1.本发明涉及一种寡核苷酸，其为微小rnamir-132的有效抑制剂，以及其在医学中的用途，特别是在预防或治疗人受试者的心脏病症和/或纤维化病症中的用途。2.心力衰竭是世界上导致死亡的主要病理原因之一。心肌梗死(mi)是心力衰竭的最重要原因，因为mi导致随后的心脏的进行性不利重构，从而导致预后不良的心力衰竭。目前使用的心力衰竭的治疗药物选项包括血管紧张素调节剂、β受体阻滞剂、利尿剂、醛固酮拮抗剂、血管紧张素-ii-受体阻滞剂与脑啡肽酶抑制剂、血管扩张剂、正性肌力剂或sglt-2抑制剂的组合。尽管几项临床研究已显示，所有这些药剂均可显著降低心力衰竭诱发的死亡率，但5年死亡率仍令人难以接受地高达近50％。因此，非常需要开发新型且更高效的心力衰竭治疗方法。3.心肌细胞病理性肥大性生长可导致心脏重构、心力衰竭和心源性猝死的发生。心肌细胞的肥大性生长是对由心脏容量和/或压力超负荷引起的心脏壁应力增加的反应。最初，心脏肥大是一种代偿机制，旨在减小壁应力和增加心输出量。然而，长时间的心脏肥大发展为收缩功能障碍、心脏代偿失调和最终心力衰竭(hill和olson，2008；barry和townsend,2010)。从生理性肥大到病理性肥大的转变发生可取决于许多因素，包括通过细胞凋亡或坏死导致的肌细胞损失、自噬的改变、收缩反应的缺陷、钙稳态失调、肾上腺素能受体脱敏或心脏纤维化(hill和olson,2008；barry和townsend,2010)。肥大信号传导主要由胰岛素信号通路介导(debosch和muslin,2008；barry和townsend,2010)。胰岛素和胰岛素样生长因子-1(igf-1)都通过igf-1受体激活心肌细胞中的促肥大通路，所述促肥大通路激活磷酸肌醇-3-激酶(pi3k)(mcmullen等人，2004)。pi3k活性导致丝氨酸/苏氨酸激酶akt通过其磷酸化而被激活，并且活性akt磷酸化抗肥大foxo转录因子，导致其去稳定化和防止核定位(datta等人，1999；skurk等人，2005；ronnebaum和patterson，2010)。相反地，去乙酰化酶-1(sirtuin-1)(sirt-1)对foxo因子的乙酰化导致其稳定化和核转位(frescas等，2005)。稳定化的foxo转录因子位于细胞核中，以调节抗肥大基因的表达。foxo蛋白的抗肥大功能在很大程度上是通过抑制促-肥大钙调神经磷酸酶信号通路介导的，该通路是通过foxo因子的抗-肥大基因靶标诸如萎缩酶-1的表达来实现(ni等人，2006；ronnebaum和patterson，2010；glas，2010)。此外，foxo转录因子还诱导心肌细胞的凋亡并调节其自噬(ronnebaum和patterson，2010)。
背景技术：
：：4.已证明微小rna在不利的心脏重构中起着关键作用。wo2013/034653描述了mir-132和/或mir-212可以诱导心脏肥大，从而构成心力衰竭治疗的潜在治疗靶点。5.wo2016/042561描述了通过向受试者施用治疗有效量的多核苷酸剂来治疗脂质相关病症的方法，所述多核苷酸剂与人mir-132的核苷酸序列基本互补。技术实现要素：6.本发明人已经鉴定了新型寡核苷酸类似物，其为心肌细胞中mir-132表达的有效抑制剂。寡核苷酸类似物，以下称为cdr132l，是由dna和lna构件(buildingblock)组成的混合物，具有核苷间硫代磷酸酯键联。7.用cdr132l在小鼠和猪中进行临床前药理学研究。在心脏肥大的转基因小鼠模型中，cdr132l导致与mir-132表达减少相关的心脏重构逆转。在mi后心力衰竭的小鼠模型中，发现cdr132l治疗减少mi后左心室功能障碍和心脏收缩功能的负荷无关参数。另外，施用cdr132l导致心脏功能的改善，并减少mir-132的表达、心脏应激信号传导和mi后肥大。8.在mi后心力衰竭的猪模型中，发现cdr132l治疗可避免适应不良的重构并改善左心室功能。另外，cdr132l使病理性心力衰竭标志物(诸如bnp、anp)的组织表达正常化，并提供肌球蛋白重变亚型(myh7/6比率)的转变。在mi后心力衰竭的猪模型中，发现cdr132l可治疗亚急性和慢性心力衰竭。9.cdr132l在人肝细胞系和分离的新生大鼠心肌细胞中也没有显著的毒性。通过在大鼠和小型猪中进行的体内毒性研究，发现活性剂即使在分别为20和40mg/kg的高剂量下也能被很好地耐受。10.对健康大鼠和健康猪静脉内或皮下注射cdr132l的药代动力学研究证实了cdr132l组织水平的剂量依赖性。11.另外，已显示与具有相同核苷酸序列但lna构件分布不同的其它寡核苷酸类似物相比，cdr132l表现出更好的效果。12.在另一项研究中，本发明人在心肌梗死的体内小鼠模型和肝纤维化和肺纤维化的体外模型中鉴定了寡核苷酸类似物cdr132l的抗纤维化治疗效果。13.此外，还发现循环体液中mir-132的量与cdr132l的治疗效果之间存在显著关系。因此，体液中mir-132的量是用于治疗监测的相关生物标志物。14.基于上述结果，已经开发了用于向患有慢性心力衰竭的人患者施用cdr132l的临床ib期研究方案。这项ib期临床研究与此同时已成功完成。15.因此，寡核苷酸cdr132l可用作药剂中的活性剂，特别是用于预防或治疗心脏病症和/或纤维化病症。16.因此，本发明的第一方面提供了一种寡核苷酸类似物，其包含式i的序列：17.5'-atggctgtagactgtt-3'18.其中a、t、g和c是脱氧核糖核苷酸构件，并且19.其中至少一个g或t构件是桥连的核苷酸构件。这种寡核苷酸特别适用于预防和/或治疗人受试者的病症，更特别地是心脏病症。20.在特定实施方案中，寡核苷酸包含或具有式ii的序列：21.5'-a tg gc tg ta gactg t t-3'22.其中a、t、g和c是脱氧核糖核苷酸构件，并且23.其中 g和 t是桥连的核苷酸构件和/或吗啉代核苷酸构件，特别是其中 g和 t是lna构件。这种寡核苷酸特别适用于预防或治疗人受试者的病症，更特别是心脏病症或纤维化病症。24.式i或式ii的寡核苷酸类似物可以包含至少一个经修饰的核苷间键联，例如被稳定化而抗核酸酶消化的核苷间键联，例如硫代磷酸酯或磷酸二酰胺酯键联。在具体实施方案中，所有的核苷间键联都是经修饰的键联，特别是硫代磷酸酯键联。25.在更具体的实施方案中，本发明涉及如本文所述的寡核苷酸cdr132l。26.寡核苷酸cdr132l具有式iii的序列：27.5'-da* t*dg* g*dc* t*dg* t*da* g*da*dc*dt*dg* t* t-3'28.其中da为2'脱氧腺苷，dg为2'脱氧鸟苷，dc为2'脱氧胞苷，t为胸苷，29.其中 t是lna-t构件， g是lna-g构件，并且其中*是硫代磷酸酯键联。这种寡核苷酸特别适用于预防或治疗人受试者的疾病，更特别是心脏或纤维化病症。30.本发明的又一方面涉及药物组合物，其包含作为活性剂的寡核苷酸类似物和药学上可接受的载体，所述寡核苷酸类似物包含式i、式ii或式iii的序列，所述药物组合物特别地用于预防或治疗人受试者的疾病，更特别地心脏或纤维化病症。31.如上所述，包含式i、式ii或式iii序列的寡核苷酸类似物适用于医学用途。32.在某些实施方案中，医学用途涉及用于治疗或预防与mir-132的病理表达相关、伴随和/或由其引起的病症的用途。在某些实施方案中，医学用途涉及治疗或预防心脏病症，特别是心脏肥大相关病症。在某些实施方案中，医学用途涉及治疗纤维化病症，例如与病理性纤维化相关、伴随和/或由其引起的病症，特别是心脏纤维化病症、肺纤维化病症或肝纤维化病症。33.式i、式ii或式iii的寡核苷酸可由脱氧核糖核苷酸dna构件和桥连的核苷酸构件组成。“桥连的核苷酸”是指经修饰的核糖核苷酸，其中核糖部分包含连接2'-碳原子和4'-碳原子的两个或三个原子的桥。例如，桥可包括结构2'-o-ch2-4'、2'-o-ch2-ch2-4'、2'-o-ch(ch3)-4'或其中o被s或nh替代的相应结构。在特定的实施方案中，至少一个桥连的核苷酸构件是具有2'-o-ch2-4'-桥的锁核酸(lna)构件。34.式i、式ii或式iii的寡核苷酸具有至少16个构件的长度，例如16至20个构件的长度。在特定的实施方案中，式i、式ii或式iii的寡核苷酸具有16个构件的长度。35.在一些实施方案中，式i、式ii或式iii的寡核苷酸包含5至10个，例如6至8个，特别是7个桥连的核苷酸构件，例如lna构件。36.在一些实施方案中，式i、式ii或式iii的寡核苷酸是裸寡核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸可与至少一个异源部分缀合，所述异源部分例如是不促进寡核苷酸与mir-132结合的部分。所述异源部分可以是增加靶向性和/或细胞摄取的部分，例如脂质部分诸如胆固醇或脂肪酸，糖或氨基糖部分诸如含n-半乳糖胺的部分，肽或多肽部分或核苷或核苷酸部分诸如适体。异源部分可通过共价键或间隔子与寡核苷酸类似物的5'和/或3'-末端缀合。37.本发明的寡核苷酸适用于包括人药和兽药在内的药物。在某些实施方案中，所述化合物可用于预防或治疗与mir-132的病理表达例如过表达相关、伴随和/或由所述病理表达引起的病症。发现所述化合物的施用在体外和体内显著减少mir-132的表达。38.在一些实施方案中，可向与健康受试者相比显示mir-132过表达的患者施用所述化合物。在一些实施方案中，可向与健康受试者相比未显示mir-132过表达但仍然需要降低mir-132水平的患者施用所述化合物。39.在本发明的上下文中，术语“预防”涉及向已知患某种疾病的风险增加的患者施用所述化合物。在本发明的上下文中，术语“治疗”涉及对已经出现某种病症的体征和/或症状的患者施用所述化合物。术语“患者”涉及在人或兽医学领域中需要施用本发明化合物的受试者。在特定实施方案中，患者是人患者。40.在某些实施方案中，本发明的化合物可用于预防或治疗心脏病症，特别是心脏肥大相关病症。例如，所述化合物可用于预防或治疗收缩功能障碍、心脏代偿失调、心力衰竭，或用于预防或治疗心肌梗死、心肌炎、瓣膜性心脏病诸如主动脉狭窄或二尖瓣关闭不全、伴有心脏肥大的遗传性心脏疾病例如肥厚型非梗阻性和梗阻性心肌病或法布里病后的心脏重构。另外，所述化合物可用于预防或治疗心脏纤维化。41.所述化合物可用于向选自以下的患者施用：42.(i)患心力衰竭的风险增加的患者，43.(ii)患有(充血性)心力衰竭的患者，例如心力衰竭进展风险增加的患者，44.(iii)心肌梗死后患者和/或45.(iv)患有与心脏肥大相关的先天性心脏病，诸如主动脉和/或肺静脉狭窄、心房或心室间隔缺损的患者。46.在某些实施方案中，化合物，特别是cdr132l，可用于向患有急性心力衰竭的人患者、患有亚急性心力衰竭的人患者或患有慢性和/或恶化的慢性心力衰竭的人患者施用。47.在某些实施方案中，所述化合物，特别是cdr132l，可用于向患有稳定型心力衰竭，例如非缺血性和/或缺血性来源的稳定型心力衰竭的人患者施用。48.在某些实施方案中，所述化合物，特别是cdr132l，可用于向患有非缺血性和/或缺血性心力衰竭的人患者施用。49.在某些实施方案中，所述化合物，特别是cdr132l，可用于向患有较晚期心力衰竭的人患者或患有晚期心力衰竭的人患者施用。50.在某些实施方案中，所述化合物，特别是cdr132l用于向患有根据纽约州心脏协会(nyha)分类的心力衰竭i期、ii期、iii期和/或iv期的人患者施用，例如患有根据nyha的i期和/或ii期的心力衰竭的患者、患有根据nyha的i期、ii期和/或iii期的心力衰竭的患者或患有根据nyha的iii和/或iv期的心力衰竭的患者。51.在某些实施方案中，所述化合物，特别是cdr132l，可用于向患有心力衰竭并具有植入泵，例如左心室辅助装置(lvad)的人患者施用。52.在特定实施方案中，所述化合物可用于预防和/或治疗包括收缩性心力衰竭、舒张性心力衰竭在内的左侧心力衰竭和与收缩性心力衰竭和/或舒张性心力衰竭相关的疾患。53.收缩性心力衰竭是一种与降低的射血分数，尤其是与40％或更低的射血分数相关的心力衰竭，其中左心室失去其正常收缩的能力。在收缩性心力衰竭的治疗中施用本发明的化合物可以导致射血分数的稳定、增加和/或正常化。本发明的化合物适用于向有发展收缩功能病症风险的患者，例如患有高血压或冠状动脉阻塞的患者施用。54.舒张性心力衰竭是一种与伴有或不伴有充盈压增加的左心室舒张功能受损相关的心力衰竭。在许多情况下，舒张性心力衰竭与保留射血分数(preservedejectionfraction)相关。在舒张性心力衰竭的治疗中施用本发明的化合物可导致左心室舒张的稳定、改善和/或正常化。本发明的化合物适用于向有发展舒张功能障碍风险的患者，例如患有高血压、高脂血症、糖尿病、阻塞性睡眠呼吸暂停、心脏储备疾病、遗传性心力衰竭(例如titin或其它结构基因中的突变)的患者施用。55.在另外的具体实施方案中，所述化合物可用于预防和/或治疗右侧心力衰竭，特别是由左侧心力衰竭引起的右侧心力衰竭。56.在某些实施方案中，本发明的化合物可用于预防或治疗纤维化病症，特别是与病理性纤维化相关、伴随和/或由病理性纤维化引起的病症。57.病理性纤维化是器官或组织中特别是与病理状态相关、伴随和/或由病理状态引起的过量纤维结缔组织的形成。病理性纤维化可发生在体内许多不同的器官和组织中，通常由炎症或损伤引起。58.在特定实施方案中，所述纤维化是心脏纤维化，例如涉及心脏中的病理性纤维化的病症。心脏纤维化的示例性类型包括心房纤维化、心内膜心肌纤维化或由先前心肌梗死引起的纤维化。59.在另外的实施方案中，纤维化是肺纤维化，例如涉及肺中的病理性纤维化的疾患。示例性肺纤维化类型包括由职业或环境因素，例如暴露于毒素和污染物，诸如二氧化硅粉尘、石棉纤维、金属粉尘、煤尘、谷物粉尘、鸟类和动物粪便，引起的纤维化病症。其它类型的肺纤维化病症是由放射治疗和/或利用诸如化学治疗药物、心脏药物、抗生素或抗炎药物等药物的治疗引起的。还有其它类型的肺纤维化病症是由包括特发性肺纤维化、皮炎、多发性肌炎、混合结缔组织病、自身免疫性疾病诸如类风湿性关节炎、硬皮病、sjogren综合征或系统性红斑狼疮、结节病、肺炎、病毒感染或胃食管反流病(gerd)在内的病症引起的。60.在另外的实施方案中，纤维化可以是肝纤维化，例如涉及肝脏中的病理性纤维化的疾患。肝纤维化的示例性类型是由病毒感染(例如由乙型和/或丙型肝炎病毒)、遗传代谢病症、自身免疫性肝炎、胆道梗阻、铁超载、非酒精性脂肪性肝病，包括非-酒精性脂肪肝(nafl)和非酒精性脂肪性肝炎(nash)以及酒精性肝病引起的。61.在又一另外的实施方案中，纤维化也可以是血管纤维化，例如动脉硬化，皮肤纤维化，例如瘢痕疙瘩形成或肾源性系统性纤维化，关节纤维化(arthrofibrosis)、一些形式的粘连性囊炎、软组织纤维化(诸如纵隔纤维化或腹膜后纤维化)或骨髓纤维化，诸例如脊髓纤维化(myelofibrosis)。62.在某些实施方案中，本发明包括在施用本发明的化合物之前、期间和/或之后测定待治疗的受试者中某些生理参数的量和/或活性。该伴随诊断程序可为上述医疗用途提供帮助。例如，所述诊断程序可以在风险评估、患者分层、疗程监测和/或治疗后控制方面提供帮助。63.在某些实施方案中，本发明包括在施用本发明化合物之前、期间和/或之后测定待治疗的受试者中mir-132的量和/或活性。在另外的实施方案中，本发明包括测定至少一种特别地选自心脏标志物和/或纤维化标志物的标志物的量和/或活性。在某些实施方案中，本发明包括测定心脏标志物的量和/或活性，所述心脏标志物是诸如bnp(例如nt-probnp)、anp或肌球蛋白重变亚型(例如myh7/6比率)，和/或foxo3和/或serca2的水平。在特定的实施方案中，本发明包括测定nt-probnp的量。在又一另外的实施方案中，本发明包括测定纤维化标志物的量和/或活性，所述标志物是诸如胶原蛋白，例如胶原蛋白沉积和/或纤维化标志物基因诸如-但不限于-胶原蛋白1a1、胶原蛋白1a2、胶原蛋白3a1、i型前胶原蛋白c端前肽(picp)和/或半乳糖凝集素-3(gal-3)，和/或基质金属蛋白酶(金属蛋白酶)诸如基质金属蛋白酶1(mmp-1)和/或基质金属蛋白酶2(mmp-2)的表达。64.上述参数的测定可以在诸如血液、血浆或血清等的体液样品中或组织样品中根据已知方法在核酸和/或蛋白质水平上进行，并且可以提供有用的诊断信息，例如关于疾病进程和/或疗程和/或治疗成功的信息。65.另外，本发明人通过基于pcr的检测方法发现，心脏组织中mir132的量显示与循环体液例如全血、血浆或血清中mir132的量呈正相关。因此，体液样品例如全血、血浆或血清样品中的mir132的量的测量提供了靶组织中，特别是心脏组织中mir132的量的指示。66.在某些实施方案中，本发明包括了在治疗过程中测定待治疗的受试者(例如，人受试者)中mir-132的量和/或活性。本说明书中的术语“治疗过程”应理解为在一定时间段内，例如至少一天、至少一周、至少两周或至少一个月的时间段内，向有需要的受试者，特别是人受试者施用本发明的化合物，特别是施用cdr132l。