单倍体诱导基因的应用

1.本发明属于植物育种领域，具体涉及一种与玉米单倍体诱导有关的基因。本发明提供了该基因的核酸和氨基酸序列以及利用基因编辑方法编辑基因序列，创制单倍体诱导系的方法，同时公开了创制获得的单倍体诱导系的编辑后基因序列。


背景技术：

2.单倍体在植物遗传育种中具有重要意义。单倍体育种一般只需要两年就能获得纯合的自交系，比常规方法缩短育种周期3-5年。同时，单倍体育种的选择效率更高，且有利于准确筛选隐性突变体。此外，单倍体技术还广泛应用于自交系的提纯复壮、遗传材料的创制以及作物数量遗传的应用研究等领域。
3.在单倍体育种领域，玉米单倍体育种技术的应用最为成功，这主要得益于天然玉米高频单倍体诱导系stock 6等的应用。当stock 6做父本时，可以形成只保留母本基因组的单倍体，结合r1-nj颜色标记，单倍体的选择效率大大提高。通过数十年的遗传改良，诱导率在10-12％的诱导系已经非常常见(dong x,xu x,miao j,et al.fine mapping of qhir1 influencing in vivo haploid induction in maize[j].theoretical&applied genetics,2013,126(7):1713-1720.)。通过单倍体诱导系诱导获得dh纯系是目前玉米常规育种工作中最有经济意义的方法，美国是玉米单倍体诱导系育种的发源地，目前国外大约60％的马齿型自交系及30％的硬粒型自交系都由单倍体技术选育而来的(徐艳霞.stock6在玉米自交系选育中的应用[j].黑龙江农业科学，2014，(11)：157-159.)。因此，单倍体诱导系的应用与发展在农作物遗传育种中具有重大意义。然而，具有天然诱导系功能的种质资源有限，通过传统育种培育诱导系也十分困难。另外，在玉米之外的作物上，由于没有类似stock 6这样的天然诱导系，人工培育诱导系更加困难。
[0004]
研究证实，单倍体诱导系stock 6的诱导能力是受多个数量性状位点控制的遗传性状，其中两个主效qtl qhir1和qhir8，分别可以解释66％和20％的表型变异(prigge v,xu x,li l,et al.new insights into the genetics of in vivo induction of maternal haploids,the backbone of doubled haploid technology in maize[j].genetics,2012,190(2):781-93.)。其中qhir8位点被精细定位在789kb的区间内(liu c,li w,zhong y,et al.fine mapping of qhir8 affecting in vivo haploid induction in maize[j].theoretical and applied genetics,2015,128(12):2507-2515.)；qhir1位点也已经被精细定位和克隆，并明确了控制该位点的功能基因为zmpla1/matl/nld(liu c,li x,meng d,et al.a 4-bp insertion at zmpla1 encoding a putative phospholipase a generates haploid induction in maize[j].mol plant,2017,10(3):520-522；kelliher t,starr d,richbourg l,et al.matrilineal,a sperm-specific phospholipase,triggers maize haploid induction[j].nature,2017,542(7639):105-109；gilles l m,khaled a,laffaire,j b,et al.loss of pollen-specific phospholipase not like dad triggers gynogenesis in maize[j].the embo journal,
id no.27所示的组合；
[0019]
(2)编码(1)所述sgrna的dna分子；
[0020]
(3)表达(1)所述sgrna的载体。
[0021]
本发明还提供一种玉米单倍体诱导系突变基因和突变蛋白，其特征在于：所述突变基因序列为seq id no.16或seq id no.17或seq id no.22或seq id no.28所示；所述突变蛋白的氨基酸序列如seq id no.18或seq id no.19或seq id no.23或seq id no.29所示。这些突变基因或突变蛋白可以通过常规杂交授粉的方式转育到其他玉米材料或玉米品种中，从而培育新的单倍体诱导系。
[0022]
