一种评估橡胶树白粉菌遗传转化体系转化效率的方法

3’；hindiii序列为5
‘‑
aagctt-3’。
13.进一步的，所述第二酶切位点为bamhi，其中：bamhi序列为5
‘‑
ggatcc-3’。
14.本发明还提出一种用于评估橡胶树白粉菌转化体系转化效率的重组丝状真菌，所述重组丝状真菌为采用上述的重组质粒转化橡胶树白粉菌而得。
15.本发明提出上述的重组质粒应用于评估橡胶树白粉菌转化体系转化效率。
16.本发明还提出一种评估橡胶树白粉菌遗传转化体系转化效率的方法，包括以下步骤：
17.(1)采用上述的重组质粒转化至橡胶树白粉菌得到重组丝状真菌；
18.(2)将所述的重组丝状真菌接种至橡胶树古铜期叶片上进行培养；
19.(3)重组丝状真菌在橡胶树古铜期叶片上培养24小时后喷施10ng/μl的潮霉素b进行筛选；
20.(4)取发病叶片连同菌丝用gus染色液进行染色，判断gus报告基因是否转化成功，被染成蓝色的菌丝所对应的重组丝状真菌即为转化成功的转化子。
21.相比于现有技术，本发明具有如下优点：
22.(1)本发明提供了一种可用于转化橡胶树白粉菌等丝状真菌且可用于评估橡胶树白粉菌转化体系转化效率的重组质粒，此重组质粒携带由橡胶树白粉菌核糖体蛋白编码基因rp60启动子序列融合gus基因序列的重组报告基因。使用此重组质粒转化橡胶树白粉菌时，可对转化后获得的转化子菌丝进行简单的gus染色来判断报告基因是否转化成功，相比以往传统检测转化子的方法检测效率更高。
23.(2)本发明提供了一种评估橡胶树白粉菌转化体系转化效率的方法，此方法将携带gus报告基因的重组质粒转化橡胶树白粉菌孢子，转化后的橡胶树白粉菌孢子接种橡胶树古铜期叶片，并用潮霉素b进行筛选，长出的转化子只需要进行简单的gus染色就能判断是否转化成功，结果准确操作简单。
附图说明
24.图1为本发明提出的重组质粒的结构示意图。
具体实施方式
25.下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。
26.实施例1
27.一种重组质粒pjnarg-gus的构建
28.该重组质粒包含第一酶切位点、第二酶切位点、橡胶树白粉菌编码rp60基因启动子(橡胶树白粉菌erysiphe quercicola)、gus报告基因(大肠杆菌e.coli,扩增至pbi121质粒)、编码终止子基因和抗性基因。
29.其中：橡胶树白粉菌编码rp60基因启动子序列如序列3所示，gus报告基因序列如序列2所示，gus报告基因编码氨基酸序列如序列1所示。所述橡胶树白粉菌编码rp60基因启动子的序列位于gus报告基因序列上游；所述编码终止子基因的序列位于gus报告基因序列
下游；所述第一酶切位点位于橡胶树白粉菌编码rp60基因启动子序列上游；所述第二酶切位点位于编码终止子基因序列下游。所述抗性基因为氨苄青霉素抗性基因和潮霉素抗性基因。所述第一酶切位点为ecori和hindiii，其中：ecori序列为5
‘‑
gaattc-3’；hindiii序列为5
‘‑
aagctt-3’。所述第二酶切位点为bamhi，其中：bamhi序列为5
‘‑
ggatcc-3’。
30.上述重组质粒pjnarg-gus的构建，通过pcr分别扩增seq id no.2所示gus报告基因序列和seq id no.3所示rp60启动子基因序列，用split-pcr将rp60序列和gus序列进行融合。融合目的基因通过酶切连接的方法将重组基因整合到载体第一酶切位点和第二酶切位点之间。该重组质粒的结构图如图1所示。
31.重组质粒验证方法：通过pcr检测重组质粒，引物tf(5'-agcaatatatacacgtagta-3')和引物tr(5'-cattgtttgcctccct-3')检测。阳性质粒电泳后能检测到2200bp的条带。
32.实施例2
33.本发明提出一种评估橡胶树白粉菌遗传转化体系转化效率的方法，包括以下步骤：
34.(1)通过现有技术的电击转化法将上述重组质粒转化至橡胶树白粉菌，得到重组丝状真菌；转化方法为用电击缓冲液(10mm tris-cl ph 7.5，270mm蔗糖，1mm liac)将橡胶树白粉菌分生孢子配制成109个/ml孢子悬浮液；向0.2cm电击杯中加入150μl孢子悬浮液，10μg重组质粒，最终体积为200μl，冰上预冷15min；电转仪(bio-rad)参数设置为两次方波脉冲电压1.7kv,1ms,中间间隔5s，进行电击转化。
35.(2)将所述的重组丝状真菌接种至橡胶树古铜期叶片上在25℃温室中进行保湿培养；具体方法为转化后的孢子悬浮液离心，倒掉上清液后用蒸馏水将离心管底部孢子重悬浮定浓度至1
×
105个/ml。用10μl的移液器将孢子悬浮液滴到古铜期橡胶树叶片上,待叶片干后将橡胶树转移到恒温温室中25℃保湿培养。
36.(3)重组丝状真菌在橡胶树古铜期叶片上培养24小时后喷施10ng/μl的潮霉素b进行筛选；具体为重组丝状真菌在橡胶树古铜期叶片上培养24小时后喷施10ng/μl的潮霉素b，并继续在温室中培养4天。
37.(4)取发病叶片连同菌丝用gus染色液进行染色，判断gus报告基因是否转化成功，被染成蓝色的菌丝所对应的重组丝状真菌即为转化成功的转化子。具体为：取长有橡胶树白粉菌菌丝的橡胶树叶片置于玻璃瓶中，在瓶中加入gus染色液没过叶片，用真空泵抽取瓶中空气5分钟；在37℃条件下，遮光孵育24h；显微镜下观察菌丝颜色变化，颜色为蓝色的重组菌株即为转化成功菌株。
38.为了对比，本实施例进一步通过pcr检测转化子，三次实验检测转化子总数分别为22、15和17。相比pcr检测gus染色的准确率分别为100％，93.3％和100％。gus
阳
表示gus染色检测阳性转化子数目，pcr
阳
表示通过pcr检测阳性转化子数目。
[0039][0040]
pcr检测和gus染色检测方法对比
[0041]


