一种苯并咪唑类MK2变构抑制剂及其制备方法和应用

一种苯并咪唑类mk2变构抑制剂及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明涉及一种苯并咪唑类化合物，尤其涉及一种可作为新型的mk2变构抑制剂的苯并咪唑类化合物，以及它的制备方法和应用。


背景技术：

2.多发性骨髓瘤(multiple myeloma,mm)是一种单克隆浆细胞恶性肿瘤，约占所有肿瘤的1％，占所有血液系统恶性肿瘤的13％[rajkumar sv.treatment of multiple myeloma.nat revclin oncol.2011,8(8):479-91.siegel r,ma j,zou z,jemal a.cancer statistics,2014.cacancerj clin.2014,64(1):9-29.]。它的特征是骨髓内和髓外的克隆浆细胞增殖，大多数情况下分泌一种单克隆蛋白，临床表现为终末器官损伤，由四种主要疾病症状即“crab特征”确定，包括高钙血症、肾功能不全、贫血和骨病[kyle ra,rajkumar sv.multiple myeloma.blood.2008, 111(6):2962-72.]。
[0003]
在过去的二十年里，随着蛋白酶体抑制剂(pis)硼替佐米和卡非佐米以及免疫调节药物 (imids)沙利度胺、来那度胺和波马度胺的引入[murray my,auger mj,bowles km. overcoming bortezomib resistance in multiple myeloma.biochem soc trans.2014,42(4):804-8. kumar sk,lee jh,lahuerta jj,morgan g,richardson pg,crowley j,et al.risk of progressionand survival in multiple myeloma relapsing after therapy with imids and bortezomib:amulticenter international myeloma working group study.leukemia.2012,26(1):149-57.]，mm患者的生存率显著提高。虽然蛋白酶体抑制剂和免疫调节药物在患者初期治疗中取得了不错的临床效果，但几乎所有mm患者最终都会耐药和复发，需要进一步治疗。复发的mm患者，特别是那些蛋白酶体抑制剂和imids耐药的患者，预后较差(中位总生存期为9个月，无事件生存期为5个月)，其中只有22％的患者对后续治疗有反应。因此，现阶段需要在治疗方法上不断创新，例如开发具有不同作用机制的新抑制剂。
[0004]
mapk-activated protein kinase 2(mk2)是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，被称为p38 map 激酶的下游蛋白，参与许多细胞过程如应激和炎症反应、核输出、细胞增殖和侵袭。肿瘤基因芯片数据库研究表明，与正常血浆细胞相比，mk2在mm中表达相对较高，高表达mk2 引发mm的耐药性和复发，同时，mk2通过阻断rna外泌体靶向来增加核ncrna的稳定性[tiedje c,lubas m,tehrani m,menon mb,ronkina n,rousseau s,cohen p,kotlyarov a, gaestel m.p38mapk/mk2-mediated phosphorylation of rbm7 regulates the human nuclearexosome targeting complex.rna.2015,21(2):262-78.]，进一步导致肿瘤恶性增值。因此，mk2 可看作是癌细胞的一个强有力标志，抑制mk2可破坏肿瘤的生长[kotlyarov a,yannoni y, fritz s,laass k,telliez jb,pitman d,et al.distinct cellular functions of mk2.mol cell biol. (2002)22:4827
–
4835.]，这为探索药物对mm的治疗提供了新的途径及治疗方法。
[0005]
本课题组前期工作通过基因表达谱(gep)和基于阵列的比较基因组杂交(acgh)法
