一种细胞穿透肽-甾醇耦合物及其制备方法

1.本发明属于生物医药技术领域，涉及一种细胞穿透肽-甾醇耦合物及其制备方法。


背景技术：

2.细胞穿透肽是一类对带正电荷，对细胞膜具有强力穿透作用的短肽，可用来修饰脂质体、纳米粒、胶束等纳米药物递送系统，促进细胞摄取，目前在药物递送领域受到了广泛关注。以脂质体为例，细胞膜表面带有负电荷，普通脂质体的入胞能力有限，经细胞穿透肽修饰的脂质体表面带有正电荷，与细胞膜产生静电吸附作用，可显著提高脂质体的入胞效率。
3.一种细胞穿透肽-甾醇耦合物是指经细胞穿透肽修饰的甾醇，甾醇包括胆固醇、麦角固醇、β-谷甾醇、豆甾醇、羊毛甾醇等。胆固醇是哺乳动物细胞膜的主要组成部分，能与磷脂产生相互作用，调节脂膜结构、动力学特性等，化学结构如图1。同时，胆固醇在人体内具有重要生理作用，是胆汁酸和类固醇激素合成的前体。胆固醇可作为脂质体膜材、乳化剂、软膏基质等药用辅料，尤其在脂质体制剂中对提高制剂稳定性有重要作用。在制备脂质体时添加适量的胆固醇，可使膜保持流动性的同时具备一定刚性。麦角固醇是真菌细胞膜中的主要甾醇成分，可以通过微生物发酵合成得到，与胆固醇结构相似，化学结构如图2。麦角固醇具有抑菌、抗肿瘤、抗炎等作用，且为黄体酮、可的松、维生素d2等多种药物的前体，对膜结构有重要作用，可增加膜的堆积，起到填充双层膜的作用。β-谷甾醇(化学结构如图3)、豆甾醇(化学结构如图4)为植物甾醇，被称为健康型甾醇，与胆固醇结构类似，却能够抑制胆固醇在肠道的吸收并影响其代谢，对心血管代谢性疾病和癌症等也有预防作用，β-谷甾醇、豆甾醇剂量适当具有与胆固醇类似的热致相行为和抗脂质体氧化的作用；天然的植物甾醇属于无毒物，是一类被允许在食品中添加的甾醇，在脂质体制剂中使用安全可靠，植物甾醇具有与胆固醇相似的调节脂膜的能力，所得功能性脂质体能保持与原胆固醇脂质体类似的基本特征；且植物甾醇赋予了脂质体自身干扰体内胆固醇吸收和抗肿瘤等药理活性；这类健康型甾醇的药理作用以及不使用胆固醇，扩大了脂质体制剂在降血脂领域的应用。羊毛甾醇(化学结构如图5)是菌类甾醇，广泛用于食品、医药、化工行业中的安全性天然产物，具备生产原料成本低、易工业化生产等优势。一定浓度范围下如20％的用量的羊毛甾醇具有脂膜调节作用。菌类甾醇丰富的药理活性以及细微的结构差异赋予脂质体新的特性。
4.经检索，凯瑟琳
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菲奥纳
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多尔顿等(专利，公开号：cn104530190a)采用fmoc和boc固相肽方法合成肽链，使用哌啶脱除fmoc保护基，其次缩合剂为二异丙基碳二亚胺、二环己基碳二亚胺以及n-乙基-n
’‑
(3-二甲基-氨基丙基)碳二亚胺，与本发明明显不同，本发明采用的是吗啉脱除fmoc保护基，其次缩合剂采用的是苯并三氮唑-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯以及1-羟基苯并三氮唑；拉尔夫
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艾森胡特等(专利，公开号：cn111670194a)采用fmoc固相肽法合成胰高血糖素肽，缩合剂采用的是tbtu，与本发明明显不同，首先目标肽链不同，本发明目标肽链为自主设计，其次本发明缩合剂采用的是hbtu。
5.本发明的创新点在于：第一，细胞穿透肽肽链为自主设计并合成；第二，利用溴乙
酸/吡啶酸与甾醇形成中间体化合物，继而与多肽链连接，合成路线为自主设计；第三，除胆固醇外，其他甾醇几乎未应用于纳米递送载体的构建。


技术实现要素：

6.本发明涉及一种细胞穿透肽-甾醇耦合物及其制备方法具有以下优点：第一，自主设计细胞穿透肽cgykk(图6)、cgyrr(图7)、cgyyk(图8)，采用fmoc固相合成法合成，收率高，合成速度快；第二，利用溴乙酸/吡啶酸与甾醇形成中间体化合物，继而与多肽链连接，制备细胞穿透肽-甾醇耦合物经分离纯化后，纯度高，杂质少；第三，将本发明所得细胞穿透肽-甾醇耦合物应用纳米载体构建中，一方面发挥甾醇的成膜性，一方面发挥细胞穿透肽的正电性，提高载体进入细胞的转染效率；第四，除胆固醇外，其他甾醇几乎未应用于纳米递送载体的构建，但各自具有不同生物活性，故可根据纳米载体用途选用相应甾醇的耦合物作为脂质材料；第五，细胞穿透肽-甾醇耦合物在完成转染后，在细胞内可被酯酶代谢分解，成为相应的甾醇和氨基酸，均为细胞生长可利用的原材料，生物毒性低，而一般的季铵盐正电荷磷脂材料与体内细胞膜中的中性磷脂结构差异较大，在细胞内缺少高效的代谢途径，故而生物毒性较高，细胞损伤较大。