技术特征：
1.一种重组质粒，其特征在于所述重组质粒包含第一酶切位点、第二酶切位点、橡胶树白粉菌编码rp60基因启动子、gus报告基因、编码终止子基因和抗性基因，其中：所述橡胶树白粉菌编码rp60基因启动子的序列位于gus报告基因序列上游；所述编码终止子基因的序列位于gus报告基因序列下游；所述第一酶切位点位于橡胶树白粉菌编码rp60基因启动子序列上游；所述第二酶切位点位于编码终止子基因序列下游。2.根据权利要求1所述的重组质粒，其特征在于所述抗性基因为氨苄青霉素抗性基因和潮霉素抗性基因。3.根据权利要求1所述的重组质粒，其特征在于所述第一酶切位点为ecori和hindiii，其中：ecori序列为5
‘‑
gaattc-3’；hindiii序列为5
‘‑
aagctt-3’。4.根据权利要求1所述的重组质粒，其特征在于，所述第二酶切位点为bamhi，其中：bamhi序列为5
‘‑
ggatcc-3’。5.一种用于评估橡胶树白粉菌转化体系转化效率的重组丝状真菌，所述重组丝状真菌为采用权利要求1-4任意一项所述的重组质粒转化至橡胶树白粉菌而得。6.权利要求1-4任意一项所述的重组质粒，其特征在于，应用于评估橡胶树白粉菌遗传转化体系转化效率。7.一种评估橡胶树白粉菌遗传转化体系转化效率的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将权利要求1-4任意一项所述的重组质粒转化至橡胶树白粉菌，得到重组丝状真菌；(2)将所述的重组丝状真菌接种至橡胶树古铜期叶片上进行培养；(3)重组丝状真菌在橡胶树古铜期叶片上培养后喷施潮霉素b进行筛选；(4)取发病叶片连同菌丝用gus染色液进行染色，判断gus报告基因是否转化成功，被染成蓝色的菌丝所对应的重组丝状真菌即为转化成功的转化子。8.根据权利要求7所述的评估橡胶树白粉菌遗传转化体系转化效率的方法，其特征在于，步骤(2)中培养温度为25℃。9.根据权利要求7所述的评估橡胶树白粉菌遗传转化体系转化效率的方法，其特征在于，步骤(3)具体为：重组丝状真菌在橡胶树古铜期叶片上培养24小时后喷施10ng/μl的潮霉素b，并继续在温室中培养4天。

技术总结
本发明公开了一种检测橡胶树白粉菌遗传转化效率的方法，所述方法包括如下步骤：将重组丝状真菌接种至橡胶树古铜期叶片上进行培养后喷施潮霉素B进行筛选，取发病叶片连同菌丝用GUS染色液进行染色，被染成蓝色的菌丝所对应的重组丝状真菌即为转化成功的转化子。本发明提供了一种可用于转化橡胶树白粉菌等丝状真菌且可用于评估橡胶树白粉菌转化体系转化效率的重组质粒，此重组质粒携带由橡胶树白粉菌核糖体蛋白编码基因RP60启动子序列融合GUS基因序列的重组报告基因。使用此重组质粒转化橡胶树白粉菌时，可对转化后获得的转化子菌丝进行简单的GUS染色来判断报告基因是否转化成功，相比以往传统检测转化子的方法检测效率更高。率更高。率更高。


技术研发人员：陈代朋 李潇 缪卫国 刘文波 林春花 李志刚
受保护的技术使用者：海南大学
技术研发日：2022.01.11
技术公布日：2022/5/31