这种测定可以在治疗过程中进行一次或几次。在特定实施方案中，定量测定来自体液的样品中，例如来自循环体液的样品诸如血液、血浆或血清样品的样品中的mir-132的量。特别地，样品是血浆样品。mir-132的量和/或活性与化合物在预期靶器官，特别是心脏中的浓度成反相关或负相关，但也与其活性和/或疗效成反相关或负相关。因此，所述测定允许调整待施用的剂量和/或调整单个剂量之间的间隔。另外，所述测定允许根据患者的治疗反应对患者进行分层，例如，区分有反应者与无反应者。特别地，在治疗过程中，对患有慢性疾病的患者，例如患有慢性心脏病的患者进行数次测定。例如，可以以每周、两周和/或每月的间隔进行测定。67.在某些实施方案中，本发明包括在治疗过程中测定ecg参数的变化。与心力衰竭患者相关的ecg参数包括但不限于qrs、t波、左束支传导阻滞(lbbb)和/或右束支传导阻滞(rbbb)的测量；和/或r进展。特别相关的是qrs测量。68.根据本发明的另外方面，寡核苷酸可以以基于需求的方案施用，例如通过根据体液样品中mir132的测量量调整剂量和/或单个剂量之间的时间间隔。例如，如果发现体液样品中mir132的量高于预定值，则施用新剂量的寡核苷酸。69.因此，本发明涉及用于预防或治疗人受试者的心脏疾病的如上所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸通过基于需求的方案施用，具体包括以下步骤：70.(i)测量用寡核苷酸治疗的受试者的体液样品，例如全血、血清或血浆样品中mir132的量，71.(ii)以根据步骤(i)中mir132的测量量确定的剂量和/或单个剂量之间的时间间隔施用寡核苷酸，特别是其中如果发现体液样品中mir132的量高于预定值(例如基线值)，则施用新剂量的寡核苷酸。72.本发明的化合物可以作为包含药理学上可接受的载体的药物组合物施用。施用可通过已知方法进行，其中将化合物引入待治疗的受试者的所需靶细胞或器官。73.如上所述，所述化合物可以原样或作为与异源部分的缀合物施用。74.对于药物应用，所述组合物可呈溶液形式，例如可注射溶液、乳液、悬浮液等。75.所述组合物可以以任何合适的方式施用，例如肠胃外施用，特别地通过注射诸如皮下、肌内、静脉内或动脉内注射或输注，通过口服或吸入摄入和/或通过皮肤施用，或通过局部施用至靶器官，例如通过冠状动脉内灌注。载体可以是任何合适的药物载体。优选地，使用能够增加寡核苷酸分子进入靶细胞的功效的载体。此类载体的合适实例是脂质体，例如阳离子脂质体，或预先设计的外来体。76.在某些实施方案中，将化合物，特别是cdr132l，通过静脉内注射或通过皮下注射施用。77.根据施用途径和疾病的类型或严重程度，将化合物以药学有效剂量施用。78.在某些实施方案中，将化合物例如通过肠胃外施用，特别地通过注射或输注，例如通过静脉内注射或通过皮下注射，以每次施用约0.1-100mg/kg体重，例如每次施用约0.2-50mg/kg体重，或每次施用约0.8-20mg/kg体重，或每次施用约3-10mg/kg体重的剂量向人受试者施用。79.在药代动力学研究中发现，所述化合物在心脏组织中具有长的半衰期，约为三周，和在血浆中短的双相半衰期。这些结果表明，所述化合物适用于各种不同的治疗方案，例如，适用于包括以少于一周的时间间隔施用的治疗方案和包括以一周或更长的时间间隔施用的治疗方案。80.在某些实施方案中，以选自每天施用一次、每二天施用一次、每三天施用一次和每四天施用一次的方案向人受试者施用寡核苷酸，特别地其中肠胃外施用寡核苷酸，更具体地通过静脉内或皮下注射，例如由患者皮下自我注射施用。81.在这些实施方案中，可以以体重依赖性剂量和/或固定剂量施用寡核苷酸。例如，可以以每次施用0.01mg/kg体重至50mg/kg体重的剂量、以每次施用0.02mg/kg体重至10mg/kg体重的剂量或以每次施用0.05mg/kg体重至5mg/kg体重的剂量施用寡核苷酸。可替代地，可以以每次施用1mg至5000mg的固定剂量、以每次施用2mg至1000mg的固定剂量或以每次施用5mg至500mg的固定剂量施用寡核苷酸。82.在又一另外的实施方案中，以选自每周施用一次、每2周施用一次、每3周施用一次、每4周或每月施用一次、每六周施用一次、每二个月施用一次、每三个月施用一次、每六个月施用一次和每年施用一次的方案向人受试者施用寡核苷酸，特别地其中通过肠胃外，更特别地通过静脉内或皮下注射，例如患者的皮下自我注射施用寡核苷酸。83.在这些实施方案中，可以以体重依赖性剂量或固定剂量施用寡核苷酸。例如，可以以每次施用0.01mg/kg体重至50mg/kg体重的剂量、0.05mg/kg体重至20mg/kg体重的剂量或0.1mg/kg体重至10mg/kg体重的剂量施用寡核苷酸。可替代地，可以以每次施用1mg至5000mg的固定剂量、5mg至2000mg的固定剂量或10mg至1000mg的固定剂量施用寡核苷酸。84.在又一另外的实施方案中，可以以起始剂量，例如1或2个起始剂量，以及随后以至少一个不同于所述起始剂量的维持剂量，向人患者施用所述化合物。例如，起始剂量可以高于维持剂量，诸如高至维持剂量的约1.5-3倍，例如约2倍。起始剂量和/或维持剂量可以作为体重依赖性剂量或以固定剂量施用。在具体实施方案中，起始剂量约为3-10mg/kg，维持剂量约为1–7.5mg/kg。另外，可以根据诸如血液、血浆或血清等的体液中mir132的量，例如通过滴定调整维持剂量。85.在人临床ib期研究中，发现在护理标准的基础上逐步增加单次和重复剂量的剂量下，所述化合物在人心力衰竭患者中表现出优异的耐受性和安全性。药代动力学特征谱没有显示出积累和高水平剂量线性的迹象。其在心力衰竭中的独特作用模式在相关药效学参数和靶标参与(targetengagement)中得到证实。没有观察到严重的不良事件和注射部位反应，也没有患者因不良事件退出研究。所述化合物耐受性良好，并且在最高达10mg/kg的剂量下没有显示出任何毒性迹象。86.所述化合物可以作为单一疗法施用或与另一种不同的药物(特别是适用于预防或治疗如上所述的心脏病症或纤维化病症的药物)联合施用。87.适用于预防或治疗心脏病症的其它药物的实例是血管紧张素调节剂、β-阻滞剂、利尿剂、醛固酮拮抗剂、血管扩张剂、正性肌力剂、他汀类药物、脑啡肽酶抑制剂或sglt-2抑制剂或其组合，例如脑啡肽酶抑制剂(例如沙库巴曲)与血管紧张素-ii受体阻断剂(如缬沙坦)的组合。88.在某些实施方案中，将所述化合物与以下物质一起施用：(i)至少一种利尿剂，(ii)至少一种血管紧张素转换酶抑制剂，(iii)至少一种β-阻滞剂，任选的(iv)血管紧张素-ii-受体阻滞剂和/或(v)任选的if-通道抑制剂诸如伊伐布雷定和任选的(vi)血管紧张素-受体-脑啡肽酶抑制剂，和任选的(vii)葡萄糖共转运蛋白2抑制剂诸如恩格列净和达格列净，和/或任选的(viii)干细胞治疗剂和/或任选地(ix)靶向不同通路的抗mirna和/或任选的(x)sglt-2抑制剂。本领域技术人员可以选择合适的抑制剂、干细胞治疗剂和/或靶向不同通路的mi-rna。根据(i)至(x)的化合物和抑制剂可以被独立选择并以任何合适的方式组合。89.适用于预防或治疗纤维化病症的其它药物的实例是用于预防或治疗心脏纤维化的药物，诸如ace抑制剂，例如赖诺普利，血管紧张素ii受体阻滞剂，例如坎地沙坦、氯沙坦或奥美沙坦，醛固酮拮抗剂，例如螺内酯和/或tgfβ抑制剂，例如吡非尼酮或曲尼司特，用于预防或治疗肺纤维化的药物，诸如抗纤维化剂，例如尼达尼布或吡非尼酮，抗炎剂，例如皮质类固醇、硫唑嘌呤、环磷酰胺和霉酚酸酯，抗反流剂，例如蛋白泵抑制剂或h2阻滞剂和/或抗咳嗽剂和用于预防和/或治疗肝纤维化的药物，诸如ace抑制剂，例如贝那普利、赖诺普利或雷米普利，抗病毒剂或pparα-激动剂。90.更进一步，本发明涉及如在此上文所述的本发明化合物用于制备用于预防或治疗心脏病症的药物的用途。91.更进一步，本发明涉及如在此上文所述的本发明化合物用于制备用于预防或治疗纤维化病症的药物的用途。92.更进一步，本发明涉及用于预防或治疗心脏病症的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的至少一种本文所述的化合物。93.更进一步，本发明涉及用于预防或治疗纤维化病症的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的至少一种本文所述的化合物。94.更进一步，本发明涉及用于监测用如上所述的寡核苷酸进行的治疗的药盒，所述监测包括测定施用了寡核苷酸的受试者的mir-132的量和/或活性。所述药盒可包含与mir-132编码dna或与其互补的dna结合的引物(优选引物hsa-mir-132)，与mir-39编码dna或与其互补的dna结合的引物(优选引物cel-mir-39)和任选的阳性对照hsa-mir-132和任选的阳性对照cel-mir-39。根据优选实施方案，将引物hsa-mir-132和mir-39一起使用。另外，所述药盒可包含附加的化合物，例如qpcr预混合物和不含核酸酶的水。在优选实施方案中，所述药盒包含引物hsa-mir-132、引物cel-mir-39、上述阳性对照以及qpcr预混合物和不含核酸酶的水。本领域技术人员可以选择合适的引物。95.另外，将通过以下附图和实施例更详细地描述本发明。具体实施方式96.实施例1-心肌细胞中mir-132表达的沉默97.对衍生自抗mir-132文库的许多结构类似物化合物的mirna抑制活性进行了体外定量测定。通过测定和定量实时pcr对mirna表达的沉默进行定量。98.在通过浓度为10μm的去氧肾上腺素/异丙肾上腺素处理进行的肥大刺激后分离的大鼠心肌细胞中进行该研究。将细胞在标准细胞培养基中孵育48小时。以100nm的浓度单独施用测试化合物。试验以一式三份进行。99.化合物cdr132l(一种具有硫代磷酸酯骨架的lna-dna混合物)被鉴定为来自抗mir-132结构类似物库的最强效的化合物。100.cdr132l的结构如下：101.5'-da* t*dg* g*dc* t*dg* t*da* g*da*dc*dt*dg* t* t-3'102.其中da为2'脱氧腺苷，dg为2'脱氧鸟苷，dc为2'脱氧胞苷，t为胸苷，103.其中 t是lna-t构件， g是lna-g构件，并且其中*是硫代磷酸酯键联。104.实施例2-毒理学谱表征105.2.1研究目的：cdr132l的毒性谱表征106.2.2研究大纲:107.在人肝细胞(hepg2)和分离的新生心肌细胞(nrcm)中进行了体外细胞毒性测定。商业mtt比色测定用于评估细胞毒性。添加单独的化合物后，将细胞在dmem培养基中孵育48小时。将cdr132l(红色)的效果与在0.01-100μm剂量范围内的用作对照(蓝色)的加扰lna寡核苷酸进行比较。治疗剂量范围用灰色标出。108.2.3结果：在治疗剂量范围内，未发现cdr132l对hepg2细胞和nrcm有显著毒性(参见图1a和图1b)。109.实施例3–通过在转基因小鼠模型中施用cdr132l来进行衰竭心脏的左心室逆重构110.3.1研究目的：在心力衰竭小鼠模型中测试cdr132l在逆转心力衰竭方面的疗效。111.3.2研究大纲:112.心脏肥大模型：心脏mir-132过表达的转基因(tg)小鼠(ucar等人2012)。113.治疗：每周20mg/kgip.cdr132l或安慰剂(参见图2a)114.分组：野生型(wt)同窝生幼仔 安慰剂，wt cdr132l，tg 安慰剂，tg cdr132l。n＝6/组。115.通过qpcr检测mir-132的表达水平。统计检验：非配对t检验。(图2b)。116.**p《0.01,n＝6/组。117.3.3结果：118.心脏的代表性超声心动图图像(图3a)。119.cdr132l逆转肥大，如通过心脏质量和舒张末期容积(lvedv)所测量的(图3b)。120.cdr132l改善左心室大部分节段的局部收缩功能(ab，前基底；am，中前壁；aa，前心尖；pa，后心尖；pm，中后壁和pb，后基底(图3c)。121.实施例4-在mi后心力衰竭的小鼠模型中施用cdr132l122.4.1研究目的：在mi后心力衰竭小鼠模型中测试cdr132l的疗效123.4.2研究大纲：124.心肌梗死(mi)小鼠模型：c57bl/6n小鼠中冠状动脉的永久结扎(lad)(kolk等人，2009)。125.组：mi或假手术组，用cdr132l或安慰剂治疗126.治疗：20mg/kgip，于mi后第7天和第14天127.终点：mi后第28天左心室功能。n＝6-7/组。(图4)，128.4.3结果：129.cdr132l治疗改善mi后左心室功能障碍(图5a)。130.心脏收缩收缩功能的负荷无关参数也得到改善(图5b)(*p《0.05)。131.cdr132l治疗还可改善纵向应变速率(lsr)，从而逆转心脏远端区域中个别心脏节段的mi后收缩功能障碍。(*p《0.05)(图6)。132.cdr123l治疗有效地沉默了例如远端(非梗死)区域和梗死周围区域的心脏组织中的mir-132表达(图7a)。133.在组织学水平上，cdr132l减少了mi后心脏远端区域的心肌细胞尺寸(图7b)。134.在组织水平上，cdr132l减少了mi后心脏中的心脏应激信号anp的表达(图7c)。135.实施例5-在mi后心力衰竭的猪模型中测试cdr132l136.5.1研究目的：cdr132l在心肌梗死后临床相关模型中的体内疗效证明。137.5.2研究设置：138.·由90分钟缺血(lad闭塞)和随后再灌注诱发的猪心肌梗死模型。139.·分组：安慰剂或cdr132l，n＝6/组。140.·治疗：2次，在mi后第3天和第28天，分别地冠状动脉内注射0.3mg/kg和静脉内注射0.5mg/kg(图8)。141.·终点：mi后8周。主要结果指标：ef和lv重构。142.5.3结果：143.·如通过舒张末期容积、收缩末期容积、射血分数和左心室功能的测量所确定，cdr132l治疗避免了适应不良的重构并改善了功能(图9a至图9d)。144.·cdr132l治疗改善了对应于存活/远端心肌的节段的节段收缩性；终点心脏mri：n＝6/组，红色区域：p《0.05(图9e)。145.·cdr132l治疗避免了适应不良的重构，并改善了心尖区的lv活力，如通过noga所测定的，终点电解剖映射：n＝6/组，安慰剂对比cdr132l：p《0.05(图10)。146.·cdr132l使病理性心力衰竭标志物anp和bnp的组织表达正常化，并提供肌球蛋白重变亚型的转变，即myh7/6比率(图11)。147.·在组织学水平上，cdr132l治疗有效地减少了远端lv区域中的心肌细胞肥大。lv区域的代表性显微摄影图像(wga/dapi染色20x)(图12a)和图形描绘(图12b)，n＝6/组，安慰剂对比cdr132l：p《0.05。148.实施例6–cdr132l在猪体内的药效学特征谱/靶标参与149.6.1研究设置：150.处理：1x，第0天，0.5mg/kg或5mg/kg冠状动脉内灌注，n＝3头猪/组，安慰剂对比cdr132l：p《0.05。151.·终点(治疗后24小时)的qpcr组织mirna测定。152.6.2结果：153.·单剂量的cdr132l治疗剂量依赖性地抑制心脏mir-132水平(图13)。154.实施例7–器官毒理学表征谱155.7.1研究设置：156.·治疗：2次，im后第3天和第28天，分别地冠状动脉内注射0.3mg/kg和静脉内注射0.5mg/kg。157.·连续血液取样，终点：治疗后72小时，n＝6头猪/组，安慰剂对比cdr132l：p《0.05。158.7.2结果：159.·体内cdr132l治疗不会引起猪中任何器官毒性(图14)。160.对大鼠和小型猪进行了随后重复剂量毒性研究。161.根据在大鼠中进行的为期4周的毒性研究，即在第1天和第28天静脉内推注注射4mg/kg、20mg/kg和100mg/kg的cdr132l，然后进行为期4周的恢复期，大鼠中的“无观测效应水平(noael)”被认为是20mg/kg。这对应于3.23mg/kg体重的人当量剂量。162.根据在小型猪中进行的为期4周的毒性研究，即在第1天和第28天静脉内推注注射4mg/kg、20mg/kg和40mg/kg的cdr132l，然后进行为期4周的恢复期，小型猪的“无观测效应水平”(noel)被认为是40mg/kg。这对应于36.36mg/kg体重的人当量剂量。163.实施例8-心力衰竭小鼠模型中心脏foxo3和serca2mrna的水平164.在通过每周4次腹膜内注射对照加扰寡核苷酸或cdr132l处理的对照和mir-132tg小鼠中，测量心脏foxo3和serca2mrna的水平。所有数值代表平均值±sem。*p《0.05(图15a和图15b)。165.实施例9–不同寡核苷酸的比较166.本研究的目的是使用两种对比寡核苷酸评价根据本发明的新型mir-132-3p抑制剂cdr132l的治疗效果。所述两种对比寡核苷酸显示出与cdr132l相同的寡核苷酸序列和硫代磷酸酯骨架，但分子内的lna构件的分布不同。