7.一种细胞胞穿透肽-甾醇耦合物的制备方法，包括下述步骤：
8.步骤1，采用树脂与氨基酸进行偶联反应，使树脂上偶联有直链肽；
9.步骤2，向树脂中加入切割液反应，经过滤处理后，加入二甲基甲酰胺(dmf)或异丙醇洗掉多余的液体；
10.步骤3，加入缩合剂以及氨基酸，进行连接；
11.步骤4，重复步骤2、3的操作，连接上最后一个氨基酸；
12.步骤5，加入切割液，切掉所有的保护基团，即可获得目标细胞穿透肽；
13.步骤6，将溴乙酸或吡啶酸、edci、dmap、甾醇，溶于二氯甲烷中，冰浴下搅拌，然后继续在室温下反应，依次用饱和nahco3和饱和nacl水溶液洗涤，无水mgso4或na2so4干燥，得中间体化合物b。
14.步骤7，中间体化合物b经柱层析纯化，得甾醇溴乙酸酯或甾醇吡啶酸酯；
15.步骤8，将细胞穿透肽、甾醇、溴乙酸酯或吡啶酸酯溶于dmf，室温下反应h，经萃取浓缩可得细胞穿透肽-甾醇耦合物。
16.具体地，cgykk的氨基酸加入顺序为赖氨酸、赖氨酸、酪氨酸、甘氨酸和半胱氨酸；cgyrr的氨基酸加入顺序为精氨酸、精氨酸、酪氨酸、甘氨酸和半胱氨酸；cgyyk的氨基酸加入顺序为赖氨酸、酪氨酸、酪氨酸、甘氨酸和半胱氨酸；所述甾醇包括胆固醇、麦角固醇、β-谷甾醇、豆甾醇、羊毛甾醇。
17.具体地，一种细胞穿透肽-甾醇耦合物及其制备方法，甾醇包括胆固醇、麦角固醇、β-谷甾醇、豆甾醇、羊毛甾醇，
18.包括下述步骤：
19.步骤1，采用树脂与氨基酸进行偶联反应，使树脂上偶联有直链肽；
20.步骤2，向树脂中加入切割液反应，经过滤处理后，加入二甲基甲酰胺(dmf)/异丙醇洗掉多余的液体；
21.步骤3，加入缩合剂以及氨基酸，进行连接；
22.步骤4，重复步骤2、3的操作，直至连接上最后一个氨基酸
23.步骤5，加入切割液，切掉所有的保护基团，即可获得目标细胞穿透肽。
24.步骤6，将溴乙酸/吡啶酸、edci、dmap、甾醇(胆固醇、麦角固醇、β-谷甾醇、豆甾醇、羊毛甾醇)，溶于二氯甲烷中，冰浴下搅拌10-60min，然后继续在室温下反应3-24h，依次用饱和nahco3和饱和nacl水溶液洗涤，无水mgso4/na2so4干燥，得中间体化合物b。
25.步骤7，中间体化合物b经柱层析纯化，得甾醇溴乙酸酯/吡啶酸酯。
26.步骤8，将细胞穿透肽、甾醇溴乙酸酯溶/吡啶酸酯于dmf，室温下反应0.5-5h，经萃取浓缩可得细胞穿透肽-甾醇耦合物。
27.其中，cgykk的氨基酸加入顺序为赖氨酸、赖氨酸、酪氨酸、甘氨酸和半胱氨酸；cgyrr的氨基酸加入顺序为精氨酸、精氨酸、酪氨酸、甘氨酸和半胱氨酸；cgyyk的氨基酸加入顺序为赖氨酸、酪氨酸、酪氨酸、甘氨酸和半胱氨酸。
28.具体的，将细胞穿透肽-甾醇耦合物与磷脂材料混合，通过有机溶剂溶解，再以薄膜分散法或逆向溶剂挥发法或微流控法制备具有包载递送功能的纳米载体。
29.细胞穿透肽-甾醇耦合物的设计原理如下：第一，甾醇的结构中仅有3位羟基可作为反应的活性基团，并且多肽c端的羧基反应活性很弱，不能直接与甾醇3位羟基反应，而n端的氨基亦不能与羟基直接结合，因此需要先将甾醇3位羟基与溴乙酸或者吡啶酸反应成酯，该反应条件温和且收率高(与溴乙酸反应为例，路线见图9)。为了将其引入到肽链的两端，在肽链n端加入1个半胱氨酸，利用其侧链巯基(-sh)与其进行化学反应，从而将甾醇与多肽连接(反应路线见图10，以cygkk与胆固醇溴乙酸酯反应为例)。第二，为了保持与脂膜结合时甾醇的构象灵活性，在半胱氨酸与肽链间加入1个甘氨酸，利用其分子的柔韧性来达到保持肽链及甾醇各自构象灵活性的目的同时空间位阻最小。第三，细胞穿透肽的c端需符合cend r基序规则，即c端必须为精氨酸或者赖氨酸，提供正电荷。第四，酪氨酸为含有苯环的氨基酸，可以增加肽链的免疫原性。第五，设计的肽链重复的氨基酸是为了提供正电荷以及增加免疫原性；本发明的细胞穿透肽-甾醇耦合物均带正电荷，可辅助dna，sirna和mrna等进入细胞；本发明的细胞穿透肽-甾醇耦合物可作为磷脂材料应用于纳米载体处方中，提高其递送效率，并可应用于生物医药、保健品、化妆品等领域。
附图说明：
30.图1是胆固醇的化学结构
31.图2是麦角固醇的化学结构
32.图3是β-谷甾醇的化学结构
33.图4是豆甾醇的化学结构
34.图5是羊毛甾醇的化学结构
35.图6是cgykk的化学结构式
36.图7是cgyrr的化学结构式
37.图8是cgyyk的化学结构式
38.图9是甾醇(a胆固醇、b麦角固醇、cβ-谷甾醇、d豆甾醇、e羊毛甾醇)与溴乙酸反应的化学反应式
39.图10是胆固醇溴乙酸酯与肽链cgykk的化学反应式
40.图11是实施例1cgykk的合成反应式
41.图12是实施例1cgykk的maldi-tof ms图谱(a)以及hplc图(b)
