一种用于早期诊断妊娠糖尿病的miRNA分子标志物及其应用的制作方法

一种用于早期诊断妊娠糖尿病的mirna分子标志物及其应用
技术领域
1.本发明属于妊娠糖尿病诊断标志物分子的技术领域，具体涉及一种用于早期诊断妊娠糖尿病的mirna分子标志物及其应用。


背景技术：

2.妊娠期糖尿病(gdm)定义为任何程度的胰岛素抵抗和葡萄糖耐受不良，在怀孕期间发病或首次发现。gdm是最常见的妊娠并发症之一，其患病率从4％到15％不等。gdm患者在分娩后发生多种慢性疾病的风险增加，包括2型糖尿病，独立于其他临床危险因素。此外，gdm孕妇更容易发生羊水过多、难产、死胎、死产、巨大儿等不良妊娠事件，而gdm婴儿新生儿疾病发生率较高。gdm及其相关的代谢紊乱正在全球范围内迅速蔓延，对孕妇及其新生儿造成健康和生命危险，这种危险可能持续到成年。然而，gdm的发病机制尚不清楚，大多数妇女在怀孕前没有糖尿病或只有轻微的症状，加重的糖尿病只发生在怀孕期间，但一旦妇女分娩血糖水平和其他生理变化恢复正常，这是gdm的主要临床特征。这表明，在怀孕期间短暂出现的胎盘是这种情况的主要效应器官。妊娠期间糖皮质激素、催乳素、孕酮、胎盘生长激素等激素水平升高，可进一步促进胰岛素抵抗和gdm的发生。
3.在孕妇的胎盘组织上，pi3k/akt信号通路在胰岛素抵抗中其关键作用，在分析糖尿病发病机制时常用于研究。葡萄糖转运体(gluts)是pi3k/akt通路的重要组成部分，迄今已鉴定出6中glut蛋白-glut1-5和glut7，其中glut4是进入骨骼肌的关键葡萄糖转运蛋白。glut4由slc2a4(染色体17p13)编码，在胰岛素信号刺激下可从细胞间室转移到细胞膜表面，在糖稳态和糖尿病发病机制中起重要作用。因此以上观察结果表明，胎盘可能也是pi3k/akt/glut4信号通路的靶点。gdm对产妇及婴儿的危害极大，但目前的临床诊断方法十分局限，主要是空腹血糖检测及口服葡萄糖耐量ogtt实验，这些都是在gdm发生后检出的确诊实验，临床急需开发出用于gdm风险预测的早筛和疾病早期诊断的分子标志物。
4.micrornas(mirnas)由一类19-24个核苷酸长的小非编码rna分子组成。它们虽然高度保守，但表达谱多样性广泛，并通过在转录后水平调控靶基因表达参与许多生物学过程。多项研究表明，mirnas参与ii型糖尿病的发病机制，但是，哪些mirnas在胰岛素通路介导的gdm中发挥调控作用及主要功能尚不清楚，而这些问题的解决有助于开发出gdm早期诊断的分子诊断产品。


技术实现要素：

5.针对上述问题，本发明的目的在于提供一种用于早期诊断妊娠糖尿病的mirna分子标志物及其应用，所述mirna-372标志物可用于早期诊断gdm以及作为治疗gdm的靶点。
6.本发明的技术内容如下：
7.本发明提供了一种用于早期诊断妊娠糖尿病的mirna分子标志物，所述mirna分子标志物包括mirna-372标志物、mirna-22标志物的一种或两种组合；
8.所述mirna-372标志物的核苷酸序列如序列表seq id no.1所示；
9.所述mirna-22标志物的核苷酸序列如序列表seq id no.2所示；
10.本发明还提供了一种mirna-372标志物的模拟物，其特征在于，其正向引物的核苷酸序列如序列表seq id no.3所示，反向引物的核苷酸序列如序列表seq id no.4所示。
11.本发明还提供了一种mirna-22标志物的模拟物，其正向引物的核苷酸序列如序列表seq id no.5所示，反向引物的核苷酸序列如序列表seq id no.6所示。
12.本发明还提供了一种mirna-372标志物在制备妊娠糖尿病诊断试剂盒的应用；
13.所述试剂盒包括上述正向引物、反向引物分子以及pcr反应常用的酶和试剂。
14.本发明还提供了一种的mirna-22标志物在制备妊娠糖尿病诊断试剂盒的应用；
15.所述试剂盒包括上述正向引物、反向引物分子以及pcr反应常用的酶和试剂。
16.本发明还提供了一种早期诊断妊娠糖尿病的mirna分子标志物的靶点基因slc2a4，其核苷酸序列如序列表seq id no.20所示。
17.本发明的有益效果如下：
