用于将昆虫转化为营养流的方法和由此产生的产品与流程

用于将昆虫转化为营养流的方法和由此产生的产品
1.发明的技术领域
2.本发明涉及将昆虫转化为营养流(如原浆、酶促水解的原浆、脂肪部分和蛋白质部分)的方法。本发明还涉及(水解的)原浆以及涉及通过所述方法可获得的部分，以及涉及它们作为食品或饲料产品的用途。本发明还涉及将昆虫幼虫转化为具有抗氧化性质的组合物的方法。此外，本发明涉及通过所述方法可获得的具有抗氧化性质的组合物，以及涉及所述组合物作为促进健康的食品成分或作为饲料成分的用途。
3.发明背景
4.城市固体废物管理被认为是城市政府所面临的最紧迫和最严重的环境问题之一。鉴于快速城市化和城市人口增长的趋势，这种挑战的严重程度在未来将会增加。目前，回收有机废料仍然相当有限，但是这是迄今为止产生的所有城市废物中最大的一部分。
5.一种相当新颖的生物废物转化方法是通过昆虫幼虫，例如使用黑水虻(hermetia illucens)、家蝇(musca domestica)和粉虫(黄粉虫(tenebrio molitor l.))。它们的普遍性与使用收获的幼虫作为动物饲料或食品的蛋白质和脂肪来源的大好机遇相关，从而为蛋白质和脂肪的其它(动物)来源提供了有价值的替代品。
6.虽然许多人不喜欢食用整只昆虫，但是将昆虫用作单独的脂肪和蛋白质的来源，随后将其用于制备食品和饲料更容易被接受。然而，为了使昆虫成为商业上可行的营养源，它们的制备和加工应当大规模进行，并且所获得的营养流应当不含不需要的味道和变色。
7.虽然大规模的昆虫生产设施已经投入使用，但是经济性地制备足够优质的营养流仍然是一个挑战。在国际专利申请wo2014123420中描述了一种从昆虫或蠕虫中获得营养流的一般方法。虽然事实是其中公开的方法能够提供足够优质的营养流，但仍需要进一步提高这种方法的产量和由此获得的营养流的品质。
8.在世界各地的许多文化中，昆虫通常被当作食品食用。在欧洲国家，昆虫蛋白质作为动物饮食中的高价值蛋白质成分获得了快速接受。欧盟已经批准将昆虫蛋白质包含在宠物食品和水产养殖饲料制剂中。鸡粉和鱼粉分别是宠物食品和水产养殖饲料制剂中的常见成分。在这些市场中，昆虫蛋白质正日益被视为鸡粉和鱼粉的替代品。在以工业规模生产的所有昆虫中，黑水虻幼虫因其在广泛的有机残留物上生长的能力和独特的营养组成而得到特别的关注。黑水虻幼虫(bsf)蛋白质在水产养殖和宠物饮食中的营养适用性得到充分证实。
9.宠物随年龄的增长而发展出范围广泛的健康障碍。衰老可加速宠物体内的自由基损伤，这可能导致认知和运动系统故障。类似地，鱼类因免疫应答而产生的氧化应激可导致健康受损。中性粒细胞(白细胞)负责身体的主要防御机制。在接收到信号时，中性粒细胞冲向病原微生物入侵的部位。然后中性粒细胞通过吞噬和释放活性氧物质(ros)来灭活病原体。ros的产生对于宿主防御是至关重要的。然而，从长远来看，中性粒细胞的过度ros产生可损伤动物细胞，并可能导致细胞老化、癌症、免疫力降低等。能够清除ros的饮食干预可以有助于减少动物体内的氧化损伤和因而发生的健康状况。本领域需要这种饮食干预。
10.本发明的目的是与现有技术中已知的方法相比，进一步提高从昆虫获得的营养流
的产量和品质。本发明进一步的目的还在于用这种方法获得的营养流。
11.发明概述
12.本发明的第一方面涉及将昆虫转化为营养流的方法，其包括以下步骤：
13.a)提供新鲜昆虫并制备其浆状物；
14.b)将所述浆状物在60-95℃的温度下加热50-100秒；
15.c)对加热的浆状物进行物理分离步骤，从而获得脂肪部分、含水的蛋白质部分和含固形物的部分。
16.本发明的一个方面涉及将昆虫转化为营养流的方法，其包括以下步骤：
17.a)提供新鲜昆虫并制备其浆状物；以及
18.b)将所述浆状物在60-95℃的温度下加热50-100秒，
19.从而获得昆虫原浆(浆状物)。营养流是在加热由新鲜昆虫如黑水虻(bsf)幼虫制备的浆状物之后获得的昆虫原浆。任选地，该方法包括在步骤b)之后的另一步骤c)：对加热的浆状物进行物理分离步骤，从而获得脂肪部分、含水的蛋白质部分和含固形物的部分。蛋白质部分的干燥展现了从昆虫如bsf幼虫获得的蛋白粉。
20.本发明的一个方面涉及将昆虫转化为营养流的方法，其包括以下步骤：
21.a)提供新鲜昆虫并制备其浆状物；
22.a1)通过使步骤a)的浆状物与肽酶在预定的温度下接触预定的时间段而使所述浆状物进行酶水解；随后
23.b)将步骤a1)的水解的浆状物在60-95℃的温度下加热50-100秒，
24.从而获得水解的昆虫原浆。营养流是在加热水解的浆状物之后获得的水解的昆虫原浆，所述浆状物从新鲜昆虫(如bsf幼虫)获得。任选地，该方法包括在步骤b)之后的另一步骤c)：对加热和水解的浆状物进行物理分离步骤，从而获得脂肪部分、含水的蛋白质部分和含固形物的部分。蛋白质部分的干燥展现了从昆虫如bsf幼虫获得的水解蛋白粉。
25.已经发现，采用本发明的方法，可以提高来自加工的昆虫的脂肪产量。令人惊讶地发现，通过使用本发明的时间-温度组合，蛋白质部分中包埋的油较少。由于本发明的方法导致本发明的步骤b)和步骤c)中较少的蛋白质聚集体和颗粒形成，因此当与应用加热时间超过100秒(如至少5min)的方法相比时，较少的油可以被包埋在这种蛋白质聚集体处以及内部(不希望被任何理论束缚)。还发现浆状物和营养物部分的变色减少。本发明的方法还节约能源，因为如现有技术中先前推荐的一样，加热浆状物需要相当少的时间。此外，本技术的发明人发现加热的昆虫浆状物和加热的水解昆虫浆状物具有抗氧化性质。
26.在一个实施方案中，将昆虫转化为营养流的方法包括以下步骤：
27.a)提供新鲜昆虫并制备其浆状物；
28.b)将所述浆状物在60-95℃的温度下加热50-100秒；
29.c)对加热的浆状物进行物理分离步骤，从而获得脂肪部分、含水的蛋白质部分和含固形物的部分，并且所述方法还包括在步骤b)之前通过酶处理浆状物的步骤a1)(例如浆状物中蛋白质的酶水解)。浆状物可以在40℃至70℃、优选在45℃至65℃、更优选在50℃
±
2℃或约50℃的温度下通过酶处理0.5-3小时，如1至2小时。酶可以是蛋白酶如肽酶，优选地所述酶是风味酶(flavourzyme)。已经发现，在加热步骤b)之前的这个酶处理步骤a1)增加了所获得的昆虫(幼虫)原浆的游离氨基酸含量和消化率，并且改善了以下分离步骤c)中脂
肪从浆状物中的分离以及与蛋白质部分的分离(获得具有较少脂肪/脂质的蛋白质)。此外，已经确定，在该方法的步骤b)和c)之后获得的加热的浆状物以及在步骤a1)和步骤b)及步骤c)之后获得的加热的酶促水解的浆状物均具有抗氧化性质。
30.本发明的第二方面涉及通过根据本发明的方法可获得的脂肪部分。由于昆虫的脂肪部分包含相当大量的不饱和脂肪酸，因此减少加热时间对所获得的脂肪部分的品质具有相当大的影响，即脂肪部分比用现有技术中已知的方法所获得的部分更不易酸败。
31.本发明的一个方面涉及用本发明的方法获得的加热的昆虫原浆，优选加热的bsf幼虫原浆。这种加热的昆虫原浆令人惊讶地具有抗氧化性质，并且适于用作抗氧化饲料或食品或其成分。
32.本发明的一个方面涉及水解的昆虫原浆，优选水解的bsf幼虫原浆。在加热步骤之前，在例如肽酶的影响下，昆虫原浆的水解产生具有改善的抗氧化活性的原浆。此外，与根据本发明的方法获得的非水解的原浆相比，以及与通过应用例如30分钟的延长的加热步骤而常规获得的非水解的原浆相比，从这种水解的原浆中分离的蛋白质包含有所改善地更少的脂肪。
33.本发明的一个方面涉及利用本发明的方法获得的加热的昆虫原浆，优选加热的bsf幼虫原浆。这种加热的昆虫原浆令人惊讶地具有抗氧化性质，并且适于用作促进健康的饲料或食品或其成分。
34.本发明的一个方面涉及水解的昆虫原浆，优选水解的bsf幼虫原浆。在加热步骤之前，在例如肽酶的影响下，昆虫原浆的水解产生具有改善的抗氧化性质的原浆。此外，与根据本发明的方法获得的非水解的原浆相比，以及与通过应用的例如30分钟的延长的加热步骤而常规获得的非水解的原浆相比，从这种水解的原浆中分离的蛋白质包含有所改善地更少的脂肪。
35.本发明的第三方面涉及用根据本发明的方法获得的蛋白质部分。由于较低/较短的温度-时间组合，蛋白质比已知的昆虫蛋白质部分包埋更少的脂肪。此外，由于相对温和的处理条件，至少一部分蛋白质将保留其功能性。此外，与由较长处理时间和/或在较高的温度下处理较长时间所引起的变色相比，相对温和的处理条件减少了例如由美拉德反应(maillard reaction)引起的变色。这允许使用所述蛋白质部分的各种应用。
36.本发明的一个方面涉及用根据本发明的方法获得的蛋白质部分，其中所述方法包括酶水解昆虫浆状物的步骤，然后将水解的浆状物进行加热浆状物的步骤。由于较低/较短的温度-时间组合和水解步骤，蛋白质比已知的昆虫蛋白质部分包埋更少的脂肪。此外，与由较长处理时间和/或在较高的温度下处理较长时间所引起的变色相比，相对温和的处理条件减少了例如由美拉德反应引起的变色。这允许使用所述蛋白质部分的各种应用。
37.本发明的第四方面涉及所述脂肪部分和/或蛋白质部分和/或昆虫原浆和/或水解的昆虫原浆作为食品或饲料产品、或者作为其成分的用途。
38.本发明的第五方面涉及通过根据本发明的方法的步骤a)和b)或步骤a)、a1)和b)可获得的昆虫浆状物。优选地，昆虫浆状物是黑水虻幼虫浆状物。
39.本发明的第六方面涉及水解的昆虫浆状物和/或昆虫浆状物如(水解的)黑水虻幼虫浆状物作为抗氧化的食品成分或饲料成分的用途，其中(水解的)浆状物利用本发明的方法可获得，该方法包括或不包括在该方法的步骤b)之前的酶水解步骤a1)。
40.本发明的一个方面涉及水解的昆虫浆状物和/或昆虫浆状物如(水解的)黑水虻幼虫浆状物作为促进健康的食品成分或饲料成分的用途，其中(水解的)浆状物利用本发明的方法可获得，该方法包括或不包括在该方法的步骤b)之前的酶水解步骤a1)。
41.本发明的第七方面涉及水解的昆虫浆状物和/或昆虫浆状物如黑水虻幼虫浆状物作为食品成分或作为饲料成分的用途，其中(水解的)浆状物利用本发明的方法可获得，该方法包括或不包括在该方法的步骤b)之前的酶水解步骤a1)。