42.图13是实施例2cgyrr的合成反应式
43.图14是实施例2cgyrr的maldi-tof ms图谱(a)以及hplc图(b)
44.图15是实施例3cgyyk的合成反应式
45.图16是实施例3cgyyk的maldi-tof ms图谱(a)以及hplc图(b)
46.图17是实施例5溴乙酸的结构(a)和实施例6吡啶酸(b)的结构
47.图18是实施例6的胆固醇酯的合成路线图
48.图19是实施例6的胆固醇酯的hnmr图(a)和hplc图(b)
49.图20是实施例7cgykk-胆固醇的maldi-tof ms图(a)和hplc图(b)
50.图21是实施例8cgyrr-胆固醇的maldi-tof ms图(a)和hplc图(b)
51.图22是实施例9cgyyk-胆固醇的maldi-tof ms图(a)和hplc图(b)
52.图23是实施例10的麦角固醇酯的合成路线图
53.图24是实施例10的麦角固醇酯的hnmr图(a)和hplc图(b)
54.图25是实施例11cgykk-麦角固醇的maldi-tof ms图(a)以及hplc图(b)
55.图26是实施例12cgyrr-麦角固醇的maldi-tof ms图(a)以及hplc图(b)
56.图27是实施例13cgyyk-麦角固醇的maldi-tof ms图(a)以及hplc图(b)
57.图28是实施例15的粒径电位图
58.图29是实施例15的透射电镜扫描图
59.图30是实施例15、实施例16的细胞摄取倒置荧光显微镜图
60.图31是实施例14、对比例1的转染效率图
61.图32是实施例7、实施例8、实施例9、实施例11、实施例12、实施例13细胞毒性mtt实验结果
62.图33是实施例对比例1、实施例15、实施例16的细胞毒性mtt实验结果
具体实施方式
63.下面通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步的说明。
64.实施例1 cgykk肽链的合成
65.称取1g的2-氯-3苯甲基氯树脂、2.23g的fmoc-lys(boc)-oh溶于10ml的dcm中，向其中滴加1.77ml的diea，反应3.5h，再滴加0.48ml的meoh，反应0.5h，待反应结束，抽滤(除去液体)，再加入异丙醇/dmf清洗，在加入10ml30％吗啉(吗啉/dmf)，反应30min，经茚三酮检测，树脂呈蓝色，说明已脱去fmoc保护基，再加入异丙醇/dmf清洗；加入1.67g的fmoc-lys(boc)-oh、1.35g hbtu和0.48g hobt溶于10ml的dmf中，再向其中加入1.18ml的diea，反应2.5h，待反应结束，经茚三酮检测，树脂呈无色，说明氨基酸已经连接上，抽滤(除去液体)，再加入异丙醇/dmf清洗，在加入10ml30％吗啉(吗啉/dmf)，反应30min，经茚三酮检测，树脂呈蓝色，说明已经脱去fmoc保护基，再加入异丙醇/dmf清洗；加入1.64g的fmoc-tyr(tbu)-oh、1.35g的hbtu和0.48g hobt溶于10ml的dmf中，再向其中加入1.18ml的diea，反应2.5h，待反应结束，经茚三酮检测，树脂呈无色，说明氨基酸已连接上，抽滤(除去液体)，再加入异丙醇/dmf清洗，在加入10ml30％吗啉(吗啉/dmf)，反应30min，经茚三酮检测，树脂呈蓝色，
说明已脱去fmoc保护基，再加入异丙醇/dmf清洗；加入1.06g的fmoc-gly-oh、1.35g的hbtu和0.48g hobt溶于10ml的dmf中，再向其中加入1.18ml的diea，反应2.5h，待反应结束，经茚三酮检测，树脂呈无色，说明氨基酸已经连接上，抽滤(除去液体)，再加入异丙醇/dmf清洗，在加入10ml30％吗啉(吗啉/dmf)，反应30min，经茚三酮检测，树脂呈蓝色，说明已脱去fmoc保护基，再加入异丙醇/dmf清洗；加入2.09g的fmoc-cys(trt)-oh、1.35g的hbtu和0.48g hobt溶于10ml的dmf中，再向其中加入1.18ml的diea，反应2.5h,待反应结束，经茚三酮检测，树脂呈无色，说明氨基酸已连接上，抽滤(除去液体)，再加入异丙醇/dmf清洗，在加入10ml30％吗啉(吗啉/dmf)，反应30min，经茚三酮检测，树脂呈蓝色，说明已脱去fmoc保护基。此时形成了cgykk-resin，需要将cgykk从树枝上切下来，同时除去trt、boc、tbu保护基，向其中加入10ml裂解液(8.25ml的tfa、0.5ml的甲苯硫醚、0.25ml的水、0.5ml苯酚、0.5ml乙二硫醇)，反应3.5小时，待反应结束，抽滤，将液体滴加到冻20-30ml甲叔醚中，即有沉淀产生，经离心，取沉淀，经氩气吹干，即得cgykk(化学反应式见图11)，白色固体，共456mg，产物经maldi-tof和hplc检测，maldi-tof ms值为[m-1]-，(图12a)，hplc(方法：色谱柱：zorbax sb-c18(4.6mm