cdr2u1在5'端和3'端有两个lna构件，而对于cdr301，每个核苷酸都带有lna构件。167.为了测试效率，向新生大鼠心肌细胞(nrcm)施用不同的寡核苷酸。在mir-132-3p及其已知靶基因foxo3(叉头盒o3)的表达发生变化后，通过定量实时pcr(qrt-pcr)监测这种治疗的效果。168.实验设计和结果如图16所示：(a)实验设置概述。将新生大鼠心肌细胞在第0天接种，并在第1天用寡核苷酸cdr132l、cdr2u1或cdr301(各100nm)处理。在终点，收集细胞用于基因表达分析。(b)经cdr132l、cdr2u1或cdr301处理后mir-132-3p的表达水平。(c)经cdr132l、cdr2u1或cdr301处理后mir-132-3p靶基因叉头盒o3(foxo3)的表达水平。数据均为平均值±sd。寡核苷酸对比安慰剂的p值通过双尾学生t检验来确定。169.用cdr132l和cdr301治疗nrcm导致mir-132-3p水平显著降低96％，而cdr2u1使mirna表达降低30％(图16a至图16b)。另外，用cdr132l治疗导致对mir-132-3p靶基因foxo3的显著抑制，这是用cdr2u1和cdr301不能实现的(图16c)。170.总之，我们的数据表明，cdr132l与cdr2u1和cdr301相比的更好的抑制作用表现为mir-132-3p的表达水平显著降低，并且其靶基因foxo3受到显著抑制。171.实施例10–cdr132l在心脏纤维化中的作用172.本研究的目的是在纤维化体内模型中评估cdr132l的抗纤维化治疗效果。173.为了在体内证明抗纤维化活性，使用在c57bl/6n小鼠中通过永久性左前降支冠状动脉(lad)结扎建立的心肌梗死(mi)小鼠模型。在第7天和第14天应用cdr132l治疗，接受安慰剂(cdr132l的加扰寡核苷酸类似物，20mg/kg)和cdr132l(20mg/kg)。各组包括对照组(假手术小鼠)和lad结扎小鼠(mi，心肌梗死)，接受安慰剂或cdr132l：假手术 安慰剂，假手术 cdr132l，mi 安慰剂，mi cdr132l。n＝6-7/组。实验设计如图17所述。图18显示了mi后心力衰竭中cdr132l体内抗纤维化效果的评估。mi后，通过用dr132l治疗，纤维化(显示为通过苦味酸-天狼猩红(psr)染色检测到的胶原蛋白沉积的百分比和相对于β-肌动蛋白的iii型胶原蛋白α1链(col3a1)基因表达)减弱了。各组包括对照组(假手术小鼠)和lad结扎小鼠(mi)，接受安慰剂(黑色柱)或cdr132l(白色柱)：假手术 安慰剂，假手术 cdr132l，mi 安慰剂，mi cdr132l。在用安慰剂或cdr132l治疗的mi小鼠之间进行统计检验(非配对t检验)。**p《0.01，n＝6-7/组。174.根据组织学结果，cdr132l治疗后减弱了纤维化(图18a)。这在分子水平上得到证实，纤维化标志物如iii型胶原蛋白α1链(col3a1)的基因表达降低(图18b)。175.实施例11–cdr1321在肺和肝纤维化中的作用176.在肺和肝纤维化的体外模型中测试了cdr132l的抗纤维化效果。为此，来源于肝(人原代肝成纤维细胞，hplf，pelobiotech)和肺(正常人原代肺成纤维细胞，nhlf，lonza)的人原代成纤维细胞用促纤维化剂刺激并用cdr132l处理。cdrl132l的治疗效果通过遵循纤维化途径中的关键过程来监测，包括增殖速率和终点时纤维化标志物基因表达的改变。另外，mir-132-3p的表达经评估证明是有效的cdr132l治疗。177.为了测定细胞增殖，使用了细胞增殖elisa(酶联免疫吸附测定)试剂盒(由roche提供)。这种比色测定允许基于掺入在增殖细胞新合成的dna中的brdu(溴脱氧尿苷)的测量来定量细胞增殖。已经检测并定量了掺入的brdu的量。吸光度值直接与dna的合成量相关，并因此与相应微量培养物中增殖细胞的数量相关。使用定量实-时pcr(qrt-pcr)测量mir-132-3p和包括胶原蛋白蛋白1a1(col1a1)、胶原蛋白蛋白1a2(col1a2)和基质金属蛋白酶2(mmp2)在内的纤维化标志物的表达水平来评估基因表达。178.图19涉及肝纤维化的体外模型：(a)实验设置概述。将人原代肝成纤维细胞(由pelobiotech提供)在第0天接种，并在第1天用纤维化刺激物(10ng/ml的于正常生长培养基(补充有10％fbs的完全成纤维细胞培养基)中的tgf-β)和cdr132l(100nm)处理。终点时，已经评估了细胞增殖和纤维化标志物的基因表达。(b)用cdr132l处理后的mir-132-3p的表达水平。(c)通过监测dna合成过程中brdu的掺入来评估增殖。终点前20小时，brdu试剂已被添加到培养基中。(d)纤维化标志物基因(胶原蛋白1a1(col1a1)、胶原蛋白1a2(col1a2)和基质金属蛋白酶2(mmp2))的表达水平。在(b)和(d)中，虚线指示未受刺激的对照细胞的表达水平。数据均为平均值±sd。cdr132l对比对照的p值通过双尾学生t检验确定。179.用转化生长因子β(tgf-β)刺激hplf(图19a)导致mir-132-3p的轻微诱导，该诱导被cdr132l处理显著降低(图19b)。另外，该化合物减少了成纤维细胞增殖(图19c)和包括col1a1、col1a2和mmp2在内的纤维化基因表达(图19d)。180.图20涉及肺纤维化的体外模型：(a)实验设置概述。将正常人肺成纤维细胞(由lonza提供)在第0天接种，并在第1天用成纤维细胞生长培养基中的纤维化刺激物(高fbs(5％))和cdr132l(100nm)处理。终点时，已经评估了细胞增殖和基因表达。(b)用cdr132l处理后的mir-132-3p的表达水平。(c)通过监测dna合成过程中brdu的掺入来评估增殖。终点前20小时，brdu试剂已被添加到培养基中。在(b)中，虚线表示未受刺激的对照细胞的表达水平。数据为平均值±sd。cdr132l对比对照的p值通过双尾学生t检验确定。181.在nhlf细胞中，在用高fbs(与2％fbs的正常生长条件相比为5％)进行纤维化刺激后(图20a)，未观察到mir-132-3p的升高(图20b)。然而，用cdr132l处理导致靶向微小rna的显著减少(图20b)和成纤维细胞增殖(图20c)。182.总之，我们的数据表明寡核苷酸类似物cdr132l在肝或肺来源的成纤维细胞以及心脏组织中具有显著的抗纤维化作用。我们假设这种效应可能基于药物的抗增殖能力，和/或基于其对细胞外基质蛋白表达的影响。183.实施例12–人体临床研究的方案和结果184.12.1方案：185.基本原理186.目前现有技术的心力衰竭药物疗法主要局限于不太晚期的疾病阶段(纽约心脏协会i期和ii期；nyhai/ii)。然而，药物不能阻止至晚期(nyha的iii期和iv期)的进展，这与频繁住院和超过70％的1年死亡率相关(13)。作为最后的手段，植入泵(左心室辅助装置，lvad)和最终的心脏移植可能是极少数末期心力衰竭患者唯一的救命选择。187.因此，迫切需要降低死亡率和住院率的新型、高效的疾病中止疗法来为患者提供治愈希望。本发明人的方法提供了革新医疗实践、改善患者护理和降低心力衰竭护理成本的新机会。188.cdr132l的作用模式具有形成其作为心力衰竭下一代药物的基础的以下关键要素：189.a)异常心脏mir-132水平的正常化，190.b)钙信号传导和收缩性以及心脏功能的正常化，191.c)心脏自噬和稳态的改善，以及192.d)适应不良的心脏重构的减弱。193.临床前研究结果表明，cdr132l的安全性特征谱足以随着临床发展而进步。194.因此，本研究计划基于临床相关大型动物研究中证明的显著治疗效果，在稳定型缺血性心力衰竭(nyhai-iii)患者中评估安全性、药代动力学和一些药效学参数。对于本研究，计划采用剂量递增方案。195.主要目标196.·评估一种单一剂量和一种重复剂量的cdr132l在稳定型缺血性心力衰竭(nyha的i期、ii期和iii期)患者中的安全性。197.次要目标198.·表征cdr132l在稳定型缺血性心力衰竭患者中的药代动力学(pk)特征谱。199.探索性目标200.·确定cdr132l对药效学(pd)参数的影响。201.主要终点202.主要终点是如通过以下方法测量的cdr132l的安全性：203.·治疗突发性不良事件(teae)的发生率和严重程度，204.·实验室安全测试(血液学、化学、凝血和尿液分析)有临床显著变化的受试者比例，205.·心电图(ecg)形态和/或节律异常的受试者比例，206.·ecg时间间隔(pr、qrs、qt和qtc间隔)有临床显著变化的受试者比例，207.·生命体征(收缩血压、舒张血压和脉率)发生临床显著变化的受试者比例，208.·心脏(高敏心肌肌钙蛋白t)、肾脏(肌酐)和肝脏(天冬氨酸转氨酶和丙氨酸转氨酶)损害和减充血(n末端b型脑钠肽前209.体)的器官损害标志物出现临床显著变化的受试者比例。210.次要终点211.通过非房室方法导出的pk参数包括最大观察血浆浓度(cmax)、达到最大血浆浓度的时间(tmax)、从时间零点至最后可检测血浆浓度的血浆浓度-时间曲线下面积(auc0-t)、从时间零点外推至无穷大的血浆浓度-时间曲线下面积(auc0-inf)、血液清除率(cl)、终末消除率常数(λz)、终末消除半衰期(t1/2)、分布体积(vdss)。212.探索性终点213.·pd参数包括但不限于以下生物标志物：用于靶向参与的微小rna132(mir-132)、用于减充血的n-末端b型脑钠肽前体(nt-pro-bnp)和作为心脏重构的标志物的嗜中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(ngal)。可能需要附加的参数。214.·鉴定生物标志物，所述生物标志物可以(1)预测对cdr132l治疗的反应，(2)解释药物pk/pd的可变性，(3)预测对药物相互作用的易感性或(4)预测安全问题的发生。这种探索性研究的目的将是更好地理解可能影响cdr132l在人受试者体内药代动力学的内在和外在因素。这将不包括任何患者的基因组(dna)测序。215.研究设计216.这是一项i期、随机、双盲、安慰剂对照研究，旨在评估cdr132l在稳定型缺血性心力衰竭(nyha的i-iii期)患者中的安全性、药代动力学和药效学参数。217.最多将招募28名患者。下面列出了最大队列规模的四个计划队列。这些队列中的每一个队列将最多由7名患者组成。患者将随机接受15分钟的cdr132l或安慰剂的静脉内输注，cdr132l与安慰剂的比例高达5:2。218.·治疗1(n＝高达7)-0.32mg/kgcdr132l；安慰剂219.·治疗2(n＝高达7)-1.00mg/kgcdr132l；安慰剂220.·治疗3(n＝高达7)-3.00mg/kgcdr132l；安慰剂221.·治疗4(n＝最高7)-10.00mg/kgcdr132l；安慰剂。222.患者将在第-1天进入研究前的41天内接受筛查。在进行任何筛选程序之前，每位受试者都将收到口头和书面信息，签署知情同意书(icf)。受试者将在第-1天进入研究单位，第4天出院，第27天再次入院，并在第31天出院。第一天，志愿者将接受cdr132l或安慰剂；当他们在第27天再次入院时，他们将接受第二次匹配剂量，第28天进行第二次给药。根据最新的欧洲指南(14)，所有患者都应接受缺血性心力衰竭的护理标准(soc)疗法。cdr132l或安慰剂将作为soc治疗的添加疗法给出。223.所有受试者将在第10-14天、第56天、第84天和第112天前往该单位进行计划门诊。研究期间进行的所有评估在研究评估时间表(表2和表3)中有详细说明。研究设计特征可根据适应性特征进行调整(表4)。本研究将采用哨兵给药策略，详情见第3.3.5节。224.受试者人数225.28名稳定型缺血性心力衰竭患者被招募到给药队列1、2、3和4。226.主要纳入标准227.c18036_cdr132l-fih01_clinicalstudyprotocol_v1.0_17apr2019228.临床研究方案模板(第6版)2019年3月14日第16页，共85页229.如果受试者年龄在30至80岁之间，体重指数(bmi)在18.0kg/m2与28.0kg/m2之间，并且被确认为稳定型缺血性心力衰竭，则将包括他们。230.主要排除标准是：非缺血性心力衰竭(高血压性心脏病、心肌炎、酒精性心肌病和快速房颤引起的心功能不全)、当前或复发疾病；不包括可能影响cdr132l的作用、吸收或处置，或可能影响临床评估或临床实验室评估的稳定型心力衰竭(例如血液学、神经病学、内分泌、免疫学、肾脏、肝脏或胃肠或其它疾患)。231.一种或多种试验治疗和施用方式232.队列1：在第1天和第28天，0.32mg/kgcdr132l静脉内输注(15min；20ml)(n＝5)233.队列2：在第1天和第28天，1.00mg/kgcdr132l静脉内输注(15min；20ml)(n＝5)234.队列3：在第1天和第28天，3.00mg/kgcdr132l静脉内输注(15min；20ml)(n＝5)235.队列4：在第1天和第28天，10.00mg/kgcdr132l静脉内输注(15min；20ml)(n＝5)236.一种或多种参考治疗和施用方式237.静脉输注(15min；20ml)安慰剂(n＝8)以匹配cdr132l。238.评价标准[0239]-安全性分析[0240]安全性评估将包括标准实验室安全性测试(血液学、凝血、生物化学和尿液分析)、生命体征(收缩血压[sbp]、舒张血压[dbp]、呼吸频率、脉率和鼓膜温度(tympanictemperature))、体格检查、12导联ecg(rr、pr、qrs、qt、qtcf间期和心率[hr])、遥测、生物标志物评估和不良事件监测。[0241]-药代动力学分析[0242]以下药代动力学参数将根据cdr132l的测得的血浆浓度计算：最大观察血浆浓度(cmax)、达到最大血浆浓度的时间(tmax)、从时间零点至最后可检测血浆浓度的血浆浓度-时间曲线下的面积(auc0-t)、从时间零点外推至无穷大的血浆浓度-时间曲线下的面积(auc0-inf)、血液清除率(cl)、终末消除速率常数(λz)、终末消除半衰期(t1/2)、分布体积(vdss)。[0243]-药效学分析[0244]药效学评估将是探索性的，并将通过采集血液样本以测定以下生物标志物的浓度来进行评估：用于靶向参与的微小rna132(mir-132)，用于减充血的n末端b型脑钠肽前体(nt-pro-bnp)，以及作为心脏重构标志物的嗜中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(ngal)。可能需要附加的参数。[0245]统计方法[0246]将在数据库硬锁定之前编写并签署包含详细统计方法学的统计分析计划(sap)。该计划可以适当地更新以反映研究的适应性特征。[0247]-安全性参数的统计分析[0248]不良事件(ae)、生命体征、ecg参数和临床实验室数据将使用描述性统计进行列出和总结。[0249]将概述每个剂量中出现任何ae的受试者人数(和百分比)。所有ae将按照系统器官分类(soc)和使用药事管理的医学辞典(medicaldictionaryforregulatoryactivities)(meddra)分配给事件的首选术语(pt)列出。此外，这些事件将以最大强度进行概述。还将概述出现药物相关ae的受试者人数。将列出任何导致停药的严重不良事件(sae)和/或不良事件。[0250]-药代动力学参数的统计分析[0251]将按时间点列出和概述血浆浓度。将为每个受试者列出药代动力学参数，并使用描述性统计对每个治疗组进行概述。为了初步评估对于cmax和auc的剂量比例，将计算剂量标准化的血浆cmax、auc0-t和auc0-inf并对其进行描述性地概述。另外，将以log(pk参数)作为反应变量以及以log(剂量)作为预测因子的功率模型与血浆cmax、auc0-t和auc0-inf的数据进行拟合。该模型中为1的斜率对应于剂量比例。斜率将以其双-侧90％和95％ci进行估算。[0252]-药效学参数的统计分析[0253]将使用描述性统计列出和概述pd参数数据：绝对值以及相对于基线的变化。[0254]对于每个剂量组，将使用每个pd参数相对于血浆浓度的图形表示来研究血浆浓度与pd参数之间的关系。将使用pk和相关pd群体的交集来研究这种关系。当汇总统计和图形表示表明血浆浓度与pd参数之间的关系时，可以开发适当的统计模型来进一步解释这种关系。[0255]12.2患者特征：[0256]28名稳定型缺血性心力衰竭患者(nyha的1-3)被纳入一项随机双盲安慰剂对照研究。患者特征还包括2型糖尿病、既往心肌梗死事件、心房颤动、动脉高血压、经皮介入和/或冠状动脉旁路手术。左心室射血分数在31％与56％之间的范围内。[0257]根据医生的判断，患者接受了共存病的背景治疗，并根据其个人hf情况进行了稳定治疗。大多数患者接受双重/三重疗法(β受体阻滞剂联合ace抑制剂或血管紧张素受体阻滞剂和盐皮质激素拮抗剂)。