一种辅助诊断结直肠癌高危人群的生物标志物及方法与流程

1.本技术涉及结直肠癌诊断领域，更具体地说，尤其涉及一种辅助诊断结直肠癌高危人群的生物标志物及方法。


背景技术：

2.结直肠癌(crc)是最常见的癌症之一，并带来重大的全球健康负担。与许多疾病一样，大肠中的肿瘤形成是多因素的，各种遗传和环境因素会导致疾病发展。尽管对crc的遗传易感性综合征进行了很好的描述，例如lynch综合征、家族性腺瘤性息肉病和peutz-jeghers综合征，但它们仅占crc病例的少数。根据双胞胎和家庭研究的证据，估计crc的遗传率仅为12-35％。crc的这种相对较低的遗传力反映了环境的重要性，环境在引起散发性crc中的作用更大。
3.在环境因素中，微生物在癌症生物学中的作用已越来越得到认可。据估计，在2012年的新癌症病例中，传染性病原体占所有癌症的15％以上，包括绝大多数胃癌(幽门螺杆菌)、肝细胞癌(乙型和丙型肝炎病毒)和宫颈癌(人乳头瘤病毒)。尽管已经研究了特定感染因子的致癌机制，但研究人员也开始研究肿瘤环境中的集体微生物群落。这种微生物群，也称为微生物群，已成为一些癌症的重要环境因素，包括结肠直肠癌、肝癌、胆道癌，甚至乳腺癌。结直肠含有大约3
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10～13细菌，与大量微生物相互作用，肠上皮与这些微生物具有持续的串扰。这些微生物对胃肠生理学(如能量收集和免疫成熟)很重要，它们相对丰度的变化会改变平衡，导致肠道和肠外疾病。尽管肠道微生物群的扰动已在各种疾病中得到描述，包括心血管疾病、代谢疾病、神经精神疾病和其他消化系统疾病(如炎症性肠病和艰难梭菌，但它在结直肠中的作用在过去的5年中，致癌作用受到了广泛的关注，肠道微生物群的一个新兴转化应用是其作为生物标志物的用途。生物标志物是疾病存在或严重程度的指标。鉴于大量证据表明筛查平均风险个体可以降低crc发病率和死亡率，准确且无创的筛查测试可以大大减轻crc的全球健康负担。此外，一些研究报告了细菌标志物与治疗效果或临床结果之间的关联，增加了使用这些标志物进行治疗预测和预后的潜力。肠道微生物群的分析是潜在生物标志物的丰富来源。目前，一些临床前期研究表明通过分析鉴定结直肠癌特征性的微生物分布情况，可以用来判断结直肠癌的发生风险。尽管如此，通过基于ngs等二代测序方法(如宏基因组)鉴定结直肠癌特征性微生物组的方法，判断结直肠息肉患者罹患结直肠癌的可能性仍然受限于费用、时间和专业人员，无法大规模地在临床实践中开展，降低对结直肠癌特征性微生物的筛分效率。
4.因此，怎样提高对结直肠息肉患者的结直肠癌特征性微生物的筛分效率，已成为本领域技术人员亟待解决的问题。