本发明的优点及有益效果如下：本发明通过将野生型与单倍体诱导系材料的多组学数据进行整合分析，从183个过氧化物酶基因中，逐步筛选到在配子体发育时期分子层面存在差异，会影响ros含量，进而可能导致单倍体诱导的3个功能基因grmzm2g442008、grmzm2g122816和grmzm2g063435，并进一步验证了这3个基因的单倍体诱导功能。之前的技术资料并未给出这3个基因与玉米单倍体诱导相关的技术启示。本发明提供了新的单倍体诱导相关基因及蛋白，并提供了创制单倍体诱导系的新方法，同时公开了创制获得的单倍体诱导系的编辑后基因序列。
附图说明
[0023]
图1玉米140个过氧化物酶基因的表达谱。
[0024]
图2zmpod65、zmpod60-1、zmpod60-2在配子体发育第二次有丝分裂至三核花粉时期特异表达。
[0025]
图3蛋白定位结果，箭头指示荧光信号和精细胞位置。
[0026]
图4基因编辑玉米的穗部表型，方框中指示败育籽粒。
[0027]
图5zmpod65靶标1基因编辑材料的流式细胞鉴定结果。
[0028]
图6zmpod65靶标2基因编辑材料的流式细胞鉴定结果。
具体实施方式
[0029]
提供以下定义和方法用以更好地界定本技术以及在本技术实践中指导本领域普通技术人员。除非另作说明，术语按照相关领域普通技术人员的常规用法理解。本文所引用的所有专利文献、学术论文、行业标准及其他公开出版物等，其中的全部内容整体并入本文作为参考。
[0030]
如本文所用，“玉米”是任何玉米植物并包括可以与玉米育种的所有植物品种，包括整株植物、植物细胞、植物器官、植物原生质体、植物可以从中再生的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物或植物部分中完整的植物细胞，所述植物部分例如胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、茎杆、根、根尖、花药等。“植物”包括对整株植物、植物器官、植物组织、种子和植物细胞以及它们的子代的标引。植物细胞包括但不限于来自种子、悬浮培养物、胚芽、分生区域、愈伤组织、叶、根、苗、配子体、孢子体、花粉和小孢子的细胞。“子代”包含植物的任何后续世代。
[0031]
在本技术中，将词语“包括”、“包含”或其变体应理解为除所描述的元素、数或步骤外，还包含其它元素、数或步骤。
[0032]
除非另有所指，核酸以5’至3’方向从左向右书写；氨基酸序列以氨基至羧基方向从左向右书写。氨基酸在本文可以用其通常所知的三字母符号或iupac-iub生物化学命名委员会推荐的单字母符号来表示。同样地，可以用通常接受的单字母码表示核苷酸。数字范围包括限定该范围的数字。如本文所用，“核酸”包括涉及单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸多聚物，并且除非另有限制，包括具有天然核苷酸基本性质的已知类似物(例如，肽核酸)，所述类似物以与天然存在的核苷酸类似的方式与单链核酸杂交。如本文所用，术语“编码”或“所编码的”用于特定核酸的上下文时，指该核酸包含指导该核苷酸序列翻译成特定蛋白的必需信息。使用密码子表示编码蛋白的信息。如本文所用，涉及特定多核苷酸或其所编码的蛋白的“全长序列”指具有天然(非合成)内源序列的整个核酸序列或整个氨基酸序列。全长多核苷酸编码该特定蛋白的全长、催化活性形式。本文可互换地使用术语“多肽”、“多肽”和“蛋白”，以指氨基酸残基的多聚物。该术语用于氨基酸多聚物，其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学类似物。该术语还用于天然存在的氨基酸多聚物。本文可互换地使用术语“残基”或“氨基酸残基”或“氨基酸”，以指被并入蛋白、多肽或肽(统称“蛋白”)的氨基酸。氨基酸可以是天然存在的氨基酸，并且除非另有限制，可以包括天然氨基酸的已知类似物，所述类似物可以与天然存在的氨基酸相似的方式起作用。
[0033]
在一些实施方案中，可以对本技术的核苷酸序列进行改变，以进行保守氨基酸替换。保守氨基酸替换的原则和实例在下文中进一步描述。在某些实施方案中，可以依照公开的单子叶密码子偏好性对本技术的核苷酸序列进行不改变氨基酸序列的替换，例如可以用单子叶植物偏好的密码子替换编码同一氨基酸序列的密码子，而不改变该核苷酸序列所编码的氨基酸序列。在一些实施方案中，以编码同一氨基酸序列的不同密码子替换本技术中的部分核苷酸序列，从而在改变核苷酸序列的同时不改变其编码的氨基酸序列。保守变体包括由于遗传密码子简并性而编码实施方案的蛋白中的一种的氨基酸序列的那些序列。在一些实施方案中，根据单子叶植物偏好密码子替换本技术中的部分核苷酸序列。本领域技术人员会认识到氨基酸添加和/或取代通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如，所述取代基的疏水性、电荷、大小等等。