成纤维细胞激活蛋白-α作为药物靶点的应用

成纤维细胞激活蛋白-α
作为药物靶点的应用
技术领域
1.本发明属于生物医药领域，涉及一种药物靶点在筛选及治疗心肌梗死的药物中的应用，具体来说是一种成纤维细胞激活蛋白-α作为靶点在筛选用于治疗心肌梗死或者缺血再灌注损伤后的药物中的应用。


背景技术：

2.心血管疾病是目前全球首位的致死因素，在我国，根据《中国心血管病报告2019概要》显示，我国从2005 年开始急性心肌梗死死亡率呈快速上升趋势。针对心肌梗死的治疗措施包括血运重建、抗血小板、控制血脂等药物干预方式，但目前综合的治疗方案并未使得中国心血管疾病的死亡率下降，随着人口老龄化的加剧，心肌梗死的发病率、死亡率仍在继续逐年升高。
3.心肌梗死是心血管疾病中最严重、致死率最高的疾病之一，心肌梗死后大量具有收缩能力的成熟心肌细胞快速死亡，导致心脏的结构和功能严重受损。由于心肌细胞增殖的能力微弱，无法快速修复受损的心脏，因此在心肌梗死后的损伤修复中，成纤维细胞发挥了巨大的作用。心脏中驻留的成纤维细胞在心肌梗死后受到局部的坏死因子、代谢产物以及炎症因子等的刺激后快速活化，并开始大量增殖，活化和增殖的心脏成纤维细胞可以大量分泌细胞外基质蛋白，使受损部位形成肉芽肿，促进血管新生，最终形成纤维疤痕，以此修复受损的心脏，保护心脏的结构和功能。在心肌梗死的修复过程中，纤维化和血管新生发挥了重要的作用。过度的纤维化可能导致心脏舒张功能障碍，心室顺应性下降，导致远期的心力衰竭；但纤维化不足也可能导致心脏破裂、瘢痕扩大。因此，有效的调控心肌梗死后成纤维细胞的功能显得尤为重要。
4.成纤维细胞激活蛋白-α(fibroblast activation protein α, fap)是位于人、鼠、牛、羊二号染色体上的一种二型跨膜整合糖蛋白，人与鼠共享89%的氨基酸序列。fap主要存在于成纤维细胞膜上，在胞质、跨膜和胞外的结构分别由6、18、736个氨基酸组成，具有胶原酶和二肽酶活性，可降解二肽和ι型胶原等。既往研究表明，fap主要高表达于肿瘤相关成纤维细胞（cancer associated fibroblasts，cafs）中，广泛参与肿瘤的生长、侵袭、转移和肿瘤胞外基质重建、血管生成、免疫逃逸过程、参与肿瘤微环境的形成与调控。fap的表达也与损伤修复等密切相关，在类风湿性关节炎、骨关节炎、肺纤维化、肝纤维化等相关疾病中发挥重要作用。2015年，tillmanns等首次发现fap可作为心肌梗死后活化成纤维细胞的标志物；2017年，bauersachs等首次检测了急性st段抬高型心肌梗死（stemi）患者外周血中fap浓度的变化，首次提出fap的变化与心肌损伤和炎症反应有关，可以作为心肌梗死诊断的生物标志物。2019年，aghajanian等对238名正常成人和心力衰竭患者的心脏组织进行测序发现，fap是缺血性心力衰竭、肥厚性心肌病、扩张性心肌病等心力衰竭患者中表达量最高的成纤维细胞标记蛋白，2020年，monika litvi
ň
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等绘制了迄今为止最全的人类心脏细胞图谱，结果表明，fap特异性的标记了一群心脏成纤维细胞。综上所述，既往的研究多将fap当作心脏成纤维细胞的表面标记蛋白，fap蛋白本身在心血管疾病中的作用机制尚不
清楚，利用car-t的方法将fap阳性的心脏成纤维细胞进行定向杀伤后，可显著缓解心肌纤维化，改善心脏的收缩和舒张功能，提示fap标记的成纤维细胞具有重要的病理生理作用，但与此同时，car-t的治疗方法也将导致严重的不良反应，如贫血、体重下降、肌肉及骨骼丢失等，因此，如何有效的调控fap阳性的成纤维细胞的功能至关重要。
