一种高分子量纤维素硫酸酯及其制备方法和应用与流程

1.本发明属于纤维素衍生物制备技术领域，尤其涉及一种高分子量纤维素硫酸酯及其制备方法和应用。


背景技术：

2.纤维素是自然界中分布最广、产量最大的可再生资源，它可从多种自然资源中获取，如棉花、林木、秸秆、微生物等。纤维素具有可生物降解性、生物相容性和可衍生化等特点，纤维素功能化产品在能源、材料、化工和农业等领域有着广泛的应用。然而，纤维素大分子的高结晶度导致其难溶和难熔，制约了其作为基础原材料的开发和利用。自然界每年通过光合作用合成的纤维素高达1.5
×
10
12
吨，但只有2.5％得到了应用。因此通过纤维素的衍生化，改善其水溶性和油溶性，可以更好地开发丰富的纤维素资源。
3.纤维素硫酸酯化是指纤维素结构中的羟基部分或者完全被硫酸酯基取代得到硫酸酯多糖。与其它纤维素衍生物相比，纤维素硫酸酯具备独特的生物学特性：抗菌、抗病毒、抗凝血等，在多个领域都具有广阔的应用前景。抗凝血药物在临床、生物医用材料及再生医学材料领域都有广泛应用，有学者研究发现，纤维素硫酸酯的抗凝血效果比肝素更强，且抗凝血活性与分子量、硫酸酯取代度之间呈正相关关系，即随其增大而增大，故获得较高分子量的纤维素硫酸酯在该应用领域是有益的。
4.纤维素硫酸酯的基本合成方法是已知的，且方法众多。其实验室制备方法可分为非均相法和均相法；比如典型的非均相法制备纤维素硫酸酯是使用硫酸和丙醇作为反应试剂和反应介质，其须在低温-5℃条件下反应；即便如此，这种方法剧烈反应还是会产生大量的热，导致纤维素链降解、取代基不均匀分布，从而得不到高分子量的纤维素硫酸酯；另外的缺点是存在不溶性的部分需要除去导致产率低。而均相反应则可以采用相对温和的硫酸酯化试剂，有学者在溶解纤维素之后使用三氧化硫吡啶复合物硫酸酯化得到了高分子量的产物，但是其所采用的温度为80℃，该方法一是能耗高，二是长时间高温、酸或氧化剂存在时容易导致链降解。现有技术中，纤维素硫酸酯化的反应温度一般要大于80℃才能获得分子量比较高和收率比较好的高分子量纤维素硫酸酯。这是因为若温度较低，无法溶解纤维素进行后续反应，导致不能得到较高的取代度和高分子量的纤维素硫酸酯。
5.因此，有必要开发一种反应条件温和且分子量高的纤维素硫酸酯的制备方法。