技术实现要素：

5.为解决上述技术问题，本技术提供了一种辅助诊断结直肠癌高危人群的生物标志物及方法，能提高对结直肠息肉患者的结直肠癌特征性微生物的筛分效率。
6.本技术提供的技术方案如下：
7.本技术提供一种辅助诊断结直肠癌高危人群的生物标志物，包括：核梭桿菌(fusobacterium nucleatum)、双歧杆菌(bifidobacterium)、擬杆菌(bacteroides clarus)和梭狀芽孢杆菌(clostridium hathewayi)中的一种或两种以上。
8.进一步地，在本发明一种优选的方式中，包括血液微生物和/或粪便微生物。
9.本技术还提供一种辅助诊断结直肠癌高危人群的检测试剂，所述检测试剂包含所述辅助诊断结直肠癌高危人群的生物标志物。
10.进一步地，在本发明一种优选的方式中，还包括：检测核梭桿菌的引物与探针；检测双歧杆菌的引物与探针；检测擬杆菌的引物与探针；检测梭狀芽孢杆菌的引物与探针。
11.进一步地，在本发明一种优选的方式中，所述检测核梭桿菌的引物序列为：
12.上游引物5
′‑
caaccattactttaactctaccatgttca-3
′
；
13.下游引物5
′‑
gttgactttacagaaggagattatgtaaaaatc-3
′
，
14.所述检测核梭桿菌的探针序列为：
15.探针gttgactttacagaaggagattatgtaaaaatc。
16.进一步地，在本发明一种优选的方式中，所述检测双歧杆菌的引物序列为：
17.上游引物5
′‑
ctcctggaaacgggtgg-3
′
；
18.下游引物5
′‑
ggtgttcttcccgatatctaca-3
′
，
19.所述检测双歧杆菌的探针序列为：
20.探针5
′‑
atgcgagggcaa-3
′
。
21.进一步地，在本发明一种优选的方式中，所述检测擬杆菌的引物序列为：
22.上游引物tccatccgcaagcctttact；
23.下游引物gcttccggtgccattgacta，
24.所述检测擬杆菌的探针序列为：
25.探针ttcatcatcacagccgacaacgca。
26.进一步地，在本发明一种优选的方式中，所述检测梭狀芽孢杆菌的引物序列为：
27.上游引物gggctgcggaagcaactta；
28.下游引物gatgacctcgccctgatcat，
29.所述检测梭狀芽孢杆菌的探针序列为：
30.探针accaccacacaggacggaaagattctcc。
31.本技术还提供一种辅助诊断结直肠癌高危人群的试剂盒，包括：所述辅助诊断结直肠癌高危人群的检测试剂及pcr所需试剂。
32.本技术还提供一种结直肠癌高危人群的辅助诊断方法，包括以下步骤：
33.s1、收集结直肠息肉患者的粪便样本；
34.s2、对所述步骤s1中的粪便样本进行粪便基因组dna的提取；
35.s3、采用所述辅助诊断结直肠癌高危人群的试剂盒对所述步骤s2中的粪便基因组dna进行微生物菌群探针法实时荧光定量pcr检测，测定所述生物标志物的含量；
36.s4、根据所述步骤s3测定的所述生物标志物的含量辅助判断结直肠息肉患者的患结直肠癌风险。
37.本发明所提供的技术方案，与现有技术相比，本发明涉及的辅助诊断结直肠癌高
危人群的生物标志物及方法，通过收集结直肠息肉患者的粪便样本，对粪便样本进行粪便基因组dna的提取，采用辅助诊断结直肠癌高危人群的试剂盒对粪便基因组dna进行微生物菌群探针法实时荧光定量pcr检测，测定样本中核梭桿菌、双歧杆菌、擬杆菌及梭狀芽孢杆菌的含量，根据测定结直肠癌特征性微生物菌群含量辅助判断结直肠息肉患者的患结直肠癌风险，如此，能快速诊断粪便中是否含有结直肠癌特征性微生物，以便对结直肠癌高风险人群进行早期干预防治，提高了对结直肠息肉患者的结直肠癌特征性微生物的筛分效率。
附图说明
38.为了更清楚地说明本技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
39.图1为本发明实施例提供的结直肠癌高危人群的辅助诊断方法的步骤流程图。
具体实施方式
40.为了使本领域的技术人员更好地理解本技术中的技术方案，下面将结合申请实施例中的附图对本技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本技术的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本技术保护的范围。
41.需要说明的是，当元件被称为“固定于”或“设置于”另一个元件上，它可以直接在另一个元件上或者间接设置在另一个元件上；当一个元件被称为是“连接于”另一个元件，它可以是直接连接到另一个元件或间接连接至另一个元件上。
42.需要理解的是，术语“长度”、“宽度”、“上”、“下”、“前”、“后”、“第一”、“第二”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本技术和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本技术的限制。
