非生物胁迫耐性植物和方法与流程

1.本公开发明涉及到植物育种和遗传学领域，尤其是，涉及到提高植物对非生物胁迫的耐受性。
2.研究背景
3.生物和非生物原因可以对植物产生胁迫，例如造成生物胁迫的原因包括病原菌感染、昆虫取食、一种植物对另一种植物的寄生，例如槲寄生；非生物胁迫包括诸如有效水分的过量或者不足、极限温度和诸如除草剂的合成化学药品。
4.非生物胁迫是造成世界范围内农作物减产的主要原因，造成主要农作物平均减产50％以上(boyer,j.s.(1982)science,218：443-448；bray,e.a.等(2000)in biochemistry and molecular biology of plants,编辑buchannan,b.b.等,amer.soc.plant biol.,pp.1158-1249；mushtaq等(2018)journal of plant physiology,224
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225:156
–
162)。尽管人们对非生物胁迫响应和抗性进行了广泛的研究，并应用各种技术开发了非生物胁迫耐受作物，但目前还没有理想的商业产品。
5.因此，需要开发提高植物对非生物胁迫耐受性的成分和方法。本发明提供此类组合物和方法。
6.发明概述
7.以下是本发明所涵盖的实施例：
8.在一个实施例中，本公开发明包括一个分离的多核苷酸，其编码的多肽的氨基酸序列与seq id no:3、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32、35、38、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156或158有至少90％的序列一致性，其中植物中该多核苷酸表达的增加能提高耐旱性。在某些实施例中，所述分离的多核苷酸编码的氨基酸序列是seq id no:3、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32、35、38、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126,128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156或158。在某些实施例中所述分离的多核苷酸含有的核苷酸序列为seq id no:1、2、4、6、7、9、10、12、13、15、16、18、19、21、22、24、25、27、28、30、31、33、34、36、37、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157。在某些实施例中，植物中该多核苷酸表达的增加提高了干旱条件下籽粒的产量。
9.本公开发明还提供了一种重组dna构建体，其含有的分离的多核苷酸可操作地连接至少一个异源调控元件，其中所述多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列与seq id no:3、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32、35、38、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156或158有至少90％的序列一致性。
10.本公开发明进一步提供了一个改良植物或种子，含有至少一个编码多肽的多核苷
酸表达或活性的增加，所述多肽的氨基酸序列与seq id no:3、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32、35、38、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156或158有至少90％的序列一致性。在某些实施例中，所述改良的植物或种子在其基因组中含有一个重组dna构建体，其含有的多核苷酸可操作地连接至少一个异源调控元件，其中所述多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列与seq id no:3、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32、35、38、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156或158有至少90％的序列一致性。在某些实施例中，该改良的植物和同样生长在干旱条件下的对照植物相比较，表现出提高的耐旱性和/或增加的籽粒产量。
11.在某些实施例中，所述改良的植物或种子在其基因组位点上含有一个靶向基因修饰，该靶向基因修饰的基因组位点上含有一种编码多肽的多核苷酸，该多肽的氨基酸序列与seq id no:3、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32、35、38、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156或158有至少90％的序列一致性，其中所述靶向基因修饰提高了该多肽的表达和/或活性。在某些实施例中，所述改良的植物与同样生长在干旱条件下的对照植物相比较，表现出提高的耐旱性和增加的籽粒产量。
12.在某些实施例中，所述植物选自水稻、玉米、大豆、向日葵、高粱、油菜、小麦、苜蓿、棉花、大麦、小米、甘蔗和柳枝稷。
13.还提供了一种提高植物耐旱性的方法，该方法包括增加至少一个编码多肽的多核苷酸的表达，所述多肽的氨基酸序列与seq id no:3、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32、35、38、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156或158有至少90％的序列一致性。其中所述植物与对照植物相比较时，表现出提高的耐旱性。
14.在某些实施例中，所述提高耐旱性的方法包括：(a)向一个可再生的植物细胞引入一个重组dna构建体，其含有一个多核苷酸可操作地连接至少一个异源调控元件，其中所述多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列与seq id no:3、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32、35、38、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156或158相比较时，有至少80％的序列一致性；和(b)再生所述植物，该植物在其基因组中含有所述重组dna构建体。
15.在某些实施例中，提高植物耐旱性的方法包括：(a)向一个可再生植物细胞的基因组位点上引入一个靶向基因修饰，该靶向基因修饰的基因组位点上包含一个编码多肽的多核苷酸，，其编码的多肽的氨基酸序列与seq id no:3、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32、35、38、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、
152、154、156或158相比较时，有至少80％的序列一致性；和(b)再生所述植物，该植物在其基因组中包含有引入的基因修饰，且所述多肽的表达和/或活性是增加的。在某些实施例中，靶向基因修饰的引入可使用以下基因组修饰技术：多核苷酸引导的核酸内切酶、crispr-cas核酸内切酶、碱基编辑脱氨酶、锌指核酸酶、转录激活物样效应器核酸酶(talen)、工程位点特异性巨核酸酶或argonaute。在某些实施例中，靶向基因修饰存在于基因组位点的(a)编码区域；(b)非编码区域；(c)调控区域；(d)非翻译区域；或(e)任意(a)-(d)的组合，其编码的多肽的氨基酸序列与seq id no:3、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32、35、38、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110,112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146,148、150、152、154、156或158相比较时有至少80％的序列一致性。
16.附图说明和序列表
17.通过以下详细描述和构成本技术一部分的随附序列列表，可以更全面地理解本发明。此处所附的序列描述和序列列表符合37c.f.r.
§§
1.821和1.825中规定的专利申请中核苷酸和氨基酸序列披露规则。序列描述包括37c.f.r.
§§
1.821和1.825中定义的氨基酸的三个字母代码，通过引用并入本文。
