一种猪螺杆菌检测的引物、探针及方法和试剂盒与流程

1.本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及用于检测猪螺杆菌的荧光定量 pcr的引物和探针，本发明还涉及利用所述引物和探针检测猪螺杆菌的方法和试剂盒。


背景技术：

2.猪螺杆菌(helicobacter suis)是一种人兽共患的病原菌，它不仅感染猪类同时也感染人类。在全球有报道的范围内，猪螺杆菌在猪类感染中超过了60％，对各个年龄的猪都有感染，主要造成猪胃(食管区)溃疡。众所周知，幽门螺杆菌是人类胃部的主要疾病的致病因子，是世界卫生组织癌症机构规定的第ⅰ类致癌因子。相关研究表面，人类胃部除了猪螺杆菌定植，还有其他一些螺杆菌定植(non-helicbacter pylori helicobacters，nhph)，这其中最重要的就是猪螺杆菌。根据相关报道，猪螺杆菌在胃病患者中的检出率约为1.8％∽6.94％，并且有逐年上升的趋势。研究结果表明，感染猪螺杆菌发展为粘膜相关组织淋巴瘤(malt淋巴瘤)的可能性要高于猪螺杆菌感染。最新的研究表明，帕金森患者中猪螺杆菌感染率要明显高于普通人群。对于猪螺杆菌感染人类的途径，目前尚不清楚，推测可能是在食品加工和流通环节造成了污染，有报道显示在市场中的猪胃和猪肉馅中检测到了猪螺杆菌的存在，其在这些食品中的存活时间可达48小时。
3.猪螺杆菌生长条件与幽门螺杆菌类似，但是更为苛刻，因此其分离培养也更为困难。自从1990年第一次发现猪胃部中存在这一细菌，科学家一直尝试对其进行分离培养，都未能成功。直到2008年比利时科学家第一次从猪胃中成功分离，人们才真正拿到了这一菌株。又经过多年的努力，日本科学家于2016年成功从人类患者胃部分离到了猪螺杆菌，进一步证实了其对人类的致病性。目前，世界上研究猪螺杆菌的实验室并不多，主要为比利时、日本和中国。随着人群中越来越多的猪螺杆菌感染病例报道，这一细菌受到了更为广泛的关注。同时我国也是生猪养殖大国，因此，研究猪螺杆菌有非常重要的流行病学意义。
4.由于猪螺杆菌分离培养困难，其分子生物学检测具有十分重要的意义，但是这一工作一直进展缓慢。2011年，比利时科学家首次公布了猪螺杆菌全基因组序列，这为设计构建相关分子生物检测产品奠定了基础。我国研究者也曾报告了基于普通pcr的猪螺杆菌检测方法(
①
王艳冬.猪螺杆菌聚合酶连锁反应检测方法的建立及初步应用[d],北京，中国疾病预防控制中心。
②
郑浩,姚火春. pcr法检测猪胃中的螺杆菌[j],中国人兽共患病杂志,2004,11:983-986.)目前，在传染病诊断和病原菌检测方面，实时荧光pcr应用最为广泛，这一方法检测灵敏度高，特异性好。