43.此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本技术的描述中，“多个”、“若干个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。
44.须知，本说明书附图所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配说明所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本技术可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本技术所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本技术所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。
45.本技术提供一种辅助诊断结直肠癌高危人群的生物标志物，包括：核梭桿菌(fusobacterium nucleatum)、双歧杆菌(bifidobacterium)、擬杆菌(bacteroides clarus)和梭狀芽孢杆菌(clostridium hathewayi)中的一种或两种以上。
46.具体地，在本发明实施例中，包括血液微生物和/或粪便微生物。
47.本技术还提供一种辅助诊断结直肠癌高危人群的检测试剂，所述检测试剂包含所述辅助诊断结直肠癌高危人群的生物标志物。
48.具体地，在本发明实施例中，还包括：检测核梭桿菌的引物与探针；检测双歧杆菌的引物与探针；检测擬杆菌的引物与探针；检测梭狀芽孢杆菌的引物与探针。
49.具体地，在本发明实施例中，所述检测核梭桿菌的引物序列为：
50.上游引物5
′‑
caaccattactttaactctaccatgttca-3
′
；
51.下游引物5
′‑
gttgactttacagaaggagattatgtaaaaatc-3
′
，
52.所述检测核梭桿菌的探针序列为：
53.探针gttgactttacagaaggagattatgtaaaaatc。
54.具体地，在本发明实施例中，所述检测双歧杆菌的引物序列为：
55.上游引物5
′‑
ctcctggaaacgggtgg-3
′
；
56.下游引物5
′‑
ggtgttcttcccgatatctaca-3
′
，
57.所述检测双歧杆菌的探针序列为：
58.探针5
′‑
atgcgagggcaa-3
′
。
59.具体地，在本发明实施例中，所述检测擬杆菌的引物序列为：
60.上游引物tccatccgcaagcctttact；
61.下游引物gcttccggtgccattgacta，
62.所述检测擬杆菌的探针序列为：
63.探针ttcatcatcacagccgacaacgca。
64.具体地，在本发明实施例中，所述检测梭狀芽孢杆菌的引物序列为：
65.上游引物gggctgcggaagcaactta；
66.下游引物gatgacctcgccctgatcat，
67.所述检测梭狀芽孢杆菌的探针序列为：
68.探针accaccacacaggacggaaagattctcc。
69.本技术还提供一种辅助诊断结直肠癌高危人群的试剂盒，包括：所述辅助诊断结直肠癌高危人群的检测试剂及pcr所需试剂。
70.需要补充说明的是，在本发明实施例中，所述辅助诊断结直肠癌高危人群的试剂盒，还包括：用于内部对照的内参引物。
71.更为具体地阐述，所述内参引物的序列特征为：
72.上游引物cgtcagctcgtgycgtgag；
73.下游引物cgtcrtccccrccttcc；
74.探针ttaagtcccryaacgagcgcaaccc。
75.更为具体地阐述，所述内参引物采用16s rrna基因作为内部对照。
76.请如图1所示，本技术还提供一种结直肠癌高危人群的辅助诊断方法，包括以下步骤：
77.s1、收集结直肠息肉患者的粪便样本；
78.s2、对所述步骤s1中的粪便样本进行粪便基因组dna的提取；
79.s3、采用所述辅助诊断结直肠癌高危人群的试剂盒对所述步骤s2中的粪便基因组dna进行微生物菌群探针法实时荧光定量pcr检测，测定所述生物标志物的含量；
80.s4、根据所述步骤s3测定的所述生物标志物的含量辅助判断结直肠息肉患者的患结直肠癌风险。
81.更为具体地阐述，当采用所述辅助诊断结直肠癌高危人群的试剂盒测定到核梭桿菌、双歧杆菌、擬杆菌和梭狀芽孢杆菌在样本中表达时，则判断为有患肿瘤的风险，如此，能快速诊断血液或粪便中是否含有结直肠癌特征性微生物，对结直肠癌高风险人群进行早期干预防治，有助于结直肠癌的临床诊疗，有利于降低结直肠息肉患者结直肠癌的发病率。
82.对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其他实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。