18.表1.序列表详述
19.20.[0021][0022]
详细描述
[0023]
本文件所述各参考文献全部通过引用并入本文件。
[0024]
如本文和所附权利要求中所使用的，除非上下文另有明确规定，否则单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数引用。因此，例如，对“植物”的引用包括多个这样的植物；对“细胞”的引用包括本领域技术人员已知的一个或多个细胞及其等效物，等等。
[0025]
定义
[0026]
在本文中，植物“增加的耐旱性”是指生理或物理特性的任何可测量的改善，例如产量，当在干旱条件下生长时相对于参照或对照植物测量。通常，当基因组中包含重组dna构建体或dna修饰的植物，与基因组中不包含重组dna构建体或dna修饰的参照或对照植物相比较时，表现出更强的耐旱性。
[0027]“农艺性状”是可测量的指标参数，包括但不限于：叶片绿色程度、籽粒产量、生长速率、总生物量或积累速率、成熟时的鲜重、成熟时的干重、果实产量、种子产量、植物总氮含量、果实氮含量、种子氮含量、植物营养组织氮含量、植物总游离氨基酸含量、果实游离氨基酸含量、种子游离氨基酸含量、植物营养组织游离氨基酸含量、植物总蛋白含量、果实蛋白含量、种子蛋白含量、植物营养组织蛋白质含量、耐旱性、氮的吸收、根的倒伏、收获指数、茎的倒伏、株高、穗高、穗长、耐盐性、分蘖数、圆锥花序的大小、早期苗的活力和低温胁迫下的出苗状况。
[0028]“转基因的”指其基因组因异源核酸(如重组dna构建体)的存在而发生改变的任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物。例如一个重组dna构建体，包括最初的转基因事件以及由最初转基因事件产生的有性杂交或无性繁殖产生的事件。本文使用的术语“转基因”不包括通过常规植物育种方法或自然发生的事件(如随机交叉受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座)改变基因组(染色体或额外染色体)，或自发突变。
[0029]“对照”、“对照植物”或“对照植物细胞”为测定受测试植物或植物细胞的表型变化提供参考，由于转化，受测植物或植物细胞的基因组改变影响到目的基因，测试的植物或植物细胞可以是转基因植物或转基因植物细胞的子代。例如，除了导致测试植物或细胞的遗传改变之外，对照植物可以和测试植物具有相同的遗传背景。
[0030]“植物”包括整个植株、植物器官、植物组织、种子和植物细胞以及该植株的子代。植物细胞包括但不限于来自下列物质的细胞：种子、悬浮培养物、胚、分生区域、愈伤组织、叶、根、芽、配子体、孢子体、花粉和小孢子。
[0031]“子代”包括植物的任何后续世代。
[0032]“修饰植物”包括在其基因组内包含异源多核苷酸或修饰基因或启动子的植物。例如，异源多核苷酸稳定地整合在基因组内，使得该多核苷酸被传递到连续世代。异源多核苷酸可单独或作为重组dna构建物的一部分整合到基因组中。
[0033]
关于序列的“异源”意思是来源于外来物种的序列，或者，如果来自同一物种，在组成和/或基因组位置上通过人为干预对其天然的组成形式进行了实质性的修改。
[0034]“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”或“核酸片段”可互换使用并且是任选含有合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基的单链或双链rna或dna聚合物。核苷酸(通常以它们的5
′‑
单磷酸形式存在)通过如下它们的单个字母名称来指代：“a”为腺苷酸或脱氧腺苷酸(分别对应rna或dna)，“c”表示胞苷酸或脱氧胞苷酸，“g”表示鸟苷酸或脱氧鸟苷酸，“u”表示尿苷酸，“t”表示脱氧胸苷酸，“r”表示嘌呤(a或g)，“y”表示嘧啶(c或t)，“k”表示g或t，“h”表示a或c或t，“i”表示肌苷，并且“n”表示任何核苷酸。
[0035]“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白质”在本发明中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。术语“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白质”还可包括修饰形式，包括但不限于糖基化、脂质连接、硫酸盐化、谷氨酸残基的γ羧化、羟化和adp-核糖基化。
[0036]“重组dna构建体”指在自然界中通常不会一起存在的核酸片段的组合。因此，重组dna构建体可包含源于不同来源的调控序列和编码序列，或源于相同来源但以不同于通常天然存在的方式排列的调控序列和编码序列。
[0037]“调控元件”指位于编码序列的上游(5'非编码序列)、中间或下游(3'非编码序列)，并且影响相关编码序列的转录、rna 加工或稳定性或者翻译的核苷酸序列。调控序列可包括但不限于启动子、翻译前导序列、内含子和多腺苷酸化识别序列。术语“调控序列”和“调控元件”在本文中可互换使用。
[0038]“启动子”指能够控制另一核酸片段转录的核酸片段。“植物中有功能启动子”是能够控制植物细胞中基因转录的启动子，无论其是否来源于植物细胞。“组织特异性启动子”和“组织优选启动子”可互换使用，并且指主要但非必须专一地在一种组织或器官中表达，而且也可在一种特定细胞或细胞型中表达的启动子。“发育调控启动子”指其活性由发育事件决定的启动子。
[0039]“可操作地连接”指核酸片段连接成单一片段，使得其中一个核酸片段的功能受到
另一个核酸片段的调控。例如，在启动子能够调节核酸片段的转录时，该启动子与该核酸片段进行了可操作地连接。
[0040]“表达”指功能产物的产生。例如，核酸片段的表达可指核酸片段的转录(如转录生成mrna或功能rna)和/或rna翻译成前体或成熟蛋白质。
[0041]
在本文中，“增加”、“增多”等是指实验组(例如，具有本文所述dna修饰的植物)与对照组(例如，不包含dna修饰的野生型植物)相比的任何可检测到的增加。因此，蛋白质的增加表达包括样品中蛋白质总水平的任何可检测的增加，并且可以使用本领域的常规方法(例如，western blotting和elisa)来确定。
[0042]
在本文中，“产量”指每单位土地收获的农业产量，可包括收获时作物每英亩蒲式耳或每亩千克数，并根据谷物水分进行调整(例如，玉米通常为15％，水稻为13.5％)。谷物水分是在谷物收获时测量的。谷物的调整试验重量确定为每蒲式耳磅或每株克的重量，并根据收获时的谷物水分水平进行调整。
[0043]
在本文中，在两个多核苷酸或多肽序列的上下文中，“序列一致性”或“一致性”指当在指定的比较窗口上对齐以获得最大对应性时相同的两个序列中的残基。当序列同一性百分比用于蛋白质时，人们认识到，不完全相同的残基位置往往因保守的氨基酸替换而不同，氨基酸残基被具有类似化学性质(如电荷或疏水性)的其他氨基酸残基取代，因此不会改变分子的功能性质。当序列在保守替换中不同时，可向上调整序列一致性百分比，以纠正替换的保守性质。通过这种保守替换而不同的序列称为“序列相似性”或“相似性”。进行此调整的方法为本领域技术人员所熟知。通常，这涉及将保守替换作为部分不匹配而不是完全不匹配进行评分，从而增加序列一致性的百分比。因此，例如，如果相同氨基酸的得分为1，非保守替代的得分为0，保守替代的得分为0到1之间。计算保守替换的得分，例如，在pc/gene计划(intelligenetics,mountain view,california)中实施。
[0044]“序列一致性百分比(％)”是经过序列比对和引入缺口后，待测序列的序列一致性计算包括，将两个序列中相同核苷酸碱基或氨基酸残基的位置数目，获得匹配位置数，然后将匹配的位置数除以比对窗口中位置总数再乘以100。
[0045]
除非另有说明，本文提供的序列的多重比对是使用clustal v比对方法(higgins and sharp.(1989)cabios,5:151-153)进行的，具有默认参数(间隙惩罚＝10，间隙长度惩罚＝10)。使用clustal v方法进行成对比对和氨基酸序列同一性百分比计算的默认参数为k倍数＝1，间隙惩罚＝3，窗口＝5，对角线保存＝5。对于核酸，这些参数为k倍数＝2，间隙惩罚＝5，窗口＝4，对角线保存＝4。序列对齐后，使用clustal v程序，通过查看同一程序上的“序列距离”表，可以获得“一致性百分比”和“散度”值；除非另有说明，否则本文中提供和声明和分歧百分比是以这种方式计算的。
[0046]
组合物：
[0047]
a.多核苷酸和多肽
[0048]