42.本发明的一个方面涉及根据本发明的昆虫浆状物或水解的昆虫浆状物或其衍生物，其作为饲料或饲料成分，特别是宠物食品的用途。
43.本发明的一个方面涉及根据本发明的昆虫浆状物或水解的昆虫浆状物或其衍生物作为具有促进健康的潜能的食品或饲料成分的用途。
44.本发明的一个方面涉及根据本发明的昆虫浆状物或水解的昆虫浆状物或其衍生物，其用于预防和/或抑制细胞氧化损伤的方法中的用途。
45.定义
46.本文中使用的术语“昆虫”是指处于任何发育阶段的昆虫，如成虫、昆虫幼虫、昆虫预蛹和蛹。
47.本文中使用的术语“孵化”具有其常规含义，并且是指低龄幼虫从卵中出来的过程。
48.本文中使用的术语“幼虫”具有其常规含义，并且是指完全变态的昆虫的幼虫期(juvenile stadium)，如黑水虻幼虫。
49.本文中使用的术语“孵化”或“新生体(neonate)”具有其常规含义，并且是指刚从卵中孵化出的幼虫。
50.本文中使用的术语“预蛹”是指其中幼虫的甲壳素含量显著增加的最后幼虫阶段。
51.本文中使用的术语“蛹”具有其常规含义，并且是指昆虫生命中其中从幼虫蜕变为成虫(如黑水虻)的阶段。
52.本文中使用的术语“浆状物(pulp)”或“昆虫浆状物”或“原浆(puree)”或“幼虫原浆”都具有相同的含义，并且是指在将昆虫的尺寸机械减小到小于0.5mm的尺寸之后获得的产物。
53.本文中使用的术语“营养流”具有其常规含义，并且是指含有营养物的流，所述营养物如脂肪、蛋白质和蛋白质衍生材料、碳水化合物、矿物质和/或甲壳素。在本发明的上下文中，甲壳素也被认为是营养物。
54.术语“抗氧化性质”具有其常规的科学含义，并且在本文是指由具有抗氧化活性(如抗炎反应)的抗氧化剂组成或者包含其的化合物或组合物，如本发明的以及用本发明的方法可获得的原浆和水解的原浆。通常，这种抗炎反应是对由例如在诸如宠物或人类对象的哺乳动物的细胞中或鱼的细胞中的例如活性氧物质诱发的炎症反应的反应。例如，参考书籍“食品中的抗氧化剂：实际应用(antioxidants in food:practical applications)”的第1章、5章和6章(jan pokorny,nedyalka yanishlieva和michael gordon(编辑),2001,cambridge:crc press,woodhead publishing ltd.isbn 185573 463x,crc press,isbn 0-8493-1221-1)。抗氧化剂是具有抗氧化活性的化合物或具有抗氧化活性的组合物或包含具有抗氧化活性的化合物的组合物，所述抗氧化活性如抵抗由宿主免疫反应引起的氧化损
伤的活性。抗氧化剂例如抑制氧化。在对象中的氧化(例如活性氧物质)例如诱导细胞(氧化)损伤。
55.诸如在“促进健康的食品”、“促进健康的活性”、“促进健康的性质”和“促进健康的潜能”中的术语“促进健康的(health promoting)”具有其常规的科学含义，并且在本文是指当化合物或组合物，如本发明的或利用本发明的方法可获得的水解的原浆或原浆被动物食用时，这种化合物或组合物对诸如哺乳动物(如宠物动物或人类对象)的动物的健康的影响。食用具有促进健康的潜能的化合物或组合物有助于或支持或促进或增加或维持诸如哺乳动物(如宠物动物或人类对象)的动物的健康状态。例如，参考书籍“食品中的抗氧化剂：实际应用”的第1章、第5章和第6章(jan pokorny,nedyalka yanishlieva和michael gordon(编辑),2001,cambridge:crc press,woodhead publishing ltd.isbn 1 85573 463x,crc press,isbn0-8493-1221-1)。
56.附图简述
57.图1显示了作为浆状物的加热时间的函数的从bsf幼虫浆状物的脂肪分离。
58.图2描述了bsf幼虫原浆的加热时间对昆虫浆状物颜色的影响。
59.图3a：bsf幼虫原浆中的游离氨基酸含量和经受基于原浆总重量的0.1重量％或0.5重量％的肽酶的bsf幼虫原浆中的游离氨基酸含量。
60.图3b：bsf幼虫原浆的胃蛋白酶消化率和经受基于原浆总重量的0.1重量％或0.5重量％的肽酶的bsf幼虫原浆的胃蛋白酶消化率。
61.图3c：从bsf幼虫原浆中分离的蛋白粉中脂质(脂肪)的含量和从经受基于原浆总重量的0.1重量％或0.5重量％的肽酶的bsf幼虫原浆中分离的蛋白粉中脂质(脂肪)的含量。
62.图4：bsf pureex
tm
(bsf-p)、bsf水解原浆(bsf-hp)、鸡粉(cm)和鱼粉(fm)在孵育30分钟之后的dpph自由基清除活性(n＝3)。
63.图5：bsf pureex
tm
(bsf-p)、bsf水解原浆(bsf-hp)、鸡粉(cm)和鱼粉(fm)在孵育60分钟之后的dpph自由基清除活性(n＝3)。
64.图6：bsf pureex
tm
(bsf-p)、bsf水解原浆(bsf-hp)、鸡粉(cm)和鱼粉(fm)在孵育30分钟之后的abts阳离子自由基清除活性(n＝3)。
65.图7：使用siefed测定法，bsf pureex
tm
(bsf-p)、bsf水解原浆(bsf-hp)、鸡粉(cm)和鱼粉(fm)的mpo反应调节活性(n＝3)。
66.图8：使用经典测量法，bsf pureex
tm
(bsf-p)、bsf水解原浆(bsf-hp)、鸡粉(cm)和鱼粉(fm)的mpo反应调节活性(n＝3)。
67.图9：bsf pureex
tm
(bsf-p)、bsf水解原浆(bsf-hp)、鸡粉(cm)和鱼粉(fm)的中性粒细胞反应调节活性(n＝3)。
68.图10：在甲醇中进行的wsep的abts自由基清除活性。结果为一式三份的三次独立测定的平均值
±
sd。
69.发明详述
70.本发明的第一方面涉及将昆虫转化为营养流的方法，所述方法包括以下步骤：
71.a)提供新鲜昆虫并制备其浆状物；
72.b)将该浆状物在60-95℃的温度下加热50-100秒；
73.c)对加热的浆状物进行物理分离步骤，从而获得脂肪部分、含水的蛋白质部分和含固形物的部分。在整个说明书、实施例、实施方案、权利要求书中，术语“原浆”和“浆状物”具有相同的含义。
74.令人惊讶地发现，利用本发明的方法，可以提高来自加工的昆虫的脂肪产量。进一步发现，通过使用本发明的时间-温度组合，蛋白质部分中包埋的油较少。还发现浆状物和营养物部分的变色减少。本发明的方法还节约能源，因为与现有技术中先前推荐的方法所需的时间相比，加热浆状物需要相当少的时间。
75.本发明的一个方面涉及将昆虫转化为营养流的方法，其包括以下步骤：
76.a)提供新鲜昆虫并制备其浆状物；以及
77.b)将该浆状物在60-95℃的温度下加热50-100秒，
78.从而获得昆虫原浆(浆状物)。营养流是在加热由新鲜昆虫如黑水虻(bsf，黑水虻)幼虫制备的浆状物后获得的昆虫原浆。任选地，该方法包括在步骤b)之后的另一步骤c)：对加热的浆状物进行物理分离步骤，从而获得脂肪部分、含水的蛋白质部分和含固形物的部分。干燥蛋白质部分展现了从昆虫如bsf幼虫获得的蛋白粉。
79.本发明的一个方面涉及将昆虫转化为营养流的方法，其包括以下步骤：
80.a)提供新鲜昆虫并制备其浆状物；
81.a1)通过使步骤a)的浆状物与肽酶在预定的温度下接触预定的时间段而使所述浆状物进行酶水解；随后
82.b)将步骤a1)的水解的浆状物在60-95℃的温度下加热50-100秒，
83.从而获得水解的昆虫原浆。营养流是在加热水解的浆状物之后获得的水解的昆虫原浆，所述浆状物从新鲜昆虫(如bsf幼虫)获得。任选地，该方法包括在步骤b)之后的另一步骤c)：对加热和水解的浆状物进行物理分离步骤，从而获得脂肪部分、含水的蛋白质部分和含固形物的部分。蛋白质部分的干燥展现了从昆虫如bsf幼虫获得的水解蛋白粉。
84.将酶处理的昆虫浆状物(如绞碎的幼虫)和未经酶处理的(对照)昆虫浆状物(例如未经酶促水解的绞碎的幼虫)例如加热至90℃，并且将浆状物例如在该温度下保持80秒。所获得的昆虫原浆可以进行用于测量游离氨基酸含量和消化率的测试。蛋白粉可以从加热的昆虫浆状物，如加热的bsf幼虫浆状物获得，以及从加热步骤之前酶处理之后的加热的浆状物获得。例如，在90℃的加热步骤之前首先使用0.1重量％或0.5重量％的风味酶进行蛋白质的酶水解的加热的bsf幼虫浆状物的批次，例如通过从浆状物中分离蛋白质、蒸发、干燥和研磨的步骤，获得蛋白粉。本发明的一部分是，与在加热之前未进行酶促处理的昆虫原浆相比，当在加热之前对昆虫原浆(bsf幼虫原浆)进行酶促处理时，脂肪从蛋白质部分中分离的程度更高。根据本发明，当考虑施用酶的量时，获得脂肪与蛋白质分离的剂量依赖性程度。因此，根据本发明，在加热步骤之前使用风味酶对例如绞碎的幼虫如绞碎的bsf幼虫进行酶处理，增加了所获得的水解幼虫原浆的游离氨基酸含量和胃蛋白酶消化率，结果，根据本发明，所获得的包含水解蛋白质的原浆具有更好的味道(当动物和人类食用包含游离氨基酸的产品时，游离氨基酸含量与诱人的、可观的味道有关)，是高度可消化的并且具有抗氧化性质(参见下文的测试结果)。此外，根据本发明，bsf幼虫浆状物的酶处理改善了在酶水解和酶促消化的浆状物的热处理之后的后续分离步骤中的脂肪分离，这与用在90℃加热之前未进行酶水解步骤的幼虫原浆获得的脂肪与蛋白质部分的分离相比，增加了从蛋白粉
中提取的脂肪。
85.尽管在现有技术中描述了从昆虫浆状物中分离营养流的方法，但迄今为止尚未认识到相对温和的处理，即相对低且短的温度/时间处理可以导致脂肪产量的增加。在这方面，参考wo2014/123420，其中描述了分离营养流的方法，但其中认为为了增加从昆虫浆状物获得的脂肪的产量，应使用相对长且高的温度/时间的组合。
86.然而，使用长且高的温度/时间的组合对营养流，特别是所获得的脂肪部分的品质具有负面影响。例如，如果昆虫浆状物在相对高的温度下加热相对长的时间，就会出现浆状物变色。此外，由于加工的昆虫的脂肪部分含有相对高量的不饱和脂肪酸，因此脂肪会变酸败。这导致脂肪部分产生异味并限制其使用范围。