研究了mk2在mm病人的表达，并通过mtt法、western blot和流式细胞分析法确定了mk2 在mm的功能。另外，通过小鼠存活实验解释了mk2在mm的体内活性。与正常细胞相比， mm细胞中mk2的mrna水平和mk2位点的染色体显著增加[guo m,sun d,fan z,yuan y, shao m,hou j,zhu y,wei r,zhu y,qian j,li f,yang y,gu c.targeting mk2 is a novelapproach to interfere in multiple myeloma.front oncol.2019,9:722.]。
[0006]
鉴于p38/mapk激活激酶2(mk2)信号通路参与了一系列病理状态(炎症性疾病和肿瘤转移)以及抗肿瘤药物的耐药机制。p38抑制剂因为其全身副作用而没有进入临床试验。 mk2可避免p38抑制剂的副作用，而被确定为一个替代靶点来阻断该通路。
[0007]
在过去的几年中，有潜力的mk2抑制剂可通过atp竞争性或atp非竞争性作用机制来阻断mk2活性[fiore m,forli s,manetti f.targeting mitogen-activated protein kinase-activatedprotein kinase 2(mapkapk2,mk2):medicinal chemistry efforts to lead small moleculeinhibitors to clinical trials.j.med.chem.2016,59,3609-3634]。atp竞争性mk2抑制剂存在溶解度低、细胞通透性差、激酶选择性差等缺点。而mk2非atp竞争性抑制剂(即变构抑制剂)不与atp结合位点相互作用，从而避免了激酶之间的选择性问题。另外，mk2变构抑制剂不需要与细胞内高浓度的atp竞争，也不需要与atp对非活性和活性形式mk2的高亲和力竞争。因此，mk2变构抑制剂与atp竞争性抑制剂相比，还具有在较低浓度下有效的额外优势，可带来较少的副作用。


技术实现要素：

[0008]
本发明所要解决的问题是提供一种可作为mk2变构抑制剂的苯并咪唑类化合物。
[0009]
本发明所要解决的另一问题是提供上述苯并咪唑类化合物的制备方法。
[0010]
本发明所要解决的再一问题是提供上述苯并咪唑类化合物在制备抗骨髓瘤药物中的应用。
[0011]
为了解决上述问题，本发明采用如下技术方案：
[0012]
一种苯并咪唑类化合物，为如式(i)所示的化合物：
[0013][0014]
或其立体异构体、几何异构体、互变异构体、药学上可接受的盐或前药；
[0015]
其中：
[0016]
r1选自苯基、含有1～2个氮原子或1个硫原子或1个氧原子的五元或六元芳香杂环；
[0017]
r2选自-h、甲基、甲氧基、三氟甲基或卤素；
[0018]
r3选自哌嗪基或取代哌嗪基，所述取代哌嗪基的取代基选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、正戊基、异戊基；或者，r3选自含有氮原子、硫原子、氧原子中的1 个或2个杂原子的五元环或六元环；或者，r3选自-(ch2)n-oh、-(ch2)n-nh2，n＝3～5。
[0019]
优选的，所述化合物选自：
[0020]
[0021][0022]
本发明还涉及式(i)化合物的制备方法，所述方法包括如下步骤：
[0023][0024]
a.dmf中加入取代甲醛、取代邻苯二胺，再加入亚硫酸氢钠，搅拌回流充分反应；冷却至室温，冰水稀释，二氯甲烷萃取，合并有机层，干燥，浓缩，柱层析，得取代苯并咪唑 v-a；
[0025]
b.无水dmf加入取代苯并咪唑v-a、碳酸钾，充分搅拌混匀，再加入3-溴苄基溴，回流搅拌充分反应；冷却至室温，冰水稀释，乙酸乙酯萃取，合并有机层，干燥，浓缩，柱层析，得中间体v-b；
[0026]
c.将中间体v-b加入二氧六环中，然后分别加入pd2(dba)3、xphos和叔丁醇钠，充入氮气，室温搅拌充分反应；加入取代哌嗪，搅拌回流充分反应；冷却至室温，浓缩，柱层析，即得。
[0027]
在一个实施例中，若取代哌嗪为1-(叔丁氧羰基)哌嗪，经过上述反应得到中间体后，加入二氯甲烷、三氟乙酸(tfa)，室温条搅拌充分反应1h；乙酸乙酯稀释反应液，水萃取3 次，合并水层，冰浴中调节ph至10；再乙酸乙酯萃取3次，合并有机层，无水硫酸钠干燥，浓缩，得r3为哌嗪取代的目标化合物(i)。
[0028]
本发明还涉及一种药物组合物，其特征在于，所述的组合物含有权利要求1或2所述的苯并咪唑类化合物。