技术实现要素：

6.本发明旨在至少解决现有技术中存在的上述技术问题之一。为此，本发明提供了一种高分子量纤维素硫酸酯的制备方法。
7.本发明还提供了一种高分子量纤维素硫酸酯。
8.本发明还提供了一种高分子量纤维素硫酸酯的应用。
9.本发明的第一方面提供了一种高分子量纤维素硫酸酯的制备方法，包括如下步骤：
10.s1.在惰性气氛下，将干燥后的莱赛尔纤维加入到无水二甲基乙酰胺后加热，再加入无水氯化锂，加热至莱赛尔纤维完全溶解，并冷却；
11.s2.将三氧化硫吡啶加入到步骤s1中的溶液中，于20～30℃进行反应，后处理即得高分子量纤维素硫酸酯；所述三氧化硫吡啶的摩尔用量是所述莱赛尔纤维摩尔用量的至少5倍。
12.本发明关于高分子量纤维素硫酸酯的技术方案中的一个技术方案，至少具有以下有益效果：
13.本发明采用莱赛尔作为纤维素原料，这种纤维素原料为再生纤维素，本身纯度非常高，同时其分子微观状态同天然纤维素不同，结晶度比天然纤维素低一半，且分子量比天然纤维素没有低太多，所以非常适合作为改性用原料。使用莱赛尔作为原料，溶解过程中加热时间减少一半，降低了纤维素分子链断裂的几率，分子量得以保持。
14.本发明在硫酸酯化阶段，采用20～30℃的反应条件，温和的反应条件更有利于硫酸酯化大分子的生成及降低纤维素的反应降解，而本发明所得产物完全水溶，具有低毒性、反应时间短和产率高的特性，反应产率最低为80％。且具有分子量大、取代度高和原子经济性的优势。
15.根据本发明的一些实施方式，所述无水二甲基乙酰胺通过将二甲基乙酰胺用4a分子筛干燥12h即得。
16.根据本发明的一些实施方式，所述无水氯化锂是将氯化锂在120℃真空干燥箱中干燥2h即得。
17.根据本发明的一些实施方式，步骤s2中，所述三氧化硫吡啶的摩尔用量是所述莱赛尔纤维摩尔用量的小于等于12倍。
18.当三氧化硫吡啶的摩尔用量是所述莱赛尔纤维摩尔用量高于12倍时，对反应没影响，因此，考虑成本的原因，选择三氧化硫吡啶的摩尔用量是所述莱赛尔纤维摩尔用量的小于等于12倍。
19.根据本发明的一些实施方式，步骤s2中，所述后处理为将反应后的溶液滴入有机溶剂中得到沉淀，多次洗涤后再溶解调节ph值至碱性条件，透析得到高分子量纤维素硫酸酯。
20.根据本发明的一些实施方式，所述有机溶剂包括乙醇或丙酮。
21.根据本发明的一些优选的实施方式，所述有机溶剂为乙醇。
22.发明人经过研究发现，采用乙醇作为沉淀介质，相比丙酮介质价格更低廉，也更安全。
23.根据本发明的一些实施方式，所述碱性条件是ph值为8～14。
24.根据本发明的一些实施方式，所述ph值通过氢氧化钠调节。
25.根据本发明的一些实施方式，步骤s1中，所述加热的温度为110～120℃。
26.根据本发明的一些实施方式，步骤s2中，进行反应的时间为1～3h。
27.根据本发明的一些实施方式，步骤s1中，所述惰性气氛为氩气或氮气气氛。
28.本发明的第二方面提供了由所述方法制备得到高分子量纤维素硫酸酯，所述高分子量纤维素硫酸酯的取代度为1.5以上，重均分子量为45万道尔顿以上。
29.本发明的第三方面提供所述高分子量纤维素硫酸酯在抗凝血、涂料或制备高分子
聚合物中的应用。
附图说明
30.图1是葡萄糖标准品的线性回归方程图；
31.图2是实施例1的高分子量纤维素硫酸酯的分子量分布图；
32.图3是实施例1的高分子量纤维素硫酸酯的细胞毒性图。
具体实施方式
33.下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，但本发明的实施方式不限于此。
34.本发明所采用的试剂、方法和设备，如无特殊说明，均为本技术领域常规试剂、方法和设备。
35.实施例1
36.实施例1提供一种高分子量纤维素硫酸酯的制备方法，包括如下步骤：
37.原料前处理，对所用原料进行脱水处理。所用物料包含氯化锂、二甲基乙酰胺、莱赛尔纤维。氯化锂脱水是在120℃真空箱中干燥2h得到无水氯化锂，二甲基乙酰胺用4a分子筛干燥12h得到无水二甲基乙酰胺，莱赛尔在真空箱中110℃干燥12h。
38.s1.在惰性气氛下，称取干燥后的莱赛尔纤维1.75g加入到80ml无水二甲基乙酰胺中，升温至120℃，加入8g无水氯化锂，继续反应1h，并冷却至室温，莱赛尔纤维完全溶解；
39.s2.将5倍摩尔量的三氧化硫吡啶加入到步骤s1中的溶液中，于25℃进行反应3h；将反应液滴到乙醇中，产物沉淀出来；然后用乙醇洗涤沉淀3次，过滤，得到白色固体；所得固体加水溶解，然后用1m naoh调ph到9，搅拌后装入透析袋，透析即得高分子量纤维素硫酸酯，产率为86％。
40.实施例2
41.原料前处理，对所用原料进行脱水处理。所用物料包含氯化锂、二甲基乙酰胺、莱赛尔纤维。氯化锂脱水是在120℃真空箱中干燥2h得到无水氯化锂，二甲基乙酰胺用4a分子筛干燥12h得到无水二甲基乙酰胺，莱赛尔在真空箱中110℃干燥12h。
42.s1.在惰性气氛下，称取干燥后的莱赛尔纤维1.75g加入到80ml无水二甲基乙酰胺中，升温至120℃，加入8g无水氯化锂，继续反应1h，并冷却至室温，莱赛尔纤维完全溶解；
43.s2.将12倍摩尔量的三氧化硫吡啶加入到步骤s1中的溶液中，于25℃进行反应3h；将反应液滴到乙醇中，产物沉淀出来；然后用乙醇洗涤沉淀3次，过滤，得到白色固体；所得固体加水溶解，然后用1m naoh调ph到9，搅拌后装入透析袋，透析即得高分子量纤维素硫酸酯，产率为80.5％。
44.对比例1
45.对比例1提供一种纤维素硫酸酯的制备方法，包括如下步骤：
46.原料前处理，对所用原料进行脱水处理。所用物料包含氯化锂、二甲基乙酰胺、莱赛尔纤维。氯化锂脱水是在120℃真空箱中干燥2h得到无水氯化锂，二甲基乙酰胺用4a分子筛干燥12h得到无水二甲基乙酰胺，莱赛尔在真空箱中110℃干燥12h。
47.s1.在惰性气氛下，称取干燥后的莱赛尔纤维1.75g加入到80ml无水二甲基乙酰
胺，升温至120℃，加入8g无水氯化锂，继续反应1h，并冷却至室温，莱赛尔纤维完全溶解；
48.s2.将3倍摩尔量的三氧化硫吡啶加入到步骤s1中的溶液中，于20～30℃进行反应3h；产物不完全溶解于水，在水中呈细绒毛状。