技术实现要素：

[0005]
针对目前猪螺杆菌分子生物快速检测技术缺乏的情况，提供一套用于猪螺杆菌检测的实时荧光pcr检测体系，该方法灵敏度好，特异性高，既可以用于菌株鉴定，也可以直接用于人或猪的样本检测，还可以用于细菌分离培养前的筛查。
[0006]
本发明的目的在于提供用于猪螺杆菌检测的实时荧光pcr的特异性引物和探针；
本发明目的还在于提供上述引物和探针的用途，以实现更快更准确地检测猪螺杆菌的能力。
[0007]
为实现上述目的，我们对ncbi数据库中所发表的猪螺杆菌的序列进行比对分析，找到其特异性保守区域，发现了核苷酸完全保守区域478bp，位于234947 ∽235424的位置(相对于helicobacter suis nhp19-4004 ap023042.1)该靶序列是检测猪螺杆菌的遗传标记。此外，本领域技术人员应当理解，该序列的特异性片段也可以作为检测猪螺杆菌的遗传标记。
[0008]
进一步，本发明还提供了用于扩增上述特异序列的引物，以及与引物配合使用的荧光探针。通常引物长度为15-30个碱基，一条引物序列与本发明所比对发现的hs遗传标记物序列相同，另一条引物序列与该遗传标记物序列互补；通常taqman探针长度为20-50个碱基，其序列与上述遗传标记物相同或互补，其 5’标记荧光基团hex，3’标记淬灭基团bhq1。本发明探针和引物不但适用于已报道的猪螺杆菌的扩增检测，也可以用于实际样本的直接检测。
[0009]
本发明实施方案中，优选的引物序列为：
[0010]
hs-f:5
’‑
tgtggctagatgtttgccaattt-3’[0011]
hs-r:5
’‑
gctttggctgcaggcaa-3’[0012]
探针序列为：
[0013]
(hex)5
’‑
ccacgcctgcaggcaacaaatcc-3’(bhq1)。
[0014]
本发明提供一种用于猪螺杆菌检测的实时荧光pcr方法，包括以样品总 dna为模板，以上述特异基因为靶序列，利用本发明提供的引物和探针进行实时荧光定量pcr，同时设立无模板对照和阳性对照，根据扩增曲线判定结果。
[0015]
在对照有效扩增的情况下，样品检测结果可信，否者试验需要重复；在检测中两种对照为有效扩增时，样本结果判断标准如下：
[0016]
ct值小于等于38的标本为阳性结果；
[0017]
ct值大于40的标本为阴性性结果；
[0018]
ct值在38-40之间的标本需要重复，重复试验如ct值依然低于40判定为阳性扩增，超过40判定为阴性扩增。
[0019]
本发明的实时荧光定量pcr扩增反应体系，当为20μl反应体系时，其优选配置为：
[0020]
[0021][0022]
本发明的实时荧光定量pcr的反应程序为：95℃预变性10min，1个循环； 95℃变性10s，55～62℃退火30s，45个循环。
[0023]
本发明优选的实时荧光定量pcr的反应程序为：95℃预变性10min，1个循环；95℃变性10s，60℃退火30s，45个循环。
[0024]
本发明每次检测标本时必须设立ntc对照(无模板对照)和pos对照(阳性对照)，两种对照对于结果判读起决定性作用：
[0025]
有效扩增：ntc(－)and pos( )
[0026]
无效扩增：ntc( )and pos( )提示体系污染
[0027]
无效扩增：ntc(－)and pos(－)提示体系错误或者试剂失效。
[0028]
只有对照有效扩增情况下的样品检测结果才可信，否者试验需要重复。
[0029]
在检测中两种对照为有效扩增时，样本结果判断标准如下：
[0030]
ct值小于等于38的标本为阳性结果；
[0031]
ct值大于40的标本为阴性结果；
[0032]
ct值在38-40之间的标本需要重复，重复试验如ct值依然低于40判定为阳性扩增，超过40判定为阴性扩增。
[0033]
本发明提供了一种用于猪螺杆菌检测的试剂盒，其包括上述遗传标记物或其特异性片段的特异性引物以及配合引物使用的taqman探针。
[0034]
本发明试剂盒的引物序列为：
[0035]
hs-f:5
’‑
tgtggctagatgtttgccaattt-3’[0036]
hs-r:5
’‑
gctttggctgcaggcaa-3’[0037]
探针序列为：
[0038]
(hex)5
’‑
ccacgcctgcaggcaacaaatcc-3’(bhq1)。
[0039]
本发明提供的试剂盒，还包括荧光定量反应液，阴性模板和阳性模板，所述阴性模板为去核酸水，所述阳性模板为猪螺杆菌基因组dna，例如浓度为1.78 ng/μl的猪螺杆菌基因组dna。
[0040]