[0029]
本发明还涉及所述苯并咪唑类化合物在制备抗多发性骨髓瘤药物中的应用。
[0030]
进一步的，将本发明苯并咪唑类化合物和药学上可接受的载体制成片剂、胶囊剂、颗粒剂、喷雾剂、注射剂、微囊、软膏剂或透皮控释贴剂剂型的药物。
[0031]
在一个实施例中，本发明提供的苯并咪唑类化合物制成片剂时，把苯并咪唑类化合物和载体乳糖或玉米淀粉，需要时加入润滑剂硬脂酸镁，混合均匀，然后压片制成片剂。
[0032]
在一个实施例中，本发明提供的苯并咪唑类化合物制成胶囊剂时把苯并咪唑类化合物和载体乳糖或玉米淀粉混合均匀，整粒，然后装胶囊制成胶囊剂。
[0033]
在一个实施例中，本发明提供的苯并咪唑类化合物制成颗粒剂时，把组合物和稀释剂乳糖或玉米淀粉混合均匀，整粒，干燥，制成颗粒剂。
[0034]
与现有技术相比，本发明具有如下有益技术效果：
[0035]
(1)本发明苯并咪唑类化合物可作为mk2变构抑制剂，用于制备抗多发性骨髓瘤的药物。
[0036]
(2)本发明涉及的合成方法操作简便、得率高。
[0037]
关于本发明的有益技术效果，详见下文试验例。
[0038]
定义
[0039]
术语“卤素”或前缀“卤”，是指f，cl，br或i。
[0040]
像本发明所描述的，取代基画一个键连接到中心的环上形成的环体系(如式i所示)代表r2可以在环上任何可取代的位置取代。
[0041]
本发明中所述的“药学上可接受的”是指包括任意不干扰活性成分的生物活性的有效性且对它被给予的宿主无毒性的物质。
[0042]
本发明所使用的术语“前药”，代表一个化合物在体内转化为式ⅰ所示的化合物。这样的转化受前体药物在血液中水解或在血液或组织中经酶转化为母体结构的影响。本发明前体药物类化合物可以是酯，在现有的发明中酯可以作为前体药物的有苯酯类，脂肪族(c1-24) 酯类，酰氧基甲基酯类，碳酸酯，氨基甲酸酯类和氨基酸酯类。例如本发明里的一个化合物包含羟基，即可以将其酰化得到前体药物形式的化合物。其他的前体药物形式包括磷酸酯，如这些磷酸酯类化合物是经母体上的羟基磷酸化得到的。
[0043]
除非其他方面表明，本发明的化合物的所有互变异构形式都包含在本发明的范围之内。另外，除非其他方面表明，本发明所描述的化合物的结构式包括一个或多个不同的原子的富集同位素。术语“互变异构体”或“互变异构的形式”是指不同能量的结构的同分异构体可以通过低能垒互相转化。这样的实例包括，但并不限于，质子互变异构体(即质子移变的互变异构体)包括通过质子迁移的互变，如酮式-烯醇式和亚胺-烯胺的同分异构化作用。原子价(化合价)互变异构体包括一些成键电子的重组互变。
[0044]
本发明的化合物可以包含不对称中心或手性中心，因此存在不同的立体异构体。本发明的化合物所有的立体异构形式，包括但不限于，非对映体，对映异构体，阻转异构体，和它们的混合物，如外消旋混合物，组成了本发明的一部分。很多有机化合物都以光学活性形式存在，即它们有能力旋转平面偏振光的平面。在描述光学活性化合物时，前缀d、l或r、s 用来表示分子手性中心的绝对构型。前缀d、l或( )、(-)用来命名化合物平面偏振光旋转的符号，前缀(-)或l是指化合物是左旋的，前缀( )或d是指化合物是右旋的。这些立体异构体的化学结构是相同的，但是它们的立体结构不一样。特定的立体异构体可以是对映体，异构体的混合物通常称为对映异构体混合物。50:50的对映体混合物被称为外消旋混合物或外消旋体，这可能导致化学反应过程中没有立体选择性或立体定向性。术语“外消旋混合物”和“外消旋体”是指等摩尔的两个对映异构体的混合物，缺乏光学活性。
[0045]
用于本发明的药学上可接受的载体是指不会破坏一起调配的化含物的药理学活性的无毒载剂、佐剂或媒剂。
附图说明
[0046]
图1为本发明化合物的结构通式图。
[0047]
图2为本发明化合物的合成方法反应流程图。
[0048]
图3为本发明化合物i-1与mk2蛋白结合的相互作用结果图。
[0049]
图4为本发明化合物i-2与mk2蛋白结合的相互作用结果图。
[0050]
图5为本发明化合物i-3与mk2蛋白结合的相互作用结果图。
[0051]
图6为本发明化合物i-4与mk2蛋白结合的相互作用结果图。
[0052]
图7为本发明化合物i-5与mk2蛋白结合的相互作用结果图。
[0053]
图8为本发明化合物i-6与mk2蛋白结合的相互作用结果图。
具体实施方式
[0054]
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
[0055]