本公开发明提供的多核苷酸编码以下多肽：fbx335(osfbx335-f-box结构域蛋白)；nadh1(呼吸链nadh脱氢酶，49kd亚单位家族蛋白)；drh7(dead-box atp依赖性rna解旋酶7)；puf1(含有未知功能域的植物蛋白)；pk1(丙酮酸激酶，推测)；dn-dtp17(表达蛋白)；cuao1(铜胺氧化酶，推测)；fao1(酒精氧化酶，推测)；dn-dtp9(保守假设蛋白)；dn-dtp18(表达蛋白)；scp52(osscp52-推定的丝氨酸羧肽酶同系物)；和dn-dtp19(表达蛋白)。
[0049]
一方面，本公开发明提供的多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列与氨基酸序列seq id no:3、5、8、11、14、17、20、23,26、29、32、35、38、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156或158中的任何一个都有至少80％(例如，81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的一致性。
[0050]“osfbx335”是指一种水稻多肽，在过量表达时赋予耐旱表型。osfbx335多肽(seq id no:3和5)由水稻基因位点loc_os09g32860.1上的编码序列(cds)(seq id no:2和4)或核苷酸序列(seq id no:1)编码，在tigr的注释为“osfbx335-f-box结合域蛋白，表达”。“fbx335多肽”在这里是指osfbx335多肽及其同源物(例如，由seq id no:69编码的seq id no:70)或来自其他生物体的同源物，比如玉米(由seq id no:71编码的seq id no:72)和高粱(seq id no:73编码的seq id no:74)。
[0051]“osnadh1”是指一种水稻多肽，在过量表达时赋予耐旱表型。osnadh1多肽(seq id no:8)由水稻基因位点loc_os07g41300.1处的编码序列(cds)(seq id no:7)或核苷酸序列(seq id no:6)编码。在tigr中被注释为“呼吸链nadh脱氢酶，49kd亚单位家族蛋白，表达”。“nadh1多肽”在本文中指osnadh1多肽及其同源物(例如seq id no:75编码的seq id no:76)或来自其他生物体的同源物，例如玉米(seq id no:77编码的seq id no:78)和拟南芥(seq id no:79编码的seq id no:80)。
[0052]“ospuf1”是指一种水稻多肽，在过量表达时赋予耐旱表型。ospuf1多肽(seq id no:11)由水稻基因位点loc_os03g19700.1处的编码序列(cds)(seq id no:10)或核苷酸序列(seq id no:9)编码，在tigr中被注释为“含有未知功能域蛋白的植物蛋白，表达”。“puf1多肽”在本文中指ospuf1多肽及其同源物(例如seq id no:81编码的seq id no:82)或来自于其它生物体的同源物，例如玉米(seq id no:83编码的seq id no:84)、高粱(seq id no:85编码的seq id no:86)、拟南芥(seq id no:87编码的seq id no:88)和大豆(seq id no:89编码的seq id no:90)。
[0053]“ospk1”是指一种水稻多肽，在过量表达时赋予耐旱表型。ospk1多肽(seq id no:14)由水稻基因位点loc_os01g47080.1处的编码序列(cds)(seq id no:13)或核苷酸序列(seq id no:12)编码，在tigr中被注释为“丙酮酸激酶，推定，表达”。“pk1多肽”在本文中指ospk1多肽及其同源物(例如seq id no:91编码的seq id no:92)或来自于其它生物体的同源物，例如玉米(seq id no:93编码的seq id no:94)、高粱(seq id no:95编码的seq id no:96)、拟南芥(seq id no:97编码的seq id no:98)和大豆(seq id no:99编码的seq id no:100)
[0054]“osfao1”是指一种水稻多肽，在过量表达时赋予耐旱表型。osfao1多肽(seq id no:17)由水稻基因位点loc_os02g40840.1处的编码序列(cds)(seq id no:16)或核苷酸序列(seq id no:15)编码，在tigr中被注释为“酒精氧化酶，推定，表达”。“fao1多肽”在本文中指osfao1多肽及其同源物(例如seq id no:101编码的seq id no:102)或来自于其它生物体的同源物，例如玉米(seq id no:103编码的seq id no:104)、高粱(seq id no:105编码的seq id no:106)、拟南芥(seq id no:107编码的seq id no:108)和大豆(seq id no:109编码的seq id no:110)
[0055]“osdn-dtp17”是指一种水稻多肽，在过量表达时赋予耐旱表型。osdn-dtp17多肽(seq id no:20)由水稻基因位点loc_os01g19400.1处的编码序列(cds)(seq id no:19)或核苷酸序列(seq id no:18)编码，在tigr中被注释为“表达蛋白”。“dn-dtp17多肽”在本文中指osdn-dtp17多肽及其同源物(例如seq id no:111编码的seq id no:112)或来自于其它生物体的同源物，例如玉米(seq id no:113编码的seq id no:114)、高粱(seq id no:115编码的seq id no:116)、拟南芥(seq id no:117编码的seq id no:118)和大豆(seq id no:119编码的seq id no:120)。
[0056]“oscuao1”是指一种水稻多肽，在过量表达时赋予耐旱表型。oscuao1多肽(seq id no:23)由水稻基因位点loc_os04g39120.1处的编码序列(cds)(seq id no:22)或核苷酸序列(seq id no:21)编码，在tigr中被注释为“铜胺氧化酶，推定，表达”。“cuao1多肽”在本文中指oscuao1多肽及其同源物(例如seq id no:121编码的seq id no:122)或来自于其它生物体的同源物，例如玉米(seq id no:123编码的seq id no:124)、高粱(seq id no:125编码的seq id no:126)。
[0057]“osdrh7”是指一种水稻多肽，在过量表达时赋予耐旱表型。osdrh7多肽(seq id no:26)由水稻基因位点loc_os09g34910.1处的编码序列(cds)(seq id no:25)或核苷酸序列(seq id no:24)编码，在tigr中被注释为“dead-box atp依赖性rna解旋酶7，推测，表达”。“drh7多肽”在本文中指osdrh7多肽及其同源物(seq id no:127编码的seq id no:128)或来自于其它生物体的同源物，例如玉米(seq id no:129编码的seq id no:130)、高粱(seq id no:131编码的seq id no:132)、拟南芥(seq id no:133编码的seq id no:134)和大豆(seq id no:135编码的seq id no:136)
[0058]“osdn-dtp9”是指一种水稻多肽，在过量表达时赋予耐旱表型。osdn-dtp9多肽(seq id no:29)由水稻基因位点loc_os07g45810.1处的编码序列(cds)(seq id no:28)或核苷酸序列(seq id no:27)编码，在tigr中被注释为“保守假设蛋白”。“dn-dtp9多肽”在本文中指osdn-dtp9多肽及其同源物(例如seq id no:137编码的seq id no:138)或来自于其它生物体的同源物。
[0059]“osdn-dtp18”是指一种水稻多肽，在过量表达时赋予耐旱表型。osdn-dtp18多肽(seq id no:32)由水稻基因位点loc_os09g12780.1处的编码序列(cds)(seq id no:31)或核苷酸序列(seq id no:30)编码，在tigr中被注释为“表达蛋白”。“dn-dtp18多肽”在本文中指osdn-dtp18多肽及其同源物或来自于其它生物体的同源物，例如玉米(seq id no:139编码的seq id no:140)、高粱(seq id no:141编码的seq id no:142)、拟南芥(seq id no:143编码的seq id no:144)和大豆(seq id no:145编码的seq id no:146)。