2名安慰剂和2名真正患者有双心室起搏器；3名真正患者有植入的心律转复除颤器(cardioverterdefibrillator)(icd)。[0258]12.3初步结果：[0259]药代动力学(pk)特征谱[0260]人中的cdr132lpk特征谱已确认安全性特征谱，无蓄积迹象。证实了pk特征谱和从猪到人的可译性。cmax和auc的高水平剂量线性允许预测其它剂量(例如5mg/kg)的pk参数。根据ib期研究的初步结果，临床研究ii期的起始剂量建议在3与10mg/kg之间，随后维持剂量约在3与5mg/kg之间。[0261]目标参与[0262]真正患者的循环mir-132水平显著且呈剂量依赖性降低，并随着时间的推移保持低水平(直至第112天的研究终点)。[0263]ecg结果[0264]大多数真正患者在筛查时具有正常的ecg。其中许多在cdr132l治疗下表现出正常化或显著的剂量依赖性改善(例如，t波的正常化；qrs狭窄或者不存在左束支传导阻滞(lbbb)和/或右束支传导阻滞(rbbb)；r进展的正常化)。在cdr132l治疗下，无一例ecg相较于基线恶化。根据qt和qtc数据，未发现诱发心律失常的迹象。[0265]药效学(pd)参数[0266]在大多数接受治疗的患者中发现对射血分数(ef)有积极影响。nt-probnp作为心脏安全标志物未受到cdr132l治疗的不利影响。与基线相比，最高剂量组(10mg/kg)的患者在第28天和第122天的nt-probnp水平显著下降。利用cdr132l的2x治疗(剂量为1-10mg/kg)导致在所有患者中》50％的患者的ef改善和/或nt-probnp值降低。在ef》45％的患者中，发现左心室舒张的重要标志物等容舒张时间(ivrt)减少，这表明舒张功能障碍患者受益。[0267]生物标志物[0268]心脏纤维化生物标志物i型前胶原蛋白c端前肽(picp)和半乳糖凝集素-3(gal-3)在cdr132l治疗的hf患者中显示水平降低，表明具有抗纤维化作用。另外，纤维化生物标志物基质金属蛋白酶1(mmp-1)与mir-132的循环水平呈正相关，并且在较高剂量组(队列3和4)的患者中降低。在研究终点，在队列4中基质金属蛋白酶-1水平低于检测极限。[0269]安全性和耐受性[0270]未发现严重不良事件(sae)。在生化和血液学参数、生命体征和ecg中未发现病理效应或安全性信号：[0271]12.4结论：[0272]cdr132l被人心力衰竭患者良好地耐受，并且在剂量高达10mg/kg时未显示出任何毒性迹象。[0273]实施例13-通过定量血浆中的循环mir-132-3p来监测cdr132l疗法[0274]本研究的目的是评估血浆中mir-132-3p的水平，作为监测cdr132l疗法的生物标志物。[0275]测量了来自安慰剂-对照的心肌梗死(mi)诱发的心力衰竭(hf)的猪模型的血浆样品中的循环mir-132-3p(图21)。动物经历mi接受不同的cdr132l治疗方案，包括在第3天和第1个月的两次应用(冠状动脉内/静脉内(iciv)对比静脉内/静脉内(iviv))和三个剂量水平的cdr132l(低：1mg/kg，中：5mg/kg或高：10mg/kg)。[0276]这项研究伴随着连续的血液取样，直至第2个月。在来自终点的血浆样品中，使用针对mir-132-3p的taqman探针，通过定量实时pcr(qrt-pcr)监测mir-132-3p的循环水平。将数据以rna提取过程中加入的合成微小rna(cel-mir-39)加标作标准化。[0277]利用cdr132l的治疗导致靶器官、心脏中药物物质的剂量依赖性增加，以及血浆样品中功能性mir-132-3p的显著降低。图22显示了所有纳入动物(iviv和iciv)的心脏组织(lvmi远端区域)中cdr132l浓度与mir-132-3p的循环水平(以cel-mir-39作标准化的)的相关性分析。数据是单个动物的平均值±sem。p值由非参数双尾mann-whitneyu检验评估(左图)。通过皮尔逊积矩相关和斯皮尔曼等级相关(右图)进行关联。因此，循环mir-132-3p与接受治疗的动物心脏组织中cdr132l的浓度密切相关。这些数据表明，循环mir-132-3p是心脏组织中cdr132l存在的指示性标志物。[0278]我们进一步评估了其它已建立的生物标志物是否指示心脏组织中存在cdr132l。众所周知，n末端b型脑钠肽前体(nt-probnp)是心脏应激的标志物，其与心力衰竭的严重程度相关。与mir-132-3p水平一致，[0279]图23显示了所有纳入动物(iviv和iciv)心脏组织(lvmi远端区域)中cdr132l浓度与血浆nt-probnp(n末端b型脑钠肽前体)水平的相关性分析。数据是单个动物的平均值±sem。p值由非-参数双尾mann-whitneyu检验评估(左图)。通过皮尔逊积矩相关和斯皮尔曼等级相关(右图)进行关联。在经cdr132l治疗的动物的血浆中观察到nt-probnp减少(图23)。然而，剂量依赖性不太明显，与心脏cdr132l的相关性不太显著。[0280]除了血浆中循环mir-132与心脏中的cdr132l之间的关系之外，我们评估了该药物物质是否高效抑制其靶微小rnamir-132-3p。心脏组织(lvmi远端区域)中功能性mir-132-3p水平显著降低，且剂量越高，这种降低越强。[0281]图24显示了所有纳入动物(iviv和iciv)心脏组织(lvmi远端区域)中功能性mir-132-3p水平与以cel-mir-39作标准化的该微小rna循环水平的相关性分析。数据是单个动物的平均值±sem。p值由非-参数双尾mann-whitneyu检验评估(左图)。通过皮尔逊积矩相关和斯皮尔曼等级相关(右图)进行关联。血浆和心脏mir-132-3p的相关性未揭示了两个参数之间的显著负相关，表明mir-132-3p水平的血浆水平指示cdr132l对其靶mir-132-3p的活性。[0282]研究表明，cdr132l治疗改善mi后的心脏功能。因此，我们测试了这种功能改善，即mi后第3天与第2个月之间相比的左心室射血分数(ef)的变化(δef)是否与循环mir-132-3p一致。观察到两个参数显著负相关，表明循环mir-132-3p水平指示心脏功能的改善。[0283]图25显示了所有纳入动物(iviv和iciv)的δef(从第3天至第2个月ef的改善)与该微小rna循环水平(以cel-mir-39作标准化的)的相关性分析。数据是单个动物的平均值±sem。p值由非参数双-尾mann-whitneyu检验评估(左图)。通过皮尔逊积矩相关和斯皮尔曼等级相关(右图)进行关联。[0284]所述负相关和功能改善与心脏应激标志物nt-probnp之间的相关性一样强。[0285]图26显示了所有纳入动物(iviv和iciv)的nt-probnp血浆水平与δef(从第3天至第2个月ef的改善)的相关性分析。数据是单个动物的平均值±sem。p值由非参数双尾mann-whitneyu检验评估(左图)。通过皮尔逊积矩相关和斯皮尔曼等级相关(右图)进行关联。[0286]另外，低水平的循环nt-probnp以线性方式对应于低水平的循环mir-132-3p。[0287]图27显示了所有纳入动物(iviv和iciv)的nt-probnp血浆水平与mir-132-3p的循环水平(以cel-mir-39作标准化的)的相关性分析。数据是单个动物的平均值±sem。p值由非参数双尾mann-whitneyu检验评估(左图)。通过皮尔逊积矩相关和斯皮尔曼等级相关(右图)进行关联。[0288]实施例14–亚急性心力衰竭中的cdr132l[0289]14.1研究目的：在mi后-亚急性心力衰竭(hf)猪模型中测试cdr132l的疗效[0290]14.2研究大纲：[0291]·心肌梗死后hf模型，135只动物随访56天[0292]·体重增长缓慢的家猪(“曼加利卡品种(mangalicabreed)”)[0293]·安慰剂对照和3个剂量组[0294]1、5、10mg/kgb.w.，在第3天和第28天治疗两次(图28)。[0295]·冠状动脉内/静脉内[0296](ic/iv)与静脉注射/静脉注射(iv/iv)施用的比较。[0297]·考虑用于数据分析的动物：79只动物。[0298]14.3结果：[0299]射血分数变化δef(第56天的ef–第3天的ef)[0300]nb：纳入标准，第3天的ef《40％[0301]在中剂量和高剂量iv/iv和ic/iv组中，发现mi后第3天至第56天的ef有显著变化(δef)，表明功能得到改善(图29)。[0302]循环nt-probnp与δef(第56天-第3天)的相关性[0303]在第56天，中剂量组和高剂量组中nt-probnp的mi后hf相关增加被逆转。低水平的循环nt-probnp浓度与通过增加的δef指示的心脏功能的改善相符。nt-probnp作为用于指示靶标参与的潜在生物标志物(参考实施例13)。[0304]lvmi远端区域中终点(第56天)时的纤维化(％)[0305]nb：纳入标准，第3天的ef《40％[0306]发现中剂量组和高剂量组中纤维化发展的显著变化有助于功能改善(图30)。[0307]治疗反应(第56天)[0308]nb：纳入标准，第3天的ef《40％[0309]反应者分析揭示了ef改善的剂量依赖性反应。85.7％的iviv高剂量组显示》7％的δef，而所有安慰剂动物中只有4.6％显示》7％的恢复(图31)。[0310]14.4结论：[0311]基于临床相关和公认的mi后hf大动物模型中的金标准心脏mri测量的cdr132l有效改善心脏功能。观察到心脏功能改善的线性剂量关系。与第3天(经安慰剂校正的)相比时，iviv高剂量组显示第56天的ef增加了10.38％。cdr132l的已证实的疗效具有高临床相关性(相比之下，心脏细胞移植最多增加3-4％的ef)。[0312]实施例15–用于治疗慢性心力衰竭的cdr132l[0313]15.1研究目的：在mi后慢性心力衰竭(hf)猪模型中测试cdr132l的疗效[0314]15.2研究大纲：[0315]在慢性mi后心力衰竭(hf)猪模型中验证cdr132l的疗效[0316]·6个月随访的mi后hf慢性模型(图32)[0317]·体重增长缓慢的家猪(“曼加利卡品种”)[0318]·三个治疗臂：[0319]每月5x安慰剂[0320]每月5xcdr132l[0321]每月3xcdr132l[0322]·剂量：5mg/kg[0323]·施用途径：iv[0324]·考虑用于数据分析的动物：29只动物。[0325]15.3.结果：[0326]射血分数(ef)[0327]nb：纳入标准，第1个月的ef《40％[0328]与安慰剂相比，在所有治疗组中发现mi后第1个月至第6个月的ef变化均显著》7％(图33)。[0329]反应者分析[0330]nb：纳入标准，第1个月的ef《40％[0331]观察到治疗量与ef改善(δefm6-m1)之间有很强的相关性(图33)。87.5％的5x治疗组显示》7％的δef，而11只安慰剂动物中只有2只显示》3％的恢复。[0332]6个月后cdr132l和mir-132-3p的水平[0333]nb：纳入标准，第1个月的ef《40％[0334]观察到剂量依赖性cdr132l心脏组织分布(lvmi远端区域)。cdr132l组织浓度与mir-132-3p的低功能水平相符(图34)。[0335]左心室收缩末期容积(lvesv)[0336]与安慰剂组相比，cdr132l治疗在6个月的随访期内显示出对不良左心室重构的有益效果，并显著减轻了mi后lvesv的扩大。[0337]左心房(la)[0338]如通过成像所评估的，经cdr132l治疗后，mi后慢性心房重构减少。与安慰剂相比，两个治疗组的la容积和la指数(以体表面积作标准化的la容积)均显著降低。[0339]收缩功能和收缩性[0340]mi后衰竭心脏的收缩功能和收缩性通过cdr132l治疗得到显著改善，通过在6个月终点时的有创血液动力学测量进行评估。对负荷无关参数的分析提示了显然转化为更好的整体收缩功能的心肌收缩性的cdr132l治疗依赖性改善(收缩末期压力-容积关系和前负荷补充搏功(preloadrecruitablestrokework))。[0341]舒张功能[0342]通过cdr321l治疗，整体舒张压参数(最小心室压力变化率)和负荷无关参数edpvr(舒张末期压力容积关系)(心脏硬度和容量的敏感性标志物)均得到改善。[0343]15.4结论：[0344]在猪慢性心力衰竭模型中，cdr132l强烈改善心脏功能。在接受cdr132l(经安慰剂校正的)5个月治疗的动物中，显示了第6个月的ef增加了7.14％。87.5％的动物对治疗有反应，ef改善超过7％。未观察到与治疗相关的不良事件或血液学或实验室化学的变化。cdr132l作为慢性心力衰竭的治疗选择，其已证实的疗效在临床上具有高度相关性。[0345]另外，每月给予的cdr132l治疗在慢性mi后心力衰竭模型中有效地改善重构、收缩功能(例如心脏收缩性)和舒张功能(例如心脏舒张性)。[0346]实施例16–药代动力学研究[0347]为了进一步评估cdr132l的治疗潜力，我们设计了大型动物药代动力学(pk)研究，以评估我们的化合物在猪体内的组织暴露和在靶组织中的分布。静脉内(iv)施用是临床上优选的应用途径，然而许多新型治疗方法依赖于替代施用途径，诸如冠状动脉内(ic)灌注，这在心脏基因治疗研究中是常见的。我们发现对于cdr132l的iv和ic施用，心脏组织样品中的剂量依赖性组织暴露相当(图16a、图16b)。与未治疗的对照动物相比，靶mir-132水平的倒数剂量依赖性降低证实了cdr132l活性。心脏抗mir-132浓度与功能性mir-132水平之间有与施用途径无关的很强的反向相关性(图36c)。据计算，该化合物在心脏组织中的半衰期约为3周(图36d)，并且对于血浆，发现具有快速α相和长β相的化合物的双相消除(图36e)。[0348]参考资料[0349]1.barry，s.p.；townsend，p.a.(2010).whatcausesabrokenheart-molecularinsightsintoheartfailure.lntrevcellmolbiol284，113-179.[0350]2.datta，s.r.；brunet，a.；greenberg，m.e.(1999).cellularsurvival：aplayinthreeakts.genesdev.13，2905-2927.[0351]3.debosch，b.j.；muslin，a.j.(2008).insulinsignalingpathwaysandcardiacgrowth.jmolcellcardiol.44，855-864.[0352]4.frescas，d.；valenti，l.；accili，d.(2005).nucleartrappingoftheforkheadtranscriptionfactorfoxo1viasirt1-dependentdeacety1ationpromotesexpressionofglucogeneticgenes.jbiolchem.280，20589-20595.[0353]5.glas，d.j.(2010).pi3kinaseregulationofskeletalmusclehypertrophyandatrophy.currtopmicrobiolimmunol.346，267-278.[0354]6.gottlieb，r.a.；gustafsson，a.b.(2011).mitochondrialturnoverintheheart.biochimbiophysacta.1813，1295-1301.[0355]7.kolk，m.v.；meyberg，d.；denset.；tang-quam，k.r.；robbinsr.c.；reichenspurner，h.；schrepfer.s(2009)，j.visexp.32，pii：1438.doi：103791/1438[0356]8.mcmullen，j.r.；shioi，t.；huang，w.y.；zhang，l.；tarnavski，o.；bisping，e.；schinke，m.；kong，s.；sherwood，m.c.；brown，j.etal.(2004).theinsulin-likegrowthfactor1receptorinducesphysiologicalheartgrowthviathephosphoinositide3-kinase(p110alpha)pathway.jbiolchem.279，4782-4793.[0357]9.ni，y.g.；berenji，k.；wang，n.；oh，m.；sachan，n.；dey，a.；cheng，j.；lu，g.；morris，d.j.；castrillon，d.h.etal.(2006).foxotranscriptionfactorsbluntcardiachypertrophybyinhibitingcalcineurinsignaling.circulation.174.1159-1168.[0358]10.ronnebaum，s.m.；patterson，c.(2010).thefoxofamilyincardiacfunctionanddysfunction.annurevphysiol.72，81-94.[0359]11.skurk，c.；lzumiya，y.；maatz，h.；razeghi，p.；shiojima，l.；sandri，m.；sato，k.；zeng，l.；schiekofer，s.；pimentel，d.etal.(2005).thefoxo3atranscriptionfactorregulatescardiacmyocytesizedownstreamofaktsignaling.jbiolchem.280，20814-23.[0360]12.ucar，a.etal.(2012)，nat.commun.3∶1078.doi：10.1038/ncomms2009.[0361]13.grech，e.d.&ramsdale，d.r.(2003)，bmj326：1259-61.[0362]14.ponikoskwi，p.etal.(2016)，eur.heartj.37：2129-2200.当前第1页12当前第1页12
