鼻渊通窍颗粒多息药效预测特征图谱构建方法

1.本发明涉及一种中成药的特征图谱分析方法，具体涉及一种鼻渊通窍颗粒多息药效预测特征图谱构建方法。


背景技术：

2.鼻渊通窍颗粒由辛夷、炒苍耳子、麻黄、薄荷、黄芩、连翘、野菊花、天花粉、地黄、丹参、茯苓、白芷、藁本、甘草十四味中药材组成的中药复方制剂，具有疏风清热、宣肺通窍功效，用于急鼻渊（急性鼻窦炎）属外邪犯肺证，症见前额或额骨部压痛，鼻塞时作，流涕黏白或黏黄，或头痛，或发热，苔薄黄或白，脉浮。现临床上，已广泛用于治疗急、慢性鼻窦炎、应变性鼻炎、过敏性鼻炎等疾病。
3.目前，中国药典2020版一部标准中关于鼻渊通窍颗粒的现行成分检查主要包括：木兰脂素、盐酸麻黄碱、欧前胡素、黄芩苷、连翘、连翘苷、丹酚酸b的薄层色谱鉴别，hplc测定盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱的含量。鼻渊通窍颗粒由十四味中药材制成，原料多样、成分复杂，仅用薄层色谱法进行指标成分的定性鉴别，并采用高效液相色谱法测定盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱的含量，不足以全面反映鼻渊通窍颗粒的质量优劣。网络药理学融合了系统生物学、生物信息学、网络科学的学科，从网络分析的角度研究药物的作用机制，强调从系统层次和生物网络的整体角度出发，解析药物与治疗对象之间的分子关联，揭示药物的系统性药理机制，从而指导新药研发和临床诊疗可有效对中药进行药效物质预测，广泛应用于中药、中成药的药效物质及作用机制的研究。中药指纹图谱作为一项质量控制技术，能够较全面的控制药品质量，具有系统性、整体性和稳定性的特点。多息整合技术可以对多个波长的图谱进行信号数据的整合处理，通过对多个波长的图谱信息进行整合，体现在一张图谱上，可以解决单一波长无法较为全面的反映样品信息的问题。本发明利用该方法构建了鼻渊通窍颗粒多息药效预测特征图谱，科学的将药效信息反映在指纹图谱中，对鼻渊通窍颗粒的质量评价、质量控制与临床应用等具有重要意义，可优化企业对鼻渊通窍颗粒进行质量控制时的方法，降低成本。


技术实现要素：

4.针对上述问题，本发明的目的是针对现有鼻渊通窍颗粒的质量控制方法不完善，结合药效预测提供一种鼻渊通窍颗粒多息药效预测特征图谱构建方法。其特点是首先将鼻渊通窍颗粒化学成分通过网络药理学方法进行分析，从中预测其药效物质，其次将鼻渊通窍颗粒供试品溶液，经过hplc分离检测，获得鼻渊通窍颗粒3个波长的色谱数据，进行数据的多息整合，获得鼻渊通窍颗粒多息整合图谱，最后通过对照品比对确定特征峰构建鼻渊通窍颗粒多息药效预测特征图谱。
5.为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案。
6.本发明提供一种鼻渊通窍颗粒多息药效预测特征图谱，其特征在于：所述特征图谱中包含14种药效成分，其中（1）号峰为绿原酸、（2）号峰为咖啡酸、（3）号峰为阿魏酸、（4）
号峰为连翘酯苷a、（5）号峰为柚皮苷、（6）号峰为橙皮苷、（7）号峰为丹酚酸b、（8）号峰为黄芩苷、（9）号峰为槲皮素、（10）号峰为木犀草素、（11）号峰为汉黄芩苷、（12）号峰为蒙花苷、（13）号峰为黄芩素和（14）号峰为白杨素。
7.本发明还提供一种上述鼻渊通窍颗粒多息药效预测特征图谱的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）鼻渊通窍颗粒药效物质预测：a．鼻渊通窍颗粒活性物质筛选：通过uplc-q-tof-ms/ms技术挖掘鼻渊通窍颗粒的主要化学成分，并结合tcmsp数据库进行活性筛选，筛选条件为ob值≥30%、dl值≥0.18，将满足条件的成分视为活性物质；对于不满足筛选条件的通过“中国知网”数据库查询是否有文献报道具有药理作用或生物活性，对于有文献报道的成分视为活性物质，综合结果；b．鼻渊通窍颗粒活性物质潜在靶点预测：通过drugbank数据库、ttd数据库查询步骤a中活性物质的疗效靶点；通过sea数据库对步骤a中活性物质进行靶点预测，综合预测结果；c．