×
250mm，5μm)；流动相：a水50％b甲醇：50％；流速：0.6ml/min；柱温：30℃；检测波长：220nm；进样量：20μl，检测其纯度为92％(图12b)。
[0066]
实施例2 cgyrr肽链的合成
[0067]
称取1g的2-氯-3苯甲基氯树脂、3.08g的fmoc-arg(pbf)-oh溶于10ml的dcm中，向其中滴加1.77ml的diea，反应3.5h，再滴加0.48ml的meoh，反应0.5h，待反应结束，抽滤(除去液体)，再加入异丙醇/dmf清洗，在加入10ml30％吗啉(吗啉/dmf)，反应30min，待反应结束，经茚三酮检测，树脂呈蓝色，说明已脱去fmoc保护基，再加入异丙醇/dmf清洗；加入2.32g的fmoc-arg(pbf)-oh、1.35g hbtu和0.48g hobt溶于10ml的dmf中，再向其中加入1.18ml的diea，反应2.5h，待反应结束，经茚三酮检测，树脂呈无色，说明氨基酸已连接上，抽滤(除去液体)，再加入异丙醇/dmf清洗，在加入10ml30％吗啉(吗啉/dmf)，经茚三酮检测，树脂呈蓝色，说明已脱去fmoc保护基，再加入异丙醇/dmf清洗；加入1.64g的fmoc-tyr(tbu)-oh、1.35g的hbtu和0.48g hobt溶于10ml的dmf中，再向其中加入1.18ml的diea，反应2.5h，待反应结束，经茚三酮检测，树脂呈无色，说明氨基酸已连接上，抽滤(除去液体)，再加入异丙醇/dmf清洗，在加入10ml30％吗啉(吗啉/dmf)，经茚三酮检测，树脂呈蓝色，说明已脱去fmoc保护基，再加入异丙醇/dmf清洗；加入1.06g的fmoc-gly-oh、1.35g的hbtu和0.48ghobt溶于10ml的dmf中，再向其中加入1.18ml的diea，反应2.5h，待反应结束，经茚三酮检测，树脂呈无色，说明氨基酸已连接上，抽滤(除去液体)，再加入异丙醇/dmf清洗，在加入10ml30％吗啉(吗啉/dmf)，经茚三酮检测，树脂呈蓝色，说明已脱去fmoc保护基，再加入异丙醇/dmf清洗；加入2.09g的fmoc-cys(trt)-oh、1.35g的hbtu和0.48g hobt溶于10ml的dmf中，再向其中加入1.18ml的diea，反应2.5h，待反应结束，经茚三酮检测，树脂呈无色，说明氨基酸已连接上，抽滤(除去液体)，再加入异丙醇/dmf清洗，在加入10ml30％吗啉(吗啉/dmf)，经茚三酮检测，树脂呈蓝色，说明已脱去fmoc保护基。此时形成了cgyrr-resin，需要将cgyrr从树枝上切下来，同时除去trt、boc、tbu保护基，向其中加入10ml裂解液(8.25ml的tfa、0.5ml的甲苯硫醚、0.25ml的水、0.5ml苯酚、0.5ml乙二硫醇)，反应3.5小时，待反应结束，抽滤，将液体滴加到冻20-30ml甲叔醚中，即有沉淀产生，经离心，取沉淀，经氩气吹干，即得cgyrr(化学反应式见图13)，白色固体，共436mg。将maldi-tof检测ms值为[m-1]-，见图
14a。产物经hplc检测，方法：色谱柱：zorbax sb-c18(4.6mm
×
250mm，5μm)；流动相：a水50％b甲醇：50％；流速：0.6ml/min；柱温：30℃；检测波长：220nm；进样量：20μl，检测其纯度为90％，见图14b。
[0068]
实施例3 cgyyk肽链的合成
[0069]
称取1g的2-氯-3苯甲基氯树脂、2.23g的fmoc-lys(boc)-oh溶于10ml的dcm中，向其中滴加1.77ml的diea，反应3.5h，再滴加0.48ml的meoh，反应0.5h，待反应结束，抽滤(除去液体)，再加入异丙醇/dmf清洗，在加入10ml30％吗啉(吗啉/dmf)，经茚三酮检测，树脂呈蓝色，说明已脱去fmoc保护基，再加入异丙醇/dmf清洗；加入1.64g的fmoc-tyr(tbu)-oh、1.35g hbtu和0.48g hobt溶于10ml的dmf中，再向其中加入1.18ml的diea，反应2.5h，待反应结束，经茚三酮检测，树脂呈无色，说明氨基酸已连接上，抽滤(除去液体)，再加入异丙醇/dmf清洗，在加入10ml30％吗啉(吗啉/dmf)，经茚三酮检测，树脂呈蓝色，说明已脱去fmoc保护基，再加入异丙醇/dmf清洗；加入1.64g的fmoc-tyr(tbu)-oh、1.35g的hbtu和0.48g