背景技术：
：：4.已证明微小rna在不利的心脏重构中起着关键作用。wo2013/034653描述了mir-132和/或mir-212可以诱导心脏肥大，从而构成心力衰竭治疗的潜在治疗靶点。5.wo2016/042561描述了通过向受试者施用治疗有效量的多核苷酸剂来治疗脂质相关病症的方法，所述多核苷酸剂与人mir-132的核苷酸序列基本互补。技术实现要素：6.本发明人已经鉴定了新型寡核苷酸类似物，其为心肌细胞中mir-132表达的有效抑制剂。寡核苷酸类似物，以下称为cdr132l，是由dna和lna构件(buildingblock)组成的混合物，具有核苷间硫代磷酸酯键联。7.用cdr132l在小鼠和猪中进行临床前药理学研究。在心脏肥大的转基因小鼠模型中，cdr132l导致与mir-132表达减少相关的心脏重构逆转。在mi后心力衰竭的小鼠模型中，发现cdr132l治疗减少mi后左心室功能障碍和心脏收缩功能的负荷无关参数。另外，施用cdr132l导致心脏功能的改善，并减少mir-132的表达、心脏应激信号传导和mi后肥大。8.在mi后心力衰竭的猪模型中，发现cdr132l治疗可避免适应不良的重构并改善左心室功能。另外，cdr132l使病理性心力衰竭标志物(诸如bnp、anp)的组织表达正常化，并提供肌球蛋白重变亚型(myh7/6比率)的转变。在mi后心力衰竭的猪模型中，发现cdr132l可治疗亚急性和慢性心力衰竭。9.cdr132l在人肝细胞系和分离的新生大鼠心肌细胞中也没有显著的毒性。通过在大鼠和小型猪中进行的体内毒性研究，发现活性剂即使在分别为20和40mg/kg的高剂量下也能被很好地耐受。10.对健康大鼠和健康猪静脉内或皮下注射cdr132l的药代动力学研究证实了cdr132l组织水平的剂量依赖性。11.另外，已显示与具有相同核苷酸序列但lna构件分布不同的其它寡核苷酸类似物相比，cdr132l表现出更好的效果。12.在另一项研究中，本发明人在心肌梗死的体内小鼠模型和肝纤维化和肺纤维化的体外模型中鉴定了寡核苷酸类似物cdr132l的抗纤维化治疗效果。13.此外，还发现循环体液中mir-132的量与cdr132l的治疗效果之间存在显著关系。因此，体液中mir-132的量是用于治疗监测的相关生物标志物。14.基于上述结果，已经开发了用于向患有慢性心力衰竭的人患者施用cdr132l的临床ib期研究方案。这项ib期临床研究与此同时已成功完成。15.因此，寡核苷酸cdr132l可用作药剂中的活性剂，特别是用于预防或治疗心脏病症和/或纤维化病症。16.因此，本发明的第一方面提供了一种寡核苷酸类似物，其包含式i的序列：17.5'-atggctgtagactgtt-3'18.其中a、t、g和c是脱氧核糖核苷酸构件，并且19.其中至少一个g或t构件是桥连的核苷酸构件。这种寡核苷酸特别适用于预防和/或治疗人受试者的病症，更特别地是心脏病症。20.在特定实施方案中，寡核苷酸包含或具有式ii的序列：21.5'-a tg gc tg ta gactg t t-3'22.其中a、t、g和c是脱氧核糖核苷酸构件，并且23.其中 g和 t是桥连的核苷酸构件和/或吗啉代核苷酸构件，特别是其中 g和 t是lna构件。这种寡核苷酸特别适用于预防或治疗人受试者的病症，更特别是心脏病症或纤维化病症。24.式i或式ii的寡核苷酸类似物可以包含至少一个经修饰的核苷间键联，例如被稳定化而抗核酸酶消化的核苷间键联，例如硫代磷酸酯或磷酸二酰胺酯键联。在具体实施方案中，所有的核苷间键联都是经修饰的键联，特别是硫代磷酸酯键联。25.在更具体的实施方案中，本发明涉及如本文所述的寡核苷酸cdr132l。26.寡核苷酸cdr132l具有式iii的序列：27.5'-da* t*dg* g*dc* t*dg* t*da* g*da*dc*dt*dg* t* t-3'28.其中da为2'脱氧腺苷，dg为2'脱氧鸟苷，dc为2'脱氧胞苷，t为胸苷，29.其中 t是lna-t构件， g是lna-g构件，并且其中*是硫代磷酸酯键联。这种寡核苷酸特别适用于预防或治疗人受试者的疾病，更特别是心脏或纤维化病症。30.本发明的又一方面涉及药物组合物，其包含作为活性剂的寡核苷酸类似物和药学上可接受的载体，所述寡核苷酸类似物包含式i、式ii或式iii的序列，所述药物组合物特别地用于预防或治疗人受试者的疾病，更特别地心脏或纤维化病症。31.如上所述，包含式i、式ii或式iii序列的寡核苷酸类似物适用于医学用途。32.在某些实施方案中，医学用途涉及用于治疗或预防与mir-132的病理表达相关、伴随和/或由其引起的病症的用途。在某些实施方案中，医学用途涉及治疗或预防心脏病症，特别是心脏肥大相关病症。在某些实施方案中，医学用途涉及治疗纤维化病症，例如与病理性纤维化相关、伴随和/或由其引起的病症，特别是心脏纤维化病症、肺纤维化病症或肝纤维化病症。33.式i、式ii或式iii的寡核苷酸可由脱氧核糖核苷酸dna构件和桥连的核苷酸构件组成。“桥连的核苷酸”是指经修饰的核糖核苷酸，其中核糖部分包含连接2'-碳原子和4'-碳原子的两个或三个原子的桥。例如，桥可包括结构2'-o-ch2-4'、2'-o-ch2-ch2-4'、2'-o-ch(ch3)-4'或其中o被s或nh替代的相应结构。在特定的实施方案中，至少一个桥连的核苷酸构件是具有2'-o-ch2-4'-桥的锁核酸(lna)构件。34.式i、式ii或式iii的寡核苷酸具有至少16个构件的长度，例如16至20个构件的长度。在特定的实施方案中，式i、式ii或式iii的寡核苷酸具有16个构件的长度。35.在一些实施方案中，式i、式ii或式iii的寡核苷酸包含5至10个，例如6至8个，特别是7个桥连的核苷酸构件，例如lna构件。36.在一些实施方案中，式i、式ii或式iii的寡核苷酸是裸寡核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸可与至少一个异源部分缀合，所述异源部分例如是不促进寡核苷酸与mir-132结合的部分。所述异源部分可以是增加靶向性和/或细胞摄取的部分，例如脂质部分诸如胆固醇或脂肪酸，糖或氨基糖部分诸如含n-半乳糖胺的部分，肽或多肽部分或核苷或核苷酸部分诸如适体。异源部分可通过共价键或间隔子与寡核苷酸类似物的5'和/或3'-末端缀合。37.本发明的寡核苷酸适用于包括人药和兽药在内的药物。在某些实施方案中，所述化合物可用于预防或治疗与mir-132的病理表达例如过表达相关、伴随和/或由所述病理表达引起的病症。发现所述化合物的施用在体外和体内显著减少mir-132的表达。38.在一些实施方案中，可向与健康受试者相比显示mir-132过表达的患者施用所述化合物。在一些实施方案中，可向与健康受试者相比未显示mir-132过表达但仍然需要降低mir-132水平的患者施用所述化合物。39.在本发明的上下文中，术语“预防”涉及向已知患某种疾病的风险增加的患者施用所述化合物。在本发明的上下文中，术语“治疗”涉及对已经出现某种病症的体征和/或症状的患者施用所述化合物。术语“患者”涉及在人或兽医学领域中需要施用本发明化合物的受试者。在特定实施方案中，患者是人患者。40.在某些实施方案中，本发明的化合物可用于预防或治疗心脏病症，特别是心脏肥大相关病症。例如，所述化合物可用于预防或治疗收缩功能障碍、心脏代偿失调、心力衰竭，或用于预防或治疗心肌梗死、心肌炎、瓣膜性心脏病诸如主动脉狭窄或二尖瓣关闭不全、伴有心脏肥大的遗传性心脏疾病例如肥厚型非梗阻性和梗阻性心肌病或法布里病后的心脏重构。另外，所述化合物可用于预防或治疗心脏纤维化。41.所述化合物可用于向选自以下的患者施用：42.(i)患心力衰竭的风险增加的患者，43.(ii)患有(充血性)心力衰竭的患者，例如心力衰竭进展风险增加的患者，44.(iii)心肌梗死后患者和/或45.(iv)患有与心脏肥大相关的先天性心脏病，诸如主动脉和/或肺静脉狭窄、心房或心室间隔缺损的患者。46.在某些实施方案中，化合物，特别是cdr132l，可用于向患有急性心力衰竭的人患者、患有亚急性心力衰竭的人患者或患有慢性和/或恶化的慢性心力衰竭的人患者施用。47.在某些实施方案中，所述化合物，特别是cdr132l，可用于向患有稳定型心力衰竭，例如非缺血性和/或缺血性来源的稳定型心力衰竭的人患者施用。48.在某些实施方案中，所述化合物，特别是cdr132l，可用于向患有非缺血性和/或缺血性心力衰竭的人患者施用。49.在某些实施方案中，所述化合物，特别是cdr132l，可用于向患有较晚期心力衰竭的人患者或患有晚期心力衰竭的人患者施用。50.在某些实施方案中，所述化合物，特别是cdr132l用于向患有根据纽约州心脏协会(nyha)分类的心力衰竭i期、ii期、iii期和/或iv期的人患者施用，例如患有根据nyha的i期和/或ii期的心力衰竭的患者、患有根据nyha的i期、ii期和/或iii期的心力衰竭的患者或患有根据nyha的iii和/或iv期的心力衰竭的患者。51.在某些实施方案中，所述化合物，特别是cdr132l，可用于向患有心力衰竭并具有植入泵，例如左心室辅助装置(lvad)的人患者施用。52.在特定实施方案中，所述化合物可用于预防和/或治疗包括收缩性心力衰竭、舒张性心力衰竭在内的左侧心力衰竭和与收缩性心力衰竭和/或舒张性心力衰竭相关的疾患。53.收缩性心力衰竭是一种与降低的射血分数，尤其是与40％或更低的射血分数相关的心力衰竭，其中左心室失去其正常收缩的能力。在收缩性心力衰竭的治疗中施用本发明的化合物可以导致射血分数的稳定、增加和/或正常化。本发明的化合物适用于向有发展收缩功能病症风险的患者，例如患有高血压或冠状动脉阻塞的患者施用。54.舒张性心力衰竭是一种与伴有或不伴有充盈压增加的左心室舒张功能受损相关的心力衰竭。在许多情况下，舒张性心力衰竭与保留射血分数(preservedejectionfraction)相关。在舒张性心力衰竭的治疗中施用本发明的化合物可导致左心室舒张的稳定、改善和/或正常化。本发明的化合物适用于向有发展舒张功能障碍风险的患者，例如患有高血压、高脂血症、糖尿病、阻塞性睡眠呼吸暂停、心脏储备疾病、遗传性心力衰竭(例如titin或其它结构基因中的突变)的患者施用。55.在另外的具体实施方案中，所述化合物可用于预防和/或治疗右侧心力衰竭，特别是由左侧心力衰竭引起的右侧心力衰竭。56.在某些实施方案中，本发明的化合物可用于预防或治疗纤维化病症，特别是与病理性纤维化相关、伴随和/或由病理性纤维化引起的病症。57.病理性纤维化是器官或组织中特别是与病理状态相关、伴随和/或由病理状态引起的过量纤维结缔组织的形成。病理性纤维化可发生在体内许多不同的器官和组织中，通常由炎症或损伤引起。58.在特定实施方案中，所述纤维化是心脏纤维化，例如涉及心脏中的病理性纤维化的病症。心脏纤维化的示例性类型包括心房纤维化、心内膜心肌纤维化或由先前心肌梗死引起的纤维化。59.在另外的实施方案中，纤维化是肺纤维化，例如涉及肺中的病理性纤维化的疾患。示例性肺纤维化类型包括由职业或环境因素，例如暴露于毒素和污染物，诸如二氧化硅粉尘、石棉纤维、金属粉尘、煤尘、谷物粉尘、鸟类和动物粪便，引起的纤维化病症。其它类型的肺纤维化病症是由放射治疗和/或利用诸如化学治疗药物、心脏药物、抗生素或抗炎药物等药物的治疗引起的。还有其它类型的肺纤维化病症是由包括特发性肺纤维化、皮炎、多发性肌炎、混合结缔组织病、自身免疫性疾病诸如类风湿性关节炎、硬皮病、sjogren综合征或系统性红斑狼疮、结节病、肺炎、病毒感染或胃食管反流病(gerd)在内的病症引起的。60.在另外的实施方案中，纤维化可以是肝纤维化，例如涉及肝脏中的病理性纤维化的疾患。肝纤维化的示例性类型是由病毒感染(例如由乙型和/或丙型肝炎病毒)、遗传代谢病症、自身免疫性肝炎、胆道梗阻、铁超载、非酒精性脂肪性肝病，包括非-酒精性脂肪肝(nafl)和非酒精性脂肪性肝炎(nash)以及酒精性肝病引起的。61.在又一另外的实施方案中，纤维化也可以是血管纤维化，例如动脉硬化，皮肤纤维化，例如瘢痕疙瘩形成或肾源性系统性纤维化，关节纤维化(arthrofibrosis)、一些形式的粘连性囊炎、软组织纤维化(诸如纵隔纤维化或腹膜后纤维化)或骨髓纤维化，诸例如脊髓纤维化(myelofibrosis)。62.在某些实施方案中，本发明包括在施用本发明的化合物之前、期间和/或之后测定待治疗的受试者中某些生理参数的量和/或活性。该伴随诊断程序可为上述医疗用途提供帮助。例如，所述诊断程序可以在风险评估、患者分层、疗程监测和/或治疗后控制方面提供帮助。63.在某些实施方案中，本发明包括在施用本发明化合物之前、期间和/或之后测定待治疗的受试者中mir-132的量和/或活性。在另外的实施方案中，本发明包括测定至少一种特别地选自心脏标志物和/或纤维化标志物的标志物的量和/或活性。在某些实施方案中，本发明包括测定心脏标志物的量和/或活性，所述心脏标志物是诸如bnp(例如nt-probnp)、anp或肌球蛋白重变亚型(例如myh7/6比率)，和/或foxo3和/或serca2的水平。在特定的实施方案中，本发明包括测定nt-probnp的量。在又一另外的实施方案中，本发明包括测定纤维化标志物的量和/或活性，所述标志物是诸如胶原蛋白，例如胶原蛋白沉积和/或纤维化标志物基因诸如-但不限于-胶原蛋白1a1、胶原蛋白1a2、胶原蛋白3a1、i型前胶原蛋白c端前肽(picp)和/或半乳糖凝集素-3(gal-3)，和/或基质金属蛋白酶(金属蛋白酶)诸如基质金属蛋白酶1(mmp-1)和/或基质金属蛋白酶2(mmp-2)的表达。64.上述参数的测定可以在诸如血液、血浆或血清等的体液样品中或组织样品中根据已知方法在核酸和/或蛋白质水平上进行，并且可以提供有用的诊断信息，例如关于疾病进程和/或疗程和/或治疗成功的信息。65.另外，本发明人通过基于pcr的检测方法发现，心脏组织中mir132的量显示与循环体液例如全血、血浆或血清中mir132的量呈正相关。因此，体液样品例如全血、血浆或血清样品中的mir132的量的测量提供了靶组织中，特别是心脏组织中mir132的量的指示。66.在某些实施方案中，本发明包括了在治疗过程中测定待治疗的受试者(例如，人受试者)中mir-132的量和/或活性。本说明书中的术语“治疗过程”应理解为在一定时间段内，例如至少一天、至少一周、至少两周或至少一个月的时间段内，向有需要的受试者，特别是人受试者施用本发明的化合物，特别是施用cdr132l。这种测定可以在治疗过程中进行一次或几次。在特定实施方案中，定量测定来自体液的样品中，例如来自循环体液的样品诸如血液、血浆或血清样品的样品中的mir-132的量。特别地，样品是血浆样品。mir-132的量和/或活性与化合物在预期靶器官，特别是心脏中的浓度成反相关或负相关，但也与其活性和/或疗效成反相关或负相关。因此，所述测定允许调整待施用的剂量和/或调整单个剂量之间的间隔。另外，所述测定允许根据患者的治疗反应对患者进行分层，例如，区分有反应者与无反应者。特别地，在治疗过程中，对患有慢性疾病的患者，例如患有慢性心脏病的患者进行数次测定。例如，可以以每周、两周和/或每月的间隔进行测定。67.在某些实施方案中，本发明包括在治疗过程中测定ecg参数的变化。与心力衰竭患者相关的ecg参数包括但不限于qrs、t波、左束支传导阻滞(lbbb)和/或右束支传导阻滞(rbbb)的测量；和/或r进展。特别相关的是qrs测量。68.根据本发明的另外方面，寡核苷酸可以以基于需求的方案施用，例如通过根据体液样品中mir132的测量量调整剂量和/或单个剂量之间的时间间隔。例如，如果发现体液样品中mir132的量高于预定值，则施用新剂量的寡核苷酸。69.因此，本发明涉及用于预防或治疗人受试者的心脏疾病的如上所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸通过基于需求的方案施用，具体包括以下步骤：70.