5.心肌梗死后，促进血管新生是促进心肌梗死后心肌修复、防止心脏过度重构、纠正心力衰竭的重要治疗手段，fap作为一种蛋白酶，具有二肽酶及内肽酶的活性，其作用机制可能是由于fap对底物的酶切而发挥功能。那么，fap是否在心肌梗死后存在重要作用，其作用是否源于fap的蛋白酶剪切或者分解功能，导致保护性多肽（或抑制性多肽）的生物学保护效应增强或减弱目前尚未可知。既往研究表明fap酶切底物包括经典的一型胶原、明胶等，此外，在体外研究中，fap亦可剪切人源α2-antiplasmin、神经肽y、p物质、多肽yy及脑利钠肽（bnp）。其中，bnp对心脏应激后的病理状态具有强大的调控作用，bnp可以通过激活cgmp进一步影响cgki、akt、erk1/2等通路，从而影响血管新生，fap对人源bnp的酶切很大程度上会减轻bnp的生物活性。然而，fap是否可以在体内状态下对bnp进行有效酶切，酶切后bnp是否具有相似的生物学活性，体内fap抑制是否具有治疗潜力目前尚不清楚。上述基础研究的发现，为我们提供了研究fap蛋白功能的新思路，为后续有效的调控fap蛋白的功能提供了重要的理论基础。


技术实现要素：

6.针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了成纤维细胞激活蛋白-α作为靶点在筛选用于治疗心肌梗死或者缺血再灌注损伤后的药物中的应用，所述的这种成纤维细胞激活蛋白-α作为靶点在筛选用于治疗心肌梗死或者缺血再灌注损伤后的药物中的应用要解决现有技术中对于治疗心肌梗死或者缺血再灌注损伤后的效果不佳和手段有限的技术问题。
7.本发明提供了成纤维细胞激活蛋白-α作为靶点在筛选用于治疗心肌梗死或者缺血再灌注损伤后的药物中的应用。
8.进一步的，所述药物是抑制成纤维细胞激活蛋白-α的基因和蛋白表达水平的药物。
9.进一步的，所述药物是抑制成纤维细胞激活蛋白-α的蛋白酶活性的药物。
10.本发明提供了成纤维细胞激活蛋白-α的基因表达作为药物靶点在筛选用于治疗心肌梗死或者缺血再灌注损伤后的药物中的应用。
11.本发明提供了成纤维细胞激活蛋白-α的蛋白酶活性作为药物靶点在筛选用于治疗心肌梗死或者缺血再灌注损伤后的药物中的应用。
12.本发明提供了靶向成纤维细胞激活蛋白-α的抑制剂在制备治疗心肌梗死或者缺血再灌注损伤后的药物中的应用。
13.本发明提供了靶向成纤维细胞激活蛋白-α在制备作为心肌梗死患者进行诊断及预后判断的生物标志物的用途。
14.鉴于目前心血管疾病的综合治疗手段仍无法有效的降低死亡率，本发明发现了一种新的治疗靶点，用于改善心肌梗死、缺血再灌注损伤等重大心血管疾病的治疗手段，提高治疗的有效率和成功率，以期降低心血管疾病的死亡率。
15.靶向抑制成纤维细胞激活蛋白-α（fap）在心肌梗死治疗中的应用方法主要包括以下内容：fap在成人病理性心脏重构中原位高表达，在血清中，游离fap的浓度下降，且血清中游离fap的浓度与心脏功能，心脏损伤等指标具有良好的相关性，因此fap可以作为一种生物标志物来对病理性心脏重构，尤其是心肌梗死患者进行诊断及预后判断。
16.本发明通过各种方法干预了fap蛋白的功能，具体包括基因层面的敲除、敲降以及药理学层面的抑制，研究中发现，通过干预fap的表达及功能可以有效的对心肌梗死及缺血再灌注损伤起到良好的治疗作用。
17.fap抑制对于应激后心功能的保护主要是由于其酶活性被抑制，导致保护性多肽免于被清楚而发挥作用。比如心脏应激后保护性多肽——bnp，本发明发现bnp为新的fap内源性底物，既往发现的众多底物如i型胶原，α2-antiplasmin、神经肽y、p物质等在心脏应激损伤后都可能出现表达的变化，fap功能的干预均可影响底物的活性而发挥潜在的保护作用， 因此，fap为本发明中发现的重要干预靶点。
18.本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。本发明提供了一个全新的心肌梗死及缺血再灌注损伤后治疗的干预靶点，所述干预靶点为成纤维细胞激活蛋白α（fibroblast activation protein α，fap），其干预方式主要为敲降其表达及抑制其蛋白功能。通过一系列体内外实验，发现了fap新的内源性底物——bnp，并通过与已上市阳性药物的对比，进一步明确了fap抑制剂潜在的治疗作用，在一定程度上具有较强的转化潜力，可以有效的保护心肌梗死及缺血再灌注损伤后心脏重构和功能损害，促进梗死区域血管新生。