18.本发明所述mirna分子标志物，包括mirna-372标志物、mirna-22标志物的一种或两种组合，用于早期诊断妊娠糖尿病以及制备试剂盒，可作为治疗gdm的靶点；与正常葡萄糖条件下培养的细胞相比，高糖培养的htr8/svneo细胞表现出更低的mir-372和mirna-22表达，表明它们均可作为胰岛素信号通路的调节器。western blot结果显示，转染mir-372或mirna-22模拟物的高糖培养细胞中glut4的表达显著增加，而转染mir-372或mirna-22抑制剂的细胞中glut4的表达则相反。mir-372或mirna-22的模拟物或抑制剂处理的细胞中，pi3k、akt和irs的表达均显著降低。提示glut4是胰岛素通路中mir-372的主要靶点。当glut4表达水平升高时，可促进对葡萄糖的摄取和利用。由于mir-372和mirna-22对glut4具有明显的正调控作用，可降低gdm中葡萄糖积累，改善高血糖，凸显其作为gdm治疗靶点的潜力，mir-22和mir-372表达的下调可能通过调控pi3k/glut4通路促进gdm的胰岛素抵抗，而mir-22和mir-372表达的增加可以对抗这些影响，并且mir-22和mir-372直接靶向slc2a4的3'utr并调控其表达。
附图说明
19.图1为mir-372在胎盘组织中的表达水平结果图；
20.图2为mir-372在hrt8/svneo(人绒毛膜滋养层)细胞中的表达水平结果图；
21.图3为胎盘组织中胰岛素信号通路的irs/pi3k/akt表达结果图；
22.图4为irs/pi3k/akt对mir-372诱导的胰岛素信号通路的调控作用表达结果图；
23.图5为双荧光素酶基因报告。
具体实施方式
24.以下通过具体的实施案例以及附图说明对本发明作进一步详细的描述，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本技术所附权利要求所限定。
25.若无特殊说明，本发明的所有原料和试剂均为常规市场的原料、试剂。
26.实施例1
27.用于早期诊断妊娠糖尿病的mirna标志物的验证：
28.选取150名孕妇志愿者，其中包括75名gdm孕妇(gdm组)和75名健康孕妇对照组(hc组)。
29.1.获取胎盘组织
30.在分娩后15分钟内获取胎盘组织，从胎盘的中央区域取出胎盘小叶(子叶)，将组织碎片切成1cm3的碎片(100-200mg湿重)，除去子叶上的基底板和绒毛膜表面，并收集绒毛组织，解剖胎盘组织以去除可见的结缔组织和钙沉积物，在滤纸上吸干，立即在液氮中速冻，并储存在-80℃直至进一步分析。
31.2.细胞培养
32.htr8/svneo细胞(中国中原合聚生物科技有限公司)是一种人绒毛膜滋养细胞，将其置于含有10％胎牛血清、100μg/ml青霉素和100μg/ml链霉素的rpmi-1640培养基中，37℃、5％co2条件下培养，每天更换培养基。用pbs洗涤细胞两次，然后以每孔3
×
105个细胞的密度接种到6孔细胞培养板中。将细胞分为正常葡萄糖组(5.57mmol/l)和三个高糖组，分别用10.57mmol/l葡萄糖(hgl组)、15.57mmol/l葡萄糖(hg2组)和40.57mmol/l葡萄糖(hg3组)，在37℃和5％co2下培养24小时。
33.3.rna的提取以及mirnas的制备
34.根据制造商协议，使用trizol试剂(magen biotechnology co.，guangzhou，china)从140mg胎盘组织或5
×
106个细胞中提取总rna，使用分光光度计(nanodrop，美国)评估获得的总rna的数量和质量，长度小于35个核苷酸的小rna分子被定义为mirna，并使用rnamisi试剂盒(aidlab，北京，中国)从提取的总rna中分离。
35.4.rt-qpcr测试
36.使用takara primescript ii第一链cdna合成试剂盒(takara，日本)对来自所有胎盘组织和细胞模型的总rna进行逆转录。使用miscript sybr green pcr kit(takara，日本)在cfx96 touch实时pcr检测系统(bio-rad，美国)上进行qpcr。以u6 snorna用作内源性对照，规范mirna表达，并使用2-δδct方法测量mir-372和mir-22靶基因的相对表达量。
37.所采用的引物序列如下：
38.hsa-mir-372-3p(seq in no.1)：
39.aaagugcugcgacauuugagcgu；
40.hsa-mir-22-3p(seq in no.2)：
41.aaagugcugcgacauuugagcgu；
42.细胞样品来源的实验结果代表了三个独立实验。
43.5.转染mir-372或mir-22模拟物或反义寡核苷酸
44.mir-372和mir-22抑制剂和模拟物由上海综合生物技术有限公司(sibs co.)合成。模拟物、抑制剂和对照的序列如表1所示。
45.在转染前一天，将htr8/svneo细胞以2
×
104/孔接种在24孔微孔板中，葡萄糖浓度为50mm。lipofectamine rnaimax(thermo fisher scientific，美国)根据制造商的说明制备。将mir-372模拟物/抑制剂/阴性对照(nc)置于200μl opti-mem无血清培养基中稀释，并以50nm mirna模拟物和100nm抑制剂/nc的终浓度添加到细胞中。细胞在37℃、5％co2条件下培养24h。