(i)测量用寡核苷酸治疗的受试者的体液样品，例如全血、血清或血浆样品中mir132的量，71.(ii)以根据步骤(i)中mir132的测量量确定的剂量和/或单个剂量之间的时间间隔施用寡核苷酸，特别是其中如果发现体液样品中mir132的量高于预定值(例如基线值)，则施用新剂量的寡核苷酸。72.本发明的化合物可以作为包含药理学上可接受的载体的药物组合物施用。施用可通过已知方法进行，其中将化合物引入待治疗的受试者的所需靶细胞或器官。73.如上所述，所述化合物可以原样或作为与异源部分的缀合物施用。74.对于药物应用，所述组合物可呈溶液形式，例如可注射溶液、乳液、悬浮液等。75.所述组合物可以以任何合适的方式施用，例如肠胃外施用，特别地通过注射诸如皮下、肌内、静脉内或动脉内注射或输注，通过口服或吸入摄入和/或通过皮肤施用，或通过局部施用至靶器官，例如通过冠状动脉内灌注。载体可以是任何合适的药物载体。优选地，使用能够增加寡核苷酸分子进入靶细胞的功效的载体。此类载体的合适实例是脂质体，例如阳离子脂质体，或预先设计的外来体。76.在某些实施方案中，将化合物，特别是cdr132l，通过静脉内注射或通过皮下注射施用。77.根据施用途径和疾病的类型或严重程度，将化合物以药学有效剂量施用。78.在某些实施方案中，将化合物例如通过肠胃外施用，特别地通过注射或输注，例如通过静脉内注射或通过皮下注射，以每次施用约0.1-100mg/kg体重，例如每次施用约0.2-50mg/kg体重，或每次施用约0.8-20mg/kg体重，或每次施用约3-10mg/kg体重的剂量向人受试者施用。79.在药代动力学研究中发现，所述化合物在心脏组织中具有长的半衰期，约为三周，和在血浆中短的双相半衰期。这些结果表明，所述化合物适用于各种不同的治疗方案，例如，适用于包括以少于一周的时间间隔施用的治疗方案和包括以一周或更长的时间间隔施用的治疗方案。80.在某些实施方案中，以选自每天施用一次、每二天施用一次、每三天施用一次和每四天施用一次的方案向人受试者施用寡核苷酸，特别地其中肠胃外施用寡核苷酸，更具体地通过静脉内或皮下注射，例如由患者皮下自我注射施用。81.在这些实施方案中，可以以体重依赖性剂量和/或固定剂量施用寡核苷酸。例如，可以以每次施用0.01mg/kg体重至50mg/kg体重的剂量、以每次施用0.02mg/kg体重至10mg/kg体重的剂量或以每次施用0.05mg/kg体重至5mg/kg体重的剂量施用寡核苷酸。可替代地，可以以每次施用1mg至5000mg的固定剂量、以每次施用2mg至1000mg的固定剂量或以每次施用5mg至500mg的固定剂量施用寡核苷酸。82.在又一另外的实施方案中，以选自每周施用一次、每2周施用一次、每3周施用一次、每4周或每月施用一次、每六周施用一次、每二个月施用一次、每三个月施用一次、每六个月施用一次和每年施用一次的方案向人受试者施用寡核苷酸，特别地其中通过肠胃外，更特别地通过静脉内或皮下注射，例如患者的皮下自我注射施用寡核苷酸。83.在这些实施方案中，可以以体重依赖性剂量或固定剂量施用寡核苷酸。例如，可以以每次施用0.01mg/kg体重至50mg/kg体重的剂量、0.05mg/kg体重至20mg/kg体重的剂量或0.1mg/kg体重至10mg/kg体重的剂量施用寡核苷酸。可替代地，可以以每次施用1mg至5000mg的固定剂量、5mg至2000mg的固定剂量或10mg至1000mg的固定剂量施用寡核苷酸。84.在又一另外的实施方案中，可以以起始剂量，例如1或2个起始剂量，以及随后以至少一个不同于所述起始剂量的维持剂量，向人患者施用所述化合物。例如，起始剂量可以高于维持剂量，诸如高至维持剂量的约1.5-3倍，例如约2倍。起始剂量和/或维持剂量可以作为体重依赖性剂量或以固定剂量施用。在具体实施方案中，起始剂量约为3-10mg/kg，维持剂量约为1–7.5mg/kg。另外，可以根据诸如血液、血浆或血清等的体液中mir132的量，例如通过滴定调整维持剂量。85.在人临床ib期研究中，发现在护理标准的基础上逐步增加单次和重复剂量的剂量下，所述化合物在人心力衰竭患者中表现出优异的耐受性和安全性。药代动力学特征谱没有显示出积累和高水平剂量线性的迹象。其在心力衰竭中的独特作用模式在相关药效学参数和靶标参与(targetengagement)中得到证实。没有观察到严重的不良事件和注射部位反应，也没有患者因不良事件退出研究。所述化合物耐受性良好，并且在最高达10mg/kg的剂量下没有显示出任何毒性迹象。86.所述化合物可以作为单一疗法施用或与另一种不同的药物(特别是适用于预防或治疗如上所述的心脏病症或纤维化病症的药物)联合施用。87.适用于预防或治疗心脏病症的其它药物的实例是血管紧张素调节剂、β-阻滞剂、利尿剂、醛固酮拮抗剂、血管扩张剂、正性肌力剂、他汀类药物、脑啡肽酶抑制剂或sglt-2抑制剂或其组合，例如脑啡肽酶抑制剂(例如沙库巴曲)与血管紧张素-ii受体阻断剂(如缬沙坦)的组合。88.在某些实施方案中，将所述化合物与以下物质一起施用：(i)至少一种利尿剂，(ii)至少一种血管紧张素转换酶抑制剂，(iii)至少一种β-阻滞剂，任选的(iv)血管紧张素-ii-受体阻滞剂和/或(v)任选的if-通道抑制剂诸如伊伐布雷定和任选的(vi)血管紧张素-受体-脑啡肽酶抑制剂，和任选的(vii)葡萄糖共转运蛋白2抑制剂诸如恩格列净和达格列净，和/或任选的(viii)干细胞治疗剂和/或任选地(ix)靶向不同通路的抗mirna和/或任选的(x)sglt-2抑制剂。本领域技术人员可以选择合适的抑制剂、干细胞治疗剂和/或靶向不同通路的mi-rna。根据(i)至(x)的化合物和抑制剂可以被独立选择并以任何合适的方式组合。89.适用于预防或治疗纤维化病症的其它药物的实例是用于预防或治疗心脏纤维化的药物，诸如ace抑制剂，例如赖诺普利，血管紧张素ii受体阻滞剂，例如坎地沙坦、氯沙坦或奥美沙坦，醛固酮拮抗剂，例如螺内酯和/或tgfβ抑制剂，例如吡非尼酮或曲尼司特，用于预防或治疗肺纤维化的药物，诸如抗纤维化剂，例如尼达尼布或吡非尼酮，抗炎剂，例如皮质类固醇、硫唑嘌呤、环磷酰胺和霉酚酸酯，抗反流剂，例如蛋白泵抑制剂或h2阻滞剂和/或抗咳嗽剂和用于预防和/或治疗肝纤维化的药物，诸如ace抑制剂，例如贝那普利、赖诺普利或雷米普利，抗病毒剂或pparα-激动剂。90.更进一步，本发明涉及如在此上文所述的本发明化合物用于制备用于预防或治疗心脏病症的药物的用途。91.更进一步，本发明涉及如在此上文所述的本发明化合物用于制备用于预防或治疗纤维化病症的药物的用途。92.更进一步，本发明涉及用于预防或治疗心脏病症的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的至少一种本文所述的化合物。93.更进一步，本发明涉及用于预防或治疗纤维化病症的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的至少一种本文所述的化合物。94.更进一步，本发明涉及用于监测用如上所述的寡核苷酸进行的治疗的药盒，所述监测包括测定施用了寡核苷酸的受试者的mir-132的量和/或活性。所述药盒可包含与mir-132编码dna或与其互补的dna结合的引物(优选引物hsa-mir-132)，与mir-39编码dna或与其互补的dna结合的引物(优选引物cel-mir-39)和任选的阳性对照hsa-mir-132和任选的阳性对照cel-mir-39。根据优选实施方案，将引物hsa-mir-132和mir-39一起使用。另外，所述药盒可包含附加的化合物，例如qpcr预混合物和不含核酸酶的水。在优选实施方案中，所述药盒包含引物hsa-mir-132、引物cel-mir-39、上述阳性对照以及qpcr预混合物和不含核酸酶的水。本领域技术人员可以选择合适的引物。95.另外，将通过以下附图和实施例更详细地描述本发明。具体实施方式96.实施例1-心肌细胞中mir-132表达的沉默97.对衍生自抗mir-132文库的许多结构类似物化合物的mirna抑制活性进行了体外定量测定。通过测定和定量实时pcr对mirna表达的沉默进行定量。98.在通过浓度为10μm的去氧肾上腺素/异丙肾上腺素处理进行的肥大刺激后分离的大鼠心肌细胞中进行该研究。将细胞在标准细胞培养基中孵育48小时。以100nm的浓度单独施用测试化合物。试验以一式三份进行。99.化合物cdr132l(一种具有硫代磷酸酯骨架的lna-dna混合物)被鉴定为来自抗mir-132结构类似物库的最强效的化合物。100.cdr132l的结构如下：101.5'-da* t*dg* g*dc* t*dg* t*da* g*da*dc*dt*dg* t* t-3'102.其中da为2'脱氧腺苷，dg为2'脱氧鸟苷，dc为2'脱氧胞苷，t为胸苷，103.其中 t是lna-t构件， g是lna-g构件，并且其中*是硫代磷酸酯键联。104.实施例2-毒理学谱表征105.2.1研究目的：cdr132l的毒性谱表征106.2.2研究大纲:107.在人肝细胞(hepg2)和分离的新生心肌细胞(nrcm)中进行了体外细胞毒性测定。商业mtt比色测定用于评估细胞毒性。添加单独的化合物后，将细胞在dmem培养基中孵育48小时。将cdr132l(红色)的效果与在0.01-100μm剂量范围内的用作对照(蓝色)的加扰lna寡核苷酸进行比较。治疗剂量范围用灰色标出。108.2.3结果：在治疗剂量范围内，未发现cdr132l对hepg2细胞和nrcm有显著毒性(参见图1a和图1b)。109.实施例3–通过在转基因小鼠模型中施用cdr132l来进行衰竭心脏的左心室逆重构110.3.1研究目的：在心力衰竭小鼠模型中测试cdr132l在逆转心力衰竭方面的疗效。111.3.2研究大纲:112.心脏肥大模型：心脏mir-132过表达的转基因(tg)小鼠(ucar等人2012)。113.治疗：每周20mg/kgip.cdr132l或安慰剂(参见图2a)114.分组：野生型(wt)同窝生幼仔 安慰剂，wt cdr132l，tg 安慰剂，tg cdr132l。n＝6/组。115.通过qpcr检测mir-132的表达水平。统计检验：非配对t检验。(图2b)。116.**p《0.01,n＝6/组。117.3.3结果：118.心脏的代表性超声心动图图像(图3a)。119.cdr132l逆转肥大，如通过心脏质量和舒张末期容积(lvedv)所测量的(图3b)。120.cdr132l改善左心室大部分节段的局部收缩功能(ab，前基底；am，中前壁；aa，前心尖；pa，后心尖；pm，中后壁和pb，后基底(图3c)。121.实施例4-在mi后心力衰竭的小鼠模型中施用cdr132l122.4.1研究目的：在mi后心力衰竭小鼠模型中测试cdr132l的疗效123.4.2研究大纲：124.心肌梗死(mi)小鼠模型：c57bl/6n小鼠中冠状动脉的永久结扎(lad)(kolk等人，2009)。125.组：mi或假手术组，用cdr132l或安慰剂治疗126.治疗：20mg/kgip，于mi后第7天和第14天127.终点：mi后第28天左心室功能。n＝6-7/组。(图4)，128.4.3结果：129.cdr132l治疗改善mi后左心室功能障碍(图5a)。130.心脏收缩收缩功能的负荷无关参数也得到改善(图5b)(*p《0.05)。131.cdr132l治疗还可改善纵向应变速率(lsr)，从而逆转心脏远端区域中个别心脏节段的mi后收缩功能障碍。(*p《0.05)(图6)。132.cdr123l治疗有效地沉默了例如远端(非梗死)区域和梗死周围区域的心脏组织中的mir-132表达(图7a)。133.在组织学水平上，cdr132l减少了mi后心脏远端区域的心肌细胞尺寸(图7b)。134.在组织水平上，cdr132l减少了mi后心脏中的心脏应激信号anp的表达(图7c)。135.实施例5-在mi后心力衰竭的猪模型中测试cdr132l136.5.1研究目的：cdr132l在心肌梗死后临床相关模型中的体内疗效证明。137.5.2研究设置：138.·由90分钟缺血(lad闭塞)和随后再灌注诱发的猪心肌梗死模型。139.·分组：安慰剂或cdr132l，n＝6/组。140.·治疗：2次，在mi后第3天和第28天，分别地冠状动脉内注射0.3mg/kg和静脉内注射0.5mg/kg(图8)。141.·终点：mi后8周。主要结果指标：ef和lv重构。142.5.3结果：143.·如通过舒张末期容积、收缩末期容积、射血分数和左心室功能的测量所确定，cdr132l治疗避免了适应不良的重构并改善了功能(图9a至图9d)。144.·cdr132l治疗改善了对应于存活/远端心肌的节段的节段收缩性；终点心脏mri：n＝6/组，红色区域：p《0.05(图9e)。145.·cdr132l治疗避免了适应不良的重构，并改善了心尖区的lv活力，如通过noga所测定的，终点电解剖映射：n＝6/组，安慰剂对比cdr132l：p《0.05(图10)。146.·cdr132l使病理性心力衰竭标志物anp和bnp的组织表达正常化，并提供肌球蛋白重变亚型的转变，即myh7/6比率(图11)。147.·在组织学水平上，cdr132l治疗有效地减少了远端lv区域中的心肌细胞肥大。lv区域的代表性显微摄影图像(wga/dapi染色20x)(图12a)和图形描绘(图12b)，n＝6/组，安慰剂对比cdr132l：p《0.05。148.实施例6–cdr132l在猪体内的药效学特征谱/靶标参与149.6.1研究设置：150.处理：1x，第0天，0.5mg/kg或5mg/kg冠状动脉内灌注，n＝3头猪/组，安慰剂对比cdr132l：p《0.05。151.·终点(治疗后24小时)的qpcr组织mirna测定。152.6.2结果：153.·单剂量的cdr132l治疗剂量依赖性地抑制心脏mir-132水平(图13)。154.实施例7–器官毒理学表征谱155.7.1研究设置：156.·治疗：2次，im后第3天和第28天，分别地冠状动脉内注射0.3mg/kg和静脉内注射0.5mg/kg。157.·连续血液取样，终点：治疗后72小时，n＝6头猪/组，安慰剂对比cdr132l：p《0.05。158.7.2结果：159.·体内cdr132l治疗不会引起猪中任何器官毒性(图14)。160.对大鼠和小型猪进行了随后重复剂量毒性研究。161.根据在大鼠中进行的为期4周的毒性研究，即在第1天和第28天静脉内推注注射4mg/kg、20mg/kg和100mg/kg的cdr132l，然后进行为期4周的恢复期，大鼠中的“无观测效应水平(noael)”被认为是20mg/kg。这对应于3.23mg/kg体重的人当量剂量。162.根据在小型猪中进行的为期4周的毒性研究，即在第1天和第28天静脉内推注注射4mg/kg、20mg/kg和40mg/kg的cdr132l，然后进行为期4周的恢复期，小型猪的“无观测效应水平”(noel)被认为是40mg/kg。这对应于36.36mg/kg体重的人当量剂量。163.实施例8-心力衰竭小鼠模型中心脏foxo3和serca2mrna的水平164.在通过每周4次腹膜内注射对照加扰寡核苷酸或cdr132l处理的对照和mir-132tg小鼠中，测量心脏foxo3和serca2mrna的水平。所有数值代表平均值±sem。*p《0.05(图15a和图15b)。165.实施例9–不同寡核苷酸的比较166.本研究的目的是使用两种对比寡核苷酸评价根据本发明的新型mir-132-3p抑制剂cdr132l的治疗效果。所述两种对比寡核苷酸显示出与cdr132l相同的寡核苷酸序列和硫代磷酸酯骨架，但分子内的lna构件的分布不同。cdr2u1在5'端和3'端有两个lna构件，而对于cdr301，每个核苷酸都带有lna构件。167.为了测试效率，向新生大鼠心肌细胞(nrcm)施用不同的寡核苷酸。在mir-132-3p及其已知靶基因foxo3(叉头盒o3)的表达发生变化后，通过定量实时pcr(qrt-pcr)监测这种治疗的效果。168.实验设计和结果如图16所示：(a)实验设置概述。将新生大鼠心肌细胞在第0天接种，并在第1天用寡核苷酸cdr132l、cdr2u1或cdr301(各100nm)处理。在终点，收集细胞用于基因表达分析。(b)经cdr132l、cdr2u1或cdr301处理后mir-132-3p的表达水平。(c)经cdr132l、cdr2u1或cdr301处理后mir-132-3p靶基因叉头盒o3(foxo3)的表达水平。数据均为平均值±sd。寡核苷酸对比安慰剂的p值通过双尾学生t检验来确定。169.用cdr132l和cdr301治疗nrcm导致mir-132-3p水平显著降低96％，而cdr2u1使mirna表达降低30％(图16a至图16b)。另外，用cdr132l治疗导致对mir-132-3p靶基因foxo3的显著抑制，这是用cdr2u1和cdr301不能实现的(图16c)。170.总之，我们的数据表明，cdr132l与cdr2u1和cdr301相比的更好的抑制作用表现为mir-132-3p的表达水平显著降低，并且其靶基因foxo3受到显著抑制。