87.利用本发明的方法，在很大程度上克服了这些问题。首先，利用本发明的方法大大减少了昆虫浆状物的变色。本发明方法的另一个令人惊讶的优势是，从昆虫浆状物中获得的脂肪部分比用本领域已知的方法获得的脂肪部分更不容易酸败。此外，来自加工的昆虫的脂肪产量也相当高。在不希望受到任何理论约束的情况下，假设在使用已知方法时，相当大部分的脂肪会被包埋在变性蛋白质内。通过使用较温和的处理条件，可以避免脂肪的这种包埋，从而从昆虫浆状物中获得较高的脂肪产量。此外，由于在温和温度下加热时间短，与蛋白质发生的美拉德反应的程度也较低。
88.一个实施方案是根据本发明的方法，其中昆虫是昆虫幼虫，优选为黑水虻幼虫。
89.一个实施方案是根据本发明的方法，其中黑水虻幼虫为在幼虫转化为预蛹前12至30日龄，优选14至28日龄，更优选14至26日龄，最优选12时龄至3日龄，如转化前1-2日龄。
90.一个实施方案是根据本发明的方法，其中在加热之前不对浆状物进行酶促处理。
91.一个实施方案是根据本发明的方法，其中该方法还包括在步骤b)之前用酶处理浆状物的步骤a1)。
92.一个实施方案是根据本发明的方法，其中该方法还包括在步骤b)之前用酶处理浆状物的步骤a1)，并且其中在40℃至70℃、优选在45℃至65℃、更优选在50℃
±
2℃的温度下用酶处理浆状物0.5小时至3小时，优选1小时至2小时。
93.一个实施方案是根据本发明的方法，其中该方法还包括在步骤b)之前用酶处理浆状物的步骤a1)，并且其中所述酶是蛋白酶，如肽酶，优选至少一种蛋白酶和至少一种肽酶的混合物，如风味酶。
94.一个实施方案是根据本发明的方法，其中在步骤a)中通过绞碎昆虫来制备浆状物。
95.一个实施方案是根据本发明的方法，其中步骤a)的浆状物中昆虫残留物的平均粒径范围为10至500微米。
96.一个实施方案是根据本发明的方法，其中在步骤b)中，将浆状物在60℃-95℃的温度下加热60-90秒，特别是在90℃
±
2℃的温度下加热75-85秒。
97.一个实施方案是根据本发明的方法，其中物理分离步骤包括倾析和/或离心。
98.一个实施方案是根据本发明的方法，其中在步骤(c)之后，将所述含水的蛋白质部分和所述含固形物的部分一起干燥，优选通过喷雾干燥，更优选流化床干燥。
99.一个实施方案是根据本发明的方法，其中在步骤c)之后，分别干燥所述含水的蛋白质部分和所述含固形物的部分，其中优选通过喷雾干燥、流化床干燥、冻干或折射干燥
(refractive drying)或其组合干燥所述含水的蛋白质部分。
100.由于分离步骤，即步骤c)，获得了脂肪部分、含水的蛋白质部分和含固形物的部分。以这种方式，该方法直接产生几种营养流。尽管不同部分的分离通常是本发明的最终目的，但也有这样的应用，其中使用步骤b)之后获得的昆虫浆状物是有利的。因此，本发明还涉及如上所述的但仅包括步骤a)和b)的方法。此后，可以将浆状物进行储存、包装以及可能用作如食品或饲料成分。因此，本发明还涉及通过所述方法的步骤a)和b)可获得的或通过所述方法的步骤a)和b)获得的昆虫浆状物。
101.用于制备昆虫浆状物的昆虫优选为昆虫幼虫，优选为完全变态昆虫的幼虫。幼虫优选在它们变成预蛹前制成昆虫浆状物。尽管可以使用预蛹制备昆虫浆状物，但是与转化为预蛹前的“正常”幼虫相比，它们的甲壳素含量相对高，使得它们不太适合作为人类或动物食用的营养源。高度优选使用黑水虻的幼虫，并且最优选幼虫已被培养但尚未达到预蛹阶段。通常，在孵化后允许它们在正常生长条件下生长10-30天，优选12-28天，更优选14-24天，如14天、16天、18天、20天、22天。为了使来自幼虫的营养流的产量最大化的目的，优选在幼虫转化为预蛹期之前不久对幼虫进行本发明的方法。
102.因此，有利的是，在幼虫开始转化为预蛹之前12小时至3天，优选在转化为预蛹之前1天至2天，对幼虫进行本发明的方法。与幼虫生命周期中的早期和晚期相比，在转化为预蛹期之前不久的幼虫如黑水虻幼虫的尺寸最大，含有的蛋白质和脂肪的量最大。此外，当考虑黑水虻的幼虫时，开始转化为预蛹的幼虫会从浅黄色变色为灰/棕色，这在需要浅色的白色/黄色蛋白质时是不希望的。当与具有白色/黄色外观的浅色产物相比时，在本发明的方法中因应用预蛹而产生的具有较深的褐色/浅灰色的昆虫浆状物和由其衍生的蛋白质被视为质量低劣的产物。在这方面，应注意，下文提到的选择和偏好优选是用得自这种黑水虻幼虫的昆虫浆状物进行的。
103.由昆虫制备浆状物-如本发明方法的步骤a)中提到的-可以以不同的方式进行。一种选择是将昆虫压碎以获得浆状物。优选地，使用绞碎、切割或研磨来制备浆状物。这产生了粘稠的均质起始材料。减小尺寸可以方便地在微型绞碎机中进行，但是也可以使用其它合适的技术。在该步骤期间，残留在浆状物中的昆虫(优选幼虫)的粒径优选小于500微米，优选10至500微米(通过使用显微镜确定最大尺寸)。在微型绞碎机的情况下，粒径可以通过选择特定的刀和板组合以及旋转速度进行控制。也可以使用筛子(例如由不锈钢制成)并推动昆虫通过该筛子。原则上，小的残留物粒径是有利的，因为它有利于从浆状物中提取脂肪，然而太小的粒径可能产生乳液，使得在下一个工艺步骤中脂肪和蛋白质的分离更难以进行。因此，粒径优选大于10微米。优选地，平均粒径(d
32
；体积/平均值)的范围为10至500微米。
104.在随后的步骤，即步骤(b)中，将浆状物加热到60℃-95℃的温度。加热确保大部分脂肪被液化，以便为后续分离步骤制备合适的混合物。优选地，在混合条件下进行加热，以促进不同相(如水相和脂肪相)的分离。为了避免变色(例如通过形成美拉德反应产物)和脂肪的氧化以及为了提高脂肪产量，浆状物仅在所述温度下加热相对短的时间，即50至100秒。优选地，将浆状物加热到60℃-95℃，持续60-90秒，特别是在90℃
±
2℃的温度下加热75-85秒。
105.在将浆状物加热到以上提到的温度之后，对浆状物进行物理分离步骤，即本发明
方法的步骤(c)。在该步骤期间，各种营养流(如脂肪和蛋白质)至少部分地彼此分离。然而，如上文所说明的，与本领域已知的方法相比，本发明的方法的脂肪产量明显更高。此外，营养流的品质也得到改善。优选地，所获得的营养流是含脂肪的部分、含水的蛋白质的部分和含固形物的部分。物理分离优选地包括倾析、离心或这些方法的组合。优选地，在正常(大气)压力下进行物理分离。
106.可以通过倾析分离脂肪，并且通过倾析或离心将剩余的混合物进一步分离成含水的蛋白质部分和含固形物的部分。然而，还可以以不同的顺序或同时，例如通过使用3相倾析器，获得含脂肪的部分、含蛋白质的部分和含固形物的部分。这种同时进行的方法的优势在于，这三种营养流是以最少的步骤获得的，因此产物的损失是最小的。当在连续工艺中使用时，减少分离步骤的数量也有优势。
107.在本发明的一个实施方案中，首先，例如通过倾析分离脂肪部分，剩余的混合物不再进一步分离，而是进行干燥。因此，剩余的混合物中组合了固形物部分和含水的蛋白质部分。在该实施方案中，非脂肪相优选进一步干燥以产生干燥材料。干燥材料富含蛋白质，并且含有来自含水的蛋白质部分的富含蛋白质的材料和含固形物的部分两者。由于可以用本发明的方法来更好地分离脂肪和蛋白质，因此获得了较高品质的产物。此外，利用本发明的方法，很大程度上避免了由于美拉德反应引起的(蛋白质)变色，从而提高了所获得产物的品质。干燥可以通过不同的方法实现，如空气干燥、流化床干燥、滚筒干燥、盘式干燥、闪蒸干燥、冻干、折射干燥或优选通过喷雾干燥。
108.在另一个实施方案中，在步骤c)之后分别干燥含水的蛋白质部分和含固形物的部分。由于相对温和的加热条件，存在于含水的蛋白质部分中的至少一部分蛋白质将保留其功能性。在随后的干燥期间不失去这种功能性将是有益的。因此，在这种情况下，优选流化床干燥或喷雾干燥或冷冻干燥或折射干燥。
109.本发明的第二方面涉及通过根据本发明的方法可获得的脂肪部分。由于昆虫的脂肪部分包含大量的多种不饱和脂肪酸，因此减少加热时间对所获得的脂肪部分的品质具有相当大的影响，即脂肪部分相比于利用现有技术中已知的方法获得的部分更不易酸败。可以将通过根据本发明的方法获得的脂肪部分与从其它来源获得的脂肪部分混合以获得期望的性质。因此，本发明还涉及包含通过本发明可获得的脂肪部分的脂肪组合物。
110.本发明的一个方面涉及利用本发明的方法获得的加热的昆虫原浆，优选加热的bsf幼虫原浆。这种加热的昆虫原浆令人惊讶地具有抗氧化性质，并且适于用作抗氧化饲料或食品或其成分。
111.本发明的一个方面涉及水解的昆虫原浆，优选水解的bsf幼虫原浆。在加热步骤之前，在例如肽酶的影响下，昆虫原浆的水解产生具有改善的抗氧化活性的原浆。此外，与根据本发明的方法获得的非水解的原浆相比，以及与通过应用例如30分钟的延长的加热步骤而常规获得的非水解的原浆相比，从这种水解的原浆中分离出的蛋白质包含有所改善地更少的脂肪。
112.本发明的一个方面涉及利用本发明的方法获得的加热的昆虫原浆，优选加热的bsf幼虫原浆。这种加热的昆虫原浆令人惊讶地具有抗氧化性质，并且适于用作促进健康的饲料或食品或其成分。
113.本发明的一个方面涉及水解的昆虫原浆，优选水解的bsf幼虫原浆。在加热步骤之
前，在例如肽酶的影响下，昆虫原浆的水解产生具有改善的抗氧化性质的原浆。此外，与根据本发明的方法获得的非水解的原浆相比，以及与通过应用例如30分钟的延长的加热步骤而常规获得的非水解的原浆相比，从这种水解的原浆中分离出的蛋白质包含有所改善地更少的脂肪。
114.本发明的第三方面涉及利用根据本发明的方法获得的蛋白质部分。由于较低的温度-时间组合，蛋白质比已知的昆虫蛋白质部分包埋更少的脂肪。此外，由于相对温和的处理条件，至少一部分蛋白质将保留其功能性。这允许使用所述蛋白质部分的各种应用，而这在以前是不可能的。此外，利用本发明的方法，很大程度上避免了由于美拉德反应引起的(蛋白质)变色，从而提高了所获得的产物的品质。蛋白质部分可以是步骤c)中获得的含水的蛋白质部分的形式，或者可以是其干燥形式，即干燥的蛋白质部分的形式。然而，如果不希望失去蛋白质的功能性，则应使用相对温和的干燥方法，如喷雾干燥或冷冻干燥或折射干燥。