本发明中，化合物的结构是通过质谱(ms)和/或核磁共振(1hnmr)设备来确定的。化学缩写简称具有以下意义：dmf：n,n-二甲基甲酰胺；tfa：三氟乙酸。xphos是一种市售大位阻的双膦配体，pd2(dba)3是一种市售钯催化剂，两者常常配合使用。
[0056]
本发明化合物可按照本领域常规方法，并使用合适的试剂、原料和本领域技术人员已知的纯化方法制备。下面更具体地描述本发明化合物的制备方法，但这些具体方法不对本发明构成任何限制。本发明化合物还可以任选将在本说明书中描述的或本领域已知的各种合成方法组合起来而方便地制得，这样的组合可由本发明所属领域的技术人员容易地进行。
[0057]
实施例1 2-苯基-1-(3-(1-哌嗪基)苄基)-1h-苯并咪唑(i-1)的制备
[0058][0059]
(1)中间体2-苯基-1h-苯并咪唑的合成：室温下取250ml的圆底烧瓶，依次加入邻苯二胺(1.0814mg,10mmol)、苯甲醛(1.0612g,10mmol)和dmf(100ml)，再加入亚硫酸氢钠(312.18mg,3mmol)，80℃下搅拌反应6h。反应完毕后，冷却至室温，以冰水稀释反应液，用二氯甲烷萃取3次，合并有机层，无水硫酸钠干燥，浓缩；硅胶柱层析分离纯化，以石油醚和乙酸乙酯的混合溶剂(4：1)为洗脱剂，得淡黄色固体(2-苯基-1h-苯并咪唑)，约1.3056g，收率67.3％。
[0060]
(2)中间体1-(3-溴苯基)-2-苯基-1h-苯并咪唑的合成：室温下取100ml的圆底烧瓶，依次加入上述制备的2-苯基-1h-苯并咪唑(1.240g,6.26mmol)、碳酸钾(863.88mg,6.26mmol) 和无水dmf(30ml)充分搅拌混匀，再将3-溴苄溴(1.565mg,6.26mmol)加入混合物中， 85℃下搅拌反应5h。反应完毕后，冷却至室温，以冰水稀释反应液，用乙酸乙酯萃取3次，合并有机层，无水硫酸钠干燥，浓缩；硅胶柱层析分离纯化，以石油醚和乙酸乙酯的混合溶剂(6：1)为洗脱剂，得淡黄色固体(1-(3-溴苯基)-2-苯基-1h-苯并咪唑)，约631.7mg，收率27.8％。
[0061]
(3)4-(3-((2-苯基-1h-苯并咪唑-1-基)甲基)苯基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯的合成：室温下取50ml的圆底烧瓶，依次加入上述制备的1-(3-溴苯基)-2-苯基-1h-苯并咪唑(338.8mg, 0.924mmol)、pd2(dba)3(33.88mg,0.037mmol)、xphos(35.25mg,0.074mmol)、叔丁醇钠 (248.6mg,2.59mmol)和二氧六环(28ml)，充入氮气后室温搅拌30min，后加入1-(叔丁氧羰基)哌嗪(838.15mg,4.5mmol)，氮气保护下105℃反应12h。反应完毕后，冷却至室温，
将反应液旋干，浓缩；硅胶柱层析分离纯化，以石油醚和乙酸乙酯的混合溶剂(6：1)为洗脱剂，得淡黄色油状物(4-(3-((2-苯基-1h-苯并咪唑-1-基)甲基)苯基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯)，约100mg，收率23.1％。
[0062]
(4)标题化合物(i-1)的合成：室温下取25ml圆底烧瓶，依次加入上述制备的4
‑ꢀ
(3-((2-苯基-1h-苯并咪唑-1-基)甲基)苯基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(145mg)、二氯甲烷(4ml) 和三氟乙酸(tfa)(1ml)，室温条件下搅拌反应1h。反应完毕后，乙酸乙酯稀释反应液，用水萃取3次，合并水层，并在冰浴条件下用1m的naoh溶液将ph调节至10；再用乙酸乙酯萃取3次，合并有机层，无水硫酸钠干燥，浓缩，得淡黄色油状物，约25mg，收率21.9％。1h nmr(500mhz,dmso-d6)δ7.79
–
7.74(m,1h),7.72(ddd,j＝7.8,5.2,2.8hz,1h),7.59
–ꢀ
7.53(m,2h),7.53
–
7.49(m,1h),7.29
–
7.21(m,1h),7.07(t,j＝7.9hz,1h),6.77(dd,j＝8.3, 2.1hz,1h),6.62(d,j＝21.1hz,1h),6.34(d,j＝7.6hz,1h),5.51(s,1h),2.96
–
2.86(m,2h), 2.80
–
2.72(m,2h).