具有各种前述所考虑性质的示例性氨基酸取代基团为本领域技术人员所公知，并且包括精氨酸与赖氨酸；谷氨酸和天门冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。关于不影响目的蛋白生物学活性的适当氨基酸取代的指南可以在dayhoff等人(1978)atlas of protein sequence and structure(蛋白序列和结构图集)(natl.biomed.res.found.,washington,d.c)(通过引用并入本文)的模型中找到。可以进行诸如将一个氨基酸换作具有相似性质的另一个氨基酸的保守性取代。序列一致性的鉴定包括杂交技术。例如，将已知核苷酸序列的全部或部分用作与其它相应核苷酸序列选择性杂交的探针，所述其它相应核苷酸序列存在于来自所选生物体的已克隆基因组dna片段或cdna片段群(即基因组文库或cdna文库)。所述杂交探针可以是基因组dna片段、cdna片段、rna片段或其它寡核苷酸，并且可以用诸如32p的可检测基团或其它可检测标志物来标记。因而，例如，可以通过标记基于实施方案序列的合成寡核苷酸制备杂交探针。制备杂交探针和构建cdna及基因组文库的方法通常为本领域已知。可以在严紧条件下进行所述序列的杂交。如本文所用，术语“严紧条件”或“严紧杂交条件”表示如下条件，即在该条件下，相对于与其它序列杂交，探针将以可检测的更大程度(例如，背景
的至少2倍、5倍或10倍)与其靶序列杂交。严紧条件是序列依赖性的并且在不同环境中有所不同。通过控制杂交严紧性和/或控制清洗条件，可以鉴定与所述探针100％互补的靶序列(同源探针法)。可选择地，可以调节严紧条件，以允许一些序列错配，以便检测较低的相似度(异源探针法)。通常，探针长度少于约1000或500个核苷酸。通常，严紧条件是如下的条件，即在该条件中，盐浓度为ph 7.0至8.3下，少于约1.5m na离子，通常约0.01m至1.0m na离子浓度(或其它盐)，并且温度条件为：当用于短探针时(例如10到50个核苷酸)，至少约30℃；当用于长探针时(例如大于50个核苷酸)，至少约60℃。还可以通过添加诸如甲酰胺的去稳定剂来实现严紧条件。示例性的低严紧条件包括37℃下使用30％至35％的甲酰胺缓冲液、1m nacl、1％sds(十二烷基硫酸钠)杂交，50℃至55℃下在1
×
至2
×
ssc(20
×
ssc＝3.0m nacl/0.3m柠檬酸三钠)中清洗。示例性的中度严紧条件包括37℃下在40％至45％甲酰胺、1.0m nacl、1％sds中杂交，55℃至60℃下在0.5
×
至1
×
ssc中清洗。示例性的高严紧条件包括37℃下在50％甲酰胺、1m nacl、1％sds中杂交，60℃至65℃下在0.1
×
ssc中最后清洗至少约20分钟。任选地，清洗缓冲液可以包含约0.1％至约1％sds。杂交持续时间通常少于约24小时，通常为约4小时至约12小时。特异性通常依赖杂交后的清洗，关键因素在于最后清洗溶液的离子强度和温度。dna-dna杂合体的tm(热力学熔点)可以近似自meinkoth and wahl(1984)anal.biochem.138:267-284的公式：tm＝81.5℃ 16.6(logm) 0.41(％gc)-0.61(％甲酰胺)-500/l；其中m是一价阳离子的克分子浓度，％gc是dna中鸟苷和胞嘧啶核苷酸的百分数，“甲酰胺％”是杂交溶液的甲酰胺百分数，而l是杂合体的碱基对长度。tm是(确定的离子强度和ph下)50％的互补靶序列与完全匹配的探针杂交时的温度。通常将清洗至少进行至达到平衡，并且达到低的杂交背景水平，诸如进行2小时、1小时或30分钟。每1％的错配对应使tm降低约1℃；因而，可以调节tm、杂交和/或清洗条件，从而与所需一致性的序列杂交。例如，如果需要≥90％一致性的序列，可以将tm降低10℃。通常，将严紧条件选择为比确定离子强度和ph下的特异序列及其互补序列的tm低约5℃。然而，在非常严紧的条件下，可以在比所述tm低4℃下进行杂交和/或清洗；在中度严紧条件下，可以在比所述tm低6℃下进行杂交和/或清洗；在低严紧条件下，可以在比所述tm低11℃下进行杂交和/或清洗。
[0034]
除非另外指明，本说明书和权利要求书中使用的表示成分的量、反应条件等的所有数字应被理解为在所有情况下用术语“约”来修饰。如本文所使用的术语“约”，当指代可测量的值例如质量、重量、时间、体积、浓度或百分比的量时，意味着涵盖在一些实施例中与规定量相比
±
20％的变化、在一些实施例中与规定量相比
±
10％的变化、在一些实施例中与规定量相比
±
5％的变化、在一些实施例中与规定量相比
±
1％的变化、在一些实施例中与规定量相比
±
0.5％的变化、以及在一些实施例中与规定量相比
±
0.1％的变化，因为此类变化适合于执行所披露的方法和/或使用所披露的组合物、核酸、多肽等。因此，除非相反地指出，在本说明书和所附权利要求书中所列出的数值参数是可以取决于试图通过本技术披露的主题获得的期望特性而变化的近似值。