[0060]“osscp52”是指一种水稻多肽，在过量表达时赋予耐旱表型。osscp52多肽(seq id no:35)由水稻基因位点loc_os11g24320.1处的编码序列(cds)(seq id no:34)或核苷酸序列(seq id no:33)编码，在tigr中被注释为“osscp52-推测的丝氨酸羧肽酶同系物”。“scp52多肽”在本文中指osscp52多肽及其同源物(例如seq id no:147编码的seq id no:148)或来自于其它生物体的同源物，例如玉米(seq id no:149编码的seq id no:150)、高粱(seq id no:151编码的seq id no:152)、拟南芥(seq id no:153编码的seq id no:154)和大豆(seq id no:155编码的seq id no:156)。
[0061]“osdn-dtp19”是指一种水稻多肽，在过量表达时赋予耐旱表型。osdn-dtp19多肽
(seq id no:38)由水稻基因位点loc_os01g11360.1处的编码序列(cds)(seq id no:37)或核苷酸序列(seq id no:36)编码，在tigr中被注释为“表达蛋白”。“dn-dtp19多肽”在本文中指osdn-dtp19多肽及其同源物(例如seq id no:157编码的seq id no:158)或来自于其它生物体的同源物。
[0062]
应理解，如本领域技术人员所认知的，本发明所涵盖的不仅仅是具体的示例性序列。本领域内众所周知，核酸片段中的替代物导致在给定位点产生化学等效氨基酸，但不影响所编码多肽的功能性质。例如，氨基酸丙氨酸(疏水性氨基酸)的密码子可由编码另一疏水性较小的残基(例如甘氨酸)或疏水性较大的残基(例如缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸)的密码子取代。类似地，导致一个带负电的残基替换另一个残基的变化，如用天冬氨酸替换谷氨酸，或一个带正电的残基替换另一个残基，如用赖氨酸替换精氨酸，也可预期产生功能等效的产物。导致多肽分子n端和c端部分改变的核苷酸变化也不会改变多肽的活性。所提议的每一个修改都在本领域的常规技术范围内，如同确定编码产品的生物活性保留一样。
[0063]
b.重组dna构建体
[0064]
还提供了含有任意本文描述的多核苷酸的重组dna构建体。在某些实施例中，所述重组dna构建体还包含有至少一个调控元件。在某些实施例中，所述的至少一种调控元件是一种异源调控元件。在某些实施例中，重组dna构建体中的至少一种调控元件包含有一个启动子。在某些实施例中，所述启动子是一种异源启动子。
[0065]
大量的启动子可以被用于本文中的重组dna构建体。所述启动子能够根据期望结果进行选择，并且可以包括组成型、组织特异性、诱导型或用于在宿主生物体中表达的其他启动子。
[0066]“组成型”启动子是一种能够在大多数环境中有活性的启动子。组成型启动子包括，例如，rsyn7启动子的核心启动子或在wo 99/43838和美国专利号6072050中公开的其他组成型启动子；camv35s核心启动子(odell等,(1985)nature,313:810-812)；水稻肌动蛋白(mcelroy等人,(1990)植物细胞,2:163-171)；泛素(christensen等，(1989)，plant mol.biol.，12:619-632和christensen等人，(1992)plant mol.biol.，18:675-689)；pemu(last等,(1991)theor.appl.genet.,81:581-588)；mas(velten等,(1984)embo j.,3:2723-2730)；als启动子(美国专利号5659026)等。其他组成型启动子包括，例如，美国专利号5608149、5608144、5604121、5569597、5466785、5399680、5268463、5608142和6177611。
[0067]
组织特异性或发育调控启动子是一种dna序列，能够选择性调节植物细胞/组织中dna序列的表达。例如在这些细胞/组织中至关重要的雄穗发育、种子形成或两者都有的生长发育时期，通常将dna序列的表达限制在植物中所需的发育期(如雄穗发育或种子成熟)。可在本发明的方法中使用会引起所需时间和空间表达的任何可识别的启动子。
[0068]
许多叶片优选启动子在本领域内是已知的(yamamoto等,(1997)plant j.,12(2):255-265；kwon等,(1994)plant physiol.,105:357-367；yamamoto等,(1994)plant cell physiol.,35(5):773-778；gotor等,(1993)plant j.,3:509-518；orozco等,(1993)plant mol.biol.,23(6):1129-1138；and matsuoka等,(1993)proc.natl.acad.sci.usa,90(20):9586-9590)。
[0069]
可能用于本发明的种子或胚胎特异性的启动子，包括大豆kunitz胰蛋白酶抑制子(kti3，jofuku和goldberg.，(1989)plant cell,1:1079-1093)、豌豆球蛋白convicilin、
vicilin和legumin(豌豆子叶)(rerie，w.g.，等(1991)mol.genet.,259:149-157；newbigin,e.j.等(1990)planta,180:461-470；higgins,t.j.v.等人(1988年)plant.mol.biol.,11:683-695)、玉米醇溶蛋白(玉米胚乳)(schemthaner，j.p.等,(1988)embo j.,7:1249-1255)，菜豆子叶(segupta-gopalan,c.,等,(1985)proc.natl.acad.sci.,82:3320-3324)、植物血凝素(豆子叶)(voelker,t.等(1987)embo j.6:3571-3577)，b-伴甘氨酸和甘氨酸(豆子叶)(chen，z-l，等(1988)embo j.7:297-302)，谷蛋白(水稻胚乳)、大麦醇溶蛋白(大麦胚乳)(marris，c.，等(1988)plant mol.biol.,10:359-366)、麦谷蛋白和醇溶蛋白(小麦胚乳)(colot，v.，等,(1987)embo j.,6:3559-3564)。与嵌合基因结构中异源编码区可操作连接的种子特异基因的启动子在转基因植物中保持其时空表达模式。这些例子包括在拟南芥和甘蓝型油菜种子中表达脑啡肽的拟南芥2s种子贮藏蛋白基因启动子(vanderkerckhove等(1989)bio/technology 7:l929-932)、表达荧光素酶的大豆凝集素和大豆β-豆素启动子(riggs等(1989)plant sci.,63:47-57)，以及表达氯霉素乙酰转移酶的小麦谷蛋白启动子(colot等人(1987)embo j 6:3559-3564)。
[0070]
可诱导启动子选择性表达可操作连接的dna序列，以响应内源性或外源性刺激的存在，例如通过化合物(化学诱导物)或响应环境、激素、化学和/或发育信号。可诱导或调节的启动子包括，例如，受光、热、应激、洪水或干旱、植物激素、创伤或诸如乙醇、茉莉酸、水杨酸或安全剂等化学物质调节的启动子。
[0071]
还考虑合成启动子，其包括一种或多种异源调节元件的组合。
[0072]
本发明的重组dna构建体的启动子可以是本领域已知的任何类型或类别的启动子，从而可以使用多个启动子中的任何一个来表达本文公开的各种多核苷酸序列，包括感兴趣的多核苷酸序列的天然启动子。可基于期望结果选择用于本发明重组dna构建体中的启动子。
[0073]
本发明的重组dna构建体还可包括其他调控元件，包括但不限于翻译先导序列、内含子和聚腺苷酸化识别序列。在某些实施例中，重组dna构建体进一步包含增强子或沉默子。
[0074]
可将内含子序列添加到5'-非翻译区、蛋白质编码区或3'-非翻译区，以增加积累在细胞质中的成熟信息量。在植物和动物表达结构的转录单元中加入可剪接的内含子已被证明可以在mrna和蛋白质水平上将基因表达提高1000倍(buchman和berg.,(1988)mol.cell biol.,8:4395-4405；callis等人(1987)genes dev.,1:1183-1200)。
[0075]
c.植物和植物细胞
[0076]
提供的植物、植物细胞、植物部分、种子和籽粒，在其基因组中含有任意本文描述的重组dna构建体，因而所述植物、植物细胞、部分植物、种子和/或籽粒具有增加的编码多肽的表达。
[0077]
还提供了在其基因位点上包含有一种引入的基因修饰的植物、植物细胞、部分植物、种子和籽粒，使其编码的多肽的氨基酸序列与seq id no:3、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32、35、38、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156或158这些氨基酸序列相比较时有至少80％的一致性。在某些实施例中，该基因修饰增加了编码多肽的活性。在某些实施例中，该基因修饰增加了编码多肽的表