hobt溶于10ml的dmf中，再向其中加入1.18ml的diea，反应2.5h，待反应结束，经茚三酮检测，树脂呈无色，说明氨基酸已连接上，抽滤(除去液体)，再加入异丙醇/dmf清洗，在加入10ml30％吗啉(吗啉/dmf)，经茚三酮检测，树脂呈蓝色，说明已脱去fmoc保护基，再加入异丙醇/dmf清洗；加入1.06g的fmoc-gly-oh、1.35g的hbtu和0.48g hobt溶于10ml的dmf中，再向其中加入1.18ml的diea，反应2.5h，待反应结束，经茚三酮检测，树脂呈无色，说明氨基酸已连接上，抽滤(除去液体)，再加入异丙醇/dmf清洗，在加入10ml30％吗啉(吗啉/dmf)，经茚三酮检测，树脂呈蓝色，说明已脱去fmoc保护基，再加入异丙醇/dmf清洗；加入2.09g的fmoc-cys(trt)-oh、1.35g的hbtu和0.48g hobt溶于10ml的dmf中，再向其中加入1.18ml的diea，反应2.5h，待反应结束，经茚三酮检测，树脂呈无色，说明氨基酸已连接上，抽滤(除去液体)，再加入异丙醇/dmf清洗，在加入10ml30％吗啉(吗啉/dmf)，经茚三酮检测，树脂呈蓝色，说明已脱去fmoc保护基，此时形成了cgyyk-resin，需要将cgyrr从树枝上切下来，同时除去trt、boc、tbu保护基，向其中加入10ml裂解液(8.25ml的tfa、0.5ml的甲苯硫醚、0.25ml的水、0.5ml苯酚、0.25ml乙二硫醇)，反应3.5小时，待反应结束，抽滤，将液体滴加到冻20-30ml甲叔醚中，即有沉淀产生，经离心，取沉淀，经氩气吹干，即得cgyyk(化学反应式见图15)，白色固体，共532mg，将maldi-tof检测ms值为[m-1]-，见图16a。产物经hplc检测，方法：色谱柱：zorbax sb-c18(4.6mm
×
250mm，5μm)；流动相：0-60min，从5％水，95％乙腈到95％的水，5％的乙腈；流速：0.6ml/min；柱温：30℃；检测波长：220nm；进样量：20μl，检测其纯度为83％，见图16b。
[0070]
实施例4胆固醇溴乙酸酯的合成
[0071]
将4.5g溴乙酸、5.0g胆固醇、8.7gedci及79mg dmap溶于35ml二氯甲烷(dcm)中，冰浴下搅拌反应30min，然后继续在室温下反应12h，依次用饱和nahco3和饱和nacl水溶液洗涤，无水mgso4干燥。柱层析纯化，洗脱剂：v(石油醚)∶v(乙酸乙酯)＝10∶1，得到白色固体3.6g，ms(m/z)为524[m 18]

，核磁如下：hnmr(cdcl3，250mhz)，δ:5.4(d，1h，j＝3.9hz，6-ch-cholesterol)；4.6(m，1h，3-ch-cholesterol)；3.8(s，2h，ch2br)；0.6～2.25(m，43h，cholesterol protons)，即得胆固醇溴乙酸酯。
[0072]
实施例5麦角固醇溴乙酸酯的合成
[0073]
将4.4g溴乙酸(结构见图17b)、5.0g麦角固醇、8.5gedci及77mg dmap溶于35ml二
氯甲烷(dcm)中，冰浴下搅拌反应30min，然后继续在室温下反应12h，依次用饱和nahco3和饱和nacl水溶液洗涤，无水mgso4干燥。柱层析纯化，洗脱剂：v(石油醚)∶v(乙酸乙酯)＝10∶1，得到白色固体3.2g，ms(m/z)为534[m 18]

，核磁如下：1h nmr(cdcl3，400mhz)，δ：5.58-5.56(m，1h)；5.39-5.38(m，1h)；5.22-5.18(m，2h)；3.8(s，2h，ch2br)；2.49-2.44(m，1h)；2.28(t，1h，j＝12hz)；1.91-1.90(m，3h)；1.88-1.87(m，3h)；1.55-1.25(m，16h)；1.04-1.01(m，2h)；0.95-0.91(m，5h)；0.85-0.80(m，5h)；0.63(s，2h)，即得麦角固醇溴乙酸酯。
[0074]
实施例6胆固醇吡啶酸酯的合成
[0075]
精密称定184mg吡啶酸(结构见图17a)、300mg的胆固醇、4.7mg的dmap(4-二甲基吡啶)溶于3ml的二氯甲烷中，再向其中加入178mg的edci，于0℃反应30min，继续在25℃反应6hr，，路线见图18。监测(菲律宾菌素(filipin)用于胆固醇显色，其他物质均在紫外(254nm)显色)pe：ea＝5：1，rf＝0.35。加入2ml水淬灭反应，在加入5ml乙酸乙酯萃取，经充分混匀后，待静置分离出上层液体(有机相)；水相再加入5ml乙酸乙酯萃取，重复操作，直到水相没有产品。将有机相合并，加入饱和食盐水，充分摇晃，分离有机相，再加入无水na2so4干燥，最后有机相减压除去溶剂可得417mg黄色油状物。将417mg粗品加上1.5倍200-300目硅胶拌样，干法装柱，填柱比例为30：1，洗脱剂为pe：ea＝100：1-20：1，最后得100mg无色固体。经hplc和hnmr检测，hnmr证明了其结构的正确性，见图19a。以及hplc(方法：色谱柱：zorbax sb-c18(4.6mm
