基于一代测序平台检测新生儿遗传病基因的引物库组合、试剂盒和方法与流程

1.本发明涉及基因检测技术领域，尤其是涉及一种基于一代测序平台检测新生儿遗传病基因的引物库组合、试剂盒和方法。


背景技术：

2.遗传代谢性疾病(inherited metabolic diseases，imd)是指由于基因突变引起酶缺陷、细胞膜功能异常或受体缺陷，从而导致机体生化代谢紊乱，造成中间或旁路代谢产物蓄积或终末代谢产物缺乏而引起一系列临床症状的一组疾病。迄今发现的疾病已经超过1000种。虽然imd单一病种发病率较低，每种疾病均属少见病或罕见病，但因病种繁多，综合患病率并不低。imd的临床表现复杂多样，随年龄、性别不同而有差异，危害极大。有些疾病在新生儿早期，例如出生后数小时或几天内即会发病，部分疾病却可能在幼儿期、儿童期、青少年期甚至成年期发病。由此造成的后果是：一方面，临床诊断十分困难；另一方面，如果不及早发现并治疗，疾病可对新生儿造成不可逆转的严重损害，如智力低下、终身残疾，甚至死亡。因此，对imd应致力于早期诊断和及时治疗，从而避免或减轻疾病的危害。有虽然每种遗传病发病率比例较低，但由于人群基数大，可能获益的患者数量仍然可观。因此，快速、准确、全面的遗传病检测鉴定可以为患者带来更优的医疗决策。
3.目前，新生儿遗传病的检测方法主要包括串联质谱分析(lc/ms)、二代测序(ngs)、实时荧光定量pcr(rt-rcr)等方法。如铂金埃尔默(pe)公司基于串联质谱分析neobase新生儿筛查试剂盒，通过串联质谱分析对新生儿干血斑样本中非衍生化多种氨基酸、肉碱和琥珀酰丙酮等含量变化来确定是否患有新生儿代谢性遗传疾病。串联质谱分析是目前临床上检测新生儿代谢性遗传疾病的常用检测方法；ngs目前已被广泛应用于遗传病筛查领域。基于其高通量特性，ngs可以一次性检测成百上千种遗传相关的致病性突变，是目前检测范围最广的一种检测手段；rt-pcr是一种非常成熟的遗传病检测方法，许多发病风险非常高的单基因遗传病往往可以通过这种方法进行检测，如艾吉泰康的人类hla-b27核酸检测试剂盒，使用rt-pcr的方法用于引起强制性脊柱炎的人类hla-b27基因核酸检测，其检测准确性较高。
4.串联质谱分析方法通常是对代谢产物进行检测，往往仅限于代谢性遗传病筛查，且无法得出疾病产生的根本原因，同时存在一定假阳性，假阴性的问题；实时荧光定量pcr(rt-rcr)虽然检测准确率很高，但是往往只能检测单个基因或者极少的几个基因位点的突变，检测范围比较狭窄；二代测序(ngs)检测通量很高，一次性可以检测多种引起遗传病的致病性突变，操作流程比较复杂，检测时间较长，单个样本检测成本高，技术难度相对较大，当然也会存在一定假阳性，假阴性的问题，且检测不够灵活应对多种检测需求。
5.目前已有技术成本高、可检测基因的位点少、检测不够灵活，准确性不够等缺点，难以满足目前检测样本数量大、检测位点多、检测时效要求高、检测准确性高等检测要求。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种基于一代测序平台检测新生儿遗传病基因的引物库组合、试剂盒和方法。本发明采用第一代测序技术，其中涉及120个基因及近千个不同位点的致病性突变，本发明可以根据需求，随机进行不同的基因检测验证，选择所需基因位点的引物组而无需进行相关引物设计，以及后续筛选，可以两步pcr，纯化后直接进行测序，可以一次性进行96个样本检测，很大程度上简化了检测过程，降低了检测成本，准确率较高。
7.为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
8.第一目的，本发明提供了一种基于一代测序平台检测新生儿遗传病基因的引物库组合，所述引物库组合包括以下引物：
9.1)针对ugt1a1基因(c.211g》a)多态性位点的检测引物：如seq id no:1所示的正向引物和seq id no:2所示的反向引物；
10.2)针对gjb2基因(c.109g》a)多态性位点的检测引物：如seq id no:3所示的正向引物和seq id no:4所示的反向引物；
11.3)针对gusb基因(c.104c》a)多态性位点的检测引物：如seq id no:225所示的正向引物和seq id no:226所示的反向引物；
12.4)针对slc26a4基因(c.919-2a》g)多态性位点的检测引物：如seq id no:13所示的正向引物和seq id no:14所示的反向引物；