[0035]
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本技术的范围。若无特别指明，实施例按照常规实验条件，如sambrook等人的分子克隆实验手册(sambrook j&russell d w,molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用
的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0036]
实施例
[0037]
实施例1单倍体诱导基因的发现
[0038]
申请人在前期的研究中，通过对zmpla1突变体(人工创制，过程参见：liu c,li x,meng d,et al.a 4-bp insertion at zmpla1 encoding a putative phospholipase a generates haploid induction in maize[j].mol plant,2017,10(3):520-522.)和野生型玉米b73花粉的转录组、蛋白组、蛋白修饰组、单核基因组、代谢组和脂质组分析，系统评估了诱导系花粉中存在11个功能模块的巨大差别，发现了精细胞活性氧爆发在诱导过程中的核心作用。精细胞的zmpla1失活，会导致周边卵磷脂积累，致使线粒体紊乱，活性氧爆发，进而破坏精细胞的染色体，这样的花粉授精后精子来源的染色体继续降解，最终形成了仅保留母源染色体的单倍体胚。
[0039]
过氧化物酶(pod)是生物体进行生长、发育等生命活动中维持氧化还原平衡所必须的关键蛋白，是细胞防御活性氧(ros)的主要工具。由于ros的变化是诱导单倍体产生的关键因素，所以，玉米中参与调控ros的过氧化物酶相关基因可能具有诱导单倍体产生的功能。
[0040]
在玉米中，约有183个过氧化物酶基因被注释，由于基因数量庞大，需要进一步明确究竟哪些基因会与单倍体诱导有关。
[0041]
本发明首先对zmpla1基因突变体(人工创制，过程参见：liu c,li x,meng d,et al.a 4-bp insertion at zmpla1 encoding a putative phospholipase a generates haploid induction in maize[j].mol plant,2017,10(3):520-522.)的代谢组进行定量检测，并与受体对照进行了比较，找到一些含量上存在差异的物质(包括氧化还原物质)，并以此推断与这些差异物质相关的功能基因。
[0042]
183个过氧化物酶基因中包括43个参与氨基酸和抗坏血酸氧化还原途径的基因，分析这43个基因参与的生化反应底物后发现，这些底物与鉴定到的单倍体诱导途径中存在含量差异的氧化还原物质不相同，所以排除了这43个基因，还剩下140个基因。
[0043]
根据单倍体诱导的形成过程可知，单倍体诱导系的基因组dna会发生断裂，并在配子体发育的过程中进一步降解，从而形成单倍体。因此，与单倍体形成相关的过氧化物酶(peroxidase)基因应该在配子体发育的第二次有丝分裂时期附近表达。基于这一推断，本发明进一步对野生型材料b73进行了转录组测序，并对上述140个过氧化物酶基因的表达情况进行分析(结果见图1)。结果显示，140个过氧化物酶基因中，仅grmzm2g442008、grmzm2g122816、grmzm2g063435、grmzm2g341934、grmzm2g394500、grmzm2g061230、grmzm2g439422、grmzm2g012263、grmzm2g145449这9个基因在第二次有丝分裂附近有表达。并且，在该时期附近，只有grmzm2g122816、grmzm2g063435、grmzm2g442008、grmzm2g439422这4个基因具有持续特异高表达模式。
[0044]
然而，通过比较b73和zmpla1基因突变体的转录数据，发现上述9个基因的表达量没有显著的差异。由于过氧化物酶基因最终都是以蛋白质的形式来参与酶活反应，因此推测这9个候选基因可能在不同材料的蛋白层面上存在差异。基于该推断，本发明进一步对b73和zmpla1基因突变体进行了蛋白质组的定量测定。通过蛋白质含量和磷酸化修饰水平的差异分析，发现9个基因编码蛋白的含量没有显著的差异。但是grmzm2g442008、
grmzm2g122816、grmzm2g063435这3个基因编码蛋白的磷酸化修饰水平存在显著差异(见表1)。蛋白的磷酸修饰水平本就会影响过氧化物酶的生化活性，由于这3个过氧化物酶蛋白的磷酸化水平在单倍体诱导材料中发生了变化，导致自身蛋白酶活性的降低，进而导致花粉内的ros含量上升，使得精细胞的dna受到破坏并降解，最终诱导了单倍体的产生。
[0045]
表1 3个基因在b73和zmpla1突变体中的组学差异