附图说明
19.图1显示为实施例1中fap在成人及小鼠中表达的情况及其与预后的相关性。
20.图2显示为实施例2中fap基因敲除在稳态条件下对小鼠生长发育及心功能等的影响。
21.图3显示为实施例2中fap基因敲除后对心肌梗死后心功能和心脏结构的保护作用。
22.图4显示为实施例3中小分子化合物抑制fap所取得的治疗效果。
23.图5显示为实施例4中fap抑制剂特异性分析。
24.图6显示为实施例5中fap干预对缺血再灌注损伤的治疗效果。
25.图7显示为实施例6中fap干预对i型胶原和血管新生的影响。
26.图8显示为实施例7中fap与bnp酶切作用的体外验证。
27.图9显示为实施例8中bnp对huvecs成管的影响。
28.图10显示为实施例8中fap对bnp促进huvecs成管及迁移的影响。
29.图11显示为实施例9中fapi对于底物bnp敲除小鼠的治疗效果及与阳性药物lcz696的对比。
具体实施方式
30.以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书
fraction，ef）进行线性回归分析后我们发现，血清中游离fap的浓度与ami、ihf患者ef值均呈正相关（图1j-1k）。随后，我们通过血清游离fap浓度的中位数将ami患者分为高浓度fap组及低浓度fap组，对所有患者进行d-spect检测后发现，低浓度fap组的患者在静息及负荷状态下缺血评分（srs score、sss score）更高，总体再灌注缺损（total perfusion defect，tpd%）更大（图1l-图1o）。为进一步研究fap的功能，我们在小鼠体内也观察了心肌梗死后fap的表达情况，结果显示，在小鼠心肌梗死后，梗死区域fap mrna的表达量在早期逐渐升高，到心肌梗死后7天达到高峰，随后fap mrna表达量逐渐下降，到28天几乎可降至正常水平（图1p）。由于既往研究表明，fap为活化的心脏成纤维细胞的表面标记蛋白，因此，我们通过与既往公认的活化的心肌成纤维细胞的表面标记蛋白α-sma共染，我们发现小鼠心肌梗死后7天的心脏组织中fap与α-sma均明显高表达，二者存在较多共定位（图1q），提示fap在心肌梗死后表达量升高，并标记了一群特定的活化的心脏成纤维细胞。
36.实施例2 利用fap基因敲除的小鼠进行fap的功能验证为进一步探究fap在心肌梗死后的具体功能，我们利用jackson lab购买的fap基因敲除小鼠（fap-/-）进行后续的功能验证。首先，我们分析了fap基因敲除对小鼠正常情况下生长发育的影响，结果发现，在fap基因被敲除后，小鼠的体重、各脏器器官重量、胫骨长度均无明显差异（图2a-2f），提示fap-/-不影响小鼠的生长发育。随后，我们对8周的fap-/-小鼠进行了心脏切片masson染色，结果发现在稳态下，与fap表达正常的小鼠相比两者心肌间质纤维化程度无明显差异（图2g-2h）。与此同时，我们对fap-/-小鼠及对照小鼠进行心脏切片wga染色，结果发现稳态条件下，两者心肌细胞的大小无明显差异（图2i-2j）。在心脏结构及功能方面，我们通过心超测量发现，两者具有相似的舒张期室间隔厚度（ivs;d）、舒张期左室后壁厚度（lvpw;d）、心脏射血分数（ef）、短轴收缩率（fs）及舒张末期左室容积（lvedv）（图2k-2o）。由此，我们确定在稳态下，敲除fap基因对于小鼠的生长发育、心肌间质纤维化程度、心肌细胞大小、心脏结构及功能无明显影响。
