ag)的检测。具体制备过程如下：
75.(a)ptpd纳米的制备
76.将pluronic f127(20mg)溶于含k2ptcl4(1.8ml，20mm)、na2pdcl4(0.2ml，20mm)和hcl(44μl，6m)的混合溶液中，加入还原剂抗坏血酸(2.0ml，100mm)，将混合物在35℃水浴中连续超声4h，离心，丙酮和水分别洗涤5次。最终产品分散在5ml水中，4℃保存至使用。
77.(b)ptpd纳米-犬细小病毒抗体(ptpd nps-cpv ab1)标记物的制备
78.首先，在1ml 0.5mg/ml ptpd nps加入0.02m k2co3，将ptpd nps溶液的ph调至8.4左右(优选在8.2～8.5之间)。然后将5μl cpv ab1(1mg/ml)加入到ptpd nps溶液中。室温孵育60min后，加入110μl 10.0wt％bsa，孵育30min。然后，10000rpm离心8分钟，用含1％bsa的10mm ph 7.4pbs洗涤2次。最后，将ptpd nps-cpv ab1悬浮在含有2％bsa和3％蔗糖的100μl pbs缓冲液中。
79.(c)试纸条的制备
80.①
样品垫的制备
81.用含有0.05％tween-20、2％bsa、0.05％pvp、0.05％prolin300、0.05％peg2000的0.025m ph 7.4 pbs缓冲液浸泡样品垫，然后置于37℃烘箱中烘干2h。
82.②
结合垫的制备
83.先用含有2％蔗糖、0.5％tween-20、2％bsa、0.05％pvp的0.025m ph 7.4 pbs缓冲液浸泡结合垫，然后置于烘箱中烘干。然后将制备好的探针均匀的喷涂于预处理过的结合垫上，再次置于37℃烘箱烘干。然后将上述制备的ptpd nps-cpv ab1标记物用0.025m ph 7.4 pbs磷酸缓冲液稀释300倍，用喷金仪以0.1μl/mm的喷金量喷涂于预处理过的结合垫上，置于37℃烘箱中烘干2h后，于铝箔袋中封闭保存。
84.③
检测垫的制备
85.将cpv ab2用含有2％蔗糖的0.025m ph 7.4 pbs缓冲液稀释为0.5mg/ml，然后用三维喷条仪均匀的喷涂于检测垫靠近结合垫10mm处形成t线；
86.将羊抗鼠二抗用含有2％蔗糖的0.025m ph 7.4 pbs缓冲液稀释为0.5mg/ml，然后用三维喷条仪均匀的喷涂于检测垫靠近结合垫15mm处形成c线。
87.将制备好的检测垫37℃烘干置于铝箔袋中密封保存。
88.④
试纸条的组装
89.在pvc底板上依次组装样品垫、结合垫、检测垫和吸水垫，相邻垫之间重合2-5mm。组装好后置于切条机上切成4mm宽即得所需试纸条，如图1所示。
90.接着将制备好的试纸条装入相应规格的塑料卡壳中，放置干燥剂后，于铝箔袋中密封保存。
91.实施例3
92.本实施例制备了一种基于人工模拟酶(fe3o4纳米酶)的比色免疫层析检测试纸，该
试纸可用于犬细小病毒(cpv ag)的检测。具体制备过程如下：
93.(a)fe3o4纳米-犬细小病毒抗体(fe3o
4 nps-cpv ab1)标记物的制备
94.首先，在1ml 0.5mg/ml fe3o
4 nps nps加入0.02m k2co3，将fe3o
4 nps溶液的ph调至8.4左右(优选在8.2～8.5之间)。然后将5μl cpv ab1(1mg/ml)加入到fe3o
4 nps溶液中。室温孵育60min后，加入110μl 10.0wt％bsa，孵育30min。然后，10000rpm离心8分钟，用含1％bsa的10mm ph 7.4 pbs洗涤2次。最后，将fe3o
4 nps-cpv ab1悬浮在含有2％bsa和3％蔗糖的100μl pbs缓冲液中。
95.(c)试纸条的制备
96.①
样品垫的制备
97.用含有0.05％tween-20、2％bsa、0.05％pvp、0.05％prolin300、0.05％peg2000的0.025m ph 7.4 pbs缓冲液浸泡样品垫，然后置于37℃烘箱中烘干2h。
98.②
结合垫的制备
99.先用含有2％蔗糖、0.5％tween-20、2％bsa、0.05％pvp的0.025m ph 7.4 pbs缓冲液浸泡结合垫，然后置于烘箱中烘干。然后将制备好的探针均匀的喷涂于预处理过的结合垫上，再次置于37℃烘箱烘干。然后将上述制备的fe3o
4 nps-cpv ab1(鼠源)标记物用0.025m ph 7.4 pbs磷酸缓冲液稀释300倍，用喷金仪以0.1μl/mm的喷金量喷涂于预处理过的结合垫上，置于37℃烘箱中烘干2h后，于铝箔袋中封闭保存。
100.③
检测垫的制备
101.将cpv ab2用含有2％蔗糖的0.025m ph 7.4 pbs缓冲液稀释为0.5mg/ml，然后用三维喷条仪均匀的喷涂于检测垫靠近结合垫10mm处形成t线；
102.将羊抗鼠二抗用含有2％蔗糖的0.025m ph 7.4 pbs缓冲液稀释为0.5mg/ml，然后用三维喷条仪均匀的喷涂于检测垫靠近结合垫15mm处形成c线。
103.将制备好的检测垫37℃烘干置于铝箔袋中密封保存。
104.④
试纸条的组装
105.在pvc底板上依次组装样品垫、结合垫、检测垫和吸水垫，相邻垫之间重合2-5mm。组装好后置于切条机上切成4mm宽即得所需试纸条，如图1所示。
106.接着将制备好的试纸条装入相应规格的塑料卡壳中，放置干燥剂后，于铝箔袋中密封保存。