×
250mm，5μm)；流动相：甲醇100％；流速：1ml/min；柱温：30℃；检测波长：220nm；进样量：20μl)证明其纯度约为85％，即得胆固醇吡啶酸酯，见图19b。
[0076]
实施例7 cgykk-胆固醇耦合物的合成
[0077]
将肽链cgykk(53.8mg)溶于0.5ml dmf中，将胆固醇酯(50.0mg)溶于0.5ml dmf中滴加于肽链cgykk的溶液中，于25℃反应2小时。pe：ea＝5:1，rf＝0.02。加入2ml水淬灭反应，在加入1ml乙酸乙酯萃取，经充分混匀后，待静置分离出上层液体(有机相)；水相再加入1ml乙酸乙酯萃取，重复操作，直到水相没有产品。将有机相合并，加入饱和食盐水，充分摇晃，分离有机相，再加入无水na2so4干燥，最后有机相减压除去溶剂可得45mg黄色油状物质。经真空干燥箱干燥24小时，可得30mg淡黄色固体。产品经hplc(方法：色谱柱：zorbax sb-c18(4.6mm
×
250mm，5μm)；流动相：a水25％,b甲醇75％；流速：1ml/min；柱温：30℃；检测波长：220nm；进样量：20μl)检测，纯度约为95％，见图20b，并经maldi-tof检测，maldi-tof检测其ms值为[m 18]

，见图20a，即得cgykk-胆固醇耦合物。
[0078]
实施例8 cgyrr-胆固醇耦合物的合成
[0079]
将肽链cgyrr(109.1mg)溶于0.5ml dmf中，将胆固醇酯(50.0mg)溶于0.5ml dmf中滴加于肽链cgyrr的溶液中，于25℃反应2小时。pe：ea＝5：1，rf＝0.02。加入2ml水淬灭反应，在加入1ml乙酸乙酯萃取，经充分混匀后，待静置分离出上层液体(有机相)；水相再加入1ml乙酸乙酯萃取，重复操作，直到水相没有产品。将有机相合并，加入饱和食盐水，充分摇晃，分离有机相，再加入无水na2so4干燥，最后有机相减压除去溶剂可得67mg黄色油状物质。经真空干燥箱干燥24小时，可得53mg淡黄色固体。产品经hplc(方法：色谱柱：zorbax sb-c18(4.6mm
×
250mm，5μm)；流动相：a水25％,b甲醇75％；流速：1ml/min；柱温：30℃；检测波长：220nm；进样量：20μl)检测，纯度约为81％，见图21b，并经maldi-tof检测，maldi-tof检测其ms值为[m 18]

，见图21a，即得cgyrr-胆固醇耦合物。
[0080]
实施例9 cgyyk-胆固醇耦合物的合成
[0081]
将肽链cgyyk(105.6mg)溶于0.5ml dmf中，将胆固醇酯(50.0mg)溶于0.5ml dmf中滴加于肽链cgyyk的溶液中，于25℃反应2小时。pe：ea＝5：1,rf＝0.02。加入2ml水淬灭反应，在加入1ml乙酸乙酯萃取，经充分混匀后，待静置分离出上层液体(有机相)；水相再加入1ml乙酸乙酯萃取，重复操作，直到水相没有产品。将有机相合并，加入饱和食盐水，充分摇晃，分离有机相，再加入无水na2so4干燥，最后有机相减压除去溶剂可得56mg黄色油状物质。经真空干燥箱干燥24小时，可得38mg淡黄色固体。产品经hplc(方法：色谱柱：zorbax sb-c18(4.6mm
×
250mm，5μm)；流动相：a水25％,b甲醇75％；流速：1ml/min；柱温：30℃；检测波长：220nm；进样量：20μl)检测，纯度约为90％，见图22b，并经maldi-tof检测，maldi-tof检测其ms值为[m 18]

，见图22a，即得cgykk-胆固醇耦合物。
[0082]
实施例10麦角固醇吡啶酸酯的合成
[0083]
精密称定89mg吡啶酸、150mg的麦角固醇、2.3mg的dmap溶于3ml的二氯甲烷中，再向其中加入87mg的edci，于0℃反应30min，继续在25℃反应8hr，路线见图23。pe：ea＝5：1，产品麦角固醇酯rf＝0.35。加入2ml水淬灭反应，在加入5ml乙酸乙酯萃取，经充分混匀后，待静置分离出上层液体(有机相)；水相再加入5ml乙酸乙酯萃取，重复操作，直到水相没有产品。将有机相合并，加入饱和食盐水，充分摇晃，分离有机相，再加入无水na2so4干燥，最后有机相减压除去溶剂可得150mg黄色固体。将150mg粗品加上1.5倍200-300目硅胶拌样，干法装柱，填柱比例为30：1，洗脱剂为pe：ea＝100：1-20：1，最后得30mg白色固体。产品经hnmr和hplc检测，hnmr证明了其结构的正确性，见图24a。hplc(方法：色谱柱：zorbax sb-c18(4.6mm
