即插式仿生生理屏障动态培养装置

1.本发明属于生物医学与流体力学建模的交叉研究领域，具体涉及一种仿真生理屏障体外动态培养装置。


背景技术：

2.药物递送领域的一个主要挑战就是如何加强药物穿过生理屏障的运输功能，诸如血-脑屏障、气-血屏障、胎盘屏障、血-尿屏障、皮肤及粘膜等。屏障是人体天然的防御体系，可防止外来物质侵入，只允许具有特定性质的小分子通过。以血脑屏障(blood-brain barrier,bbb)为例，bbb通过调节必要的营养物质运输和抑制血液中的有害病原体、毒素和免疫因子的进入来维持脑组织内环境的基本稳态，对保证中枢神经系统正常生理功能具有重要意义。目前研究表明，一些神经退行性疾病，如阿尔兹海默症、帕金森症以及多发性硬化症等都与bbb的完整性破坏相关联。此外，由于bbb的屏障功能，阻碍了神经疾病治疗药物透过并有效进入脑组织，因此，成为神经退行性疾病相关药物研发环节的重要挑战。为了深入探索神经退行性疾病中bbb损伤机制以及神经退行性疾病相关新药的临床前bbb透过性研究，具有仿生屏障功能的血脑屏障体外模型的构建具有重要意义。
3.bbb是由脑微血管内皮细胞、基膜和血管周围神经细胞组成，与之生理结构相似的屏障还有血-胸腺屏障、气-血屏障、血-睾屏障、及滤过屏障。这类屏障功能主要依赖于微血管内皮细胞之间形成的的紧密连接以防止水溶性分子的细胞旁运动。而紧密连接蛋白的表达则会受到微血管内皮细胞的微环境影响，包括血流剪切力、细胞共培养、细胞外基质刚度等。目前研究已经表明，流体剪切力是影响体外培养的微血管内皮紧密连接蛋白表达的关键因素之一，同时，也会对微血管内皮细胞行为和其他生理特性产生影响。仍以bbb为例，现有bbb体外模型的构建大都基于transwell的培养体系，通过将细胞接种于transwell小室的pet膜上，形成生理屏障结构和功能。但是，传统的transwell模型在静态培养条件下失去了血流剪切力对细胞作用，必然会对模型中的脑微血管内皮细胞之间形成的紧密连接产生一定的影响，进而影响模型的真实性和可靠性。
4.为了构建更加真实有效的体外bbb模型，建立一个模拟血液循环的动态培养系统至关重要。目前，基于微流控技术的仿生bbb芯片是人们研究与关注的热点。但无论是已经商品化的流动培养装置，还是高度集成化的微流控芯片，多采用将细胞膜片直接集成固定其中，这为细胞接种、培养优化及细胞收集分析增加了一定的难度。以微流控芯片为例，微量流体在流动过程中容易产生微气泡，影响细胞生长，这就要求利用芯片进行细胞培养需要专业人员进行操作。另外，封装好的细胞组织芯片一般只能一次性使用，增加了使用成本。


技术实现要素：

5.为解决现有技术问题，本发明提供一种体外的即插式仿生生理屏障动态培养装置，该装置设计包括以下方面：首先通过cad画图，对装置进行基础建模，设置基本参数。通
过comsol仿真软件进行模拟，得到装置中相应细胞培养位置处的剪切力大小以及分布情况，根据模拟数据，对装置的设计参数进行优化。
6.一种体外模拟与bbb生理结构和功能相似的屏障微环境的即插式仿生生理屏障动态培养装置，包括由上到下设置的上腔室、即插式细胞膜片和下腔室，所述上腔室、即插式细胞膜片和下腔室可拆卸连接，主体部分的可灵活组装及拆卸；
7.所述上腔室为顶部封闭、底部开口的结构，连接有上腔室进液管和上腔室出液管，所述上腔室进液管位于上腔室的顶部靠近侧壁一侧，所述上腔室出液管位于上腔室的侧壁，且上腔室进液管和上腔室出液管位于上腔室的两侧，呈上下分布；
8.所述即插式细胞膜片包括细胞膜片边框和设置于细胞膜片边框内的细胞膜片(微孔滤膜)，所述细胞膜片与细胞膜片边框固定连接；所述上腔室进液管与上腔室可拆卸连接，所述上腔室进液管与细胞膜片的夹角为45
°‑
90
°
，优选为60
±2°
；所述细胞膜片为微孔滤膜；
9.所述下腔室为顶部开口、底部封闭的结构，连接有下腔室进液管和下腔室出液管，所述下腔室进液管和下腔室出液管位于下腔室的对称两侧。