46.表1模拟物、抑制剂、对照物的序列
[0047][0048]
以上抑制剂序列中，所述抑制剂中x可a、c、g、u的任一种；
[0049]
所述hsa-mir-372-3p抑制剂的包括如下一种：
[0050]
seq id no.10：5'-acgcucugaaguccagcgacuuu-3'；
[0051]
seq id no.11：5'-acgcucaaaugucgcagcacuuu-3'；
[0052]
seq id no.12：5'-acgcguccaaguacguagccuuu-3'；
[0053]
seq id no.13：5'-acgccuggaggauugacugcuuu-3'；
[0054]
seq id no.14：5'-acgccugaugguuacaaugcuuu-3'。
[0055]
所述hsa-mir-22-3p抑制剂的序列包括如下一种：
[0056]
seq id no.15：5'-acagaaguccguagcugcgcuu-3'；
[0057]
seq id no.16：5'-acaguucuucaacuggcagcuu-3'；
[0058]
seq id no.17：5'-acagaguuugcacaagucacuu-3'；
[0059]
seq id no.18：5'-acagguuugaagguccgugcuu-3'；
[0060]
seq id no.19：5'-acaguuagguuugaacgagcuu-3'。
[0061]
6.免疫印迹
[0062]
在胎盘组织的蛋白质印迹(wb)实验中，组织蛋白通过t-per
tm
组织蛋白提取试剂(thermo fisher scientific，美国)按照说明进行提取，对于细胞样品的wb实验，转染后通过3000rpm离心5分钟收集细胞；
[0063]
通过m-per
tm
哺乳动物蛋白提取试剂(thermo fisher scientific，美国)提取总蛋白，蛋白浓度采用bca蛋白检测试剂盒(beyotime biotechnology，shanghai，china)按照说明书进行鉴定，等量蛋白质(10μg，15μl)用10％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)，80v 0.5h，120v 1h，在80ma下电转移到pvdf膜上(美国密理博)持续3小时，将膜与靶向irs(1:500，abcam，美国)、pi3k(1:500，abcam，美国)、akt(1:400，abcam，美国)、glut4(1:500，abcam，usa)和β-actin(1:1000，abcam，usa)的一种抗体(免抗人)在4℃下孵育过夜。用tbst洗涤后，将膜与相应的辣根过氧化物酶标记的二抗(山羊抗兔，1：10000，abcam，usa)孵育2小时；
[0064]
将发光液滴在胶片上，放入化学发光仪ibright fl1500(美国invitrogen co.，invitrogen co.，usa)进行自动曝光成像，使用凝胶图像处理系统对目标蛋白的光密度进
行定量，以β-actin为内对照，在相同条件下，实验至少重复3次。
[0065]
7.双荧光素酶基因报告基因检测
[0066]
利用在线工具rna22 v2 microrna靶检测(https://cm.jefferson.edu/rna22/interactive)预测和分析mirna-372和mirna-22靶基因。通过数据库查询，预测了胰岛素通路中的slc2a4基因(也称为glut4)受到mir-372和mir-22的调控。该工具预测mir-372在slc2a4的3'utr有两个结合位点：mir-22可能靶向于slc2a4 3'utr的333-345bp，mir-372靶向于其68-74bp(seq id no.20agcacuu)。
[0067]
根据结合位点，sibs公司设计合成了野生型和突变型质粒，质粒载体为psicheck-2载体，序列信息如表2所示。使用lipofectamine2000将报告质粒与mir-372或mir-22模拟物或mir-372或和mir-22nc共转染到htr8/svneo细胞中。48小时后，使用双荧光素酶报告分析系统(promega corporation，usa)根据制造商说明评估荧光素酶活性。
[0068]
结果代表来自至少三个独立实验，每个样品具有三个平行孔。
[0069]
表2质粒构建信息
[0070][0071]
以上测试结果如下：
[0072]
所示数据以均数
±
标准差(sd)表示。比较分别使用两组间的t检验或组间的单因素方差分析(anova)(》两组)进行计算，其中p值《0.05被认为有统计学意义。
[0073]