115.所述含固形物的部分包含具有50重量％或更多的干物质含量的浆状物。这种浆状物可以容易地与含水的蛋白质部分区分和分离。浆状物含有固形物，如甲壳素及其衍生物。含固形物的部分还可以包含残留的脂肪或蛋白质，然而，其程度上比已知的方法要小。该含固形物的部分可以进一步进行干燥，甲壳素也可以从其中分离出来。所获得的甲壳素可用作食品或饲料中的成分。
116.本发明的一个方面涉及水解的昆虫浆状物和/或昆虫浆状物如(水解的)黑水虻幼虫浆状物作为促进健康的食品成分或饲料成分的用途，其中(水解的)浆状物利用本发明的方法可获得，该方法包括或不包括在该方法的步骤b)之前的酶水解步骤a1)。
117.本发明的第七方面涉及水解的昆虫浆状物和/或昆虫浆状物如黑水虻幼虫浆状物作为食品成分或作为饲料成分的用途，其中(水解的)浆状物利用本发明的方法可获得，该方法包括或不包括在该方法的步骤b)之前的酶水解步骤a1)。
118.本发明的一个方面涉及根据本发明的昆虫浆状物或水解的昆虫浆状物或其衍生物，其用作饲料或饲料成分，特别是宠物食品的用途。
119.本发明的一个方面涉及根据本发明的昆虫浆状物或水解的昆虫浆状物或其衍生物作为具有促进健康的潜能的食品或饲料成分的用途。
120.本发明的一个方面涉及根据本发明的昆虫浆状物或水解的昆虫浆状物或其衍生物，其用于预防和/或抑制细胞氧化损伤的方法中的用途。
121.本技术的发明人令人惊讶地使用自由基清除模型(dpph和abts测定)、涉及髓过氧化物酶反应的酶模型(经典的和siefed测定)和涉及中性粒细胞反应的细胞模型确立和分析了黑水虻蛋白质和蛋白质水解产物的体外抗氧化活性。在比较例中使用商业鱼粉和鸡粉作为工业基准。本技术的发明人进行的测试和比较的结果表明，鱼粉和鸡粉在抑制由于中性粒细胞和髓过氧化物酶反应而发生的氧化损伤方面几乎不提供任何优势。此外，鱼粉和鸡粉也在所使用的一些测试测定和模型中表现出促氧化行为。结果显示，黑水虻蛋白质(作为(水解的)幼虫原浆的一部分)在保护免受由宿主中性粒细胞和髓过氧化物酶反应引起的细胞损伤方面是有效的。因此，对于包含在宠物食品/饲料和水产养殖饲料制剂中，如用作饲料成分方面，本技术的发明人测试的黑水虻衍生物(原浆、水解的原浆)显示出优于鸡粉和鱼粉的优势。
122.本技术的发明人确定bsf蛋白质水解产物具有小于1000da的显著份额的蛋白质。这包括短链肽和游离氨基酸的混合物。已知一些短链肽和游离氨基酸具有抗氧化活性。这些分子可以主动清除ros和自由基。firmansyah和abduh[3]评价了bsf蛋白质水解产物的dpph(2,2-二苯基-1-苦基肼基)清除活性。zhu等人[4]评价了bsf蛋白质水解产物的dpph、abts(2,2
’‑
联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)、超氧化物和羟基自由基清除活性。迄今为止，据发明人所知，尚未有研究实现使用基本酶和细胞模型确定bsf蛋白质水解产物的抗氧化活性，显示了bsf幼虫原浆和水解的bsf幼虫原浆的令人惊讶的高抗氧化活性和令人惊讶的针对由bsf幼虫原浆和水解的bsf幼虫原浆引起的氧化应激和/或损伤的高度保护。因此，在当前确定的发明之前，bsf蛋白质水解产物的抗氧化潜能在基本水平上知之甚少，并且还没有公开，也没有预料或预期到。根据本发明，对bsf蛋白质和蛋白质水解产物的体外抗氧化活性的详细研究揭示了这些蛋白质衍生物改善动物健康的新应用。
[0123]
本技术的发明人使用(1)涉及dpph和abts的自由基清除模型；(2)涉及髓过氧化物酶反应的酶模型；以及(2)涉及中性粒细胞反应的细胞模型，揭示了bsf蛋白质和蛋白质水解产物的令人惊讶的高度抗氧化潜能。在比较例中用鸡粉和鱼粉作为工业基准，以与根据本发明的(水解的)bsf幼虫原浆的抗氧化活性进行比较。
[0124]
本技术的发明人令人惊讶地确定，在90℃下加热40s的昆虫原浆具有相对高的游离脂肪酸量(约70％)。例如参见实施例4，其涉及使绞碎的黑水虻幼虫进行本发明的方法。对原浆仅加热40s对于脂肪酶的失活是无效的。然而，当将原浆加热80s时观察到低量的游离脂肪酸，这表明该时间足以使酶在90℃下失活。与将黑水虻幼虫原浆加热80秒时获得的低脂肪酸含量相比，在超过80秒的加热时间，如长达300秒或1800s时，脂肪酸含量增加。因此，为了利用本发明的方法获得包含相对低的游离脂肪酸含量的蛋白质部分，本发明的方法中的加热时间应长于40秒且短于300秒，如50-100秒，或加热时间选自60-90秒或70-85秒，如约80秒。优选的加热时间为约90℃或90℃
±
2℃。
[0125]
令人惊讶的是，本技术的发明人确定，当使由绞碎的黑水虻幼虫而获得的绞碎的昆虫浆状物(如原浆)进行本发明的方法步骤，但是加热步骤持续时间小于50秒(因此偏离本发明的方法)时，加热持续时间小于50秒，如约40秒会观察到较高的过氧化值。当将原浆或浆状物加热40秒时获得的大量的游离脂肪酸(其能够参与酶氧化，导致产生氢过氧化物)是出现相对大量的过氧化物的基础。然而，与加热短于50秒时获得的过氧化值相比，当对昆虫浆状物或原浆，如从黑水虻幼虫获得的原浆，进行本发明的其中加热步骤为80秒处理的方法时，获得相对较低的过氧化值。与例如将原浆或浆状物加热80秒时的过氧化值相比，根据本发明的方法，将产物(例如来自幼虫的原浆)加热长于100秒或少于100秒的时段，如300秒或1800秒，会对脂肪氧化具有影响，其中过氧化值增加。因此，为了使用本发明的方法获得包含相对低的过氧化值的蛋白质部分，本发明方法中的加热时间应长于40秒且短于300秒，如50-100秒，或加热时间选自60-90秒或70-85秒，如约80s。优选的加热时间为约90℃或90℃
±
2℃。
[0126]
令人惊讶的是，本技术的发明人确定，用本发明方法获得的或通过本发明方法提供的蛋白质部分具有自由基清除活性。在饲喂包含一系列剂量的用本发明方法获得的黑水虻幼虫蛋白质的鱼饲料(基于喂给鱼的鱼饲料的总质量，最低剂量为：饲料中0％bsf幼虫蛋白质；最高剂量为：100％bsf幼虫蛋白质；还测试了25％和50％)之后评估鱼肉的氧化状态
时，该自由基清除活性高于用喂给鱼的常规鱼饲料可获得的自由基清除活性。还参见实施例部分，下文的实施例5。将先前用包含由本发明方法获得的蛋白质或由其组成(称为水溶性提取物粉末(water soluble extract powders，wsep))的饲料饲喂鱼之后的鱼肉的abts自由基清除活性与先前用缺少由本发明方法获得的黑水虻幼虫蛋白质部分的常规饲料饲喂鱼之后的鱼肉的自由基清除活性进行比较。对于所有样品，浓度的增加导致平均抑制值的增加(显示当评估鱼肉中的自由基清除活性时饲喂饲料的抗氧化行为)。e
max
(在测试期间获得的最大抑制)的顺序如下：hi-25》hi-100》hi-50》hi-0(均以0.2mg/ml终浓度获得)，是指基于饲喂饲料的总质量，鱼饲料分别包含25重量％、100重量％、50重量％和0重量％的用本发明方法获得的bsf幼虫蛋白质。该结果显示，在hi-25样品的剂量下，获得最高的abts自由基清除活性。另一方面，hi-0样品表现出最小的abts自由基清除活性。如通过使用abts测定所评估的，通过对黑水虻幼虫应用本发明的方法获得的所有蛋白质样品均以剂量依赖性的方式表现出抗氧化活性。hi-25样品显示出最高的抗氧化活性。
[0127]
总之，利用本发明的方法，可以从昆虫获得有价值的营养流。这些流没有受到外来化学物质的污染并且具有纯的生物来源。分离的营养流可用于制备食品、饲料或药物。此外，根据预期的应用，可以进一步处理所获得的营养流，例如分离特定的成分，如水解蛋白质、氨基酸或特定脂肪酸。
[0128]
一个实施方案是根据本发明的将昆虫转化为营养流的方法，其中在步骤b)中，浆状物在75℃-95℃的温度下，特别是在80℃-93℃，优选85℃-90℃的温度下。一个实施方案是根据本发明的将昆虫转化为营养流的方法，其中在步骤b)中，将所述浆状物加热60-95秒，特别是70-90秒，优选75-85秒，如78-82秒。如所述，本技术的发明人确定，通过应用本发明的(黑水虻)幼虫加工方法，在该方法的步骤a)中，获得了包含从黑水虻幼虫获得的含水的蛋白质部分的流作为蛋白质源的营养流，当与通过应用本领域已知的替代性黑水虻幼虫加工方法(如欧洲专利申请ep2953487中，在其实施例部分中，特别是实施例1，第12页第8-13行和第13页第3-5行概述的方法)从这种幼虫获得的蛋白质相比时，该含水的蛋白质部分具有令人惊讶地改善的特征和结构特性。特别地，在本发明方法的步骤b)中，100秒或小于100秒的相对短的加热时间对于在步骤b)中获得改善的幼虫浆状物以及随后用于在该方法的步骤c)中获得改善的含水的蛋白质部分被认为是必需的。发明人已经发现，与使用用于从黑水虻幼虫中分离蛋白质部分作为蛋白质源的替代的、现有的手段和方法提供的蛋白质源相比，通过使用时间-温度组合，在含水的蛋白质部分内包埋的油较少，从而在本发明方法的步骤c)中提供了更纯的蛋白质源。还发现，在很大程度上避免了在方法的步骤b)中由于美拉德反应而导致的(蛋白质的)加热浆状物的变色，从而改善所获得的产物，例如本发明方法的步骤b)中的加热浆状物和步骤c)中的含水的蛋白质部分，的品质。例如，当将绞碎的黑水虻幼虫在90℃加热80秒或在90℃
±
2℃的温度下加热75-85秒时，获得具有降低的脂肪含量的含水的蛋白质部分。在ep2953487中，加热时间为至少5min，甚至30min。此外，与在本领域已知的现有方法中应用的较长的加热时间相比，绞碎的黑水虻幼虫浆状物(在方法的步骤a)中提供的)的至多100秒，优选约70-90秒的相对短的加热时间导致在方法的步骤b)中的较少的颗粒化和较少的聚集的加热的昆虫浆状物。在该方法的步骤b)之后较少颗粒化的幼虫浆状物对例如浆状物中包含的蛋白质的酶水解是有益的，并且通常，较少颗粒化和聚集的昆虫浆状物和随后的蛋白质部分有助于改善的分离结果以及改善的易于加工浆