达水平。在某些实施例中，该基因修饰同时增加了编码多肽的表达水平和活性。
[0078]
所述植物可以是单子叶植物或双子叶植物，例如，水稻或玉米或大豆植物，例如玉米杂交植株或玉米自交植株。所述植物还可以是向日葵、高粱、油菜、小麦、苜蓿、棉花、大麦、小米、甘蔗或柳枝稷。
[0079]
在某些实施例中，所述植物与对照植物相比较时表现出增加的耐旱性。在某些实施例中，所述植物与对照植物相比较时，表现出至少一种农艺性状的改变。
[0080]
本领域内技术人员熟悉模拟干旱条件和评估遭受模拟或自然发生干旱条件的植物耐旱性的方法。例如，可以通过在一段时间内给植物提供低于正常需要的水分或没有水分来模拟干旱条件，也可以通过寻找生理和/或物理条件的差异来评估耐旱性，包括(但不限于)活力、生长、大小或根长，尤其是，叶颜色或叶面积大小。评估耐旱性的其他技术包括测量叶绿素荧光、光合速率和气体交换速率。
[0081]
d.其它目的性状的堆叠
[0082]
在某些实施例中，本文中发明的多核苷酸被设计成一种分子堆叠。这样，本文所述的多种宿主细胞、植物、植物细胞、植物部分、种子和/或籽粒能进一步包含一个或多个期望的性状。在某些实施例中，这些宿主细胞、植物、部分植物、种子和/或籽粒可以任何多核苷酸序列的组合形式进行堆叠，以产生具有期望性状组合的植物。如本文所用，术语“堆叠”是指在同一植物或有机体中具有多种性状。例如，“性状堆叠”可以包含一种序列在物理上互相毗邻的分子堆叠。在本文中，一种性状是指来自于特定序列或序列组的表型。在一个实施例中，分子堆叠包括至少一个能赋予草甘膦耐性的多核苷酸。这种赋予草甘膦耐性的多核苷酸在领域内是已知的。
[0083]
在某些实施例中，分子堆叠包含至少一个赋予草甘膦耐性的多核苷酸和至少一个赋予第二除草剂耐性的附加的多核苷酸。
[0084]
在某些实施例中，含有本发明的多核苷酸序列的植物、植物细胞、种子和/或籽粒可以被和一种或多种赋予以下耐性的序列进行堆叠，例如：als抑制剂；hppd抑制剂；2,4-d；其他苯氧基生长素除草剂；芳氧基苯氧基丙酸除草剂；麦草畏；草铵膦除草剂；针对protox酶的除草剂(也称为“protox抑制剂”)。
[0085]
含有本发明的多核苷酸序列的植物、植物细胞、植物部分、种子和/或籽粒还能与至少一个其它性状相结合以产生进一步包含有多种期望的性状组合的植物。例如，具有本发明多核苷酸序列的植物、植物细胞、植物部分、种子和/或籽粒可与编码具有杀虫和/或杀虫活性的多肽的多核苷酸进行堆叠，或植物、植物细胞、植物部分、种子和/或具有本发明多核苷酸序列的籽粒可与植物抗病基因结合。
[0086]
这些堆叠组合可以使用任何方法来创建，包括但不限于，使用任何常规育种方法，或基因转化方法。如果所述序列通过对植物进行基因转化而堆叠的，该目的多核苷酸序列能够在任何时间以任何顺序进行结合。这些性状可以在共转化方案中与任何转化盒组合提供的相关多核苷酸同时引入。例如，如果两个序列将被引入，这两个序列可以被包含在单独的转化盒(trans)或包含在相同的转化盒(cis)中。该序列的表达受到相同启动子或不同启动子的驱动。在某些情况下，也可以期望引入一个转化盒来抑制目标多核苷酸的表达。可以与任何其它抑制盒或过表达盒的组合进行结合，以产生植物中期望性状的组合。需要进一步认识到，多核苷酸序列能使用位点特异性重组方法在所需的基因位点上进行堆叠。参见，
例如，wo99/25821、wo99/25854、wo99/25840、wo99/25855和wo99/25853，以上均通过引用并入本文。
[0087]
方法：
[0088]
提供了一种增加植物耐旱性和/或增加籽粒产量的方法，包括增加至少一个编码多肽的多核苷酸的表达，该多肽的氨基酸序列与seq id no:3、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32、35、38、70,72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114,116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150,152、154、156或158至少有80％(例如，80％、81％、82％、83％、84％,85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的一致性。
[0089]
在某些实施例中，所述方法包括：(a)在一个可再生植物细胞中表达一个重组dna构建体，该重组dna构建体含有一个调控元件可操作地连接一个编码多肽的多核苷酸；和(b)再生所述植物，其中该植物在其基因组中包含有所述重组dna构建体。在某些实施例中，所述调控元件是一个异源启动子。
[0090]
在某些实施例中，所述方法包括：(a)在一个可再生植物细胞的编码多肽的基因组位点上引入一个靶向基因修饰；和(b)再生所述植物，其中植物中所述编码多肽的表达水平和/或活性是增加的。在某些实施例中，所述靶向基因修饰是使用基因修饰技术被引入的，包括：多核苷酸引导核酸内切酶、crispr-cas核酸内切酶、碱基编辑脱氨酶、锌指核酸酶、转录激活物样效应器核酸酶(talen)、工程化位点特异性巨核酸酶或argonaute。在某些实施例中，所述靶向基因修饰存在于基因位点的(a)编码区；(b)非编码区；(c)调控序列；(d)非翻译区；或(e)任何(a)-(d)的组合。所述多肽包含的氨基酸序列与seq id no:3、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32、35、38、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88,90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126,128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156或158这些氨基酸序列相比较有至少80％的一致性。
[0091]
在某些实施例中，所述dna修饰是基因位点上的一个或多个核苷酸，甚至是相邻的。例如，一个表达调节元件(eme)插入可操作连接的基因中，如pct/us2018/025446所描述的。在某些实施例中，所述靶向dna修饰可以用另一种领域内已知的具有高表达的启动子替换内源性多肽启动子。在某些实施例中，所述靶向dna修饰可以插入一个领域内已知的具有高表达的启动子到5’utr，以使内源性多肽的表达受到插入的启动子的控制。在某些实施例中，所述dna修饰是一种优化kozak序列以增加表达的修饰。在某些实施例中，所述dna修饰是一种位点上的多核苷酸修饰或snp，可以调节表达蛋白的稳定性。
[0092]
使用本发明的方法的植物可以是文中描述的任何种类的植物。在某些实施例中，这些植物是玉米、大豆或水稻。多种方法能被用于向植物、植物部分、植物细胞、种子和/或籽粒引入一个期望的序列。“引入”在这里是指把本发明的多核苷酸或产生的多肽提供给植物、植物细胞、种子和/或籽粒，使该序列获得进入植物细胞内部的途径。本公开发明的方法不依赖于特定的方法将序列引入植物、植物细胞、种子和/或籽粒，只是单纯的让所述多核苷酸或多肽能够进入植物的至少一个细胞内部。
[0093]
转化方法是引入多肽或多核苷酸序列到植物中的方法，可以根据转化目标植物或
植物细胞(即双子叶植物或单子叶植物)类型的不同而异。合适的引入多肽和多核苷酸到植物细胞的方法微量注射(crossway等(1986)biotechniques，4:320-334)、电穿孔(riggs等(1986)proc.natl.acad.sci.usa，83:5602-5606)、农杆菌介导的转化(美国专利号5563055和美国专利号5981840)、直接基因转移(paszkowski等(1984)embo j.3:2717-2722)，和弹道粒子加速(例如，见美国专利号4945050、美国专利号5879918、美国专利号5886244和美国专利号5932782；tomes等人(1995)，in plant cell,tissue,and organ culture:fundamental methods,编著者gamborg和phillips(柏林springer verlag)；mccabe等人(1988)biotechnology 6:923-926)、和lec1转化(wo 00/28058)。另见weissinger等人(1988年ann.rev.genet.，22:421-477；sanford等人(1987)particulate science and technology，5:27-37(洋葱)；christou等人(1988年)plant physiol.