171.实施例10–cdr132l在心脏纤维化中的作用172.本研究的目的是在纤维化体内模型中评估cdr132l的抗纤维化治疗效果。173.为了在体内证明抗纤维化活性，使用在c57bl/6n小鼠中通过永久性左前降支冠状动脉(lad)结扎建立的心肌梗死(mi)小鼠模型。在第7天和第14天应用cdr132l治疗，接受安慰剂(cdr132l的加扰寡核苷酸类似物，20mg/kg)和cdr132l(20mg/kg)。各组包括对照组(假手术小鼠)和lad结扎小鼠(mi，心肌梗死)，接受安慰剂或cdr132l：假手术 安慰剂，假手术 cdr132l，mi 安慰剂，mi cdr132l。n＝6-7/组。实验设计如图17所述。图18显示了mi后心力衰竭中cdr132l体内抗纤维化效果的评估。mi后，通过用dr132l治疗，纤维化(显示为通过苦味酸-天狼猩红(psr)染色检测到的胶原蛋白沉积的百分比和相对于β-肌动蛋白的iii型胶原蛋白α1链(col3a1)基因表达)减弱了。各组包括对照组(假手术小鼠)和lad结扎小鼠(mi)，接受安慰剂(黑色柱)或cdr132l(白色柱)：假手术 安慰剂，假手术 cdr132l，mi 安慰剂，mi cdr132l。在用安慰剂或cdr132l治疗的mi小鼠之间进行统计检验(非配对t检验)。**p《0.01，n＝6-7/组。174.根据组织学结果，cdr132l治疗后减弱了纤维化(图18a)。这在分子水平上得到证实，纤维化标志物如iii型胶原蛋白α1链(col3a1)的基因表达降低(图18b)。175.实施例11–cdr1321在肺和肝纤维化中的作用176.在肺和肝纤维化的体外模型中测试了cdr132l的抗纤维化效果。为此，来源于肝(人原代肝成纤维细胞，hplf，pelobiotech)和肺(正常人原代肺成纤维细胞，nhlf，lonza)的人原代成纤维细胞用促纤维化剂刺激并用cdr132l处理。cdrl132l的治疗效果通过遵循纤维化途径中的关键过程来监测，包括增殖速率和终点时纤维化标志物基因表达的改变。另外，mir-132-3p的表达经评估证明是有效的cdr132l治疗。177.为了测定细胞增殖，使用了细胞增殖elisa(酶联免疫吸附测定)试剂盒(由roche提供)。这种比色测定允许基于掺入在增殖细胞新合成的dna中的brdu(溴脱氧尿苷)的测量来定量细胞增殖。已经检测并定量了掺入的brdu的量。吸光度值直接与dna的合成量相关，并因此与相应微量培养物中增殖细胞的数量相关。使用定量实-时pcr(qrt-pcr)测量mir-132-3p和包括胶原蛋白蛋白1a1(col1a1)、胶原蛋白蛋白1a2(col1a2)和基质金属蛋白酶2(mmp2)在内的纤维化标志物的表达水平来评估基因表达。178.图19涉及肝纤维化的体外模型：(a)实验设置概述。将人原代肝成纤维细胞(由pelobiotech提供)在第0天接种，并在第1天用纤维化刺激物(10ng/ml的于正常生长培养基(补充有10％fbs的完全成纤维细胞培养基)中的tgf-β)和cdr132l(100nm)处理。终点时，已经评估了细胞增殖和纤维化标志物的基因表达。(b)用cdr132l处理后的mir-132-3p的表达水平。(c)通过监测dna合成过程中brdu的掺入来评估增殖。终点前20小时，brdu试剂已被添加到培养基中。(d)纤维化标志物基因(胶原蛋白1a1(col1a1)、胶原蛋白1a2(col1a2)和基质金属蛋白酶2(mmp2))的表达水平。在(b)和(d)中，虚线指示未受刺激的对照细胞的表达水平。数据均为平均值±sd。cdr132l对比对照的p值通过双尾学生t检验确定。179.用转化生长因子β(tgf-β)刺激hplf(图19a)导致mir-132-3p的轻微诱导，该诱导被cdr132l处理显著降低(图19b)。另外，该化合物减少了成纤维细胞增殖(图19c)和包括col1a1、col1a2和mmp2在内的纤维化基因表达(图19d)。180.图20涉及肺纤维化的体外模型：(a)实验设置概述。将正常人肺成纤维细胞(由lonza提供)在第0天接种，并在第1天用成纤维细胞生长培养基中的纤维化刺激物(高fbs(5％))和cdr132l(100nm)处理。终点时，已经评估了细胞增殖和基因表达。(b)用cdr132l处理后的mir-132-3p的表达水平。(c)通过监测dna合成过程中brdu的掺入来评估增殖。终点前20小时，brdu试剂已被添加到培养基中。在(b)中，虚线表示未受刺激的对照细胞的表达水平。数据为平均值±sd。cdr132l对比对照的p值通过双尾学生t检验确定。181.在nhlf细胞中，在用高fbs(与2％fbs的正常生长条件相比为5％)进行纤维化刺激后(图20a)，未观察到mir-132-3p的升高(图20b)。然而，用cdr132l处理导致靶向微小rna的显著减少(图20b)和成纤维细胞增殖(图20c)。182.总之，我们的数据表明寡核苷酸类似物cdr132l在肝或肺来源的成纤维细胞以及心脏组织中具有显著的抗纤维化作用。我们假设这种效应可能基于药物的抗增殖能力，和/或基于其对细胞外基质蛋白表达的影响。183.实施例12–人体临床研究的方案和结果184.12.1方案：185.基本原理186.目前现有技术的心力衰竭药物疗法主要局限于不太晚期的疾病阶段(纽约心脏协会i期和ii期；nyhai/ii)。然而，药物不能阻止至晚期(nyha的iii期和iv期)的进展，这与频繁住院和超过70％的1年死亡率相关(13)。作为最后的手段，植入泵(左心室辅助装置，lvad)和最终的心脏移植可能是极少数末期心力衰竭患者唯一的救命选择。187.因此，迫切需要降低死亡率和住院率的新型、高效的疾病中止疗法来为患者提供治愈希望。本发明人的方法提供了革新医疗实践、改善患者护理和降低心力衰竭护理成本的新机会。188.cdr132l的作用模式具有形成其作为心力衰竭下一代药物的基础的以下关键要素：189.a)异常心脏mir-132水平的正常化，190.b)钙信号传导和收缩性以及心脏功能的正常化，191.c)心脏自噬和稳态的改善，以及192.d)适应不良的心脏重构的减弱。193.临床前研究结果表明，cdr132l的安全性特征谱足以随着临床发展而进步。194.因此，本研究计划基于临床相关大型动物研究中证明的显著治疗效果，在稳定型缺血性心力衰竭(nyhai-iii)患者中评估安全性、药代动力学和一些药效学参数。对于本研究，计划采用剂量递增方案。195.主要目标196.·评估一种单一剂量和一种重复剂量的cdr132l在稳定型缺血性心力衰竭(nyha的i期、ii期和iii期)患者中的安全性。197.次要目标198.·表征cdr132l在稳定型缺血性心力衰竭患者中的药代动力学(pk)特征谱。199.探索性目标200.·确定cdr132l对药效学(pd)参数的影响。201.主要终点202.主要终点是如通过以下方法测量的cdr132l的安全性：203.·治疗突发性不良事件(teae)的发生率和严重程度，204.·实验室安全测试(血液学、化学、凝血和尿液分析)有临床显著变化的受试者比例，205.·心电图(ecg)形态和/或节律异常的受试者比例，206.·ecg时间间隔(pr、qrs、qt和qtc间隔)有临床显著变化的受试者比例，207.·生命体征(收缩血压、舒张血压和脉率)发生临床显著变化的受试者比例，208.·心脏(高敏心肌肌钙蛋白t)、肾脏(肌酐)和肝脏(天冬氨酸转氨酶和丙氨酸转氨酶)损害和减充血(n末端b型脑钠肽前209.体)的器官损害标志物出现临床显著变化的受试者比例。210.次要终点211.通过非房室方法导出的pk参数包括最大观察血浆浓度(cmax)、达到最大血浆浓度的时间(tmax)、从时间零点至最后可检测血浆浓度的血浆浓度-时间曲线下面积(auc0-t)、从时间零点外推至无穷大的血浆浓度-时间曲线下面积(auc0-inf)、血液清除率(cl)、终末消除率常数(λz)、终末消除半衰期(t1/2)、分布体积(vdss)。212.探索性终点213.·pd参数包括但不限于以下生物标志物：用于靶向参与的微小rna132(mir-132)、用于减充血的n-末端b型脑钠肽前体(nt-pro-bnp)和作为心脏重构的标志物的嗜中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(ngal)。可能需要附加的参数。214.·鉴定生物标志物，所述生物标志物可以(1)预测对cdr132l治疗的反应，(2)解释药物pk/pd的可变性，(3)预测对药物相互作用的易感性或(4)预测安全问题的发生。这种探索性研究的目的将是更好地理解可能影响cdr132l在人受试者体内药代动力学的内在和外在因素。这将不包括任何患者的基因组(dna)测序。215.研究设计216.这是一项i期、随机、双盲、安慰剂对照研究，旨在评估cdr132l在稳定型缺血性心力衰竭(nyha的i-iii期)患者中的安全性、药代动力学和药效学参数。217.最多将招募28名患者。下面列出了最大队列规模的四个计划队列。这些队列中的每一个队列将最多由7名患者组成。患者将随机接受15分钟的cdr132l或安慰剂的静脉内输注，cdr132l与安慰剂的比例高达5:2。218.·治疗1(n＝高达7)-0.32mg/kgcdr132l；安慰剂219.·治疗2(n＝高达7)-1.00mg/kgcdr132l；安慰剂220.·治疗3(n＝高达7)-3.00mg/kgcdr132l；安慰剂221.·治疗4(n＝最高7)-10.00mg/kgcdr132l；安慰剂。222.患者将在第-1天进入研究前的41天内接受筛查。在进行任何筛选程序之前，每位受试者都将收到口头和书面信息，签署知情同意书(icf)。受试者将在第-1天进入研究单位，第4天出院，第27天再次入院，并在第31天出院。第一天，志愿者将接受cdr132l或安慰剂；当他们在第27天再次入院时，他们将接受第二次匹配剂量，第28天进行第二次给药。根据最新的欧洲指南(14)，所有患者都应接受缺血性心力衰竭的护理标准(soc)疗法。cdr132l或安慰剂将作为soc治疗的添加疗法给出。223.所有受试者将在第10-14天、第56天、第84天和第112天前往该单位进行计划门诊。研究期间进行的所有评估在研究评估时间表(表2和表3)中有详细说明。研究设计特征可根据适应性特征进行调整(表4)。本研究将采用哨兵给药策略，详情见第3.3.5节。224.受试者人数225.28名稳定型缺血性心力衰竭患者被招募到给药队列1、2、3和4。226.主要纳入标准227.c18036_cdr132l-fih01_clinicalstudyprotocol_v1.0_17apr2019228.临床研究方案模板(第6版)2019年3月14日第16页，共85页229.如果受试者年龄在30至80岁之间，体重指数(bmi)在18.0kg/m2与28.0kg/m2之间，并且被确认为稳定型缺血性心力衰竭，则将包括他们。230.主要排除标准是：非缺血性心力衰竭(高血压性心脏病、心肌炎、酒精性心肌病和快速房颤引起的心功能不全)、当前或复发疾病；不包括可能影响cdr132l的作用、吸收或处置，或可能影响临床评估或临床实验室评估的稳定型心力衰竭(例如血液学、神经病学、内分泌、免疫学、肾脏、肝脏或胃肠或其它疾患)。231.一种或多种试验治疗和施用方式232.队列1：在第1天和第28天，0.32mg/kgcdr132l静脉内输注(15min；20ml)(n＝5)233.队列2：在第1天和第28天，1.00mg/kgcdr132l静脉内输注(15min；20ml)(n＝5)234.队列3：在第1天和第28天，3.00mg/kgcdr132l静脉内输注(15min；20ml)(n＝5)235.队列4：在第1天和第28天，10.00mg/kgcdr132l静脉内输注(15min；20ml)(n＝5)236.一种或多种参考治疗和施用方式237.静脉输注(15min；20ml)安慰剂(n＝8)以匹配cdr132l。238.评价标准[0239]-安全性分析[0240]安全性评估将包括标准实验室安全性测试(血液学、凝血、生物化学和尿液分析)、生命体征(收缩血压[sbp]、舒张血压[dbp]、呼吸频率、脉率和鼓膜温度(tympanictemperature))、体格检查、12导联ecg(rr、pr、qrs、qt、qtcf间期和心率[hr])、遥测、生物标志物评估和不良事件监测。[0241]-药代动力学分析[0242]以下药代动力学参数将根据cdr132l的测得的血浆浓度计算：最大观察血浆浓度(cmax)、达到最大血浆浓度的时间(tmax)、从时间零点至最后可检测血浆浓度的血浆浓度-时间曲线下的面积(auc0-t)、从时间零点外推至无穷大的血浆浓度-时间曲线下的面积(auc0-inf)、血液清除率(cl)、终末消除速率常数(λz)、终末消除半衰期(t1/2)、分布体积(vdss)。[0243]-药效学分析[0244]药效学评估将是探索性的，并将通过采集血液样本以测定以下生物标志物的浓度来进行评估：用于靶向参与的微小rna132(mir-132)，用于减充血的n末端b型脑钠肽前体(nt-pro-bnp)，以及作为心脏重构标志物的嗜中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(ngal)。可能需要附加的参数。[0245]统计方法[0246]将在数据库硬锁定之前编写并签署包含详细统计方法学的统计分析计划(sap)。该计划可以适当地更新以反映研究的适应性特征。[0247]-安全性参数的统计分析[0248]不良事件(ae)、生命体征、ecg参数和临床实验室数据将使用描述性统计进行列出和总结。[0249]将概述每个剂量中出现任何ae的受试者人数(和百分比)。所有ae将按照系统器官分类(soc)和使用药事管理的医学辞典(medicaldictionaryforregulatoryactivities)(meddra)分配给事件的首选术语(pt)列出。此外，这些事件将以最大强度进行概述。还将概述出现药物相关ae的受试者人数。将列出任何导致停药的严重不良事件(sae)和/或不良事件。[0250]-药代动力学参数的统计分析[0251]将按时间点列出和概述血浆浓度。将为每个受试者列出药代动力学参数，并使用描述性统计对每个治疗组进行概述。为了初步评估对于cmax和auc的剂量比例，将计算剂量标准化的血浆cmax、auc0-t和auc0-inf并对其进行描述性地概述。另外，将以log(pk参数)作为反应变量以及以log(剂量)作为预测因子的功率模型与血浆cmax、auc0-t和auc0-inf的数据进行拟合。该模型中为1的斜率对应于剂量比例。斜率将以其双-侧90％和95％ci进行估算。[0252]-药效学参数的统计分析[0253]将使用描述性统计列出和概述pd参数数据：绝对值以及相对于基线的变化。[0254]对于每个剂量组，将使用每个pd参数相对于血浆浓度的图形表示来研究血浆浓度与pd参数之间的关系。将使用pk和相关pd群体的交集来研究这种关系。当汇总统计和图形表示表明血浆浓度与pd参数之间的关系时，可以开发适当的统计模型来进一步解释这种关系。[0255]12.2患者特征：[0256]28名稳定型缺血性心力衰竭患者(nyha的1-3)被纳入一项随机双盲安慰剂对照研究。患者特征还包括2型糖尿病、既往心肌梗死事件、心房颤动、动脉高血压、经皮介入和/或冠状动脉旁路手术。左心室射血分数在31％与56％之间的范围内。[0257]根据医生的判断，患者接受了共存病的背景治疗，并根据其个人hf情况进行了稳定治疗。大多数患者接受双重/三重疗法(β受体阻滞剂联合ace抑制剂或血管紧张素受体阻滞剂和盐皮质激素拮抗剂)。2名安慰剂和2名真正患者有双心室起搏器；3名真正患者有植入的心律转复除颤器(cardioverterdefibrillator)(icd)。[0258]12.3初步结果：[0259]药代动力学(pk)特征谱[0260]人中的cdr132lpk特征谱已确认安全性特征谱，无蓄积迹象。证实了pk特征谱和从猪到人的可译性。cmax和auc的高水平剂量线性允许预测其它剂量(例如5mg/kg)的pk参数。根据ib期研究的初步结果，临床研究ii期的起始剂量建议在3与10mg/kg之间，随后维持剂量约在3与5mg/kg之间。[0261]目标参与[0262]真正患者的循环mir-132水平显著且呈剂量依赖性降低，并随着时间的推移保持低水平(直至第112天的研究终点)。[0263]ecg结果[0264]大多数真正患者在筛查时具有正常的ecg。其中许多在cdr132l治疗下表现出正常化或显著的剂量依赖性改善(例如，t波的正常化；qrs狭窄或者不存在左束支传导阻滞(lbbb)和/或右束支传导阻滞(rbbb)；r进展的正常化)。在cdr132l治疗下，无一例ecg相较于基线恶化。根据qt和qtc数据，未发现诱发心律失常的迹象。[0265]药效学(pd)参数[0266]在大多数接受治疗的患者中发现对射血分数(ef)有积极影响。nt-probnp作为心脏安全标志物未受到cdr132l治疗的不利影响。