37.为进一步探究fap在应激状态下是否具有生物学功能，我们利用fap-/-小鼠及前降支永久结扎的心肌梗死模型，对fap功能进行了探索，结果发现，小鼠心肌梗死fap基因敲除可以有效的减缓小鼠心肌梗死后的心室重构和心功能减退，心脏超声结果表明，fap-/-小鼠在心肌梗死后1、3、7、14天具有更好的左室收缩功能，ef及fs均明显高于对照组（图3a-3c），与此同时，fap-/-小鼠还具有更低的左室舒张末期容积、更小的心脏/体重比值，心肌梗死后7天，fap-/-小鼠ivs;d、lvpw;d更高，这些结果均表明fap基因敲除后小鼠心脏重构更少，fap敲除可有效保护心脏的结构及功能（图3d-3f，3k）。为了更好的观察小鼠心肌梗死后瘢痕及纤维化情况，我们对两组小鼠心肌梗死后7天的心脏组织进行了切片染色，结果发现fap-/-小鼠整体的瘢痕面积更小，间质纤维化程度更高（图3g-3j）。为了尽可能地全面评估小鼠心肌梗死后瘢痕组织的大小，我们将两组小鼠心肌梗死后7天的心脏进行取材，并用4% pfa固定后，25%的lugol’s溶液浸泡24小时候进行micro-ct扫描，结果显示，从整体来看，fap-/-小鼠亦具有更小的整体瘢痕体积（图3l-3m），由此，我们认为，fap基因敲除在心肌梗死后发挥保护作用，使得心脏出现更好的病理性重构，更好的在急性期修复瘢痕，从而使得心肌梗死后小鼠具有更好的心脏收缩功能。
38.实施例3 药理学抑制fap酶活性可有效的保护心肌梗死后小鼠心脏结构及功能fap具有胶原酶及二肽酶活性，为进一步探究fap发挥其心脏调节功能是否依赖于
酶活性，我们利用fap酶活性特异性小分子化合物抑制剂（fapi）ac-gly-boropro（一种乙酰化的甘氨酸硼酸化的脯氨酸，购买自mce（medchemexpress）公司，货号：886992-99-0）对fap酶活性进行干预，以此来验证fap酶活性抑制剂是否具有类似于fap基因敲除的保护作用。
39.首先，我们测试了fapi的剂量曲线，依据ac-gly-boropro的酶活ki值，我们选定了0.15 mg/kg、0.5 mg/kg及1.5 mg/kg作为3个治疗剂量组，固定治疗时间为7天，对心肌梗死后小鼠进行每日腹腔注射方式给药，并对小鼠的死亡率、心脏结构及功能、组织学、器官重量等多个层面进行分析（具体实验流程如图4a），结果发现，0.5 mg/kg fapi治疗剂量组可以有效降低心肌梗死后小鼠死亡率（图4b），通过对心脏收缩功能进行测定，我们发现0.5 mg/kg治疗组小鼠ef值更高（图4c）。随后我们对fapi治疗7天后的小鼠心脏进行切片并染色，结果发现在靠近结扎位点层面，vehicle治疗组与0.5 mg/kg fapi治疗组两者瘢痕面积无显著差异，但fapi治疗组具有更多的间质纤维化，与对照组相比，fapi治疗后心脏/体重的比值亦明显下降（图4d-4g），提示fapi治疗后心脏重构更少，0.5 mg/kg fapi治疗取得了最优的治疗效果。
40.随后，我们进一步测试了fapi治疗的时间曲线，在明确最佳治疗剂量的情况下，我们将治疗的剂量确定为0.5 mg/kg，治疗的时间分别设定在治疗7天、14天及28天，并对小鼠的心脏结构及功能数据、组织学数据、器官重量数据等进行收集（具体实验流程如图4h），结果发现，fapi治疗7天后即可以有效的保护心脏收缩功能，随着治疗时间的延长，小鼠心脏重构的比例大幅度下降，治疗14天及28天后，小鼠左室舒张末期容积较vehicle有明显下降（图4j）。随后我们进一步对fapi治疗的各个时间点小鼠心脏间质纤维化的程度进行了分析，结果表明随着治疗时间的延长，小鼠心脏间质纤维化的程度逐渐增强（图4k-4l）。
41.实施例4 fapi以fap酶活性依赖的形式发挥作用，并特异性的抑制了fap的酶活性为进一步排除fap抑制剂ac-gly-boropro以非依赖fap酶活性的方式发挥了心肌梗死后的心脏保护作用，我们进一步选择了另一种作用机制与ac-gly-boropro作用机制完全不同的小分子化合物sp-13786（购买自mce（medchemexpress）公司，货号：1448440-52-5）作为新的fap酶活性抑制剂，并对小鼠心肌梗死模型进行治疗，结果发现，sp-13786治疗7天后亦可有效的保护小鼠的心脏收缩功能，sp-13786治疗组小鼠ef、fs更高（图5a-5c），抑制心肌梗死后小鼠心脏的病理性重构，表现为sp-13786治疗组小鼠左室舒张末期容积更小（图5d）。全新的抑制剂sp-13786亦可发挥有效的心肌梗死后保护作用，提示fap酶活性抑制具有潜在的治疗价值。