鼻渊通窍颗粒活性物质潜在靶点kegg通路富集分析：通过david数据库对步骤b中鼻渊通窍颗粒活性物质潜在靶点进行kegg通路富集分析，并以“pvalue”值为条件，筛选富集结果前20的通路作为结果；d．鼻渊通窍颗粒“活性物质-靶点-通路”网络构建：通过cytoscape 3.8.2软件构建鼻渊通窍颗粒“活性物质-靶点-通路”网络；e．鼻渊通窍颗粒药效物质预测：对步骤d中“活性成分-靶点-通路”网络进行网络拓扑分析，将包含在网络中的活性成分作为鼻渊通窍颗粒药效物质；（2）供试品溶液的配制：取鼻渊通窍颗粒适量，研细，精密称定细粉，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇，密塞，称定质量，超声处理，放冷，称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，过滤，取续滤液；（3）混合对照品溶液的配制：取各对照品适量，精密称定，加甲醇制成混合对照品溶液，于4℃保存，待用；（4）色谱条件的确定：色谱柱为poroshell 120 sb-c
18
（4.6
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m）；流动相a为0.1%甲酸水溶液，流动相b为甲醇溶液，梯度洗脱；柱温30℃；检测波长286 nm、300 nm、330 nm；体积流量0.8 ml/min；进样量为5 μl；（5）多息整合：将286 nm、300 nm、330 nm三个波长的色谱数据利用matlab软件编程进行多息整合，得到一张同时整合3个波长信息的色谱图和1组图谱数据；（6）特征峰的确定及特征图谱的制作：按照步骤（4）中的色谱条件对步骤（2）、步骤（3）中的供试品溶液和混合对照品溶液进行分析检测，按照步骤（5）的多息整合方法进行信息整合；用指纹图谱软件处理得到供试品溶液指纹图谱以及混合对照品溶液指纹图谱，对比供试品溶液指纹图谱和混合对照品溶液指纹图谱，选择两图谱中分离度较好的共有峰作为特征峰，并构建特征图谱。
8.进一步地，步骤（1）所述的鼻渊通窍颗粒药效物质预测包括：阿魏酸、白杨素、橙皮苷、丹参酮iia、丹酚酸b、东莨菪内酯、甘草次酸、甘草苷、甘草酸、汉黄芩苷、红景天苷、槲皮
素、黄芩苷、黄芩素、咖啡酸、连翘脂苷a、绿原酸、蒙花苷、木犀草素、柚皮苷共20个。
9.进一步地，步骤（2）所述的供试品溶液，按如下步骤配制：取鼻渊通窍颗粒适量，研细，精密称定细粉，置具塞锥形瓶中，精密加入50%-70%甲醇，密塞，称定质量，超声处理（功率700 w，频率40 khz）60 min，放冷，称定质量，用50%-70%甲醇补足减失的质量，摇匀，过滤，取续滤液，0.22
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m微孔滤膜过滤，即得。
10.进一步地，步骤（3）所述的混合对照品溶液，按如下步骤配制：取各对照品适量，精密称定，加甲醇制成含药效预测物质的混合对照品溶液，于4℃保存，待用。
11.进一步地，步骤（4）所述梯度洗脱条件如下：。
12.进一步地，步骤（6）中使用国家药典委员会推荐的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012》软件分析，得到鼻渊通窍颗粒多息药效预测特征图谱。
13.更进一步地，特征图谱中包含20个药效成分中的14个作为鼻渊通窍颗粒特征图谱的特征峰，其中（1）号峰为绿原酸、（2）号峰为咖啡酸、（3）号峰为阿魏酸、（4）号峰为连翘酯苷a、（5）号峰为柚皮苷、（6）号峰为橙皮苷、（7）号峰为丹酚酸b、（8）号峰为黄芩苷、（9）号峰为槲皮素、（10）号峰为木犀草素、（11）号峰为汉黄芩苷、（12）号峰为蒙花苷、（13）号峰为黄芩素和（14）号峰为白杨素。
14.与现有技术相比本发明的有益效果。
15.（1）本发明首次对鼻渊通窍颗粒的药效物质进行分析预测，并将药效信息与指纹图谱结合构建反映药效信息的特征图谱。