13.5)针对abcg5基因(c.904 1g》a)多态性位点的检测引物：如seq id no:51所示的正向引物和seq id no:52所示的反向引物；
14.6)针对ldlr基因(c.1747c》t)多态性位点的检测引物：如seq id no:37所示的正向引物和seq id no:38所示的反向引物；
15.7)针对slc26a4基因(c.1692dupa)多态性位点的检测引物：如seq id no:131所示的正向引物和seq id no:132所示的反向引物；
16.8)针对galt基因(c.821-7a》g)多态性位点的检测引物：如seq id no:93所示的正向引物和seq id no:94所示的反向引物。
17.作为本发明所述引物库组合的优选实施方式，所述新生儿遗传病基因还包括abcd4、abcg8、acad8、acadm、acads、acadsb、acadvl、acat1、acsf3、ada、agl、ahcy、aldh7a1、aldob、apob、arg1、arsa、arsb、asl、ass1、atp7a、atp7b、auh、bckdha、bckdhb、btd、cbs、cps1、cpt1a、cpt2、cyp11b1、dbt、ddc、dld、etfa、etfb、etfdh、mut、ethe1、f9、fah、g6pc、g6pd、gaa、galc、gale、galk1、galns、gamt、gba、gcdh、gch1、gjb3、gla、glb1、gldc、gnmt、gnptab、hadha、hadhb、hbb、hexa、hlcs、hmgcl、hpd、hsd17b10、ids、idua、ivd、l2hgdh、ldlr、lmbrd1、mat1a、mccc1、mccc2、mmaa、mmab、mmachc、mmadhc、mthfr、mtr、mt-rnr1、mtrr、naglu、nags、npc1、npc2、otc、pah、pc、pcca、pccb、pcsk9、phgdh、phka2、pnpo、prodh、pts、pygl、qdpr、sgsh、slc10a1、slc12a3、slc22a5、slc25a13、slc25a15、slc25a20、slc37a4、slc6a8、smpd1、spr、suclg1、tat、th中的至少一种。
18.第二目的，本发明提供了一种基于一代测序平台检测新生儿遗传病基因的试剂盒，包括上述的引物库组合。
19.第三目的，本发明提供了一种基于一代测序平台检测新生儿遗传病基因的方法，
所述方法为非诊断用途。
20.第四目的，本发明提供了上述引物库组合在制备检测新生儿遗传病基因的试剂盒中的用途。
21.第五目的，本发明提供了一种采用上述引物库组合检测新生儿遗传病基因的方法，所述方法为非诊断方法，包括以下步骤：
22.1)提取干血斑样本的dna；
23.2)采用如上述引物库组合进行第一轮pcr扩增，获得pcr扩增产物，然后进行测序pcr扩增，纯化及上机测序，分析测序结果。
24.作为本发明所述方法的优选实施方式，步骤2)中第一轮pcr扩增的条件为：a、98℃ 30s；b、98℃ 10s；c、58℃ 30s；d、72℃ 1min；e、回到b循环30次；f、72℃ 5min；g、25℃，循环。
25.作为本发明所述方法的优选实施方式，测序pcr反应体系为：bdt v3.1 0.5μl、5x seq buffer 1.75μl、引物组1.0μl和水5.75μl。
26.作为本发明所述方法的优选实施方式，步骤2)中测序pcr扩增的条件为：a、96℃ 1min；b、96℃ 10s；c、50℃ 30s；d、60℃ 4min；e、回到b循环25次；f、25℃，循环。
27.本发明经过dna提取-多重pcr扩增-测序pcr扩增-上机测序-序列分析，操作步骤简单，结果稳定可靠，易于同时进行多个样本的批量处理，且可同时检测多个基因多种位点。
28.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
29.本发明提供了一种基于一代测序平台检测新生儿遗传病基因的引物库组合、试剂盒和方法，通过对新生儿遗传病频率较高的120个基因的常见突变位点(957个)设计扩增引物，通过两步pcr反应进行序列测定，分析序列后判读样本是否存在突变现象。本发明通过两步pcr反应即可完成测序前的样品准备工作，在很大程度上简化了检测过程，降低了检测成本，具有灵敏度高和特异性高等特点。
附图说明
30.图1为基因ugt1a1 c.211g》a的测序结果图；