42.为进一步排除小分子抑制剂在抑制fap酶活性时可能非特异的靶向抑制了其他酶的酶活性，因此，我们利用小分子化合物进一步在fap-/-小鼠中检测了小分子化合物抑制剂的特异性，通过7天的fapi治疗后我们发现，野生型小鼠心肌梗死后fapi治疗组可有效保护小鼠心脏收缩功能，改善心脏病理性重构，但fapi治疗在fap-/-小鼠中没有叠加效应（图5e-5h），提示fapi特异性的作用于fap的酶活性而发挥了治疗作用，不存在抑制剂的脱靶效应。
43.实施例5 fap基因敲除及fap酶活性抑制在缺血再灌注损伤中亦可发挥保护作用由于在临床实践中，心肌梗死后快速血运重建导致的缺血再灌注损伤更为常见。与永久性结扎导致的持续缺血不同的是，缺血再灌注过程中可能由于血液再灌注导致更多的氧化应激等损伤，为进一步模拟在临床治疗中遇到的实际情况，我们进一步在小鼠心肌缺血再灌注损伤模型中探究了是否fap基因敲除及fap酶活性抑制亦可发挥保护作用。首
先，我们通过evans blue/ttc染色的方法，对缺血再灌注损伤72小时后fap基因敲除及fapi治疗对缺血危险区、梗死区的影响进行了探究，结果发现fap基因敲除和fapi治疗均可使小鼠缺血再灌注损伤面积减小，表现为与对照组相比，fap-/-组和fapi治疗组小鼠具有更小的缺血危险区/左室面积、梗死面积/缺血危险区面积的比值（图6a-6d）。与此同时，我们也通过心脏超声观察了fap-/-组及fapi治疗组小鼠心功能及心脏结构的变化情况，结果表明fap-/-组及fapi治疗组小鼠在7天和28天的时间点具有更好的收缩功能，ef值和fs均明显升高，两组小鼠的心室重构情况更少，左室舒张末期容积更小（图6e-6h）。随后我们对三组小鼠的心脏组织进行切片机masson染色，结果显示在缺血再灌注损伤7天后，fap-/-组及fapi治疗组均表现出更多的心肌间质纤维化，提示更强的心脏瘢痕修复（图6i-6j）。最后，我们通过对小鼠心脏重量与体重的比值进行分析，结果提示在缺血再灌注损伤7天和28天后，fap-/-组及fapi治疗组均具有更小的心脏重量/体重比值（图6k）。
44.实施例6 fap基因敲除及fap酶活性抑制可促进i型胶原沉积及血管新生在心肌梗死急性期，胶原等ecm的沉积和血管新生对促进心功能恢复、保护心脏结构及功能具有重要的作用，由于fap可以有效的降解i型胶原，我们进一步探究了fap基因敲除及fap酶活性抑制是否会影响心肌梗死后小鼠心肌梗死边缘的i型胶原沉积和血管新生。通过对野生型、fap基因敲除小鼠及fapi治疗的小鼠心脏切片进行免疫荧光染色后我们发现，fap基因敲除小鼠及fapi治疗的小鼠在心肌梗死边缘区i型胶原沉积及血管新生均明显增多，提示fap影响了心肌梗死后的i型胶原及血管新生（图7a-7d）。
45.实施例7 确定fap可以有效的酶切小鼠bnpbnp在心脏各种病理生理性应激后发挥了重要的调控作用，既往研究表明fap可以对人源的bnp进行有效的酶切，从而降低bnp的生物活性，使其失去应激后的心脏调控作用。但小鼠bnp是否可以有效的被fap进行酶切至今不明，为进一步探究fap对小鼠bnp的酶切作用，我们首先通过对野生型、fap基因敲除小鼠及fapi治疗的小鼠心脏切片进行免疫荧光染色，结果发现fap基因敲除小鼠及fapi治疗的小鼠心脏切片中bnp在心肌梗死边缘区的表达明显增多，提示bnp可能为fap内源性的底物，随后，我们通过western blot进一步验证了三组小鼠心肌梗死后边缘区心脏组织中bnp的表达量，结果发现fap基因敲除小鼠及fapi治疗的小鼠心脏组织中bnp表达量明显上升（图8a-8d）。因此，为进一步验证fap对小鼠bnp的酶切，我们在体外对两种蛋白及多肽进行共孵育，首先固定fap使用的剂量，发现在10 ul的酶切体系中，10 ng的重组fap蛋白可在48小时后有效酶切小鼠bnp，通过colloidal blue染色可以发现48小时共孵育导致小鼠bnp条带变淡消失（图8e-8f），随后我们有测试了不同剂量的fap在24小时内对小鼠bnp的酶切情况，结果发现随着fap剂量的增加，小鼠bnp的酶切逐渐上升，通过fap抑制剂预处理fap蛋白后继续与小鼠bnp共孵育24小时，fap对小鼠bnp的酶切作用消失（图8g-8h），提示fap可有效对小鼠bnp进行酶切。