[0046][0047][0048]
1：数值表示基因在zmpla1与b73中的磷酸化修饰水平比值
[0049]
综上，通过将野生型与单倍体诱导系材料的多组学数据进行整合分析，本发明从183个过氧化物酶基因中，逐步筛选到在配子体发育时期分子层面存在差异，会影响ros含量，进而可能导致单倍体诱导的3个功能基因grmzm2g442008、grmzm2g122816和grmzm2g063435。
[0050]
本发明将进一步验证这3个基因的单倍体诱导功能。
[0051]
实施例2基因功能验证
[0052]
通过对转录数据的分析发现，grmzm2g442008(命名为zmpod65)、grmzm2g122816(命名为zmpod60-1)和grmzm2g063435(命名为zmpod60-2)三个基因在配子体发育过程，第二次减数分裂时期附近开始表达，且从该时期到花粉的三核期有持续表达(图2)。
[0053]
zmpod65基因位于玉米5号染色体上，在玉米基因组数据库中的编号为grmzm2g442008或zm00001d017996。基因编码蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示，本发明分别测定了该基因在玉米b73和kn5585中的基因序列，b73中的序列如seq id no.4所示，kn5585中的序列如seq id no.7所示。
[0054]
zmpod60-1基因位于玉米1号染色体上，在玉米基因组数据库中的编号为grmzm2g122816或zm00001d027710。基因编码蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示，本发明分别测定了该基因在玉米b73和kn5585中的基因序列，b73中的序列如seq id no.5所示，kn5585中的序列如seq id no.8所示。
[0055]
zmpod60-2基因位于玉米9号染色体上，在玉米基因组数据库中的编号为grmzm2g063435或zm00001d048413。基因编码蛋白的氨基酸序列如seq id no.3所示，本发明分别测定了该基因在玉米b73和kn5585中的基因序列，b73中的序列如seq id no.6所示，kn5585中的序列如seq id no.9所示。
[0056]
上述3个基因在不同材料中的基因序列有个别碱基的差异，但是编码的氨基酸序列是一样的。
[0057]
为了确定基因的表达模式，本发明利用基因起始密码子前2kb的序列作为启动子，基因cds编码区序列与荧光蛋白(yfp或gfp)编码区序列进行融合表达的表达载体。将该载体转化玉米受体kn5585，获得的转基因植株中，观察荧光，发现在精细胞上有荧光信号，表明这3个基因会在精细胞中表达(图3)。
[0058]
进一步利用crispr基因编辑技术，对基因进行基因编辑。设计的靶标序列均位于
b73和kn5585序列相同的区域，具体序列见表2。crispr/cas9基因编辑载体的构建、玉米遗传转化(受体kn5585)和编辑位点检测的具体方法参照cn 110903368 b专利实施例2的内容。
[0059]
表2编辑靶标及突变序列
[0060][0061]
下划线标注pam区，
“‑”
表示碱基缺失，粗体表示碱基突变，
“……”
表示省略。
[0062]
分析zmpod65基因两个试验批次(靶标1、靶标2)所获得的基因编辑植株。相较于未编辑的野生型材料，基因编辑的材料穗子上有明显的败育籽粒(单倍体诱导能力和败育籽粒数呈正相关)。利用流式细胞仪对基因编辑材料后代的染色体倍性进行了鉴定。结果显示，试验1中的编辑材料能诱导产生大约7.7％(共检测26株，有2株单倍体)的单倍体；试验2中的编辑材料能诱导产生大约1％(第一次共检测111株，有1株单倍体；第二次共检测96株，有1株单倍体)的单倍体。
[0063]
zmpod60-1和zmpod60-2两个基因仅进行一批次的基因编辑，其中zmpod60-1编辑后，能诱导产生大约0.8％(第一次检测116株，有1株单倍体；第二次检测120株，有1株单倍体)的单倍体；而zmpod60-2编辑后，能诱导产生大约1.5％(第一次检测100株，有2株单倍体；第二次检测100株，有1株单倍体)的单倍体。
[0064]
上述实施例显示，zmpod65、zmpod60-1、zmpod60-2突变失活后能使玉米材料具有单倍体诱导的能力。将突变单株作为父本，与二倍体母本材料授粉后，可诱导产生仅含有母本遗传物质的单倍体后代。因此，zmpod65、zmpod60-1、zmpod60-2可作为关键的靶基因，用于人工创制单倍体诱导系，诱导产生玉米母本单倍体。获得的具体不同突变基因的基因编辑材料是新型的具有单倍体诱导能力的单倍体。
[0065]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。