本发明提供了用于猪螺杆菌检测的实时荧光pcr的引物和探针，该引物和探针具有较强的特异性，利用该引物和探针能够准确检测到猪螺杆菌，并且能够从猪胃和人胃样本中检测到猪螺杆菌，其检测速度快，准确性好。本发明提供的检测试剂盒，其反应体系包含了上述引物、探针和阴性阳性对照，该试剂盒的推广应用有利于快速、准确地判定猪螺杆
菌的感染情况。
附图说明
[0041]
图1为不同退火温度体系优化检测结果；
[0042]
图2为hs体系标准曲线图，其中横坐标为阳性模板浓度的对数值，纵坐标为hs体系检测不同浓度阳性模板的ct值，r2＝0.997；
[0043]
图3.hs体系real-time pcr的特异性检测，除阳性模板对照外，其余表1 中所有模板均无扩增。
[0044]
图4.hs体系对部分猪胃的扩增结果图。
[0045]
图5.hs体系对尿素呼气试验阳性者胃黏膜扩增结果图。
具体实施方式
[0046]
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
[0047]
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0048]
实施例1
[0049]
猪螺杆菌实时荧光定量pcr体系退火温度优化：体系退火温度从55℃～62℃改变，结果显示58℃左右体系扩增效果最好(图1)
[0050]
hs实时荧光定量pcr扩增体系及扩增条件的优化
[0051]
体系配制表
[0052][0053]
扩增条件：
[0054]
95℃10min，45个循环：95℃10s，55℃～62℃30s。
[0055]
实施例2
[0056]
体系标准曲线的制作
[0057]
以标准浓度模板的log值为横坐标，以相应的ct值为纵坐标，绘制hp alpb 体系的real-time pcr标准曲线。结果显示：阳性模板量在17.8fg～17.8ng这个范围内时，其对数值与ct值具有非常好的相关性(r2＝0.997)。见图2。
[0058]
实施例3
[0059]
hs荧光pcr检测体系的灵敏度、特异度及检出限评价
[0060]
1.临床分离株检测验证
[0061]
因为猪螺杆菌目前全世界分离的很少，我们用优化了的猪螺杆菌hs检测体系对一株临床分离株dna进行了实际检测。结果，除ntc无扩增，猪螺杆菌结果呈阳性。
[0062]
2.特异度评价
[0063]
特异度，又称真阴性率，即实际上不是猪螺杆菌而按照该检测方法的标准被正确地判为猪螺杆菌的百分比。用优化了的real-time pcr检测消化道常见菌株20种及人类染色体(表1)，以猪螺杆菌为阳性对照。结果除阳性对照外，其余 21种非猪螺杆菌模板均为阴性。见图3。
[0064]
表1用于检测hs荧光pcr体系特异性模板
[0065]
[0066][0067]
atcc：美国模式培养物集存库；cicc：中国工业微生物菌种保藏管理中心。
[0068]
3.检测下限评价
[0069]
检测下限即以该优化的检测方法从一系列倍比稀释的阳性模板中检测，结果为阳性的能力。
[0070]
以猪螺杆菌临床株模板系列浓度梯度3.56ng/μl～0.56fg/μl为模板，每个浓度梯
度取5μl检测，使用阳性模板量对应为17.8ng～17.8fg。按照优化的反应体系和反应条件进行real-time pcr，每个浓度梯度做3个平行样。
[0071]
当体系标准模板量为17.8ng～17.8fg时，每个浓度梯度的3个平行样均扩增阳性，模板浓度为17.8fg时，此浓度梯度的3个平行样只有1个样本出现扩增。所以，猪螺杆菌hs体系real-time pcr检测体系的检测下限为17.8fg，约10cfu。
[0072]
实施例4
[0073]
hs体系对猪胃样本的检测
[0074]
采用优化好的hs检测体系，对60个猪胃进行检测。取刚宰杀的新鲜猪胃，采用qiagen组织dna提取试剂盒(货号51306)进行dna提取，100μl回收dna，取5μl作为模板进行扩增。结果显示，在60个猪胃中，有39个扩增为阳性，阳性率为65％。部分扩增结果见图4。
[0075]
实施例5
[0076]
hs体系对13c或者14c尿素酶呼气阳性者胃黏膜检测。
[0077]
因为猪螺杆菌也有很强的分解尿素的能力，所以感染者的尿素酶呼气试验也呈阳性。使用优化后的hs体系对150例尿素酶呼气试验阳性者的胃黏膜dna 进行扩增。尿素酶呼气阳性者胃黏膜用qiagen组织dna提取试剂盒(货号 51306)进行dna提取，100μl回收dna，取5μl作为模板进行扩增。结果显示，在150例尿素酶呼气阳性者胃黏膜中，检测到6例阳性，阳性率为4.0％。扩增结果见图5。
[0078]
上面对本发明进行了示例性描述，显然本发明具体实现并不受上述方式的限制，只要采用了本发明的方法构思和技术方案进行的各种改进，或未经改进直接应用于其它场合的，均在本发明的保护范围之内。