×
250mm，5μm)；流动相：甲醇100％；流速：1ml/min；柱温：30℃；检测波长：220nm；进样量：20μl)检测其纯度约为85％，见图24b，即得麦角固醇吡啶酸酯。
[0084]
实施例11 cgykk-麦角固醇耦合物的合成
[0085]
将肽链cgykk(21.1mg,1.05eq,0.035mmol)溶于0.5ml dmf中，将麦角固醇酯(20.0mg,1.0eq,0.033mmol)溶于0.5ml dmf中滴加于肽链cgykk的溶液中，于25℃反应2小时。pe:ea＝5:1,rf＝0.02。加入2ml水淬灭反应，在加入1ml乙酸乙酯萃取，经充分混匀后，待静置分离出上层液体(有机相)；水相再加入1ml乙酸乙酯萃取，重复操作，直到水相没有产品。将有机相合并，加入饱和食盐水，充分摇晃，分离有机相，再加入无水na2so4干燥，最后有机相减压除去溶剂可得40mg黄色油状物质，经真空干燥箱干燥24h,可得20mg淡黄色固体。产品经maldi-tof和hplc检测，maldi-tof检测其ms值为[m 1]

，见图25a。hplc(方法：色谱柱：zorbax sb-c18(4.6mm
×
250mm，5μm)；流动相：a水25％，b甲醇75％；流速：1ml/min；柱温：30℃；检测波长：220nm；进样量：20μl)检测其纯度约为95％，见图25b。即得cgykk-麦角固醇耦合物。
[0086]
实施例12 cgyrr-麦角固醇耦合物的合成
[0087]
将肽链cgyrr(42.7mg)溶于0.5ml dmf中，将麦角固醇酯(20.0mg)溶于0.5ml dmf中滴加于肽链cgyrr的溶液中，于25℃反应2小时。pe:ea＝5:1，rf＝0.02。加入2ml水淬灭反应，在加入1ml乙酸乙酯萃取，经充分混匀后，待静置分离出上层液体(有机相)；水相再加入1ml乙酸乙酯萃取，重复操作，直到水相没有产品。将有机相合并，加入饱和食盐水，充分摇晃，分离有机相，再加入无水na2so4干燥，最后有机相减压除去溶剂可得36mg黄色油状物质，经真空干燥箱干燥24h,可得22mg淡黄色固体。产品经maldi-tof和hplc检测，maldi-tof检测其ms值为[m 18]

，见图26a。产品经hplc检测，hplc(方法：色谱柱：zorbax sb-c18
(4.6mm
×
250mm，5μm)；流动相：a水25％，b甲醇75％；流速：1ml/min；柱温：30℃；检测波长：220nm；进样量：20μl)检测其纯度约为84％，见图26b。即得cgyrr-麦角固醇耦合物。
[0088]
实施例13 cgyyk-麦角固醇耦合物
[0089]
将肽链cgyyk(41.3mg)溶于0.5ml dmf中，将麦角固醇酯(20.0mg)溶于0.5ml dmf中滴加于肽链cgyyk的溶液中，于25℃反应2小时。pe：ea＝5：1，rf＝0.02。加入2ml水淬灭反应，在加入1ml乙酸乙酯萃取，经充分混匀后，待静置分离出上层液体(有机相)；水相再加入1ml乙酸乙酯萃取，重复操作，直到水相没有产品。将有机相合并，加入饱和食盐水，充分摇晃，分离有机相，再加入无水na2so4干燥，最后有机相减压除去溶剂可得41mg黄色油状物质，经真空干燥箱干燥24h，可得24mg淡黄色固体。产品经maldi-tof和hplc检测，maldi-tof检测其ms值为[m 18]

，见图27a。产品经hplc检测，hplc(方法：色谱柱：zorbax sb-c18(4.6mm
×
250mm，5μm)；流动相：a水25％，b甲醇75％；流速：1ml/min；柱温：30℃；检测波长：220nm；进样量：20μl)检测其纯度约为93％，见图27b。即得cgyyk-麦角固醇耦合物。
[0090]
实施例14 cgykk-胆固醇耦合物脂质体制备
[0091]
以实施例7所得cgykk-胆固醇耦合物为主要脂质材料，制备脂质体；操作如下：先称取14.96mg的dotap和14.88mg的dope和7mg的cgykk-胆固醇耦合物，溶于3ml三氯甲烷中，37℃减压旋转蒸发除去有机溶剂，在瓶壁形成一层薄膜；接着，加入2.99ml无核酸酶水在55℃条件下水化20min；然后将脂质体转入西林瓶中，使用超声波细胞粉碎机超声处理脂质体5min，过0.22μm滤膜后得到阳离子脂质体。将此阳离子脂质体与egfp mrna以质量比8:1混合，孵育20min，则可以制得包载有egfp mrna的脂质体。
[0092]
实施例15 cgyrr-胆固醇耦合物脂质体制备
[0093]