数据分析采用graphpad prism 8.0.2软件(graphpad software,la jolla,ca)或spss 21.0软件(ibm)。
[0074]
1)mir-372和mir-22在胎盘组织中的表达
[0075]
对来自gdm组和hc组的胎盘组织进行了qpcr检测，结果如图1所示，gdm组参与者胎盘组织中mir-372和mir-22的表达明显低于hc组(p《0.001)。
[0076]
其中两种mirna的变化差异较大，mir-22的变化最大，差异大于5000倍。
[0077]
2)mir-372和mir-22在hrt8/svneo细胞中的表达
[0078]
如图2所示，通过建立了hrt8/svneo糖耐量细胞模型(图2a)，hrt8/svneo细胞通过高葡萄糖梯度(10、30和50mm)进行刺激。测量了hrt8/svneo细胞中mir-372的表达，发现两种mirna的表达随着葡萄糖浓度的增加而逐渐降低(图2b)，以上结果与gdm和hc组织的结果一致，表明高糖治疗与mir-372和mir-22表达呈负相关。
[0079]
3)pi3k/akt/irs在胎盘胰岛素信号通路中的表达
[0080]
如图3所示，gdm组女性胎盘中pi3k、akt、irs、glut4表达较hc组明显下调，这一趋势与胎盘组织中mir-372表达的变化相一致，该结果表明胰岛素抵抗可抑制pi3k/akt/irs通路，且mir-372和mir-22可调控该细胞通路。
[0081]
4)mir-372和mir-22调控胰岛素信号通路的pi3k/akt/irs分支
[0082]
进一步研究胰岛素信号通路蛋白变化与gdm中两种mirna表达差异之间的关系，探讨了mir-372和mir-22对转染mir-372或mir-22模拟物或抑制剂的hrt8/svneo细胞中pi3k/akt/irs通路蛋白的调控作用。如图4所示，结果显示，转染mir-372或mir-22模拟物的高糖培养的hrt8/svneo细胞中，glut4的表达显著增加；相反，在mir-372或mir-22抑制剂处理的细胞中，glut4的表达显著降低。同时，在mir-372或mir-22模拟物或抑制剂处理的细胞中，pi3k、akt和irs的表达均显著降低。
[0083]
其中，mir-372对glut4表达的调控作用强于mir-22，而mir-22对pi3k、akt和irs表达的调控作用强于mir-372。
[0084]
5)slc2a4是mir-372和mir-22的靶基因
[0085]
为了进一步验证mir-372和mir-22是否与参与胰岛素信号通路的基因直接相互作用，建立了一个双荧光素酶基因报告实验，并评估了这些mirna与其推测的靶基因之间的相关性。通过对数据库的查询(使用rna22网络工具)，可以预测一个在胰岛素信号通路slc2a4(编码glut4的基因)中起作用的基因，该基因被mir-372明确调控。因此，通过构建了包含野生型或突变型的假定mir-372靶向slc2a4的3'utr的质粒。如图5所示，双荧光素酶检测结果显示，mir-22显著降低、而mir-372增加野生型slc2a4 3'utr驱动的荧光素酶活性。然而，无论是对akt1 3'utr驱动的荧光素酶活性，还是对它们各自突变的3'utr驱动的荧光素酶活性，都没有显著影响，这表明mir-372和mir-22直接靶向slc2a4的3'utr并调控其表达。
[0086]
实施例2
[0087]
妊娠糖尿病诊断试剂盒：
[0088]
表3含hsa-mir-372-3p标志物的诊断试剂盒
[0089][0090]
以上大部分试剂均已商业化，由供应商公司提供。
[0091]
实施例3
[0092]
妊娠糖尿病诊断试剂盒：
[0093]
表4含hsa-mir-22-3p标志物的诊断试剂盒
[0094][0095]
以上大部分试剂均已商业化，由供应商公司提供。
[0096]
选取5名糖尿病孕妇患者的血清，采用实施例2和实施例3所制备的试剂盒进行准确度和稳定性检测，结果如下。
[0097]
表5实施例2和实施例3试剂盒的准确度检测
[0098][0099]
由表5可见，与对照试剂盒相比，本发明的试剂盒对糖尿病孕妇患者的样本检出率能达100％，且与对照试剂盒的相关性能达到r2＞99，可见实施例2和实施例3所述试剂盒的灵敏度和准确度能达到相关要求。
[0100]
将两种试剂盒分别置于室温(20～25℃)和低温(2～8℃)放置一段时间，然后继续采用以上5名患者的血清进行试剂盒检测，结果如下表所示。
[0101]
表6实施例2和实施例3试剂盒的稳定性检测
[0102][0103]
由表6可见，本发明实施例2和实施例3的试剂盒分别统计了在低温放置下不同时间的检测信号值，结果显示所述试剂盒放置了12个月仍具备较高的检测稳定性。