10.即插式细胞膜片可模拟构建bbb这类由微血管内皮、基膜以及周围相关组织、细胞等构成的生理屏障。bbb膜片两侧可用于接种脑微血管内皮细胞和星形胶质细胞共培养，仿生血脑屏障结构。上、下腔室内的培养液在蠕动泵的驱动下形成动态微环境，其中，调控上腔室进液管的倾斜角度和流速可灵活调控施加于细胞膜片上的剪切力，以促进内皮细胞形成紧密连接结构，进而形成与体内真实血脑屏障相近的组织结构。可进行单层细胞培养、膜分隔式共培养以及混入水凝胶的三维培养。细胞膜片通过即插方式集成到装置中，可随时取出进行细胞评价。下腔室含有平行进出液孔道，为膜片下层细胞提供动态生长环境，保证新陈代谢。本装置易于组装拆卸，可重复使用。细胞膜片便于接种、观测及收获细胞，构建的内皮屏障组织膜片可作为耗材商品化，保证实验的简便快捷，易于推广。
11.进一步的，将上、下腔室设计为可拆分的装置，装置选材为不锈钢，具有一定的硬度和定型能力方便拆卸组装，上、下腔室之间设有垫圈，上、下腔室通过螺纹连接，使用垫圈进行密封；所述垫圈为硅胶垫圈。上腔室与下腔室之间通过螺纹与密封垫圈拧紧密封，细胞膜片可夹在两个腔室之间，模拟体内生理屏障结构。
12.进一步的，所述上腔室出液管与上腔室固定连接，所述下腔室进液管和下腔室出液管分别与下腔室固定连接。
13.进一步的，所述下腔室与上腔室的连接处设有凹槽。
14.进一步的，所述细胞膜片与边框粘结连接；所述边框的材质为聚二甲基硅氧烷，所述细胞膜片为聚酯膜。所述的即插式细胞膜片中心为适合细胞生长可观测的微孔径聚酯膜(polyester membrane，pet)，所述聚酯膜(pet)的孔径为0.4μm，直径为8-10mm；边框为圆环形状的聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane，pdms)，外径为21mm，内径为6-8mm，厚度为0.5-2mm。其中圆环形状的pdms和圆形的pet膜之间，通过pdms预制剂与固化剂以10:1的质量比混合形成的预聚体，再将预聚体按照预聚体与甲苯在1:1-3:2的质量比内与甲苯进行混合，混合后形成的胶黏剂进行粘结处理，放入60-80℃烘箱中加热2-5h，进行固定。pet膜可进行单层细胞培养，共培养及水凝胶三维培养。使用时，即插式细胞膜片可在装置外完成细胞接种及初期培养的优化，之后可通过镊子夹取放入下腔室与上腔室连接处的凹槽内，
组装后进行动态培养。也可随时取出观测。
15.进一步的，所述上腔室的顶部靠近侧壁一侧开圆孔，所述圆孔内塞入密封塞，所述上腔室进液管可穿透密封塞插入上腔室。所述密封塞为硅胶密封塞。上腔室内腔底面直径为16mm，高度为6mm，体积为1206mm3。上腔室进液管的外径为3-4mm，内径为2-3mm，上腔室出液管的外径为2mm，内径为1mm。上腔室一侧的细胞膜片上用来培养脑微血管内皮细胞，为获得最佳生理剪切力，在装置上腔室顶部开有直径为4-6mm的小孔，位置在上腔室出液管的水平延长线上的相对侧，紧邻侧壁。通过密封塞插入进液管，进液管入口角度可调控，不同的角度对膜片上的细胞造成不同方向的生理剪切力，根据实施例提到的模拟方法进行的模拟结果显示，确定本装置最佳进样口角度为60
°
。另外，还可以通过改变入口流速来调控装置对膜片上的细胞产生的生理剪切力大小，入口流速为10-30ml/min，优选为25ml/min。所述上腔室进液管的插入长度为出口距离细胞膜片的高度为3-5mm。
16.进一步的，下腔室内腔底面直径为16mm，高度为6mm，体积为1206mm3。下腔室进液管的外径为2mm，内径为1mm，下腔室出液管的外径为2mm，内径为1mm。下腔室侧壁水平对称方向设计下腔室进液管和下腔室出液管，实现流动式培养，为细胞膜片下层共培养细胞提供一个动态微环境，方便其进行新陈代谢，可进行连续培养。
17.进一步的，生理屏障主要由微血管内皮细胞、基膜和周围相关组织、细胞构成屏障结构，例如血-脑屏障、气-血屏障、血-尿屏障等。
18.上述体外的即插式仿生生理屏障动态培养装置，在使用时，可在装置外完成细胞接种及初期培养的优化，之后通过镊子夹取放入腔室连接处的膜片槽内，组装后进行动态培养。通过蠕动泵连接硅胶管向上腔室入口管道内通入培养基，培养基在上腔室内流动过后从出口管道流出，在细胞膜片上形成生理大小的剪切力，促进内皮细胞生长。同时，细胞膜片背面可以接种星形胶质细胞，在下腔室入口管道通入培养基，由出口管道流出，形成动态培养。该装置有利于进行长时间培养，不用每日更换培养基，同时，在需要观察细胞状态时，可以随时暂停，将装置拆卸，取出细胞膜片，置于倒置显微镜下进行观察；也可在屏障组织形成后，取出膜片进行原位免疫荧光染色实验，或收获膜片上生长的细胞进行分子生物学检测，以评价构建的生物屏障，如血脑屏障组织中存在的特征基因和特异性蛋白。