以实施例8所得cgyrr-胆固醇耦合物为主要脂质材料，制备脂质体；操作如下：先称取19.26mg的dotap、5.129mg的dope、5.06mg的dppc和7mg的cgyrr-胆固醇耦合物，再加入3.14mg香豆素-6一起溶于3ml三氯甲烷中，37℃减压旋转蒸发除去有机溶剂，在瓶壁形成一层薄膜；接着，加入5.16ml无核酸酶水在55℃条件下水化20min；然后将脂质体转入西林瓶中，使用超声波细胞粉碎机探头超声处理脂质体5min，过0.22μm滤膜后得到阳离子脂质体。
[0094]
实施例16 cgyyk-胆固醇耦合物脂质体制备
[0095]
以实施例9所得cgyyk-胆固醇耦合物为主要脂质材料，制备脂质体；操作如下：先称取18.87mg的dotap、5.129mg的dope、4.95mg的dppc和7mg的cgyyk-胆固醇耦合物，再加入3.59mg香豆素-6一起溶于3ml三氯甲烷中，37℃减压旋转蒸发除去有机溶剂，在瓶壁形成一层薄膜；接着，加入5.07ml无核酸酶水在55℃条件下水化20min；然后将脂质体转入西林瓶中，使用超声波细胞粉碎机探头超声处理脂质体5min，过0.22μm滤膜后得到阳离子脂质体。
[0096]
对比例1
[0097]
市售常用转染试剂lipo2000。
[0098]
实验例1
[0099]
将实施例1、实施例2、实施例3所得的cgykk、cgyrr、cgyyk，用maldi tof-ms确证分子量，结果如表1。
[0100]
表1
[0101][0102]
由表1可知，maldi tof-ms为[m-1]-,经确定肽链ms正确。
[0103]
实验例2
[0104]
将实施例7、实施例8、实施例9所得的cgykk-胆固醇耦合物、cgyrr-胆固醇耦合物、cgyyk-胆固醇耦合物，用maldi tof-ms确证分子量，结果如表2。
[0105]
表2
[0106][0107]
实验例3
[0108]
将实施例11、实施例12、实施例13所得的cgykk-麦角固醇耦合物、cgyrr-麦角固醇耦合物、cgyyk-麦角固醇耦合物，用maldi tof-ms确证分子量，结果如表3。
[0109]
表3
[0110][0111][0112]
实验例4粒径电位测定
[0113]
将制得的实施例15稀释适当倍数后，使用malvern nano-zs 90激光粒度仪，在室温条件下分析脂质体的粒径和电位。由图28看出其粒径为110nm左右，粒径均＜200nm，多分散系数＜0.2，表明分散度良好。
[0114]
电位为 40mv左右，证明其带正电，是阳离子脂质体。
[0115]
实验例5透射电镜试验
[0116]
在铜网上滴加实施例14所制备的脂质体，用滤纸吸干后加入磷钨酸晾干。通过透射电镜tem，确定化合物脂质体形态。由图29可以看出脂质体为均匀分散的球形。
[0117]
实验例6细胞摄取实验
[0118]
培养hepg2细胞以5
×
104/ml铺板于6孔板，放入培养箱进行培养36h。吸出原有培养基加入1ml pbs清洗后，加入1ml溶酶体(lso-track-red)染料，1ml-hoechest染色液，同时加入实施例15，实施例16各60μl于细胞培养板中，在37℃细胞培养箱中培养30-45min后吸走染色液，每隔5min用1ml pbs清洗一次，洗两次后留下pbs溶液进行倒置荧光显微镜拍照。从图30可以看出，实施例15，实施例16可通过细胞膜进入细胞，表明其具有良好的摄取能力。
[0119]
实验例7转染效率实验
[0120]
培养hek-293细胞，以细胞密度1
×
105/ml铺6孔板，细胞培养箱中培养24h后。将对比例1稀释10倍后取1ml加入细胞培养板第一个孔中，然后加入实施例14制备的脂质体60μl于细胞培养板第二个孔中。接着孵育24h后通过流式细胞仪进行测定。如图31可以看出，实施例14的转染效率高达66.70％，对比例1的转染效率为48.30％，证明实施例14具有较高转染效率。
[0121]
实验例8化合物细胞毒性实验
[0122]
培养hepg2细胞，以细胞密度1
×
10
5/
ml铺96孔板，细胞培养箱中培养24h，继而分别对实施例7、实施例8、实施例9、实施例11、实施例12、实施例13以相同剂量进行细胞毒性mtt实验，其细胞存活率实验结果见附图32。从结果可以看出化合物毒性较小，且细胞存活率很高。
[0123]
实验例9脂质体毒性实验
[0124]
培养hek-293细胞，以细胞密度1
×
105/ml铺96孔板，细胞培养箱中培养24h，继而分别以对比例1、和实施例15、实施例16以相同剂量进行细胞毒性mtt实验，结果见附图33。并且可以明显看出细胞存活率高，毒性小。
[0125]
综上所述，在脂质体处方中添加cgykk-胆固醇耦合物、cgyrr-胆固醇耦合物、cgyyk-胆固醇耦合物一方面可提高载体细胞转染效率，一方面可降低其细胞毒性，是可添加于纳米药物递送系统中的优质新型脂质材料。