状物和蛋白质。例如，颗粒化降低了酶效率，这是因为颗粒物对于酶分子来说不易接近。与对黑水虻幼虫浆状物进行100秒以上，如5分钟直至30分钟的加热时获得的较大的蛋白质聚集体和颗粒相比，通过应用作为本发明方法的一部分的幼虫加工方法步骤，短的加热时间产生由较小的蛋白质簇、聚集体、颗粒，或甚至(主要是)蛋白质单体和/或小的多聚体组成的蛋白质组合物。此外，在将昆虫浆状物在例如90℃下加热超过100秒的时间后，脂肪被包埋在相对大的蛋白质浆状物簇和蛋白质部分聚集体内。
[0129]
通过以下非限制性实例进一步例示本发明。
[0130]
实施例&实施方案
[0131]
实施例1
[0132]
将活的且洗涤过的14日龄幼虫(5kg)在绞碎器前收集，并在4℃下储存直至使用。对于每个实验，现绞碎100克幼虫。将100克绞碎的幼虫加热到90℃(使用热板并连续搅拌)，并将产物在该温度下保持0s、40s、80s、120s、300s、600s和1800s。将约30g加热的幼虫收集在3个可离心的管中，并在3200g下离心5分钟。在离心之后提取脂肪部分，使用巴斯德移液管收集脂肪部分，并称重以计算脂肪分离％(基于湿基的总原浆重量)。
[0133]
作为时间的函数的脂肪分离提供于下表1和图1中。由此可以清楚地看出，在离心未加热的昆虫浆状物时，没有获得脂肪，但脂肪稳定地增加，直到加热时间达到80秒。此后脂肪保持稳定直到加热时间达到600秒，此后脂肪分离开始下降。令人惊讶的结果显示，与本领域所预期的不同的是，10分钟或更少的相对短的加热时间可用于从加热的昆虫浆状物中最有效地去除脂肪。此外，由于加热时间减少，因此加热的昆虫浆状物发生较少的变色，这导致产物(和衍生的营养流)的品质更高。在图2中描述了加热时间对昆虫浆状物颜色的影响。此外，与超过600秒的较长加热时间相比，短的加热时间导致较少颗粒化的和较少聚集的昆虫浆状物(参见例如图2)。
[0134]
表1：作为加热时间的函数的脂肪分离(在90℃下)
[0135]
加热时间(s)获得的脂肪％00405.7808.21208.53008.46008.118006.2
[0136]
实施例2
[0137]
bsf幼虫的原浆(也称为bsf pureex
tm
(bsf-p))和通过酶水解该bsf幼虫原浆而获得的水解的原浆(bsf-hp)由protix b.v.(dongen,the netherlands)于2019年10月制备。根据以下方法获得原浆和酶促消化的原浆。收集活的且洗涤过的14日龄黑水虻幼虫，随即在绞碎器中绞碎幼虫(由此提供幼虫浆状物)，随后在4℃下储存直至使用。对于每个实验，现绞碎幼虫。在45℃至65℃(
±
2℃)下，在连续搅拌下，将绞碎的幼虫用0.1％或0.5％favourzyme(基于绞碎的幼虫的质量)处理0.5-3小时，例如1-2小时。通过在50℃(
±
2℃)下酶水解1小时，获得应用在实施例2中的一批水解的bsf幼虫原浆。风味酶(novozymes,
denmark)是具有内肽酶和外肽酶活性的氨肽酶的组合。将经酶处理的绞碎的幼虫和未经酶处理的对照幼虫加热至90℃，并将产物在该温度下保持80秒。将所获得的昆虫原浆用于测量游离氨基酸含量(图3a：游离氨基酸含量(n＝1)-在原浆中进行测试)和胃蛋白酶消化率(图3b：消化率(n＝1)-在原浆中进行测试)。从加热的bsf幼虫浆状物和两批次的在90℃的加热步骤之前首先使用0.1重量％或0.5重量％的风味酶进行蛋白质的酶水解的加热的bsf幼虫浆状物中，例如通过从浆状物分离蛋白质、蒸发、干燥和研磨的步骤获得蛋白粉。在分离步骤期间测量脂肪分离的百分比(图3c：脂肪分离％(n＝3)-在分离步骤期间测试以制备蛋白粉)。在进行的所有实验中，当考虑应用的酶的量时，观察到剂量依赖性效应。因此，在加热步骤之前使用风味酶对绞碎的幼虫进行酶处理增加了所获得的水解幼虫原浆的游离氨基酸含量和胃蛋白酶消化率，结果，所获得的包含水解蛋白质的原浆具有更好的味道(当动物和人类食用包含游离氨基酸的产品时，游离氨基酸含量与诱人、可观的味道有关)，是高度可消化的并且具有抗氧化性质(参见下文的测试结果)。另外，bsf幼虫浆状物的酶处理改善了在酶水解和酶促消化的浆状物的热处理之后的后续分离步骤中的脂肪分离，这与由在90℃加热之前未经历酶水解步骤的幼虫原浆获得的蛋白质部分的脂肪分离相比，增加了从蛋白粉中的脂肪提取。
[0138]
实施例3
[0139]
2.材料和方法
[0140]
2.1.试剂
[0141]
所有试剂均为分析级。二甲基亚砜、甲醇、乙醇、氯化钙、氯化钾、氯化钠、过氧化氢和吐温-20购自merck(vwr,leuven,belgium)。亚硝酸钠、牛血清白蛋白质、佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯和percoll
tm
购自sigma(bornem,belgium)。在使用milli-q水系统(millipore,bedford,usa)获得的milli-q水中制备水提取物和溶液。二喹啉甲酸和硫酸铜(ii)溶液购自sigma(steinheim,germany)。whatman 4级滤纸(270mm)购自amersham(buckinghamshire,uk)。sterlip 30ml一次性真空过滤系统购自millipore(bedford,usa)。2,2-二苯基-1-苦基肼基和2
’‑
联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)购自aldrich(darmstadt,germany)。8-氨基-5-氯-7-苯基吡啶并[3,4-d]哒嗪-1,4(2h,3h)二酮(l-012)购自wako chemicals(neuss,germany)。
[0142]
2.2.原料
[0143]
鸡粉(cm)和鱼粉(fm)于2019年9月从一家在线网店购买。供应商申报的两种成分的化学组成示于表2中。
[0144]
表2：鸡粉和鱼粉的化学组成(以供应商提供的为基础)。
[0145][0146]
bsf-p和水解的原浆bsf-hp由protix b.v.(dongen,the netherlands)于2019年
10月制备。(1)：bsf-p是在-20℃下冷冻供应的巴氏杀菌的bsf碎“肉”(原浆，浆状物)。bsf-p也是生产bsf蛋白粉(proteinx
tm
)的原料。(2)：bsf-hp是也在-20℃下冷冻供应的水解的和巴氏杀菌的bsf肉(原浆)。(3)：bsf-p和bsf-hp两种成分的化学组成示于表3中。
[0147]
表3.bsf蛋白质衍生物加热的原浆和加热水解的原浆的化学组成(以供应商提供的为基础)。
[0148][0149]1bsf-p：bsf pureex
tm
；2bsf-hp：bsf水解原浆；a基于在protix建立的范围的平均值。
[0150]
制备cm、fm、bsf-p和bsf-hp的水溶性提取物。将这些产物(各100克)用基于它们各自的干物质含量的6倍体积的milli-q水溶解(例如bsf-p的干物质含量为33.3％，用200ml milli-q水稀释)，并在磁力搅拌器上搅拌2小时。离心后(1000xg，在4℃下离心30分钟)，去除顶部脂肪层，并使用whatman过滤器(4级)过滤上清液。再次重复离心和过滤步骤以去除所有不溶性残留物。最后，使用sterlip filter(50ml,0.22μm)过滤上清液，并冷冻干燥两天，获得各自的水溶性提取物粉末。将所有四种水溶性提取物储存在干燥器(18℃)中，直至进一步使用。
[0151]
2.3.蛋白质定量
[0152]
使用二喹啉甲酸(bca)蛋白质测定[5]分析四种水溶性提取物的总蛋白质含量。使用牛血清白蛋白(bsa)作为标准品，在以下浓度获得校准曲线：0mg/ml、0.125mg/ml、0.25mg/ml、0.5mg/ml和1mg/ml。使用3mg/ml水溶性提取物的储备溶液进行分析。通过溶解4900μl bca(49/50)和100μl硫酸铜(ii)(1/50)制备测试溶液。将样品储备溶液(10μl)和测试溶液(200μl)加入到96孔板的孔中。将该板在37℃下孵育30分钟，并使用multitiscan ascent(fisher scientific,asse,belgium)在450nm处测量吸光度。
[0153]
2.4.dpph测定
[0154]
根据brand-willams等人[6]的方案(对其进行了一些修改)分析dpph自由基清除活性。通过将10.5mg dpph溶解在40ml乙醇中来制备dpph测试溶液。新制备测试溶液并将其储存在暗处，直至进一步使用。通过用十倍的乙醇稀释测试溶液来制备dpph工作溶液(以获得517nm处0.6至0.8的吸光度)。将dpph工作溶液(1920μl)与20μl的样品稀释液(在milli-q水中四种水溶性提取物)混合，以获得0.0125、0.025、0.05、0.1和0.2mg/ml的终浓度。使用hp 8453uv-vis分光光度计(agilent technologies,waldbronn,germany))在510nm处记录在黑暗中孵育30分钟和60分钟之后吸光度的降低。在对照的情况下，仅使用milli-q水代替样品稀释液。
[0155]
2.5.abts测定
[0156]
根据arnao等人[7]的方案(对其进行了一些修改)分析abts阳离子自由基清除活性。通过将7.0mmol/l abts和2.45mmol/l过硫酸钾溶解在milli-q水中来制备abts测试溶液。将该测试溶液在室温下于暗处保存过夜。通过用甲醇稀释来制备abts工作溶液，以获得在734nm处0.7至0.8的吸光度。将abts工作溶液(1920μl)与20μl的样品稀释液(在milli-q水中的四种水溶性提取物)混合，以获得0.0125、0.025、0.05、0.1和0.2mg/ml的终浓度。使用hp 8453uv-vis分光光度计(agilent technologies,waldbronn,germany))在734nm处记录在黑暗中孵育30分钟后之后吸光度的降低。在对照的情况下，仅使用milli-q水代替样品稀释液。