19.本发明的有益效果是：本发明提供一种微型体外动态培养装置，该装置主体为不锈钢材质，便于拆卸、组装，可高温高压灭菌并重复使用。装置的进液管角度与细胞膜片之间的夹角可调，从而实现在维持相对稳定的流体微环境下，给内皮细胞施加一个最优的剪切力。进液管角度的确定可采用流体力学建模的方法，通过模拟计算进行优化。用于构建bbb及类似生理屏障的细胞膜片为即插式膜片，便于细胞接种、实时观测以及对培养后的组织细胞进行收集分析。同时，由仿生bbb膜片隔离的两个腔室内的培养液体可随时采集，完成实时在线的生化分析。相对于目前被广泛应用于生理屏障模型构建的transwell培养装置，本发明提供的一个更加接近生理条件下的动态培养系统。本发明中的动态培养装置采用组装方式形成培养系统，体积较大，方便操作，不易形成管道堵塞，不易流体流动时形成微气泡，对细胞培养操作者的技术水平要求不高。同时，本发明中的上腔室和下腔室可以拆卸进行消毒灭菌反复使用，耗材仅为成本较低的细胞膜片，这大大降低了实验成本，易于推广。
20.同时，与现有的动态培养系统相比，本装置的即插式细胞膜片作为低成本耗材，更
有利于实验条件优化、细胞实时观测及生化分析，从而更好地提高实验结果的准确性及重现性，为后期通过集成实现高通量的药物筛选打好坚实的基础。
附图说明
21.图1a是本发明的即插式动态培养装置的内部结构拆分示意图，b是即插式动态培养装置的内部结构组装示意图。
22.图2a是本发明的即插式动态培养装置外部实体结构示意图，b是即插式动态培养装置的内部实体结构示意图，c是即插式动态培养装置的综合结构示意图。
23.图3是本发明的即插式膜片概念图。
24.图4是本发明即插式动态培养装置实验概念图。
25.图5是comsol仿真软件模拟在不同入口角度下即插式细胞膜片位置处的剪切力大小以及分布情况。
26.图6是comsol仿真软件模拟在最佳分布的条件下，不同入口流速下即插式细胞膜片位置处的剪切力大小以及分布情况。
27.图标：1-上腔室进液管；2-上腔室；3-细胞膜片边框；4-下腔室；5-下腔室进液管；6-下腔室出液管；7-细胞膜片；8-上腔室出液管。
具体实施方式
28.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的实施例进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
29.因此，下述非限定性实施实例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
30.实施例1
31.本实施例通过基于有限元方法的计算流体力学(cfd)模拟，来分析动态培养装置的不同条件下细胞膜片上的剪切力受力情况。通过autocad软件按照真实装置的结构进行三维图像构建几何模型，随后导入到comsol软件中对装置内流体流动情况进行模拟。并根据模拟的结果对动态培养装置进行条件优化。
32.首先在autocad软件中构建具有两个水平液体进出管的初始模型，然后导入到comsol软件中。以入口流量为10ml/min，出口压力为一个标准大气压(760mmhg)作为边界条件，流体流动类型设置为层流，由不可压缩的纳维斯托克斯方程控制。流体的温度设置为310.15k，流体的密度设置为1000kg/m3。模拟中所构建的网格为细化的自由四面体网格。模拟结果发现，在10ml/min的入口流量下，膜片上的内皮细胞所受到的剪切力远小于体内真实值(1～6dyn/cm2)，即使增大流速到100ml/min，仍无法使剪切力达到正常值。因此，我们通过改变几何模型，调整入口管道的插入方向，使其垂直插入装置，管的出口距离膜片1mm。结果发现，顶面中间插入管道会对细胞膜片表面的细胞造成方向相反的剪切力。于是调整顶面开口到出口管道的水平线上的相对侧，紧贴侧面开一个3mm直径的孔，倾斜不同角度插入入口管道，分别对不同方向入口管道的装置进行流体力学模拟，结果如附图5所示，不同角度都会造成细胞膜片受力，而在与出口管道水平延长线上斜倾角60