31.图2为基因gjb2 c.109g》a的测序结果图；
32.图3为基因gusb c.104c》a的测序结果图；
33.图4为基因slc26a4 c.919-2a》g的测序结果图；
34.图5为基因abcg5 c.904 1g》a的测序结果图；
35.图6为基因ldlr c.1747c》t的测序结果图；
36.图7为基因slc26a4 c.1692dupa的测序结果图；
37.图8为基因galt c.821-7a》g的测序结果图。
具体实施方式
38.为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
39.在以下实施例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、
试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
40.本发明涉及的引物库基因及相应引物组如表1所示。
41.表1
42.43.44.45.46.47.48.[0049][0050]
实施例1
[0051]
1、选择经过验证的的含gjb2 c.109g》a；gusb c.104c》a；slc26a4 c.919-2a》g；ugt1a1 c.211g》a四种致病突变的干血斑样本，编号为20211027_1，选择含有ldlr c.1747c》t及abcg5 c.904 1g》a两种致病突变的干血斑样本编号为20211027_2，选择含有slc26a4 c.1692dupa及galt c.821-7a》g两种致病突变的干血斑样本编号为20211027_3，一共8个突
变位点。同时选择5个经过验证的不含致病突变的阴性样本作为对照。
[0052]
利用湾区生物干血斑提取试剂盒进行组织dna的提取。首先取3片3mm的干血斑样品，加入裂解液及蛋白酶k等对组织细胞进行裂解，加利用磁珠将dna吸附到磁珠上上，进行清洗后，用eb水将磁铁上上的dna洗脱下来，用qubit和nd对其浓度进行检测，结果如下：
[0053][0054]
2、在引物库中选择上述8个致病位点对应的引物组，使用引物组所提取的dna进行扩增。每个阳性位点扩增的同时安排同引物组的5个阴性样本做对照，共进行48个样本的扩增。
[0055]
1)对dna进行扩增，具体流程如下：
[0056] final concentration投入量(μl)ddh2ona8.5q5tm master mix1
×
12.5正向引物10pmol1.0反向引物10pmol1.0template3.125～200ng2totalna23.0
[0057]
2)按照以下步骤进行pcr扩增：
[0058][0059]
3、对48个样本进行正反测序，按以下比例准备测序pcr反应体系，每个样本分两管，分别使用正反向引物进行扩增，一共96个带测序样本：
[0060]
reaction1/8
×
bdt v3.10.5μl5x seq buffer1.75μlprimer 3.2μm1.0μl
h2o5.75μltemplate1.0μl
[0061]
1)按照以下步骤进行pcr扩增：
[0062][0063]
4、对测序pcr产物进行纯化，流程如下：
[0064]
1)每管加入1.0μl 125mm edta到管底，每管加入1.0μl 3m naac到管底；
[0065]
2)每管加入35.0μl 100％酒精，铝箔或胶盖封严密，震荡混匀4次，室温放置15min；
[0066]
3)3700rpm离心30min，马上倒置96孔板，离心至850rpm停止离心；
[0067]
4)每管加入50.0μl的-20℃预冷70％酒精，3700rpm离心15min；马上倒置96孔板，离心至850rpm停止离心；
[0068]
5)重复用预冷70％酒精洗涤1次；
[0069]
6)室温挥发净酒精，加入10.0μl hi-di formamide溶解dna；
[0070]
溶解后的样品需要在95℃变性4min，迅速置冰中冷却4min后(取出后置于-20℃冰箱)，上样电泳。
[0071]
5、随后对96个样本上机进行后续的测序以及测序后的数据分析，得到如下结果：
[0072]
表2
[0073][0074]
参考图1-8及表2的结果知，本发明的检测方法可以快速同时验证多种基因突变位点。
[0075]
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质
和范围。