[0157]
2.6.使用特异性免疫提取随后酶检测(specific immunological extraction followed by enzymatic detection，siefed)测定的髓过氧化物酶(mpo)活性
[0158]
siefed测定是franck等人[8]开发的用于特异性检测动物源mpo的特许方法。通过将人mpo稀释于20mm磷酸盐缓冲盐水(ph 7.4)、5g/l bsa和0.1％吐温-20制备mpo溶液。将终浓度为0.0125、0.025、0.05、0.1和0.2mg/ml的样品稀释液与终浓度为25ng/ml的mpo溶液一起孵育10min(在37℃下)。孵育之后，将混合物装载到包被有抗马mpo的兔多克隆抗体(3μl/ml)的96孔微量滴定板的孔中，并且在37℃下于黑暗中孵育2小时。清洗孔之后，通过加入过氧化氢(10μm)、no2
–
(10mm)和amplex
tm red(40μm)测量抗体捕获的酶的活性。用fluorosckan ascent(fisher scientific,asse,belgium)在37℃下监测amplex
tm red至荧光加合物试卤灵(resorufin)的氧化，持续30分钟。在对照的情况下仅使用milli-q水代替样品稀释液。
[0159]
2.7.使用经典测量的髓过氧化物酶(mpo)活性
[0160]
如第2.6节所述制备mpo溶液。将终浓度为0.0125、0.025、0.05、0.1和0.2mg/ml的样品稀释液与终浓度为25ng/ml的mpo溶液一起孵育10min(在37℃)。孵育之后，立即将混合物(100μl)转移到96孔微量滴定板中。然后加入10μl的no
2-(10mm)和100μl的amplex
tm red及过氧化氢混合物(在第2.6节中提到的浓度下)。在加入相关的混合物之后，立即使用fluorosckan ascent(fisher scientific,asse,belgium)在37℃下监测amplex
tm red至荧光加合物试卤灵的氧化，持续30分钟。在对照的情况下仅使用milli-q水代替样品稀释液。
[0161]
2.8.细胞抗氧化活性
[0162]
根据paul等人[2]制备中性粒细胞和佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(pma)溶液。使用tsumbu等人[1]的方案分析样品的中性粒细胞反应调节活性。将中性粒细胞悬浮液(100万个细胞/143μl pbs)装入96孔微量滴定板的孔中，并与终浓度为0.0125、0.025、0.05、0.1和0.2mg/ml的样品的磷酸盐缓冲盐水溶液孵育10min(在37℃，在暗处)。在孵育之后，在孔中加入25μl氯化钙(10μm)和20μl l-012(100μm)。在使用fluorosckan ascent(fisher scientific,asse,belgium)在37℃下监测中性粒细胞在30min内的化学发光反应之前立即用10μl pma(16μm)活化中性粒细胞。在对照的情况下，仅使用磷酸盐缓冲盐水代替样品稀释液。
[0163]
2.9.统计分析
[0164]
所有分析均以一式三份进行。对于蛋白质定量，使用线性回归计算拟合线性方程和r平方值。抗氧化剂测定获得的浓度与抑制之间的关系本质上是非单调的。为了解决这一
问题，使用本地散点平滑估计(locally estimated scatterpot smoothing，loess)回归技术来对关系建模[9]。使用r统计软件拟合模型[10]。这些模型需要定义局部回归的平滑灵敏度的跨距参数。通过目视检查，发现0.4的跨距参数值适用于所有浓度与抑制关系曲线。使用拟合模型结合数值搜索程序，找到了具有感兴趣的预测抑制百分比的浓度，如ic
50
(达到50％抑制的浓度)。
[0165]
3.结果
[0166]
3.1.蛋白质定量
[0167]
建立了使用bsa获得的校准曲线、线性方程与r平方值。表3中提到了样品的光密度和蛋白质的相对浓度(使用线性方程计算的)。在使用二喹啉甲酸测定的测试溶液中，bsf-p提取物溶液(3mg/ml)表现出最高的蛋白质浓度，另一方面，bsf-hp溶液表现出最低的蛋白质浓度。
[0168]
表4.使用二喹啉甲酸测定法定量蛋白质
[0169][0170]1bsf-p：bsf pureex
tm
；2bsf-hp：bsf水解原浆；3fm：鱼粉；4cm：鸡粉。
[0171]
3.2.dpph测定
[0172]
所有五个样品在孵育30分钟和60分钟之后的dpph自由基清除活性分别示于图4和图5中。该图显示了测量值以及从loess获得的拟合曲线。cm在孵育30分钟以及60分钟之后，在所有测试浓度下均表现出促氧化行为。然而，fm在孵育30分钟之后在5个测试浓度中的4个测试浓度下以及在孵育60分钟之后在所有测试浓度下表现出促氧化行为。bsf-hp在孵育60分钟之后的ic
50
示于表5中。无法计算其它样品的ic
50
(孵育30或60分钟之后)，因为这些样品在测定期间未实现促氧化活性或50％抑制。所有样品的e
max
(在测定期间实现的最大抑制)也示于表6中，并且在分别孵育30分钟和60分钟之后，e
max
按以下顺序排列：bsf-hp》bsf-p》fm以及bsf-hp》bsf-p。
[0173]
表5.使用不同测定获得的样品的抗氧化活性ic
50
(mg/ml)
[0174]
测定bsf-p1bsf-hp2fm3cm4dpph 30分钟necnecnecpoddpph 60分钟nec0.18podpo
d2
abts 30分钟0.040.050.110.09mpo
a siefednec0.14podpodmpoa经典0.100.09podpodcaab0.150.15necnec[0175]1bsf-p：bsf pureex
tm
；2bsf-hp：bsf水解原浆；3fm：鱼粉；4cm：鸡粉；ampo：髓过氧化物酶；bcaa.：使用中性粒细胞模型的细胞抗氧化活性；cne：未估计，因为在测试浓度中未达
到50％抑制；dpo：未估计，因为样品在测试浓度下表现出促氧化活性。
[0176]
表6.使用不同测定获得的样品的抗氧化活性e
max
(抑制％)
[0177][0178]
*c：达到emax时的浓度；1bsf-p：bsf pureex
tm
；2bsf-hp：bsf水解原浆；3fm：鱼粉；4cm：鸡粉；ampo：髓过氧化物酶；bcaa：.使用中性粒细胞模型的细胞抗氧化活性；cpo：未估计，因为样品在测试浓度下表现出促氧化活性。
[0179]
3.3.abts测定
[0180]
在孵育30分钟之后样品的abts阳离子自由基清除活性显示在图6中(测量值以及从loess获得的拟合曲线)。所有样品均表现出相似的抑制模式，即抑制％随着渐增浓度的函数而增加。样品的ic
50
在表5中提到，并且按以下顺序排列：fm》cm》bsf-hp》bsf-p。ic
50
越低，abts阳离子自由基清除活性越高。所有样品的e
max
(在测定期间达到的最大抑制)示于表6中并且按以下顺序排列：bsf-p》bsf-hp》fm》cm。
[0181]
3.4.使用特异性免疫提取随后酶检测(siefed)测定的髓过氧化物酶(mpo)活性
[0182]
使用siefed测定获得的样品的mpo反应调节活性显示在图7中(测量值以及从loess获得的拟合曲线)。bsf-hp表现出强抑制行为，在0.20mg/ml浓度下具有》75％的抑制。样品的ic
50
在表5中提到，并且按以下顺序排列：bsf-hp。样品的e
max
显示在表6中，并且按以下顺序排列：bsf-hp》bsf-p。fm和cm在所有测试浓度下均显示出促氧化行为。另一方面，bsf-p的e
maz
《50％。
[0183]
3.5.使用经典测定的髓过氧化物酶(mpo)活性
[0184]
使用经典测定获得的样品的mpo反应调节活性示于图8中(测量值以及从loess获得的拟合曲线)。cm和fm在所有测试浓度下均表现出促氧化行为。所有测试样品的e
max
示于表6中。bsf-p和bsf-hp表现出e
max
》75％。样品的ic
50
在表5中提到，并且按以下顺序排列：bsf-p》bsf-hp。
[0185]
3.5.细胞抗氧化活性
[0186]
样品的中性粒细胞反应调节活性(测量值以及从loess获得的拟合曲线)和e
max
分别显示在图9和表6中。所有测试样品表现出e
max
》0％。fm和cm表现出e
max
《40％。cm在5个测试浓度中的3个测试浓度下表现出促氧化行为。样品的ic
50
在表5中提到。bsf-p和bsf-hp具有
相同数值的ic
50
值。
[0187]
4.讨论
[0188]
4.1.蛋白质定量
[0189]
使用二喹啉甲酸测定估计的四种水溶性提取物的蛋白质浓度显示在表4中。考虑到黑水虻蛋白质、fm和cm之间的氨基酸模式相似性，四种水溶性提取物的蛋白质含量按以下顺序排列：bsf-p》cm》fm》45.5％》bsf-hp。
[0190]
4.2.dpph自由基清除活性
[0191]
dpph和abts测定通常用于分析食品和饲料产品的抗氧化潜能。dpph自由基清除活性代表样品提供氢原子(称为氢原子转移)或电子(称为单电子转移)以稳定自由基的能力。所有测试样品的dpph测定ic
50
和e
max
分别在表5和表6中提到。孵育30分钟后，所有测试样品表现出e
max
《50％(其中bsf-hp表现最高的e
max
)。另一方面，在孵育60分钟之后，仅bsf-hp表现出e
max