49.对比例2
50.对比例2提供一种纤维素硫酸酯的制备方法，制备方法和原料与实施例1相同，其区别在于，采用棉短绒纤维替换莱塞尔纤维。
51.对比例3
52.对比例3提供一种纤维素硫酸酯的制备方法，制备方法和原料与实施例1相同，其区别在于，采用脱脂棉粉替换莱赛尔纤维。
53.性能检测
54.对上述实施例和对比例的纤维素硫酸酯进行元素分析和凝胶渗透色谱分析，并进行mtt比色法细胞毒性检测。
55.元素分析仪：
56.德国elemantar型号：vario el cube模式：chns标准样品：氨基苯磺酸炉温：炉1:1150℃，炉2:850℃，炉3:0℃；
57.氦气瓶减压阀出口压力：2.0bar；o2气瓶减压阀出口压力：2.5bar。
58.chns模式是样品在纯氧中燃烧转化成co2、h2o、n2、so2，通过色谱柱分离后进行热导检测，测得样品中的c、h、n和s的含量。
59.开启计算机后，移开仪器进样盘，然后打开仪器电源，待仪器运行球阀和进样盘底座初始化后，将进样盘放回原处。开启氦气和氧气，调整出口压力，然后启动vario el软件，在mode中选择chns模式，确认所使用的标准样品名称为氨基苯磺酸。待炉温达到设定温度后，开始常规分析。
60.凝胶渗透色谱分析：
61.gpc分析原理：按照分子的流体力学半径大小，分子量从大到小顺序进行分离。
62.gpc分析仪器：jasco分子排阻色谱系统；pss suprema 300mm
×
8mm
×
5μm；ri-930示差折光检测器；流动相：0.9％nacl水溶液，流速0.5ml/min；柱温25℃，进样体积20μl；标准品：t5、t10、t40、t70、t150、t500、t1000系列葡聚糖标准品；
63.将葡聚糖标准品配制成终浓度为1.0g
·
l-1
溶液，经0.22μm微孔滤膜过滤后进行gpc分析,以峰位保留时间(t)为横坐标,相对分子量的对数值(lgmw)为纵坐标作标准曲线,得回归方程。待测样品配制成1.0g
·
l-1
溶液，进行gpc分析，记录峰位保留时间。根据待测样品出峰时间及标准曲线,计算样品分子量。
64.如图1所示，以葡聚糖标准品的分子量对数(lgmw)对保留时间(t)进行回归处理,得线性回归方程为:lg mw＝-0.6118t 11.44,r2＝0.999,回归关系较好。
65.如图2所示，图2为实施例1的高分子量纤维素硫酸酯的分子量分布图，具体数值见表1。
66.计算取代度ds和重均分子量，数据如表1所示：
67.取代度ds计算公式为：ds＝(s％
×
72.07)/(c％
×
32.06)。
68.表1实施例和对比例的数据
[0069] 取代度(ds)重均分子量/万(mw)
实施例11.549实施例22.845对比例1——对比例20.520对比例31.235
[0070]
由于对比例1在制备过程中无法完全溶解，所以无法进行取代度和重均分子量的试验。
[0071]
mtt比色法细胞毒性检测：
[0072]
mtt全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-2,5-di-phenytetrazoliumromide，化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。
[0073]
mtt比色法：是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性mtt还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(dmso)能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在570nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，mtt结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高和经济。
[0074]
mtt溶液的配制方法：mtt浓度为5mg/ml。称取mtt 0.5克，溶于100ml的磷酸盐缓冲液(pbs)或无酚红的培养基中，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃避光保存即可。
[0075]
mtt测试步骤：
[0076]
1.收集对数期l929小鼠细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul，铺板使待测细胞密度10000/孔(96孔平底板，边缘孔用无菌pbs填充)。
[0077]
2.转移至二氧化碳细胞培养箱中，5％co2，37℃孵育，培养18-24h至细胞单层铺满孔底，细胞贴壁后即可加药(实施例1制备样品)。设置4个浓度梯度，每孔100ul，设5个复孔，同时设置阳性对照组(1m naoh 培养基)和阴性对照组(不加药，加等量新鲜培养基)。
[0078]
3.然后继续在二氧化碳细胞培养箱5％co2，37℃孵育24小时。
[0079]
4.除去孔板中的受试样品，使用pbs溶液清洗孔内2遍，每个孔内加入50ul的mtt溶液，在培养箱中孵育4小时，之后弃去孔内mtt溶液。
[0080]
5.在每个孔中加入200ul的dmso，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。同时在培养箱中孵育4-6小时；孵育结束后将溶解液吸出加入到新的96孔板中，放入酶标仪中，测定吸收波长570nm下各孔的吸光度值。
[0081][0082]
实施例1样品mtt测试细胞存活率见图3。
[0083]
依据gb/t16886.5标准附录c进行的细胞毒性测试结果表明，所有测试浓度组的小鼠成纤维细胞l929存活率都大于70％，评价为无细胞毒性。
[0084]
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可
以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。