46.实施例8 小鼠bnp体外促进血管新生的作用可被fap阻断为进一步探究fap酶切bnp对血管新生的影响，我们利用人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，huvecs）研究了小鼠bnp对huvecs成管能力的影响。首先，我们测试了不同浓度的小鼠bnp对huvecs促进成管能力的影响，我们设置了vehicle，1 nm，10 nm，100 nm四个剂量组，将小鼠bnp加入huvecs的培养基中，16小时后分析小鼠bnp对huvecs成管能力的影响，与vehicle1相比，1 nm和10 nm剂量组均可以明显促进huvecs成
管的能力，1 nm和10 nm剂量组huvecs成管所形成的腔室更多，总的腔室面积更大，分支总长度更长，其中10 nm剂量组的效果更优（图9a-9b）。随后，我们进一步测试了 10 nm小鼠bnp对于huvecs成管不同的时间点的效果，结果发现与vehicle相比，小鼠bnp在8小时、16小时和24小时均可显著促进huvecs成管，小鼠bnp处理组具有更多的连接点、更多的腔隙形成，总腔隙面积更大，分支总长度更长，其中16小时两组差异最明显（图9c-9g）。
47.在确定了最佳剂量和最佳处理时间后，我们选择10 nm小鼠bnp对huvecs处理16小时，观察vehicle、重组fap蛋白、小鼠bnp、小鼠bnp与fap共孵育对huvecs成管的影响，研究结果发现，与vehicle相比，fap对huvecs成管无明显影响，小鼠bnp可有效促进huvecs成管，这种促进成管的效果在fap与小鼠共孵育后消失，其共孵育对huvecs成管无影响（图10a-10b）。
48.血管的形成除了huvecs成管能力的影响之外，迁移能力对血管形成也有重要的影响，因此，我们进一步探索了小鼠bnp对huvecs成管的影响。通过transwell的实验体系我们发现，重组fap蛋白和10 nm的小鼠bnp可有效的促进huvecs迁移，但fap与小鼠bnp共孵育后，其促进huvecs迁移的能力消失（图10c-10d）。为了进一步明确fap及小鼠bnp对huvecs迁移能力的影响，我们利用划痕实验，对transwell的结果进行了进一步验证，与transwell结果一致的是，fap与小鼠bnp单独均可以促进划痕的愈合，但两者共孵育之后促进能力消失（图10e-10f），进一步验证了fap对bnp促进huvecs迁移能力的调控，提示小鼠bnp为fap的体外底物。
49.实施例9 确定在bnp敲除小鼠中fapi治疗无效为进一步验证bnp是fap的内源性底物，我们通过对底物——bnp敲除的小鼠进行心肌梗死造模，并给予fap酶活性抑制剂治疗来明确fapi在bnp敲除小鼠中的治疗效果（具体实验流程如图11a），研究结果显示，fapi可显著改善野生型小鼠的心脏结构及收缩功能，单独fapi治疗组小鼠具有更高的ef、fs，更小的左室舒张末期内径及左室舒张末期容积，但在bnp敲除的小鼠中给予fapi治疗7天后无明显治疗效果（图11b-11f）。随后，我们以已上市且可酶切bnp的脑啡肽酶抑制剂lcz696作为阳性药物，与fapi平行对比治疗效果（图11g），结果显示fapi和lcz696均可保护小鼠心肌梗死后心功能及心脏结构，且fapi与lcz696联合治疗无叠加效应（图11h-11l），进一步提示两者作用于共同的靶点——bnp，为bnp是fap内源性底物提供了更有力的证据。