，87:671-674(大豆)；mccabe等人(1988)bio/technology 6:923-926(大豆)；finer和mcmullen(1991)in vitro cell dev.biol.，27p:175-182(大豆)；singh等人(1998)theor.appl.genet.，96:319-324(大豆)；datta等人(1990)biotechnology 8:736-740(水稻)；klein等人(1988年)proc.natl.acad.sci.usa，85:4305-4309(玉米)；klein等人(1988)biotechnology 6:559-563(玉米)；美国专利号5240855、5322783及5324646；klein等人(1988)plant physiol.，91:440-444(玉米)；fromm等人(1990)biotechnology 8:833-839(玉米)；hooykaas van slogteren等人(1984)nature(london)311:763-764；美国专利号5736369(谷物)；bytebier等人(1987年)proc.natl.acad.sci.usa，84:5345-5349(百合科)；de wet等(1985)在胚珠组织的实验操作中，编著者chapman等(纽约朗文)，第197-209页(花粉)；kaeppler等(1990)plant cell reports 9:415-418和kaeppler等(1992)theor.appl.genet.，84:560-566(晶须介导的转化)；d'halluin等(1992)plant cell，4:1495-1505(电穿孔)；li等(1993)plant cell reports，12:250-255和christou和ford(1995)annals of botany 75:407-413(水稻)；osjoda等人(1996)《nature biotechnology14:745-750(玉米和根癌农杆菌)；所有这些都通过引用并入本文。
[0094]
在另一些实施例中，本发明的多核苷酸可以通过病毒或病毒核酸接触被引入植物中。通常，这些方法涉及到在dna或rna分子内结合本发明的核苷酸结构。需要认识到，本发明的多核苷酸序列最初可作为病毒多蛋白的一部分进行人工合成，随后可以在体内或体外通过蛋白质水解处理以产生所需的重组蛋白。进一步，还应认识到本文公开的启动子也包括用于病毒rna聚合酶转录的启动子。向植物引入多核苷酸并在其中表达编码蛋白的方法，涉及到病毒dna或rna分子，这在本领域内是已知的。例如，参见美国专利5889191、5889190、5866785、5589367、5316931和porta等人,(1996)molecular biotechnology，5:209-221。这些文本通过引用并入本文。
[0095]
这些转化的细胞可以按照常规方法生长成为植物。参见mccormick等,(1986)plant cell reports,5:81-84。然后可以生长这些植物，并用相同的转化品种或不同的品种授粉，得到的后代具有所需表型特征的组成型表达。可以种植两代或更多代以确定所需表型特征的表达能够稳定保持和遗传，然后收获的种子也能够确保获得所需的表型特征。以这种方式，本发明提供的转化种子(也称为“转基因种子”)，其具有本文公开的多核苷酸，作为表达盒的一部分，稳定地并入其基因组中。
[0096]
通过植物转化技术获得的前文讨论的这些转化植物细胞，可以培养再生成整个拥
有转化表型(即，发明的多核苷酸)的植株，并获得所需的表型，例如增加的产量。关于玉米的转化和再生，参见gordon-kamm等,(1990)the plant cell,2:603-618。
[0097]
多种方法可以用于向基因位点引入基因修饰，以在植物、植物部分、植物细胞、种子和/或籽粒中编码本文的多肽。在某些实施例中，所述靶向dna修饰通过选自以下的基因修饰技术：多核苷酸引导的核酸内切酶、crispr-cas核酸内切酶、碱基编辑脱氨酶、锌指核酸酶、转录激活物样效应器核酸酶(talen)、工程化位点特异性巨核酸酶或argonaute。
[0098]
在一些实施例中，所述基因修饰可以通过在基因组中靠近所需改变的特定位置诱导双链断裂(dsb)或单链断裂来推进。双链断裂(dsb)的诱导能使用任何双链断裂诱导剂进行，包括但不限于，talens、巨核酸酶、锌指核酸酶、cas9-grna系统(基于细菌crispr-cas系统)、引导cpf1核酸内切酶系统，等等。在一些实施例中，双链断裂的引入可以与多核苷酸修饰模板的引入相结合。
[0099]
多核苷酸修饰模板可以通过任何本领域内已知的方法被引入，比如，但不限于，瞬时导入法、转染、电穿孔、微量注射、颗粒介导的递送、局部递送、晶须介导的递送、通过细胞穿透肽的递送或介孔二氧化硅纳米颗粒(msn)介导的直接递送。
[0100]
所述多核苷酸修饰模板能作为一个单链多核苷酸分子、一个双链多核苷酸分子或作为一个环状dna(载体dna)的一部分被引入细胞。该多核苷酸修饰模板还能被束缚在向导rna和/或cas内切核酸酶上。
[0101]“修饰核苷酸”或“编辑核苷酸”是指与它的不含有修饰核苷酸序列相比较，包含至少一个改变的目的核苷酸序列。这种“改变”包括，例如：(i)至少一个核苷酸的替换，(ii)至少一个核苷酸的删除，(iii)至少一个核苷酸的插入，或(iv)任何(i)-(iii)的组合。
[0102]
术语“多核苷酸修饰模板”包括一个与被编辑的核苷酸序列相比较时含有至少一个核苷酸修饰的多核苷酸。一个核苷酸修饰能被至少一个核苷酸替代、添加或删除。通常，该多核苷酸修饰模板能进一步包含同源核苷酸序列侧翼至少一个核苷酸修饰，其中该侧翼异源核苷酸序列提供足够的同源物到所需的核苷酸序列用于编辑。
[0103]
编辑结合双链断裂(dsb)和修饰模板的基因组序列的过程通常包括：提供一个宿主细胞，一个双链断裂(dsb)诱导剂，或一个编码双链断裂(dsb)诱导剂的核酸，以识别染色体序列中的靶向序列并能够诱导基因组序列中的双链断裂(dsb)，以及与被编辑的核苷酸序列相比较，含有至少一个核苷酸改变的至少一个多核苷酸修饰模板。该多核苷酸修饰模板能进一步包含至少一个核苷酸改变的核苷酸序列的侧翼序列，其中侧翼序列与双链断裂(dsb)侧翼的染色体区域基本同源。
[0104]
核酸内切酶可以通过任何本领域内已知的方法被提供给细胞，例如，但不限于，瞬时导入法、转染、微量注射和/或局部应用或通过重组结构间接应用。核酸内切酶能作为蛋白或作为向导多核苷酸复合物直接提供给细胞或间接通过重组构建体提供。核酸内切酶通过使用本领域内已知的任何方法能短暂地被引入细胞，或能结合到宿主细胞的基因组。在crispr-cas系统的情况下，如2016年5月12日出版的wo2016073433所述，细胞穿透肽(cpp)可促进内切酶和/或引导多核苷酸进入细胞。
[0105]
除了通过双链断裂技术进行修饰外，还可以使用碱基编辑技术实现一个或多个碱基的无双链断裂修饰，例如，gaudelli等人，(2017)programmable base editing of a*t to g*c in genomic dna without dna cleavage,nature,551(7681)：464-471；komor等
人，(2016)programmable editing of a target base in genomic dna without double-stranded dna cleavage,nature,533(7603)：420-425。
[0106]
这些融合包括dcas9或cas9切口酶以及一个合适的脱氨酶，并且它们可以将，例如胞嘧啶转化为尿嘧啶，而不会导致目标dna的双链断裂。尿嘧啶然后通过dna复制或修复转化为胸腺嘧啶。改进的具有靶向灵活性和特异性的碱基编辑器用于编辑内源基因座以产生靶向变异并提高粮食产量。类似地，腺嘌呤碱基编辑器使腺嘌呤转变为肌苷，然后通过修复或复制转化为鸟嘌呤。因此，使用适当的站点特定的基础编辑器，在一个或多个位置进行有针对性的碱基改变，即c
·
g到t
·
a转换和a
·
t到g
·
c转换。
[0107]
在一个实施例中，碱基编辑是一种能够直接将目标基因组位点上的一个碱基对转变为另一个，且无需双链断裂(dsb)、同源定向修复(hdr)过程或外部供体dna模板的基因编辑方法。在一个实施例中，碱基编辑包括(i)一种催化受损的crispr
–
cas9突变体，其突变使其一个核酸酶结构域不能产生dsb；(ii)单链特异性胞苷/腺嘌呤脱氨酶，在cas9产生的单链dna泡中的适当核苷酸窗口内将c转化为u或a转化为g；(iii)尿嘧啶糖基化酶抑制剂(ugi)，阻碍尿嘧啶切除和下游过程，降低碱基编辑效率和产品纯度；(iv)尼克斯酶活性，以切割未编辑的dna链，然后进行细胞dna修复过程以替换含g的dna链。
[0108]