与基线相比，最高剂量组(10mg/kg)的患者在第28天和第122天的nt-probnp水平显著下降。利用cdr132l的2x治疗(剂量为1-10mg/kg)导致在所有患者中》50％的患者的ef改善和/或nt-probnp值降低。在ef》45％的患者中，发现左心室舒张的重要标志物等容舒张时间(ivrt)减少，这表明舒张功能障碍患者受益。[0267]生物标志物[0268]心脏纤维化生物标志物i型前胶原蛋白c端前肽(picp)和半乳糖凝集素-3(gal-3)在cdr132l治疗的hf患者中显示水平降低，表明具有抗纤维化作用。另外，纤维化生物标志物基质金属蛋白酶1(mmp-1)与mir-132的循环水平呈正相关，并且在较高剂量组(队列3和4)的患者中降低。在研究终点，在队列4中基质金属蛋白酶-1水平低于检测极限。[0269]安全性和耐受性[0270]未发现严重不良事件(sae)。在生化和血液学参数、生命体征和ecg中未发现病理效应或安全性信号：[0271]12.4结论：[0272]cdr132l被人心力衰竭患者良好地耐受，并且在剂量高达10mg/kg时未显示出任何毒性迹象。[0273]实施例13-通过定量血浆中的循环mir-132-3p来监测cdr132l疗法[0274]本研究的目的是评估血浆中mir-132-3p的水平，作为监测cdr132l疗法的生物标志物。[0275]测量了来自安慰剂-对照的心肌梗死(mi)诱发的心力衰竭(hf)的猪模型的血浆样品中的循环mir-132-3p(图21)。动物经历mi接受不同的cdr132l治疗方案，包括在第3天和第1个月的两次应用(冠状动脉内/静脉内(iciv)对比静脉内/静脉内(iviv))和三个剂量水平的cdr132l(低：1mg/kg，中：5mg/kg或高：10mg/kg)。[0276]这项研究伴随着连续的血液取样，直至第2个月。在来自终点的血浆样品中，使用针对mir-132-3p的taqman探针，通过定量实时pcr(qrt-pcr)监测mir-132-3p的循环水平。将数据以rna提取过程中加入的合成微小rna(cel-mir-39)加标作标准化。[0277]利用cdr132l的治疗导致靶器官、心脏中药物物质的剂量依赖性增加，以及血浆样品中功能性mir-132-3p的显著降低。图22显示了所有纳入动物(iviv和iciv)的心脏组织(lvmi远端区域)中cdr132l浓度与mir-132-3p的循环水平(以cel-mir-39作标准化的)的相关性分析。数据是单个动物的平均值±sem。p值由非参数双尾mann-whitneyu检验评估(左图)。通过皮尔逊积矩相关和斯皮尔曼等级相关(右图)进行关联。因此，循环mir-132-3p与接受治疗的动物心脏组织中cdr132l的浓度密切相关。这些数据表明，循环mir-132-3p是心脏组织中cdr132l存在的指示性标志物。[0278]我们进一步评估了其它已建立的生物标志物是否指示心脏组织中存在cdr132l。众所周知，n末端b型脑钠肽前体(nt-probnp)是心脏应激的标志物，其与心力衰竭的严重程度相关。与mir-132-3p水平一致，[0279]图23显示了所有纳入动物(iviv和iciv)心脏组织(lvmi远端区域)中cdr132l浓度与血浆nt-probnp(n末端b型脑钠肽前体)水平的相关性分析。数据是单个动物的平均值±sem。p值由非-参数双尾mann-whitneyu检验评估(左图)。通过皮尔逊积矩相关和斯皮尔曼等级相关(右图)进行关联。在经cdr132l治疗的动物的血浆中观察到nt-probnp减少(图23)。然而，剂量依赖性不太明显，与心脏cdr132l的相关性不太显著。[0280]除了血浆中循环mir-132与心脏中的cdr132l之间的关系之外，我们评估了该药物物质是否高效抑制其靶微小rnamir-132-3p。心脏组织(lvmi远端区域)中功能性mir-132-3p水平显著降低，且剂量越高，这种降低越强。[0281]图24显示了所有纳入动物(iviv和iciv)心脏组织(lvmi远端区域)中功能性mir-132-3p水平与以cel-mir-39作标准化的该微小rna循环水平的相关性分析。数据是单个动物的平均值±sem。p值由非-参数双尾mann-whitneyu检验评估(左图)。通过皮尔逊积矩相关和斯皮尔曼等级相关(右图)进行关联。血浆和心脏mir-132-3p的相关性未揭示了两个参数之间的显著负相关，表明mir-132-3p水平的血浆水平指示cdr132l对其靶mir-132-3p的活性。[0282]研究表明，cdr132l治疗改善mi后的心脏功能。因此，我们测试了这种功能改善，即mi后第3天与第2个月之间相比的左心室射血分数(ef)的变化(δef)是否与循环mir-132-3p一致。观察到两个参数显著负相关，表明循环mir-132-3p水平指示心脏功能的改善。[0283]图25显示了所有纳入动物(iviv和iciv)的δef(从第3天至第2个月ef的改善)与该微小rna循环水平(以cel-mir-39作标准化的)的相关性分析。数据是单个动物的平均值±sem。p值由非参数双-尾mann-whitneyu检验评估(左图)。通过皮尔逊积矩相关和斯皮尔曼等级相关(右图)进行关联。[0284]所述负相关和功能改善与心脏应激标志物nt-probnp之间的相关性一样强。[0285]图26显示了所有纳入动物(iviv和iciv)的nt-probnp血浆水平与δef(从第3天至第2个月ef的改善)的相关性分析。数据是单个动物的平均值±sem。p值由非参数双尾mann-whitneyu检验评估(左图)。通过皮尔逊积矩相关和斯皮尔曼等级相关(右图)进行关联。[0286]另外，低水平的循环nt-probnp以线性方式对应于低水平的循环mir-132-3p。[0287]图27显示了所有纳入动物(iviv和iciv)的nt-probnp血浆水平与mir-132-3p的循环水平(以cel-mir-39作标准化的)的相关性分析。数据是单个动物的平均值±sem。p值由非参数双尾mann-whitneyu检验评估(左图)。通过皮尔逊积矩相关和斯皮尔曼等级相关(右图)进行关联。[0288]实施例14–亚急性心力衰竭中的cdr132l[0289]14.1研究目的：在mi后-亚急性心力衰竭(hf)猪模型中测试cdr132l的疗效[0290]14.2研究大纲：[0291]·心肌梗死后hf模型，135只动物随访56天[0292]·体重增长缓慢的家猪(“曼加利卡品种(mangalicabreed)”)[0293]·安慰剂对照和3个剂量组[0294]1、5、10mg/kgb.w.，在第3天和第28天治疗两次(图28)。[0295]·冠状动脉内/静脉内[0296](ic/iv)与静脉注射/静脉注射(iv/iv)施用的比较。[0297]·考虑用于数据分析的动物：79只动物。[0298]14.3结果：[0299]射血分数变化δef(第56天的ef–第3天的ef)[0300]nb：纳入标准，第3天的ef《40％[0301]在中剂量和高剂量iv/iv和ic/iv组中，发现mi后第3天至第56天的ef有显著变化(δef)，表明功能得到改善(图29)。[0302]循环nt-probnp与δef(第56天-第3天)的相关性[0303]在第56天，中剂量组和高剂量组中nt-probnp的mi后hf相关增加被逆转。低水平的循环nt-probnp浓度与通过增加的δef指示的心脏功能的改善相符。nt-probnp作为用于指示靶标参与的潜在生物标志物(参考实施例13)。[0304]lvmi远端区域中终点(第56天)时的纤维化(％)[0305]nb：纳入标准，第3天的ef《40％[0306]发现中剂量组和高剂量组中纤维化发展的显著变化有助于功能改善(图30)。[0307]治疗反应(第56天)[0308]nb：纳入标准，第3天的ef《40％[0309]反应者分析揭示了ef改善的剂量依赖性反应。85.7％的iviv高剂量组显示》7％的δef，而所有安慰剂动物中只有4.6％显示》7％的恢复(图31)。[0310]14.4结论：[0311]基于临床相关和公认的mi后hf大动物模型中的金标准心脏mri测量的cdr132l有效改善心脏功能。观察到心脏功能改善的线性剂量关系。与第3天(经安慰剂校正的)相比时，iviv高剂量组显示第56天的ef增加了10.38％。cdr132l的已证实的疗效具有高临床相关性(相比之下，心脏细胞移植最多增加3-4％的ef)。[0312]实施例15–用于治疗慢性心力衰竭的cdr132l[0313]15.1研究目的：在mi后慢性心力衰竭(hf)猪模型中测试cdr132l的疗效[0314]15.2研究大纲：[0315]在慢性mi后心力衰竭(hf)猪模型中验证cdr132l的疗效[0316]·6个月随访的mi后hf慢性模型(图32)[0317]·体重增长缓慢的家猪(“曼加利卡品种”)[0318]·三个治疗臂：[0319]每月5x安慰剂[0320]每月5xcdr132l[0321]每月3xcdr132l[0322]·剂量：5mg/kg[0323]·施用途径：iv[0324]·考虑用于数据分析的动物：29只动物。[0325]15.3.结果：[0326]射血分数(ef)[0327]nb：纳入标准，第1个月的ef《40％[0328]与安慰剂相比，在所有治疗组中发现mi后第1个月至第6个月的ef变化均显著》7％(图33)。[0329]反应者分析[0330]nb：纳入标准，第1个月的ef《40％[0331]观察到治疗量与ef改善(δefm6-m1)之间有很强的相关性(图33)。87.5％的5x治疗组显示》7％的δef，而11只安慰剂动物中只有2只显示》3％的恢复。[0332]6个月后cdr132l和mir-132-3p的水平[0333]nb：纳入标准，第1个月的ef《40％[0334]观察到剂量依赖性cdr132l心脏组织分布(lvmi远端区域)。cdr132l组织浓度与mir-132-3p的低功能水平相符(图34)。[0335]左心室收缩末期容积(lvesv)[0336]与安慰剂组相比，cdr132l治疗在6个月的随访期内显示出对不良左心室重构的有益效果，并显著减轻了mi后lvesv的扩大。[0337]左心房(la)[0338]如通过成像所评估的，经cdr132l治疗后，mi后慢性心房重构减少。与安慰剂相比，两个治疗组的la容积和la指数(以体表面积作标准化的la容积)均显著降低。[0339]收缩功能和收缩性[0340]mi后衰竭心脏的收缩功能和收缩性通过cdr132l治疗得到显著改善，通过在6个月终点时的有创血液动力学测量进行评估。对负荷无关参数的分析提示了显然转化为更好的整体收缩功能的心肌收缩性的cdr132l治疗依赖性改善(收缩末期压力-容积关系和前负荷补充搏功(preloadrecruitablestrokework))。[0341]舒张功能[0342]通过cdr321l治疗，整体舒张压参数(最小心室压力变化率)和负荷无关参数edpvr(舒张末期压力容积关系)(心脏硬度和容量的敏感性标志物)均得到改善。[0343]15.4结论：[0344]在猪慢性心力衰竭模型中，cdr132l强烈改善心脏功能。在接受cdr132l(经安慰剂校正的)5个月治疗的动物中，显示了第6个月的ef增加了7.14％。87.5％的动物对治疗有反应，ef改善超过7％。未观察到与治疗相关的不良事件或血液学或实验室化学的变化。cdr132l作为慢性心力衰竭的治疗选择，其已证实的疗效在临床上具有高度相关性。[0345]另外，每月给予的cdr132l治疗在慢性mi后心力衰竭模型中有效地改善重构、收缩功能(例如心脏收缩性)和舒张功能(例如心脏舒张性)。[0346]实施例16–药代动力学研究[0347]为了进一步评估cdr132l的治疗潜力，我们设计了大型动物药代动力学(pk)研究，以评估我们的化合物在猪体内的组织暴露和在靶组织中的分布。静脉内(iv)施用是临床上优选的应用途径，然而许多新型治疗方法依赖于替代施用途径，诸如冠状动脉内(ic)灌注，这在心脏基因治疗研究中是常见的。我们发现对于cdr132l的iv和ic施用，心脏组织样品中的剂量依赖性组织暴露相当(图16a、图16b)。与未治疗的对照动物相比，靶mir-132水平的倒数剂量依赖性降低证实了cdr132l活性。心脏抗mir-132浓度与功能性mir-132水平之间有与施用途径无关的很强的反向相关性(图36c)。据计算，该化合物在心脏组织中的半衰期约为3周(图36d)，并且对于血浆，发现具有快速α相和长β相的化合物的双相消除(图36e)。[0348]参考资料[0349]1.barry，s.p.；townsend，p.a.(2010).whatcausesabrokenheart-molecularinsightsintoheartfailure.lntrevcellmolbiol284，113-179.[0350]2.datta，s.r.；brunet，a.；greenberg，m.e.(1999).cellularsurvival：aplayinthreeakts.genesdev.13，2905-2927.[0351]3.debosch，b.j.；muslin，a.j.(2008).insulinsignalingpathwaysandcardiacgrowth.jmolcellcardiol.44，855-864.[0352]4.frescas，d.；valenti，l.；accili，d.(2005).nucleartrappingoftheforkheadtranscriptionfactorfoxo1viasirt1-dependentdeacety1ationpromotesexpressionofglucogeneticgenes.jbiolchem.280，20589-20595.[0353]5.glas，d.j.(2010).pi3kinaseregulationofskeletalmusclehypertrophyandatrophy.currtopmicrobiolimmunol.346，267-278.[0354]6.gottlieb，r.a.；gustafsson，a.b.(2011).mitochondrialturnoverintheheart.biochimbiophysacta.1813，1295-1301.[0355]7.kolk，m.v.；meyberg，d.；denset.；tang-quam，k.r.；robbinsr.c.；reichenspurner，h.；schrepfer.s(2009)，j.visexp.32，pii：1438.doi：103791/1438[0356]8.mcmullen，j.r.；shioi，t.；huang，w.y.；zhang，l.；tarnavski，o.；bisping，e.；schinke，m.；kong，s.；sherwood，m.c.；brown，j.etal.(2004).theinsulin-likegrowthfactor1receptorinducesphysiologicalheartgrowthviathephosphoinositide3-kinase(p110alpha)pathway.jbiolchem.279，4782-4793.[0357]9.ni，y.g.；berenji，k.；wang，n.；oh，m.；sachan，n.；dey，a.；cheng，j.；lu，g.；morris，d.j.；castrillon，d.h.etal.(2006).foxotranscriptionfactorsbluntcardiachypertrophybyinhibitingcalcineurinsignaling.circulation.174.1159-1168.[0358]10.ronnebaum，s.m.；patterson，c.(2010).thefoxofamilyincardiacfunctionanddysfunction.annurevphysiol.72，81-94.[0359]11.skurk，c.；lzumiya，y.；maatz，h.；razeghi，p.；shiojima，l.；sandri，m.；sato，k.；zeng，l.；schiekofer，s.；pimentel，d.etal.(2005).thefoxo3atranscriptionfactorregulatescardiacmyocytesizedownstreamofaktsignaling.jbiolchem.280，20814-23.[0360]12.ucar，a.etal.(2012)，nat.commun.3∶1078.doi：10.1038/ncomms2009.[0361]13.grech，e.d.&ramsdale，d.r.(2003)，bmj326：1259-61.[0362]14.ponikoskwi，p.etal.(2016)，eur.heartj.37：2129-2200.当前第1页12当前第1页12
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