107.对比例1
108.本对比例提供了一种市购所得的au纳米颗粒。
109.检测例
110.将上述实施例1～3制备的试纸用于犬细小病毒检测，如图2所示，具体过程如下：
111.①
定性检测
112.用棉签采取样品犬的新鲜粪便，放入200μl含有0.05％tween 20的pbs缓冲液中稀释，并搅拌均匀。从铝箔袋中取出塑料卡壳，平放于桌面。吸取70μl稀释液缓慢滴入塑料卡壳的样品孔。7min后取1μl tmb液体底物系统(sigma-aldrich)滴加于t线和c线，5min后判读结果。
113.肉眼定性读取：t线和c线均成鲜艳蓝色时，表明样品犬可能感染犬细小病毒；当t线没有颜色变化，而c线呈现深蓝色时，说明样品犬没有感染细小病毒；当c线无颜色变化
时，表明此次测试无效，需要重新测试。
114.收集了150份犬粪便样本(75份阳性样本)，分为三组。分别用本方案和elisa试剂盒(上海臻科生物科技有限公司)检测样品，实验结果如下表1所示：
115.表1 不同检测方法对于犬细小病毒的检出率
116.方法阳性检出数阳性检出率(％)elisa2496％实施例12496％实施例22496％实施例32496％
117.从上表可以看出，采用本发明实施例方案产品与elisa方法的检出率相当，表明本方案均是可靠的。
118.②
定量检测
119.取正常狗的粪便，分别放入200μl含有0.05％tween 20的pbs缓冲液中稀释，并搅拌均匀。用该缓冲液将犬细小病毒校准品分别稀释到0ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml、5000ng/ml。将这些不同浓度的校准品分别置于实施例1～3制得的试纸条7min后，在t线和c线分别滴加1μl tmb底物。5min后用手机软件(strip scan)直接读取t线对应蓝色的强度来定量检测犬细小病毒的浓度，每种浓度分别测试3次。绘制标准曲线如图3、6和9所示。从图3中可以看出，实施例1制得的试纸条的线性范围是0.5～5000ng/ml，检出限为486pg/ml(根据3倍信噪比记算得到)；从图6中可以看出，实施例2制得的试纸条的线性范围是0.5～5000ng/ml，检出限为312pg/ml(根据3倍信噪比记算得到)；从图9中可以看出，实施例3制得的试纸条的线性范围是1～5000ng/ml，检出限为720pg/ml(根据3倍信噪比记算得到)。
120.将上述实施例的检测结果与相关技术其他专利中记载的效果进行比较，汇总如下表2所示：
121.表2 本发明实施例方案检测方法与其他检测方法在检测犬细小病毒的对比
[0122][0123][0124]
由表2可以看出，本发明实施例方案所述检测方法的灵敏度均高于现有的检测方法，表明酶促反应确实可以放大检测信号，提高灵敏度。
[0125]
对实施例2和3制得的人工模拟酶进行微观结构表征，结果如图4和7所示。从图中可以看出，实施例2中的人工模拟酶粒径在17nm左右，而实施例3制得的人工模拟酶的粒径在200nm左右。
[0126]
图5(或8)中，依次对应于对比例1中金纳米颗粒、实施例2(或实施例3)制得的纳米酶及上述纳米酶加入底物后与不同浓度(0ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、500ng/ml)待测物混合7min后。从图中可以看出，加入底物后的实施例人工模拟酶颜色显现明显，且随着浓度的增加，颜色逐步加深，故直接通过肉眼观察即可实现定性或半定量检测，而直接参照常规方法利用胶体金进行检测时，颜色变化不大，方法灵敏度较低。
[0127]
对实施例1～3中酶的稳定性(ph稳定性、热稳定性和储藏稳定性)进行测试，结果如图10～12所示。结果表明，纳米酶的催化反应，如同天然酶一样，依赖于ph、温度。然而，与hrp天然酶不同的是，ptpd和fe3o4纳米酶更稳定，能适应较大范围的ph和温度变化，即使在ph 8或温度80℃的条件下，仍然保持60～70％的催化活性。同时，纳米酶的活性几乎不随在室温时储藏时间的变化而变化，而天然酶却随着时间延长活性明显降低。从图可以看出，纳米酶相对于天然酶而言，稳定性更好。
[0128]
本发明方案通过将(70μl)样品滴加在样品垫上，通过毛细管层析作用向吸水垫移动。待测物与结合物(探针)以及t线上包被的抗原抗体发生特异性识别，因此，t线上被捕获的探针数量与待测物的含量成一定比例。而探针都是具有过氧化物酶或类过氧化物酶性质，可以在h2o2存在下催化3,3',5,5'-四甲基联苯胺(tmb)，生成蓝色的产物。通过该颜色信号即可定性或结合相应的仪器定量检测待测物。
[0129]
本方法以人工模拟酶或天然酶标记抗原抗体喷涂于结合垫，以捕获抗体抗原涂覆在检测线，当样品滴加在样品垫，通过毛细管层析作用，酶标记抗原抗体被捕获在检测线上。进而在检测线上添加酶促反应底物时，检测线便会出现明显的颜色变化。此方法通过酶促反应放大检测信号，相对于传统的胶体金法和荧光法，可显著提高检测方法的灵敏度。其中纳米酶相对于天然酶，稳定性更好、成本更低廉、更易于制备。本发明首次将酶促反应用于制备宠物疾病的快速检测试剂盒，应用于宠物疾病的检测。
[0130]
上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。