一种适用于舌苔样本的高通量蛋白提取方法与流程

1.本发明涉及蛋白领域，特别涉及一种适用于舌苔样本的高通量蛋白提取方法。


背景技术：

2.舌苔是由丝状乳头分化的角化树与填充其间隙中的脱落上皮、唾液、细菌、食物残屑、渗出白细胞等共同组成，舌苔中蕴含大量信息，健康和疾病状态下的舌苔存在明显差异，因此舌苔是最有前景的疾病诊断样本之一。不仅如此，舌苔拥有无创获取的特点，使得舌苔具有广阔的临床应用潜力。
3.目前舌苔样本的获取方式是使用灭菌压舌板或器械从舌头上刮下后储存在样品管中，或溶解在缓冲盐溶液后储存在样品管中。使用压舌板或器械刮取舌苔时，由于取材器械与舌苔接触的部分较为粗糙或温度较低，患者会出现不适。不仅如此，从取材器械转移至样品管或溶解在缓冲液中容易出现样品损失。在样本转移的过程中，储存管体积较大，不便于储存和运输。
4.另外，目前舌苔在临床诊断中主要是定性为主，缺乏定量的标准。针对舌苔的蛋白质组研究仍停留在仅能鉴定到高丰度角蛋白，缺乏对于舌苔蛋白质组的全方位描述以及应用于临床疾病诊断的研究。
5.换言之，舌苔蛋白质组的储存和提取技术仍有较大的发掘潜力。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种适用于舌苔样本的高通量蛋白提取方法，该方案利用咽拭子刮取舌苔样本，使用pct技术提取咽拭子上的舌苔蛋白质并获取舌苔蛋白组学信息。
7.为实现以上目的，本技术方案提供一种适用于舌苔样本的高通量蛋白提取方法，包括以下步骤：
8.使用咽拭子刮取被试者的舌苔样本得到待测咽拭子，将所述待测咽拭子冻存在低温下保存；
9.使用蛋白裂解液溶解待测咽拭子得到第一处理液，去除第一处理液中的杂质后得到第二处理液，利用pct处理所述第二处理液得到第三处理液；
10.质谱检测第三处理液得到舌苔蛋白的蛋白组学信息。
11.在本方案中独创地使用咽拭子采样舌苔样本。咽拭子是由聚酯纤维、人造丝或植绒尼龙制成，其可以充分吸收分泌物，且由于咽拭子材质比压舌板、器械等更为柔软，更容易被患者接受，在刮取舌苔的过程中不易出现恶心、呕吐、疼痛等反应。
12.另外，本方案在利用咽拭子刮取舌苔样本后不需要转移舌苔蛋白，仅需将其置于低温环境下冻存即可，这样可极大程度地减少舌苔样本在转移过程中的损失。
13.具体的，本方案将待测咽拭子置于-70—100℃的低温范围内保存，优选的，将待测咽拭子置于-80℃保存。由于咽拭子的材质较为疏松、多孔，舌苔样本可被填充于咽拭子内。
14.换言之，本方案采用咽拭子采样舌苔样本的方式具有极大的临床价值意义。本领
域技术人员可知晓的是：提取和鉴定舌苔蛋白需要专门的试剂和设备，故在临床上往往是医务人员现场采集被测试者的舌苔样本后，再将其运送到对应的检测所中进行检测。而传统方案在采集到舌苔样本之后需要将及时其转移至冻存管中或者溶解在缓冲液中，故采样人员需要在采样之后现场就操作舌苔样本的转移操作，这对于采样人员来说是费时费力的且样本在转移过程中被损失，导致检测结果不佳。但本方案则可极大程度地简便了采样过程，同时减少样本的损失：在本方案中采样人员只需要使用洁净的咽拭子刮取舌苔样本后，将待测咽拭子冻存在超低温环境即可。
[0015]“使用蛋白裂解液溶解待测咽拭子得到第一处理液”步骤的作用主要是：溶解待测咽拭子上的舌苔蛋白。在一些实施例中，蛋白裂解液选择为6m尿素 2m硫脲的混合溶液，硫脲的作用在于增加蛋白质的溶解度，有利于提取膜蛋白。尿素含量不大于7m是考虑到：在丙酮沉淀时如果尿素大于7m时容易在低温下析出。
[0016]
具体的，“使用蛋白裂解液溶液待测咽拭子得到第一处理液”包括步骤：在试管中加入待测咽拭子以及蛋白裂解液，恒温溶解一段时间后利用超声水浴冰浴一段时间。
[0017]
为了确保第一处理液中被充分溶解且确保第一处理液中杂质少，本方案可首先将待测咽拭子上没有舌苔的部分剪除后加入蛋白裂解液进行溶解。“恒温溶解一段时间”的内容控制为：恒温金属浴30度下保存至少60分钟，且控制转速为1000-1400rpm,优选为1200rpm。“利用超声水浴冰浴一段时间”的内容控制为：超声水浴锅冰浴超声1分钟，停30秒，并重复多次，可以重复3次。