如本文所用，“基因组区域”是细胞基因组中存在于靶位点任一侧的染色体片段，或者也包括靶位点的一部分。所述基因组区域可以包括至少5-10、5-15、5-20、5-25、5-30、5-35、5-40、5-45、5-50、5-55、5-60、5-65、5-70、5-75、5-80、5-85、5-90、5-95、5-100、5-200、5-300、5-400、5-500、5-600、5-700、5-800、5-900、5-1000、5-1100、5-1200、5-1300、5-1400、5-1500、5-1600、5-1700、5-1800、5-1900、5-2000、5-2100、5-2200、5-2300、5-2400、5-2500、5-2600、5-2700、5-2800.5-2900、5-3000、5-3100或更多碱基，使得基因组区域具有足够的同源性以与相应同源区域进行同源重组。
[0109]
tal效应核酸酶(talen)是一类序列特异性核酸酶，可用于在植物或其他生物体基因组中的特定目标序列上进行双链断裂(miller等,(2011)nature biotechnology,29:143
–
148)。
[0110]
核酸内切酶是在多核苷酸链内切割磷酸二酯键的酶。核酸内切酶包括限制性内切酶，其在特定位点切割dna而不损伤碱基；以及巨核酸酶，也称为归巢内切酶(hease)，其与限制性内切酶类似，在特定识别位点结合并切割，但是巨核酸酶的识别位点通常较长，大约18bp或更长(专利申请号pct/us12/30061，于2012年3月22日提交)。
[0111]
根据保守的序列基序，巨核酸酶被分为四个家族，分别是laglidadg、giy-yig、h-n-h和his cys-box家族。这些基序参与金属离子的配位和磷酸二酯键的水解。hease以其长识别位点和耐受dna底物中的某些序列多态性而著名。巨核酸酶的命名规则与其他限制性内切酶的命名规则相似。对于分别由独立orf、内含子和内含子编码的酶，巨核酸酶也以前缀f-、i-或pi-为特征。重组过程中的一个步骤涉及多核苷酸在识别位点或其附近的切割。
[0112]
解理活性可用于产生双链断裂。关于位点特异性重组酶及其识别位点的综述，见sauer(1994)curr op biotechnol 5:521-7；和sadowski(1993)faseb 7:760-7。在一些例子中，重组酶来自整合酶或分解酶家族。
[0113]
锌指核酸酶(zfns)是由锌指dna结合域和双链断裂诱导剂域组成的工程化双链断裂诱导剂。识别位点特异性由锌指结构域赋予，锌指结构域通常包括两个、三个或四个锌
指，例如具有c2h2结构，然而其他锌指结构是已知的，并且已经改变基因的结构。锌指结构域适于设计特异性结合一个选定的多核苷酸识别序列的多肽。锌指核酸酶(zfn)包括连接到非特异性核酸内切酶结构域的工程dna结合锌指结构域，例如来自iis型核酸内切酶(例如foki)的核酸酶结构域。其他功能可以融合到锌指结合域，包括转录激活域、转录抑制域和甲基化酶。在一些实例中，切割活性需要核酸酶结构域的二聚化。每个锌指识别目标dna中的三个连续碱基对。例如，一个3指结构域识别9个相邻的需要核酸酶二聚化核的苷酸的序列，两组锌指三联体用于结合18个核苷酸的识别序列。
[0114]
使用双键断裂(dsb)诱导剂(如cas9-grna复合物)进行基因组编辑已有叙述，例如在2015年3月19日发布的美国专利申请us 2015-0082478 a1、2015年2月26日发布的wo2015/026886a1、2016年1月14日发布的wo2016007347和2016年2月18日发布的wo201625131中，所有这些都通过引用并入本文。
[0115]
实例
[0116]
以下是本发明某些方面的具体实施例的示例。这些实施例仅用于说明目的，并不打算以任何方式限制本发明的范围。
[0117]
实例1
[0118]
耐旱基因的克隆和载体构建
[0119]
使用含有四个来自花椰菜花叶病毒35s(camv 35s)启动子的多聚增强子元件的双元载体，并从四个粳稻品种(中花11、超优1号、台中65和日本晴)开发水稻激活标签群体，按照lin和zhang((2005)plant cell rep.23:540-547)所述，通过农杆菌介导的方法转化。建立转基因株系，收获转基因种子，形成水稻激活标签群体。
[0120]
耐旱标签株系(atl)经重复的田间试验进行验证，并确定了t-dna的插入位点。通过测序法(zastrow-hayes g.m.等,(2015)the plant genome,8:1-15)确定了t-dna在atl株系中的插入位点。克隆该t-dna左右两侧附近的基因，并通过田间筛选重现该功能基因。此处仅显示了重现功能的基因。依据表2所示的loc id和这些基因相应的基因序列，设计引物克隆水稻抗旱基因osfbx335(使用seq id no:39和40)、osnadh1(使用seq id no:41和42)、ospuf1(使用seq id no:43和44)、ospk1(使用seq id no:45和46)、osfao1(使用seq id no:47和48)、osdn-dtp17(使用seq id no:49和50)、oscuao1(使用seq id no:51和52)、osdrh7(使用seq id no:53和54)、osdn-dtp9(使用seq id no:55和56)、osdn-dtp18(使用seq id no:57和58)、osscp52(使用seq id no:59和60)、和osdn-dtp19(使用seq id no:61和62)。
[0121]
表2.水稻基因名称、基因id(来自tigr)和构建体id
[0122]
[0123][0124]
使用柱试剂盒在琼胶凝脂电泳后提取的pcr扩增产物，然后与ta克隆载体连接。通过测序确认了这些构建体内的序列和方向。每个基因都被克隆到一个植物双元载体中。
[0125]
实例2
[0126]
转基因水稻株系的转化和基因表达分析
[0127]
如lin和zhang((2005)plant cell rep.23:540-547)所述，通过农杆菌介导的转化，使用实施例1中制备的载体或空载体(dp0158)转化中花11(oryza sativa l.)。将转化实验室产生的转基因苗(t0)移栽到田间获得t1种子。筛选t1和随后的t2种子以确认转化，并在以下性状筛选中使用阳性鉴定的转基因种子。
[0128]
通过rt-pcr测定转基因水稻叶片中的基因表达水平。设计引物对过表达的转基因水稻中的osfbx335(用seq id no:63和64)、osdrh7(用seq id nos:65和66)、以及ospk1(用seq id nos:67和68)基因进行rt-pcr。将zh11-tc(组织培养zh11水稻)中的表达水平设置为1.00，并将dp0955、dp0933和dp1004转基因水稻植株中的表达水平与zh11-tc进行比较。基因表达根据ef-1αmrna水平进行标准化，基因表达分析结果见下表3。
[0129]
表3.转基因水稻植株中相关表达水平的增长倍数
[0130]
基因名称构建体id相关表达水平的增长倍数osfbx335dp0955从97.14到93892.60osdrh7dp0933从2.72到324.88ospk1dp1004从10.23到160.62
[0131]
实例3
[0132]
转基因水稻植物的性状
[0133]
对来自于实例2的转基因水稻株系和zh11-tc以及dp0158进行耐旱性测试。将来自实施例2的植物的t2种子在32℃下用800ppm多菌灵杀菌8小时，然后洗涤3-5次，在32℃下用水浸泡16小时，之后在35-37℃培养箱中催芽18小时。发芽种子用于以下耐旱性试验。
[0134]
耐旱性试验-将发芽种子种植在苗床中。在三叶期，将幼苗移栽到试验田，每个转基因株系4个重复，每个重复种植10株，4个重复种植在同一田块中。zh11-tc和dp0158幼苗位于同一田块的转基因株系附近，并作为对照进行统计分析。水稻植株按常规使用杀虫剂和化肥进行管理。在穗分化期停止浇水，以便根据天气条件(温度和湿度)在开花期给予干旱胁迫。使用tdr30(spectrum technologies，inc.)在每个区块约10个地点每4天测量一次土壤含水量。在实验过程中观察并记录植物表型。表型包括抽穗期、卷叶程度、干旱敏感性
和耐旱性。中午特别注意卷叶程度。在生长季结束时，从每行中间收获每一转基因株系的6株代表性植株，并测量每株的粮食产量。采用混合线性模型对粮食产量数据进行统计分析。
[0135]
表4提供了这些研究的结果，其中并提供了每种载体的转基因株系的组合数据。
[0136]
表4.转基因水稻植株的农艺性状
[0137]
[0138][0139]