》50％。bsf-hp是通过黑水虻蛋白质的受控水解制备的，并且含有至少24％的小于1000da的蛋白质(参见表3)。另一方面，bsf-p含有至少6％的《1000da的蛋白质。发明人未能找到关于fm和cm的分子量分布的任何代表性文献。然而，根据文献，fm和cm分别含有2.2％和1.1％的游离氨基酸(按总蛋白质计)[li,p.；wu,g.composition of amino acids and related nitrogenous nutrients in feedstuffs for animal diets.amino acids 2020,1
–
20,doi:10.1007/s00726-020-02833-4.]。其分别转化为含有至少2.2％和1.1％的《1000da的蛋白质的fm和cm。蛋白质材料清除自由基的能力取决于蛋白质分子量分布。具有低分子量肽的蛋白质可以更有效地清除自由基。蛋白质分子的自由基清除活性也受到以下影响：(1)氨基酸组成：与亲水性氨基酸相比，疏水性氨基酸(例如tyr、phe、pro、ala、his和leu)具有优越的自由基清除活性；(2)氨基酸序列：具有两亲性质的肽可以增强样品的自由基清除活性。化学分析表明tyr通过氢原子转移机制表现出抗氧化行为。另一方面，氨基酸如cys、trp和his通过单电子转移机制表现出抗氧化行为。
[0192]
在孵育30分钟以及60分钟之后，fm和cm在大多数测试浓度下表现出促氧化行为(参见图4和图5)。这种行为主要由热处理引起。对于fm和cm两者，热处理通常包括在高温下加热初级产品15至20分钟。在挪威，在鱼粉生产期间，使野生捕获的鱼在≥70℃的温度下加热≥20分钟，以实现肠杆菌科和沙门氏菌计数减少100log
10
。这种严格的热处理条件可能导致脂肪和蛋白质的氧化。鱼粉含有富含多不饱和脂肪酸的脂质，这些多不饱和脂肪酸更易受热氧化的影响。通常在鱼粉中加入抗氧化剂以防止多不饱和脂肪酸的氧化(也可见于表1)。热诱导的氨基酸氧化导致产生广泛的氧化产物。氨基酸氧化副产物的促氧化行为已经是已知的。它们可导致动物体内广泛的健康状况。本技术的发明人使用和分析的所有黑水虻蛋白质衍生物(原浆、水解的原浆)在《100℃的温度下热处理《1.5min的时间(例如在90℃下持续80秒)。采用本发明的这些热处理时间-温度组合以确保对营养物(蛋白质和脂肪)的最小损害和病原微生物群的充分灭活。这意味着fm和cm的促氧化行为主要是由于严格的生产方法而产生的。
[0193]
在最近的一项研究[3]中，研究人员使用菠萝蛋白酶制备bsf蛋白质水解产物。还测试了菠萝蛋白酶衍生的蛋白质水解产物的dpph自由基清除活性，其产生的ic
50
为8.4mg/ml。与诸如bsf-hp(孵育60分钟之后的ic
50
为0.18mg/ml)的产品的活性相比，这种菠萝蛋白酶衍生的蛋白质水解产物的dpph自由基清除活性低得多。本技术的发明人发现的bsf-hp的
较高活性可能由原料本身的组成属性(如在本节中先前讨论的)和品质产生。据报道，protix在haccp条件下在gmp 和securefeed认证的设施中生产昆虫蛋白质。
[0194]
4.3.abts阳离子自由基清除活性
[0195]
abts阳离子自由基清除表示样品提供电子和稳定自由基的能力。所有样品的abts测定ic
50
示于表5中。它们按以下顺序排列：fm》cm》bsf-hp》bsf-p。ic
50
越高，抗氧化活性越低。在该测定中，甚至fm和cm表现出抗氧化活性。看起来fm和cm提取物在可以使用单电子转移机制使自由基稳定的情况下可能是有效的。然而，与bsf衍生物，即bsf幼虫原浆和水解的bsf幼虫原浆的令人惊讶的高清除活性相比，它们仍然表现出较低的清除活性。
[0196]
自由基清除活性对蛋白质分子量的依赖性已在第4.2节中进行了说明。在protix，发明人确定bsf-p和bsf-hp具有完全相同的氨基酸组成。然而，由于蛋白质水解，bsf-hp中《1000da的蛋白质的量高于bsf-p。因此，有些令人惊讶的是，与bsf-hp相比，bsf-p ic
50
值略低。这可以通过水解的机制来说明。酶水解通过外肽酶和内肽酶实现。外肽酶裂解末端肽键，另一方面内肽酶裂解非末端肽键。在这两种情况下，氨基酸的序列发生改变。通过单电子转移得到的肽的自由基清除能力也取决于蛋白质分子的两亲性质。bsf-hp中的肽可能在本质上具有较低的两亲性，这导致与bsf-p相比，bsf-hp的abts阳离子自由基清除活性较低。
[0197]
zhu等人[4]使用广泛的商业酶开发了bsf蛋白质水解产物。使用超滤法将该水解产物进一步分级分离成以下组：第1组(小于3000da)、第2组(3000至10,000da)和第3组(大于10,000da)。还研究了这些水解的分级分离物(fractionate)的abts阳离子自由基清除活性。在实施例中使用抗坏血酸作为参考分子。有趣的是，在0.05mg/ml浓度下，表现最佳的分级分离物和抗坏血酸能够分别抑制85.67％和92.11％的abts阳离子自由基。本技术的发明人现在令人惊讶地确定bsf-p已经表现出高达89的abts阳离子自由基清除e
max
(在0.2mg/ml时)。这表明bsf-p部分显示出具有非常强的抗氧化潜能的部分。
[0198]
4.4.中性粒细胞反应调节活性
[0199]
根据第4.2节和第4.3节，bsf衍生物的强自由基清除活性是明显的。此外，还测试了所有样品的中性粒细胞反应调节活性。中性粒细胞是存在于动物体内(包括人类、宠物、鱼类、家禽和猪)的白细胞。它们参与对病原体的主要防御。当病原微生物进入动物体内时，中性粒细胞冲向感染部位并开始防御。在造粒期间，中性粒细胞释放广泛的氧化酶，包括nadph氧化酶，其负责产生超氧阴离子和副产物(例如过氧化氢)。超氧阴离子可以进一步与一氧化氮自由基反应以产生过氧亚硝酸盐。该方法还产生羟基自由基(通过过氧化氢与金属离子的反应)。这一组氧化反应对宿主动物的防御至关重要。然而，在宿主防御期间产生的这些ros可与机体细胞的酶、蛋白质、脂质等反应，并导致不同健康状况(例如，细胞老化、癌症等)的发展。本研究中进行的中性粒细胞测定确定了蛋白质分子清除由中性粒细胞活动产生的ros的能力。pma用于活化存在于中性粒细胞中的蛋白激酶c，这导致产生负责催化ros产生的nadph氧化酶。系统中的ros产生与光泽精(lucigenin)放大的化学发光耦合。蛋白质样品清除ros(特别是超氧阴离子)的能力以化学发光降低作为标志。
[0200]
据发明人所知，这是第一次分析bsf衍生物，即bsf幼虫原浆和水解的bsf幼虫原浆的体外中性粒细胞反应调节活性。cm在5个测试浓度中的3个测试浓度下表现出促氧化行为，在0.2mg/ml时e
max
仅为5％(参见图9和表6)。cm通常用于宠物食品制剂中。然而，本发明
的实施例和实施方案中的比较测试结果表明，cm包含物对涉及清除由中性粒细胞产生的ros几乎没有提供任何益处。此外，cm包含物甚至可能导致对宿主细胞的炎症损伤。犬类或猫科动物细胞的反复性炎症损伤可能转化为诸如加速老化、认知功能缓慢的病况。
[0201]
另一方面，fm在该测定中表现出轻微的抗氧化行为，e
max
为22％(参见表6)。在0.2mg/ml时，fm表现出5％的抑制。水产养殖饲养培养基(即水)提供了致病菌的连续缓冲液。因此，水产养殖有机体一直处于致病菌入侵的风险中。这导致了广泛的健康状况，包括免疫力降低、老化等。本技术的发明人的比较例突出了fm不足以抑制由重复性中性粒细胞活动引起的炎症损伤。这通常转化为由于抗生素和营养补充剂使用而发生的成本增加。bsf-p的e
max
和ic
50
分别为59.57％和0.15mg/ml(参见表6)。此外，bsf-hp也表现出与bsf-p相当的中性粒细胞反应调节活性(参见表5)。
[0202]
4.5.mpo反应调节活性(siefed和经典测定)
[0203]
中性粒细胞反应的一般机制是已知的。中性粒细胞胞外陷阱包含灭活病原微生物所需的几种分子。存在于中性粒细胞胞外陷阱中的mpo酶可以从过氧化氢和氯离子产生次氯酸。另外，mpo能够将酪氨酸氧化成酪氨酰自由基。mpo氧化的两种产物(次氯酸和酪氨酰自由基)对于灭活病原体是至关重要的。同样，这些分子与动物细胞的反复相互作用导致炎症损伤。在动物体内，mpo-fe(iii)(活性形式)与过氧化氢反应形成氧代高价铁π阳离子自由基(cpi形式)。cpi形式转化回mpo-fe(iii)，mpo-fe(iii)与氯离子偶联转化为次氯酸。然而，在本实验中，cpi形式向mpo-fe(iii)的反向还原在2个阶段中实现。首先经由通过亚硝酸盐离子的电子转移将cpi还原为mpo-fe(iv)＝o。然后，进行电子供应(通过amplex
tm red氧化成试卤灵的反应)，其将mpo-fe(iv)＝o转化为mpo-fe(iii)形式。蛋白质分子可以通过直接与cpi形式反应并终止卤化，或者通过将氢(氢原子转移)提供给由于mpo活性产生的ros，来防止由mpo引起的氧化损伤。使用经典和siefed测定分析mpo反应调节活性。经典测定测量样品与cpi形式复合并稳定ros的能力。然而，在siefed测定中，mpo与兔多克隆抗体结合(洗掉其余的化合物)，因此它仅测量样品与cpi形式复合的能力。
[0204]
与中性粒细胞反应调节活性一样，在根据本发明的方法提供原浆之后，本技术的发明人也首次确定了bsf衍生物，即bsf幼虫原浆和水解的bsf幼虫原浆)的mpo反应调节活性。fm和cm在两种测定中均表现出促氧化行为(参见图7和8)。在第4.2节中已经讨论了fm和cm中存在氧化反应产物(由于生产过程)，这些氧化反应产物能够引发促氧化反应。本技术的发明人实现的详细体外研究表明，在动物饮食中包含fm和cm可能导致炎症损伤。
[0205]
在经典测定中，bsf衍生物表现出令人惊讶的强抗氧化潜能，ic
50
按以下顺序排列：bsf-p》bsf-hp。在siefed测定中，bsf-p未达到50％抑制(即使在最高的测试浓度下)。因此，虽然bsf-p在稳定ros方面更有效，但bsf-hp在与mpo的cpi形式复合方面具有更高的功效。这些观察结果表明，两种bsf衍生物适合用作宠物食品和水产养殖制剂中的成分以有效地抑制由mpo活性引起的炎症损伤。
[0206]
bsf蛋白质衍生物提供了优于fm和cm的抗氧化优势。
[0207]
实施例4