[0018]“去除第一处理液中的杂质后得到第二处理液”步骤作用是：将第二处理液中的杂质去除并沉淀舌苔蛋白。在一些实施例中，选用丙酮进行舌苔蛋白质的沉淀，在有机溶剂沉淀蛋白的过程中，选用丙酮所带来的蛋白损失量最小。
[0019]
具体的，“去除第一处理液中的杂质得到第二处理液”包括步骤：在第一处理液中加入丙酮并沉淀一段时间，随后离心吹干得到干燥沉淀，复溶沉淀得到第二处理液。
[0020]
在本方案的一实施例中，第一处理液和丙酮溶液的比例为1：4。且丙酮选择为100％丙酮。在往第一处理液中加入100％丙酮后摇晃后分装沉淀1-2小时，随后离心一段时间后倒掉上清液，用氮气吹干沉淀得到干燥沉淀。
[0021]
在本方案中可用6m尿素 2m硫脲的混合溶液复溶沉淀，若在复溶过程中难以溶解的话，则加入ph为9.5的tris-hcl。
[0022]“利用pct处理所述第二处理液得到第三处理液”的目的是将第二处理液中的舌苔蛋白处理成多肽，起到提取舌苔蛋白的效果。
[0023]
具体的，“利用pct处理所述第二处理液得到第三处理液”步骤包括：混合第二处理液、tcep和iaa后得到第一混合液，将第一混合液置于pct上机处理后，再加入trypsin、lys-c后得到第二混合液，将第二混合液置于pct上机处理后，加入tfa混匀后离心得到第三处理液。
[0024]
本方案中的tcep指的是：三(2-羧乙基)膦酶解前需要还原蛋白质的二硫键，破坏蛋白质结构来加强酶解的效率；iaa指的是：碘乙酰胺，为了阻止还原后的自由巯基再次形成二硫键，经常使用烷基化试剂将巯基封闭。
[0025]
本方案的trypsin能特异性酶切赖氨酸和精氨酸c端的肽键，lys-c特异性的切割赖氨酸残基的c端肽键。
[0026]
本方案的第一混合液的pct上机条件不同于第二混合液的pct上机条件，此时完成蛋白质还原和烷基化，其中对应第一混合液的pct上机条件为：90cycles，45kpsi，25s hp,10s ap,30度；对应第二混合液的pct上机条件为：120cycles，20kpsi，50s hp,10s ap,30度，此时对应的是蛋白酶切。
[0027]
其中第二处理液、tcep和iaa的比例为：300:50:25。另外在添加trypsin、lys-c后使用100ul 100mm teab或100mm abb补足,仍有空余时可以再使用100mm teab或100mm abb补足。
[0028]
在“加入tfa混匀后离心得到第三处理液”步骤中，tfa和第二混合液的体积比为：1:10。在加入tfa后将其混匀后，离心低温一段时间得到第三处理液。离心低温的条件为：离心12,000g，5min，4度。
[0029]
在将第三处理液置于质谱中进行检测之前，包括步骤：对第三处理液进行除盐、旋干以及复溶。
[0030]
在“除盐”步骤中：可依次序加入meoh、80％acn/0.1％tfa、2％acn/0.1％tfa并分阶段室温离心处理，随后混合第三处理液后再加入2％acn/0.1％tfa和2％acn/0.1％tfa。
[0031]
具体的，甲醇meoh激活c18小柱后，从高有机相到高水相平衡c18柱子，多肽可在高水相中与反相柱结合，盐和缓冲液被洗去，然后用高有机相流动相洗脱多肽。
[0032]
在一具体实施例中，“除盐”步骤包括：依次加入400ul 100％meoh活化，离心90g，30s，室温；200ul 80％acn/0.1％tfa，离心80g，30s，室温；200ul2％acn/0.1％tfa，离心80g，30s，室温；添加第三处理液150ul，离心90g，30s，室温；600ul 2％acn/0.1％tfa清洗，离心90g，1.5min，室温；更换新的1.5ml ep管，收集肽段150ul 60％acn/0.1％tfa，离心90g，30s，室温；不加液体后离心120g，3min，室温。
[0033]
本方案的质谱检测第三处理液得到舌苔蛋白的蛋白组学信息中，可用使用qe hf质谱在dda采集模式下，30分钟lc梯度检测，本方案使用pfind软件可以鉴定人源蛋白超过1000proteins，微生物蛋白超过2000protein groups。
[0034]