°
时，细胞膜片上受到
流体的剪切力最均匀。在确定管道入口角度后，通过comsol流体力学模拟进一步分析入口流速对膜片受力的影响，参数设置：流量分别设置为：5ml/min、10ml/min、25ml/min、50ml/min。结果如附图6所示，发现在流量为25ml/min时，细胞膜片上受力能够达到生理剪切力范围。
33.实施例2
34.本实施例提供一种体外模拟血脑屏障的即插式仿生血脑屏障动态培养装置，其可拆分部分包括上腔室进液管1、上腔室2、即插式细胞膜片和下腔室4四个部分，且该四个部分被构造成能够沿竖向由上至下依次叠合连接在一起的整体。上腔室2为顶部封闭、底部开口的结构，连接有上腔室进液管1和上腔室出液管8，上腔室进液管1与上腔室2可拆卸连接，上腔室出液管8与上腔室2焊接，上腔室进液管1位于上腔室2的顶部靠近侧壁一侧，所述上腔室出液管8位于上腔室2的侧壁，且上腔室进液管1和上腔室出液管8位于上腔室2的两侧，呈上下分布。即插式细胞膜片包括细胞膜片边框3和设置于边框内的细胞膜片7，细胞膜片7与细胞膜片边框3固定连接。下腔室4为顶部开口、底部封闭的结构，焊接有下腔室进液管5和下腔室出液管6，下腔室进液管5和下腔室出液管6位于下腔室6的对称两侧。上腔室2、下腔室4通过螺纹连接，使用垫圈进行密封。即插式细胞膜片中心为孔径为0.4μm的聚酯pet膜7，直径为8mm；边框3为圆环形状的pdms，外径为21mm，内径为7mm，厚度为1mm。其中圆环形状的pdms和圆形的pet膜之间，通过pdms预制剂与固化剂(道康宁sylgard 184)以10:1的质量比混合形成的预聚体，再将预聚体按照预聚体与甲苯以1:1的质量比与甲苯进行混合，使用混合后形成的胶黏剂进行粘结处理，放入80℃烘箱中加热3h，进行固定。细胞膜片7上用来培养脑微血管内皮细胞。使用时，即插式细胞膜片可在装置外完成细胞接种及初期培养的优化，之后可通过镊子夹取放入下腔室4与上腔室2连接处的凹槽内，组装后进行动态培养。也可随时取出观测。上腔室2内腔底面直径为16mm，高度为6mm，体积为1206mm3。上腔室进液管1的外径为3mm，内径为2mm、上腔室出液管8的外径为2mm，内径为1mm。下腔室4内腔底面直径为16mm，高度为6mm，体积为1206mm3。下腔室进液管5的外径为2mm，内径为1mm，下腔室出液管6的外径为2mm，内径为1mm。
35.在上腔室2顶端部分开设有直径为6mm的孔径，塞入具有良好生物相容性的硅胶塞口，通过软件模拟确定入口角度分别为45
°
、60
°
和90
°
，确定插入长度为膜上4mm，插入上腔室进液管1调节至最佳位置后进行固定，以形成能够供流体从上腔室进液管1依次流经上腔室2、即插式细胞膜片后从上腔室进液管9流出的流道，能够很好的为细胞表面提供足够的剪切力。上腔室2的下端面覆接有两侧均种植有细胞的即插式细胞膜片，即插式细胞膜片同时作为下腔室4的上界面，以部分透过地分隔上腔室2和下腔室4。下腔室4水平通过流体，形成动态培养体系。
36.本方案中的即插式动态培养装置使用时，可从上腔室进液管1通入细胞培养基，在即插式细胞膜片3上提供相应的生理剪切力刺激，流经上腔室2之后，培养基从上腔室出液管8通出。两面种植细胞的即插式细胞膜片3固定在上下腔室之间的凹槽内，并部分透过地分隔上腔室2和下腔室4。由于即插式细胞膜片的选择透过特性，上腔室2中的部分物质可透过即插式细胞膜片进入下腔室4内，从而形成细胞共培养环境。下腔室4中由下腔室进液管5水平通入细胞培养基，再从下腔室出液管6通出，两侧均种植细胞的即插式细胞膜片的一侧接触上腔室2中的流体剪切力刺激，另一侧接触下腔室4中的流动培养基，使得其整体处于
流动状态的培养之下，相较于静态的培养装置更符合生物实体环境。
37.本方案中的即插式动态培养装置采用可拆卸的组合式设计，避免了芯片一体化设计带来的复杂结构，不易出现管道堵塞，流体内产生微气泡等问题。本装置通过调节上腔室进液管1的参数，巧妙地为细胞提供了生理剪切应力刺激。前述上腔室2、下腔室4的叠合连接方式，可以通过螺纹连接和密封垫圈进行紧密连接，防止漏夜，确保密封性，可方便地实现装置的组装或拆卸。