13
c nmr(126mhz,dmso-d6)δ153.70,152.25,143.10,138.03,136.38, 130.76,130.26,129.79,129.57,129.28,123.09,122.63,119.68,116.65,114.83,113.52,111.64, 49.45,48.20,45.87。
[0063]
实施例2 1-(3-(4-甲基哌嗪-1-基)苄基)-2-苯基-1h-苯并咪唑(i-2)的制备
[0064][0065]
按实施例1中步骤(3)方法，以n-甲基哌嗪替代1-(叔丁氧羰基)哌嗪，与1-(3-溴苯基)-2-苯基-1h-苯并咪唑(按实施例1步骤(1)～(3)制备)反应，所得标题化合物为淡黄色油状物，约26.7mg，收率25.3％。1h nmr(500mhz,cdcl3)δ7.88(d,j＝8.0hz,1h),7.76
ꢀ–
7.71(m,2h),7.51
–
7.44(m,3h),7.33(ddd,j＝8.1,5.8,2.5hz,1h),7.29
–
7.25(m,2h),7.22 (t,j＝7.9hz,1h),6.87(dd,j＝8.3,2.2hz,1h),6.67(s,1h),6.60(d,j＝7.6hz,1h),5.43(s, 2h),3.21
–
3.08(m,4h),2.59
–
2.50(m,4h),2.35(s,3h).
13
c nmr(126mhz,cdcl3)δ157.95, 157.06,156.80,154.70,150.74,143.95,138.63,134.60,133.62,133.09,131.47,129.75,128.49, 127.94,127.30,115.30,114.68,80.00,49.12,39.63,28.43。
[0066]
实施例3 2-(2-呋喃基)-1-(3-(1-哌嗪基)苄基)-1h-苯并咪唑(i-3)的制备
[0067][0068]
(1)中间体2-(2-呋喃基)-1h-苯并咪唑的合成：室温下取250ml的圆底烧瓶，依次
加入邻苯二胺(1.0814g,10mmol)、糠醛(960.8mg,10mmol)和dmf(100ml)，再加入亚硫酸氢钠(312.18mg,3mmol)，80℃下搅拌反应6h。反应完毕后，冷却至室温，以冰水稀释反应液，用二氯甲烷萃取3次，合并有机层，无水硫酸钠干燥，浓缩；硅胶柱层析分离纯化，以石油醚和乙酸乙酯的混合溶剂(4：1)为洗脱剂，得淡黄色固体，约879.8mg，收率47.8％。
[0069]
(2)中间体1-(3-溴苯基)-2-(2-呋喃基)-1h-苯并咪唑的合成：室温下取100ml的圆底烧瓶，依次加入上述制备的2-(2-呋喃基)-1h-苯并咪唑(824mg,4.48mmol)、碳酸钾 (618.24mg,4.48mmol)和无水dmf(60ml)充分搅拌混匀，再将3-溴苄溴(1.120g,4.48mmol) 加入混合物中，85℃下搅拌反应5h。反应完毕后，冷却至室温，以冰水稀释反应液，用乙酸乙酯萃取3次，合并有机层，无水硫酸钠干燥，浓缩；硅胶柱层析分离纯化，以石油醚和乙酸乙酯的混合溶剂(6：1)为洗脱剂，得淡黄色固体，约1.291g，收率81.9％。
[0070]