[0208]
由于原浆加热时间导致的脂肪氧化
[0209]
引言
[0210]
巴氏杀菌对于加工的昆虫蛋白质的生产是至关重要的。最佳的加热时间和最佳的
加热温度组合对于以下方面是重要的：
[0211]
(1)病原体的灭活；以及
[0212]
(2)保留食品的营养品质。
[0213]
关于(昆虫蛋白质的)脂肪品质，巴氏杀菌时间x温度组合对于以下方面是显著的：
[0214]
(1)肠道sn-1,3-脂肪酶的灭活：如果不灭活，这种酶可能会将甘油三酯水解为游离脂肪酸(存在于甘油三酯的sn-1,3位)和2-单甘油酯。
[0215]
(2)脂质氧化：加热可能导致多不饱和脂肪酸的(非酶)氧化。由于脂肪酶活性而形成的游离脂肪酸也可通过脂氧合酶进行(酶)氧化。这两种氧化过程导致初级(例如氢过氧化物)和次级氧化产物(例如醛和酮)的形成。这些反应对食品的感官品质以及食用动物的健康具有不利影响。
[0216]
在本实施例4中，确定了在巴氏杀菌原浆中ffa形成的程度(以分析脂肪酶失活)和由于加热时间导致的氢过氧化物的形成。
[0217]
材料和方法
[0218]
从饲养单位(protix,the netherlands)收获约5kg活的黑水虻幼虫。彻底洗涤这些幼虫以去除所有可见的杂质。每次处理使用300g洗涤过的幼虫。将幼虫绞碎以获得平滑的浆液(原浆)，并根据表7中所示的处理进行巴氏杀菌。将巴氏杀菌的幼虫原浆立即冷冻(至-20℃)。这些冷冻样品随后解冻并分析游离脂肪酸含量和过氧化值。所有实验以一式两份进行。
[0219]
表7：实施例4中使用的巴氏杀菌处理的说明。
[0220]
处理巴氏杀菌温度(℃)巴氏杀菌时间(s)190029040390804903005901800
[0221]
结果
[0222]
在表8中提到了针对相应处理获得的游离脂肪酸含量和过氧化值。
[0223]
表8：针对相应处理获得的游离脂肪酸和过氧化值
[0224][0225]1以平均值
±
s.d.(n＝2)表示的结果。
[0226]
从表8中可见，在90℃下加热40秒的昆虫原浆具有相对高的游离脂肪酸的量(约70％)。仅将原浆加热40秒对于脂肪酶的失活是无效的。然而，当将原浆加热80秒时观察到低量的游离脂肪酸，这表明该时间对于在90℃下的酶失活是足够的。在加热时间超过80秒
(表7和表8中的处理4和5)时，脂肪酸含量相比于在将黑水虻幼虫原浆加热80秒时获得的低脂肪酸含量有所增加。因此，为了获得包含相对低的游离脂肪酸含量的蛋白质部分，本发明方法中的加热时间应长于40秒且短于300秒，如50-100秒，或加热时间选自60-90秒或70-85秒，如约80s。优选的加热时间为约90℃或90℃
±
2℃。
[0227]
在加热持续40秒时也观察到较高的过氧化值。这可以解释为大量的游离脂肪酸可参与酶氧化，导致产生氢过氧化物。然而，在80秒处理的情况下，获得较低的过氧化值。加热产物进一步对脂肪氧化产生影响，其中与处理3(即加热时间为80秒)的过氧化值相比，处理4和处理5的过氧化值增加。因此，为了获得包含相对低的过氧化值的蛋白质部分，本发明方法中的加热时间应长于40秒且短于300秒，如50-100秒，或加热时间选自60-90秒或70-85秒，如约80秒。优选的加热时间为约90℃或90℃
±
2℃。
[0228]
结论
[0229]
将绞碎的昆虫幼虫在90℃加热80秒足以进行酶失活，防止游离脂肪酸形成，并防止过氧化物形成。
[0230]
实施例5
[0231]
饲喂给鱼类饲料补充剂之后的鱼样品的抗氧化活性
[0232]
使用抗自由基(abts)技术研究鱼片样品的抗氧化活性。在蒸馏水中制备水溶性黑水虻幼虫蛋白质提取物(被称为hi-0、hi-25、hi-50和hi-50)，并以不同浓度使用。在abts测定中，在最大测试浓度下的抑制百分比按以下顺序排列：hi-25》hi-100》hi-50》hi-0。在abts测定中，hi-25鱼片样品达到ic
50
≥50％。总之，在测试的浓度系列内，hi-25样品在所有测试的鱼片样品中具有最大的abts自由基清除活性。
[0233]
使用abts测定，就用本发明方法获得的黑水虻蛋白质的自由基降低活性来评估鱼肉样品的活性。
[0234]
材料和方法
[0235]
饮食
[0236]
根据本发明的方法制备本研究中使用的proteinx(黑水虻的高蛋白粉)，并且其由protix(the netherlands)提供。两种等氮、等脂和等能量的饮食用鱼粉(20.6％)或proteinx(32％)作为主要蛋白质来源进行配制。两种饮食均由research diet services(the netherlands)生产。将diamol作为用于消化率测量的惰性标志物加入到两种饮食中。通过饲喂两种饲料中的一种，或将两种饲料混合成确定比例，形成四种处理。
[0237]
饮食处理被称为：
[0238]
hi0(基于100％鱼粉的饲料)；
[0239]
hi25(基于75％鱼粉的饲料与基于25％proteinx的饲料混合)；
[0240]
hi50(两种饲料以相等比例混合；基于50％鱼粉的饲料与基于50％proteinx的饲料混合)；以及
[0241]
hi100(基于100％proteinx的饲料)。
[0242]
所有四种饮食处理的近似组成呈现在表9中。
[0243]
proteinx和四种实验饮食处理的近似组成由disafa实验室确定，并呈现在表9中。使用绞碎机(mli 204；b
ü
hler ag,uzwil,switzerland)研磨饲料样品，并根据aoac国际组织的规定分析干物质含量(aoac#934.01)、粗蛋白质含量(aoac#984.13)、灰分含量(aoac#
942.05)和醚提取物(aoac#2003.05)。粗蛋白质含量计算为：氮*6.25。
[0244]
鱼和饲养条件
[0245]
动物饲养试验在都灵大学(意大利)的农业、森林和食品科学系的实验设施进行。根据现行欧洲和意大利关于实验动物的护理和使用的法律的指导方针设计实验方案(欧洲指令86 609/eec，在意大利以d.l.116/92实施法律)。实验方案得到了都灵大学伦理委员会批准(方案n
°
143811)。
[0246]
从私人孵化场(troticoltura bassignana,cuneo,italy)获得虹鳟鱼的幼鱼，并随机分布在12个玻璃纤维缸(n＝3)中(每缸中50条鱼)。在流通系统中向这些缸供应自流井水(13
±
1℃)，流速为8l/min。每两周测量一次溶解氧，其范围为7.6至8.7mg/l。使鱼适应实验设置持续四周，在此期间，每缸中饲喂总体重的1.6％的商品饲料。适应后，对鱼进行133天的限制性饲喂饮食处理，其中113天是以1.4％的固定比例饲喂，随后的20天以1.1％的固定比例饲喂。在每次喂食时监测饲料摄入量。每天手工分配饲料两次，每周6天。每14天对每个缸的生物量进行批量称重，以校正每日进料速率。每天检查死亡率。
[0247][0248]
取样：
[0249]
在试验结束时，将鱼禁食一天，每种处理取9条鱼(3条鱼/缸)，用过量的麻醉剂(ms-222-pharmaq ltd,uk；500mg/l)杀死鱼，并单独称重。收集每条鱼的右鱼片，真空密封，冷冻(-20℃)，随后冷冻干燥。
[0250]
样品制备：
[0251]
接收鱼样品(呈粉末形式)。将样品保持在冰箱(-20℃)中，直至进一步处理。根据mouithys-mickalad等人(2020)的方案制备各样品的水溶性提取物粉末(wsep)。将wsep储存在干燥器中(在18℃)，直至进一步实验。通过将wsep溶解在milli-q水中至20mg/ml的终浓度来制备wsep的储备溶液，然后将该储备溶液稀释一半以依次获得10mg/ml、5mg/ml、2.5mg/ml和1.25mg/ml。
[0252]
abts自由基清除活性：
[0253]
根据arnao等人(2001)的方法分析wsep样品对abts自由基阳离子的自由基清除活性。通过将7.0mmol/l abts和1.35mmol/l过硫酸钾完全溶解在milli-q水中来制备abts储备溶液。将测试溶液在暗处(在18℃)保持过夜以完成反应。通过用甲醇稀释储备溶液来制备abts工作溶液，以获得在734nm处的在0.7至0.8mm的吸光度。将abts工作溶液(1920μl)与20μl的wsep溶液(通过将wsep溶解在milli-q水中获得)混合，以获得0.0125、0.025、0.05、0.1和0.2mg/ml的终浓度。使用hp 8453uv-vis分光光度计在734nm处测量在黑暗中孵育30分钟后的吸光度的降低。在对照的情况下，仅使用milli-q水代替wsep稀释液。如paul(2007)所述，进行渐增浓度的不同样品的重复，并转移到多孔装置(96孔板)中，最终体积为200μl(198μl的溶剂和2μl的wsep)。类似地，在30min孵育期之后，使用multiskan ascent读数器(thermo fisher scientific)在740nm处读取吸光度。
[0254]
结果
[0255]
wsep样品的abts自由基清除活性示于图10中：显示的是在甲醇中进行的wsep的abts自由基清除活性。结果是以一式三份的三次独立测定的平均值
±
sd。对于所有样品，浓度的增加导致平均抑制值的增加(表明抗氧化行为)。e
max
(在测试期间获得的最大抑制)按以下顺序排列：hi-25》hi-100》hi-50》hi-0(均以0.2mg/ml的终浓度获得)。该结果表明hi-25样品表现出最高的abts自由基清除活性。另一方面，hi-0样品表现出最小的abts自由基清除活性。最终，hi-25样品表现出≥50％的平均抑制值(达到ic
50
)。
[0256]
结束语
[0257]
如通过使用abts测定所评估的，通过应用本发明的方法利用黑水虻幼虫获得的所有蛋白质样品均表现出剂量依赖性方式的抗氧化活性。hi-25样品显示出最高的抗氧化活性。
[0258]
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