16.（2）本发明首次创建了鼻渊通窍颗粒的特征图谱，优选了色谱条件、检测波长、温度、流量、梯度洗脱程序等，所得的特征图谱特征峰峰型好、分离度高，检测方法简便、高效。
17.（3）本发明首次创建了鼻渊通窍颗粒多息整合的特征图谱和对照特征图谱，通过计算机软件编程，对鼻渊通窍颗粒3波长图谱信息进行整合，得到反映更多信息的图谱，后利用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版》软件分析，得到鼻渊通窍颗粒多息整合的特征图谱和对照特征图谱，可为鼻渊通窍颗粒提供更为准确、全面的质量评价与控制的手段。
18.（4）本发明通过对照品比对鉴定出绿原酸、咖啡酸、阿魏酸、连翘酯苷a、橙皮苷、柚皮苷、丹酚酸b、黄芩苷、槲皮素、木犀草素、汉黄芩苷、蒙花苷、黄芩素、白杨素14个化学成分，进一步阐释了鼻渊通窍颗粒的化学物质基础。
19.（5）本发明通过构建鼻渊通窍颗粒多息药效预测特征图谱，为企业提供一种操作简单且信息丰富的可用于产品质量评价的方法，可有效降低生产成本、提高产品质量和安
全性。
附图说明
20.图1为鼻渊通窍颗粒潜在靶点kegg通路富集图。
21.图2为鼻渊通窍颗粒“活性物质-靶点-通路”。
22.图3为鼻渊通窍颗粒286 nm色谱图。
23.图4为鼻渊通窍颗粒300 nm色谱图。
24.图5为鼻渊通窍颗粒330 nm色谱图。
25.图6为鼻渊通窍颗粒多息整合色谱图。
26.图7为14个特征峰混合对照品多息整合色谱图。
27.图8为鼻渊通窍颗粒多息药效预测特征图谱叠加图。
28.图9为鼻渊通窍颗粒对照特征图谱。
具体实施方式
29.下面结合具体实例进一步阐述本发明，应当理解为以下实例仅用于表述本发明的技术方案，而不用来限制本发明的保护范围。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，所做的显而易见的修饰及改进也属于本发明的保护范围。
30.实例1鼻渊通窍颗粒多息药效预测特征图谱构建。
31.1仪器与试药。
32.1.1仪器：agilent 1290 infinity超高效液相色谱仪（美国安捷伦科技有限公司，包括高压二元梯度泵、自动进样器、柱温箱、dad检测器、agilent 1290色谱工作站）。
33.1.2 试药：鼻渊通窍颗粒10批（山东新时代药业有限公司，批号002210540、002210541、002210542、002210543、002210544、002210545、002210601、002210602、002210603、002210604，编号s1~s10）；乙腈（色谱纯，默克股份两合公司）；甲醇（色谱纯，默克股份两合公司）；甲酸（色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）；水为纯净水。
34.2 方法与结果。
35.2.1 鼻渊通窍颗粒药效物质预测。
36.2.1.1 鼻渊通窍颗粒活性物质筛选：通过超高效液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱（uplc-q-tof-ms/ms）挖掘鼻渊通窍颗粒的主要成分102个化合物，并结合tcmsp数据库进行活性筛选，筛选条件为ob值≥30%、dl值≥0.18，将满足条件的成分视为活性物质。对于不满足筛选条件的通过“中国知网”数据库查询是否有文献报道具有药理作用或生物活性，对于有文献报道的成分视为活性物质。综合结果，共筛选出鼻渊通窍颗粒37个活性物质。
37.2.1.2 鼻渊通窍颗粒活性物质潜在靶点预测：通过drugbank数据库、ttd数据库查询鼻渊通窍颗粒活性物质的疗效靶点；通过sea数据库进行鼻渊通窍颗粒活性物质潜在靶点预测。综合结果，共得到鼻渊通窍颗粒的20个活性成分的233个潜在靶点，其中有17个活性成分未查询到可靠靶点。
38.2.1.3鼻渊通窍颗粒活性物质潜在靶点kegg通路富集分析：通过david数据库对233个靶点进行kegg通路富集分析，以“pvalue”值为条件筛选富集结果前20的通路作为结果，结果见附图1。