(3)中间体4-(3-((2-(2-呋喃基)-1h-苯并咪唑-1-基)甲基)苯基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯的合成：室温下取100ml的圆底烧瓶，依次加入上述制备的1-(3-溴苯基)-2-(2-呋喃基)-1h-苯并咪唑(807mg,2.3mmol)、pd2(dba)3(84.2mg,0.092mmol)、xphos(88mg,0.184mmol)、叔丁醇钠(618.9mg,6.44mmol)和二氧六环(40ml)，充入氮气后室温搅拌30min，后加入 1-(叔丁氧羰基)哌嗪(1.2852g,6.9mmol)，氮气保护下105℃反应12h。反应完毕后，冷却至室温，将反应液旋干，浓缩；硅胶柱层析分离纯化，以石油醚和乙酸乙酯的混合溶剂(2：1) 为洗脱剂，得淡黄色油状物，约226.59mg，收率21.5％。
[0071]
(4)标题化合物(i-3)的合成：室温下取25ml圆底烧瓶，依次加入上述制备的4-(3-((2-(2
‑ꢀ
呋喃基)-1h-苯并咪唑-1-基)甲基)苯基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(180mg)，二氯甲烷(6ml)和三氟乙酸(tfa)(1.5ml)，室温条件下搅拌反应1h。反应完毕后，乙酸乙酯稀释反应液，用水萃取3次，合并水层，并在冰浴条件下用1m的naoh溶液将ph调节至10；再用乙酸乙酯萃取3次，合并有机层，无水硫酸钠干燥，浓缩，得淡黄色油状物，约63mg，收率44.8％。1h nmr(500mhz,cdcl3)δ7.88
–
7.78(m,1h),7.57(d,j＝1.1hz,1h),7.29(ddd,j＝7.2,4.0, 1.9hz,2h),7.25
–
7.21(m,1h),7.16(t,j＝7.9hz,1h),7.05(d,j＝3.4hz,1h),6.80(dd,j＝ 8.2,2.2hz,1h),6.68(s,1h),6.59(d,j＝7.6hz,1h),6.54(dd,j＝3.5,1.8hz,1h),5.62(s,2h), 3.03(dd,j＝6.2,3.6hz,4h),2.95(dd,j＝6.2,3.6hz,4h),2.10(d,j＝47.2hz,1h).
13
c nmr (126mhz,cdcl3)δ152.19,145.15,144.53,144.09,143.06,137.25,135.82,129.67,123.25, 122.88,119.81,117.36,115.14,113.53,112.69,111.96,110.12,49.92,48.52,45.92。
[0072]
实施例4 2-(2-呋喃基)-1-(3-(4-甲基哌嗪-1-基)苄基)-1h-苯并咪唑(i-4)的制备
[0073]
[0074]
按实施例3中步骤(3)方法，以n-甲基哌嗪替代1-(叔丁氧羰基)哌嗪，与1-(3-溴苯基)-2-(2-呋喃基)-1h-苯并咪唑(按实施例3步骤(1)～(3)制备)反应，所得标题化合物为淡黄色油状物，约32mg，收率30.3％。1h nmr(500mhz,cdcl3)δ7.97(dd,j＝1.6,0.6 hz,1h),7.71
–
7.65(m,1h),7.64
–
7.57(m,1h),7.30
–
7.22(m,2h),7.15(dd,j＝3.5,0.6hz, 1h),7.08(t,j＝7.9hz,1h),6.83(s,1h),6.82
–
6.78(m,1h),6.74(dd,j＝3.5,1.8hz,1h),6.37 (d,j＝7.6hz,1h),5.72(s,2h),3.07(d,j＝4.5hz,4h),2.26(s,3h).