相较现有技术，本技术方案具有以下特点和有益效果：独创性地采用咽拭子刮取舌苔样本，咽拭子采样的方式相较于压舌板、机械器皿更为柔软，不易造成被试者生理上的不适，且无需二次转移即可保存舌苔样本，减少舌苔样本在转移过程中的损失。采用压力循环样品制备技术pct，采用多次的常压和超高液压之间的压力的快速循环对舌苔蛋白进行提取和裂解，利用质谱检测到舌苔蛋白的蛋白组学信息，填补了目前舌苔蛋白质组的研究空白。
附图说明
[0035]
图1是实施例一的质谱检测结果图。
[0036]
图2是实施例一的多肽漏切率。
[0037]
图3是实施例一的多肽提取量。
具体实施方式
[0038]
下面结合实施例和附图对本方案作进一步详细说明。
[0039]
实施例一：
[0040]
随机选取4名被测试者，被测试者禁食1天，清晨漱口后使用咽拭子刮取舌苔，每位患者的舌苔储存在4片咽拭子上，将咽拭子冻存-80
°
冰箱中备用，
[0041]
溶解咽拭子中的舌苔蛋白：每位患者选取1片咽拭子，将咽拭子上没有舌苔的部分剪掉，在1.5mlep管中加入1片咽拭子，加入1ml lysis buffer(6m尿素 2m硫脲)溶解1片没过拭子，恒温金属浴30度，至少60分钟，转速1200rpm，用镊子挤去拭子中的裂解液后取出，超声水浴锅冰浴超声1分钟，停30秒，重复3次；
[0042]
丙酮沉淀蛋白：将1.5ml ep管中的样本转移到1.5ml离心管中，加入4ml倍体积的遇冷100％丙酮，摇晃5-10s，分装进4个1.5ml ep管中，每管1.1ml,-20度沉淀2小时；离心15,000g，10min，4度，倒掉上清，氮气吹干管底沉淀；每个ep管中用30ul lysis buffer复溶沉淀，复溶过程中如果难以溶解，加入1ul 1m tris-hcl(ph＝9.5)。
[0043]
使用pct机器实现还原、烷基化、酶切:将每管的30ul裂解液放入pct管中，加入5ul 100mm tcep，2.5ul 800mm iaa，避光放置，pct上机90cycles，45kpsi，25s hp,10s ap,30度，pct下机拔出pestle后，将pct管子放在ep管中，离心2000g,30s，加入0.2ug/ul trypsin 9.5ul,0.2ug/ul lys-c 2.5ul，使用100ul 100mm teab或100mm abb补足,仍有空余时可以再使用100mm teab或100mm abb补足，pct上机120cycles，20kpsi，50s hp,10s ap,30度，将150ul多肽裂解液从pct管中转移至1.5ml ep管中，加入15ul 10％tfa，混匀后，离心12,000g，5min，4度。
[0044]
除盐：400ul 100％meoh活化，离心90g，30s，室温；200ul 80％acn/0.1％tfa，离心80g，30s，室温；200ul 2％acn/0.1％tfa，离心80g，30s，室温；上样150ul，离心90g，30s，室温；600ul 2％acn/0.1％tfa清洗，离心90g，1.5min，室温；更换新的1.5ml ep管，收集肽段，150ul 60％acn/0.1％tfa，离心90g，30s，室温；不加液体，离心120g，3min，室温。
[0045]
旋干：program3，旋干大约3小时；
[0046]
复溶：复溶15ul。
[0047]
检测每片咽拭子提取到大约150ug多肽，使用qehf质谱检测，30min的dda采集模式，使用pfind软件对蛋白进行鉴定，鉴定结果如图1所示，发现鉴定到人源蛋白1000proteins,微生物蛋白2000proteins,如图2所示，可见多肽漏切率在20-30％左右，多肽的漏切率是通过pfind对质谱文件进行搜库之后得到的，每条多肽上有1-2个赖氨酸和精氨酸位点没有被切开，20％-30％的数字意味着酶切效率较高，符合质谱采集蛋白质组学数据的要求。如图3所示，提取量大概是150ug多肽，这意味着一篇拭子中含有大概150ug左右的多肽，1mg的新鲜鼠肝，大约含有10％的多肽。
[0048]
本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是具有与本技术相同或相近似的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。