39.2.1.4鼻渊通窍颗粒“活性物质-靶点-通路”网络构建：通过cytoscape 3.8.2软件构建鼻渊通窍颗粒“活性物质-靶点-通路”网络，结果见附图2。利用cytoscape 3.8.2软件中的“analyze network”插件对网络进行拓扑分析，分析结果表示该网络有139个节点和603条边，其中包含20个活性成分、99个潜在靶点、20条通路。20个活性成分都包含着网络中，均有可能是鼻渊通窍颗粒的药效成分，因此将这20个活性成分作为鼻渊通窍颗粒药效物质预测结果，见表1。
40.表1鼻渊通窍颗粒药效物质预测结果。
41.2.2 色谱条件：色谱柱为poroshell 120 sb-c
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100 mm，2.7
µ
m）；流动相为0.1%甲酸水溶液（a）-甲醇溶液（b），梯度洗脱，见表2；柱温30℃；检测波长286 nm、300 nm、330 nm；体积流量0.8 ml/min；进样量5
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42.表2梯度洗脱条件。
43.2.3多息整合方法：通过dad检测器对鼻渊通窍颗粒色谱图进行紫外全波长(190～400 nm)扫描，根据扫描结果确定286 nm、300 nm、330 nm下信息较多且可相互补充，因此选择这3个波长进行整合。分别从agilent 1290色谱工作站中导出286 nm、300 nm、330 nm的csv格式数据文件，使用matlab软件编程，对csv格式数据进行多息整合，得到同时整合3个波长信息的色谱图和1组图谱数据，见附图3-6。
44.2.4 供试品溶液的制备：取鼻渊通窍颗粒适量，研细，精密称定细粉5.0 g，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇25 ml，密塞，称定质量，超声处理（功率700 w，频率40 khz）60 min，放冷，称定质量，用50%甲醇补足减失的质量，摇匀，过滤，取续滤液，0.22
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m微孔滤膜过滤，即得。
45.2.5 混合对照品溶液的制备：取各对照品适量，精密称定，加甲醇分别制成含绿原酸58
µ
g/ml、咖啡酸16
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g/ml、阿魏酸83
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g/ml、连翘酯苷a 228
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g/ml、柚皮苷40
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g/ml、橙皮苷47
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g/ml、丹酚酸b 90
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g/ml、黄芩苷691
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g/ml、槲皮素53
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g/ml、木犀草素76
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g/ml、汉黄芩苷180
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g/ml、蒙花苷266
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g/ml、黄芩素12