13
c nmr(126mhz, cdcl3)δ151.68,145.21,144.55,144.08,143.10,137.30,135.83,129.70,123.25,122.88,119.86, 117.38,115.12,113.55,112.70,111.95,110.11,54.92,48.71,48.55,46.02。
[0075]
实施例5 2-(2-呋喃基)-1-(3-(1-哌嗪基)苄基)-1h-苯并咪唑(i-5)的制备
[0076][0077]
(1)中间体2-(2-噻吩基)-1h-苯并咪唑的合成：室温下取150ml圆底烧瓶，依次加入邻苯二胺(1.296g,11.98mmol)、噻吩2-甲醛(1.344g,11.98mmol)和dmf(80ml)，再加入亚硫酸氢钠(374mg,3.594mmol)，80℃下搅拌反应6h。反应完毕后，冷却至室温，以冰水稀释反应液，用二氯甲烷萃取3次，合并有机层，无水硫酸钠干燥，浓缩；硅胶柱层析分离纯化，以石油醚和乙酸乙酯的混合溶剂(2：1)为洗脱剂，得2-(2-噻吩基)-1h-苯并咪唑，约498mg，为淡黄色固体，收率20.8％。
[0078]
(2)中间体1-(3-溴苯基)-2-(2-噻吩基)-1h-苯并咪唑的合成：室温下取100ml圆底烧瓶，依次加入上述制备的2-(2-噻吩基)-1h-苯并咪唑(468mg,2.34mmol)、碳酸钾(324mg, 2.34mmol)和无水dmf(40ml)充分搅拌混匀，再将3-溴苄溴(585mg,2.34mmol)加入混合物中，85℃下搅拌反应5h。反应完毕后，冷却至室温，以冰水稀释反应液，用乙酸乙酯萃取3次，合并有机层，无水硫酸钠干燥，浓缩；硅胶柱层析分离纯化，以石油醚和乙酸乙酯的混合溶剂(2：1)为洗脱剂，得1-(3-溴苯基)-2-(2-噻吩基)-1h-苯并咪唑，约311.08mg，为淡黄色固体，收率36.0％。
[0079]
(3)中间体4-(3-((2-(2-噻吩基)-1h-苯并咪唑-1-基)甲基)苯基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯的合成：室温下取100ml圆底烧瓶，依次加入上述制备的1-(3-溴苯基)-2-(2-噻吩基)-1h-苯并咪唑(214.5mg,0.585mmol)、pd2(dba)3(21.42mg,0.0234mmol)、xphos(22.35mg,0.0468mmol)、叔丁醇钠(157.5mg,1.638mmol)和二氧六环(30ml)，充入氮气后室温搅拌30min，后加入1-(叔丁氧羰基)哌嗪(327mg,1.755mmol)，氮气保护下105℃反应12h。反应完毕后，冷却至室温，将反应液旋干，浓缩；硅胶柱层析分离纯化，以石油醚和乙酸乙酯的混合溶剂(2： 1)为洗脱剂，得4-(3-((2-(2-噻吩基)-1h-苯并咪唑-1-基)甲基)苯基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯，约 180mg，为淡黄色油状物，收率64.8％。
[0080]
(4)标题化合物(i-5)的合成：室温下取25ml圆底烧瓶，依次加入上述制备的4-(3-((2-(2
‑ꢀ
噻吩基)-1h-苯并咪唑-1-基)甲基)苯基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(150mg)、二氯甲烷
(4ml)和三氟乙酸(tfa)(1ml)，室温条件下搅拌反应1h。反应完毕后，乙酸乙酯稀释反应液，用水萃取3次，合并水层，并在冰浴条件下用1m的naoh溶液将ph调节至10；再用乙酸乙酯萃取3次，合并有机层，无水硫酸钠干燥，浓缩，所得标题化合物为淡黄色油状物，约32mg，收率27.1％。1h nmr(500mhz,cdcl3)δ7.86(d,j＝8.0hz,1h),7.49(dd,j＝5.1,1.0hz,1h), 7.35
–
7.32(m,1h),7.32
–
7.29(m,1h),7.28(d,j＝7.3hz,1h),7.26
–
7.23(m,1h),7.22(d,j＝ 7.9hz,1h),7.09(dd,j＝5.1,3.7hz,1h),6.86(dd,j＝8.2,2.2hz,1h),6.68(s,1h),6.60(d,j＝ 7.7hz,1h),5.55(s,2h),3.08(dd,j＝6.2,3.8hz,4h),2.98(dd,j＝6.2,3.7hz,4h),2.14(s, 1h).
13
c nmr(126mhz,cdcl3)δ152.37,148.16,143.00,137.05,136.40,132.13,129.92, 128.77,127.93,127.87,123.24,122.89,119.79,116.92,115.16,113.04,110.08,49.90,48.45, 45.93,29.71。
[0081]
实施例6 2-(2-呋喃基)-1-(3-(4-甲基哌嗪-1-基)苄基)-1h-苯并咪唑(i-6)的制备
[0082][0083]
按实施例5中步骤(3)方法，以n-甲基哌嗪替代1-(叔丁氧羰基)哌嗪，与1-(3-溴苯基)-2-(2-噻吩基)-1h-苯并咪唑(按实施例5步骤(1)～(3)制备)反应，所得标题化合物为淡黄色油状物，约31mg，收率29.5％。1h nmr(500mhz,cdcl3)δ7.87(d,j＝8.0 hz,1h),7.51(d,j＝5.0hz,1h),7.35(d,j＝4.2hz,1h),7.32(dd,j＝8.0,1.8hz,1h),7.29
–ꢀ
7.27(m,2h),7.23(d,j＝7.9hz,1h),7.10(dd,j＝4.8,4.0hz,1h),6.87(dd,j＝8.2,2.0hz,1h), 6.70(s,1h),6.61(d,j＝7.6hz,1h),5.57(s,2h),3.19
–
3.13(m,4h),2.60
–
2.54(m,4h),2.36 (s,3h).