dp0955-转基因水稻植株，两年内在海南田间进行了两次试验。结果一致表明，与对照相比，dp0955转基因水稻在田间干旱条件下的平均单株产量增加。如表4所示，在海南田间测试了12个株系。与zh11-tc和dp0158对照相比，12个株系中的10个株系的产量显著提高(p《0.1)。这12个株系的平均单株产量分别比对照zh11-tc和dp0158高39％和68％。这些数据表明osfbx335是一个水稻耐旱基因。
[0140]
dp0952-转基因水稻植物两年内在海南田间进行了两次试验。结果一致表明，与对照相比，dp0952转基因水稻在田间干旱条件下的平均单株产量增加。如表4所示，共测试了12个株系，6个株系的产量显著高于dp0158对照(p《0.1)；5个株系的产量显著高于zh11-tc对照(p《0.1)。这12个株系的单株平均产量分别比对照zh11-tc和dp0158高38％和51％。这些数据表明osnadh1是水稻耐旱基因。
[0141]
dp1091-转基因水稻植株两年内在海南田间进行了两次试验。结果一致表明，与对照相比，dp1091转基因水稻在田间干旱条件下的平均单株产量增加。如表4所示，共测试了12个株系，5个株系的产量显著高于dp0158对照(p《0.1)；4个株系的产量显著高于zh11-tc对照(p《0.1)。这12个株系的单株平均产量分别比对照zh11-tc和dp0158高31％和41％。这些数据表明ospuf1是水稻耐旱基因。
[0142]
dp1004-转基因水稻植株两年内分别在海南和宁夏田间进行了两次试验。结果一致表明，与对照相比，dp1004转基因水稻在田间干旱条件下的平均单株产量增加。如表4所示，共测试了12个株系，3个株系在海南田间表现出良好的结实率。10个株系的产量显著高于dp0158对照(p《0.1)；6个株系的产量显著高于zh11-tc对照(p《0.1)。这12个株系的单株平均产量分别比对照zh11-tc和dp0158高34％和80％。这些数据表明与两个对照相比，ospk1转基因水稻植株具有更高的耐旱性。
[0143]
dp2185-转基因水稻植株两年内在海南田间进行了两次试验。结果一致表明，与对照相比，dp2185转基因水稻在田间干旱条件下的平均单株产量增加。如表4所示，共测试了12个株系，6个株系在海南田间表现出良好的结实率。8个株系的产量显著高于dp0158对照(p《0.1)；7个株系的产量显著高于zh11-tc对照(p《0.1)。这12个株系的单株平均产量分别比对照zh11-tc和dp0158高49％和26％。这些数据表明与两个对照相比，osfao1转基因水稻植株具有更高的耐旱性。
[0144]
dp0965-转基因水稻植株两年内在海南田间进行了两次试验。结果一致表明，与对照相比，dp0965转基因水稻在田间干旱条件下的平均单株产量增加。如表4所示，共测试了8个株系，2个株系在海南田间表现出良好的结实率。7个株系的产量显著高于dp0158对照(p《0.1)；5个株系的产量显著高于zh11-tc对照(p《0.1)。这8个株系的单株平均产量分别比对照zh11-tc和dp0158高31％和48％。这些数据表明与两个对照相比，osdn-dtp17转基因水稻植株具有更高的耐旱性。
[0145]
dp1385-转基因水稻植株两年内分别在海南和宁夏田间进行了两次试验。结果一致表明，与对照相比，dp1385转基因水稻在田间干旱条件下的平均单株产量增加。如表4所示，共测试了8个株系，4个株系在海南田间表现出良好的结实率。4个株系的产量显著高于dp0158对照(p《0.1)；2个株系的产量显著高于zh11-tc对照(p《0.1)。这8个株系的单株平均产量分别比对照zh11-tc和dp0158高30％和34％。这些数据表明与两个对照相比，oscuao1转基因水稻植株具有更高的耐旱性。
[0146]
dp0933-转基因水稻植株两年内分别在海南和宁夏田间进行了两次试验。结果一致表明，与对照相比，dp0933转基因水稻在田间干旱条件下的平均单株产量增加。如表4所示，共测试了8个株系，4个株系在宁夏田间表现出良好的结实率。4个株系的产量显著高于dp0158对照(p《0.1)；3个株系的产量显著高于zh11-tc对照(p《0.1)。这8个株系的单株平均产量分别比对照zh11-tc和dp0158高57％和77％。这些数据表明与两个对照相比，osdrh7转基因水稻植株具有更高的耐旱性。
[0147]
dp2311-转基因水稻植株两年内分别在海南和宁夏田间进行了两次试验。结果一致表明，与对照相比，dp2311转基因水稻在田间干旱条件下的平均单株产量增加。如表4所示，共测试了8个株系，2个株系在海南田间表现出良好的结实率。6个株系的产量显著高于dp0158对照(p《0.1)；6个株系的产量显著高于zh11-tc对照(p《0.1)。这8个株系的单株平均产量分别比对照zh11-tc和dp0158高46％和35％。这些数据表明与两个对照相比，osdn-dtp9转基因水稻植株具有更高的耐旱性。
[0148]
dp2387-转基因水稻植株两年内分别在海南和宁夏田间进行了两次试验。结果一致表明，与对照相比，dp2387转基因水稻在田间干旱条件下的平均单株产量增加。如表4所示，共测试了8个株系，5个株系的产量显著高于dp0158对照和zh11-tc对照(p《0.1)。这8个
株系的单株平均产量分别比对照zh11-tc和dp0158高79％和76％。这些数据表明与两个对照相比，osdn-dtp18转基因水稻植株具有更高的耐旱性。
[0149]
dp0255-转基因水稻植株两年内在海南田间进行了两次试验。结果一致表明，与对照相比，dp0255转基因水稻在田间干旱条件下的平均单株产量增加。如表4所示，共测试了8个株系，5个株系在海南田间表现出良好的结实率。4个株系的产量显著高于dp0158对照和zh11-tc对照(p《0.1)。这8个株系的单株平均产量分别比对照zh11-tc和dp0158高49％和39％。这些数据表明与两个对照相比，osscp52转基因水稻植株具有更高的耐旱性。
[0150]
dp1055-转基因水稻植株两年内分别在海南和宁夏田间进行了两次试验。结果一致表明，与对照相比，dp1055转基因水稻在田间干旱条件下的平均单株产量增加。如表4所示，共测试了12个株系，2个株系在海南田间表现出良好的结实率。8个株系的产量显著高于dp0158对照，6个株系的产量显著高于zh11-tc对照(p《0.1)。这12个株系的单株平均产量分别比对照zh11-tc和dp0158高33％和46％。这些数据表明与两个对照相比，osdn-dtp19转基因水稻植株具有更高的耐旱性。
[0151]
综上所述，这些结果表明，在田间干旱胁迫条件下，与对照植株相比，osfbx335、osnadh1、ospuf1、ospk1、osfao1、osdn-dtp17、oscuao1、osdrh7、osdn-dtp9、osdn-dtp18、osscp52和osdn-dtp19转基因水稻植株具有增加的耐旱性。
[0152]
实例4
[0153]
水稻耐旱基因在玉米中的转化和评价
[0154]
玉米植株将通过编码本文所述多肽的一种多核苷酸或来自玉米、拟南芥或其他物种的相应同源物转化。该基因在玉米转化载体中的表达可由组成型启动子控制，例如玉米泛素启动子(christensen等,(1989)plant mol.biol.,12:619-632和christensen等,(1992)plant mol.biol.18:675-689)或在另一启动子的控制下，如应激反应启动子或组织优选启动子。基本上如国际专利wo 2009/006276所述，可通过粒子轰击将重组dna构建体引入玉米细胞。或者，如zhao等人在meth.mol.biol.,318:315-323(2006)和zhao等在mol.breed.,8:323-333(2001)中、以及1999年11月9日发布的美国专利号5981840中所述，玉米植株可以通过农杆菌介导的转化用重组dna构建体转化。
[0155]
再生植株的后代，如t1植株，可能受到基于土壤的干旱胁迫。通过图像分析，可以在干旱胁迫之前和期间多次测量植物的面积、体积、生长速率和颜色。与对照相比，在干旱胁迫期间，叶片萎蔫或叶面积减少的显著延迟、黄色积累的减少和/或生长速率的增加将被视为玉米中基因功能增强耐旱性的证据。
[0156]
实例5
[0157]
水稻耐旱基因在拟南芥中实验室干旱筛选
[0158]
为了了解水稻耐旱基因是否能提高双子叶植物的耐旱性或其他性状，本文所述的水稻表达载体可通过农杆菌介导的转化程序，使用花浸法转化为拟南芥(columbia)，并鉴定了转基因植物(clough，s.t.和bent，a.f.(1998)the plant journal,16,735
–
743；zhang，x.等,(2006)nature protocols,1:641-646)。
[0159]
再生植株的后代，如t1植株，可能受到基于土壤的干旱胁迫。通过图像分析，可以在干旱胁迫之前和期间多次测量植物的面积、体积、生长速率和颜色。干旱胁迫期间，与对照相比，叶片萎蔫或叶面积减少的显著延迟、黄色积累的减少和/或生长速率的增加将被视
为双子叶植物中基因功能增强抗旱性的证据。