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g/ml、白杨素12
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g/ml的混合对照品溶液，于4℃保存，待用。
46.2.6方法学考察。
47.2.6.1精密度考察：取同一供试品溶液（批号：0022105040），按“2.2”项下色谱条件重复进样6 次，进行测定，记录指纹图谱并进行多息整合。以7号峰（丹酚酸b）为参照峰，计算各个特征峰的相对保留时间和相对峰面积。结果表明，14个特征峰的相对保留时间的rsd均不大于0.33%，相对峰面积的rsd均不大于3.82%，结果表明仪器精密度良好。
48.2.6.2重复性考察：分别称取鼻渊通窍颗粒（批号：0022105040）6份，按“2.4”项下方法制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件，进样测定，记录指纹图谱并进行多息整合。以7号峰（丹酚酸b）为参照峰，计算各个特征峰的相对保留时间和相对峰面积。结果表明，14个特征峰的相对保留时间的rsd均不大于0.38%，相对峰面积的rsd均不大于3.74%，表明方法重复性良好。
49.2.6.3稳定性考察：取同一供试品溶液（批号：0022105040），分别于0，2，4，8，12，24 h按“2.2”项下色谱条件，进行测定，记录指纹图谱并进行多息整合。以7号峰（丹酚酸b）为参照峰，计算各个特征峰的相对保留时间和相对峰面积。结果表明，14个特征峰峰的相对保留时间的rsd均不大于0.32%，相对峰面积的rsd均不大于3.91%，表明供试品溶液在24 h内稳定。
50.2.7 特征峰的确定：按照“2.2”中的色谱条件对“2.4”、“2.5”中的供试品溶液和混合对照品溶液进行分析检测，按照“2.3”的多息整合方法进行整合。用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012》软件分析处理得到供试品溶液指纹图谱以及混合对照品溶液指纹图谱，对比供试品溶液指纹图谱和混合对照品溶液指纹图谱，将两图谱中分离度较好的共有峰作为特征峰。共确定了14个特征峰，其中1号峰为绿原酸、2号峰为咖啡酸、3号峰为阿魏酸、4号峰为连翘酯苷a、5号峰为柚皮苷、6号峰为橙皮苷、7号峰为丹酚酸b、8号峰为黄芩苷、9号峰为槲皮素、10号峰为木犀草素、11号峰为汉黄芩苷、12号峰为蒙花苷、13号峰为黄芩素、14号峰为白杨
素，保留时间依次为：13.256min、13.895min、21.61min、29.207min、30.141min、32.047min、38.911min、40.897min、43.583min、51.104min、52.696min、53.579min、60.263min、65.741min，见附图7，包含20个药效成分中的14个成分，占比70%，可作为整体药效预测的结果体现在特征图谱中，另有6个药效成分未在图谱中作为特征峰，原因可能为在选定波长中吸收较弱或含量较低。
51.2.8鼻渊通窍颗粒多息药效预测特征图谱及对照特征图谱的构建：取10批鼻渊通窍颗粒，按“2.4”项下方法制备供试品溶液，按“2.2”项下的色谱条件进行测定，记录指纹图谱并按“2.3”项下的整合方法进行多息整合，把10批鼻渊通窍颗粒多息整合图谱数据导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版》软件，以s1为参照峰，采用中位数法，进行多点校正和峰匹配，并生成对照图谱。得到10批鼻渊通窍颗粒特征图谱叠加图和对照特征图谱，分别见附图8、附图9。
52.与对照指纹图谱相比，计算相似度，结果s1～s10样品的相似度分别为1、0.999、1、1、0.999、0.999、1、1、1、1。10批鼻渊通窍颗粒的指纹图谱的相似度均＞0.99，表明10批鼻渊通窍颗粒的质量均一稳定，化学物质组差异小，形成的对照图谱可以作为衡量鼻渊通窍颗粒质量的标准参照物。