13
c nmr(126mhz,cdcl3)δ151.78,148.17,143.00,137.09,136.38,132.10,129.96, 128.78,127.93,127.89,123.26,122.91,119.81,117.01,115.16,113.13,110.07,54.76,48.52, 48.45,45.82。
[0084]
试验例 本发明化合物的生物活性测定
[0085]
一、mk2蛋白与小分子相互作用的研究
[0086]
实验名称：mst(微量热泳)实验：
[0087]
microscale thermophoresis(mst,微量热泳动)，是德国nano temper technologies公司推出定量分析生物分子间相互作用的革命性技术。它通过检测分子在微观温度梯度场中的运动规律(分子质量、电荷数及水化层的变化)精确定量分子间的相互作用。当进行mst 实验的时候，样品由红外激光加热产生一个微观的温度梯度场，再通过共价结合的荧光染料或色氨酸自发荧光来监测和定量分子的定向运动。应用范围包括：小分子间相互作用研究，蛋白与蛋白之间的相互作用以及蛋白与多肽、核酸、小分子间的相互作用研究，以检测相互作用的生物分子间的亲和性。
[0088]
本发明使用mst技术，准确的测定mk2蛋白与本发明合成的抑制剂在溶液中的解离常数kd值，由于kd值与核苷酸链的亲和度成反比，kd值越高则亲和度越小。根据以上实验原理来检测我们合成的化合物和mk2蛋白分子间的亲和力大小。
[0089]
实验结果：
[0090]
本发明实施例中苯并咪唑类化合物实施例1-实施例6的mst结果(见图3-图8)。
[0091]
其中化合物i-3、i-4、i-5和i-6与mk2的亲和力kd值分别为30.123μm、11.327μm、 0.384μm和0.195μm，说明这些化合物与mk2都具有较强的结合活性；化合物i-1和i-2与 mk2的亲和力kd值分别为166.57μm和191.86μm，与mk2具有一定的结合活性。该实验结果为后续研究mk2结合位点，探索基于mk2的新型靶向治疗多发性骨髓瘤药物提供了基础。
[0092]
二、细胞活性测定：mk2变构抑制剂对mm细胞增殖的影响
[0093]
活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性mtt还原为不溶于水的蓝紫色结晶甲瓒 (formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(dmso)能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在570nm波长处测定其吸收值，在一定细胞数范围内，mtt结晶形成的量与细胞数成正比，根据其测得的吸光度值(od)，来判断活细胞数量，od越大，细胞活性越强。具体步骤：1)处于对数生长期的arp1和cag野生型骨髓瘤细胞，接种在无菌96 孔板中，每组设置3个复孔，加入5个浓度梯度的药物，在37℃，5％co2的培养箱中孵育 48h；2)每个孔加入新鲜配制的mtt试剂，37℃，5％co2的培养箱中孵育3h；3)离心机中离心，每孔加入150μl dmso；4)用酶标仪测定在572nm波长处，各孔的od，按照下列公式计算药物对骨髓瘤细胞的生长抑制率，抑制率＝(实验组od-空白组od)/(对照组 od-空白组od)
×
100％(结果见表1)。
[0094]
表1化合物对arp1和cag野生型骨髓瘤细胞的抑制活性
[0095][0096]
骨髓瘤抑制结果实验(表1)表明，化合物i-1、i-3、i-4、i-5、i-6对arp1野生型骨髓瘤细胞的ic
50
分别为29.66μm、46.73μm、50.04μm、18.13μm、19.45μm，对cag野生型骨髓瘤细胞的ic
50
分别为40.26μm、52.28μm、68.48μm、33.49μm、35.63μm，这些结果表明上述化合物在抑制骨髓瘤方面具有非常好的开发前景。
[0097]
尽管已经示出了和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。