一种模板多核苷酸配对末端测序方法、试剂盒与流程

1.本发明涉及基因测序技术领域，具体涉及一种模板多核苷酸配对末端测序方法、试剂盒。


背景技术：

2.配对末端或成对测序技术在分析生物学领域是公知的，配对末端测序允许确定来自一条多核苷酸双链两个位置的序列的两个读取。由于配对末端序列并非是完全随机的，而是已知发生在单个双链上，在基因组中是相连或成对的，有助于将全基因组的序列组合成一致的序列，提高一次测序获得的序列信息的长度。
3.现有技术中公开的基于阵列多核苷酸模板的配对末端测序方法包括，wo2004/070005中公开的在固体支持物上实施的，将两个或多个引物同时与靶多核苷酸杂交，在杂交步骤之后，除一个引物之外，封闭其他所有与模板杂交的引物，未被封闭的引物进行延伸测序，完成测序之后，被封闭引物中的一个解除封闭以得到游离3’羟基进行另一个延伸测序反应。该方法实施过程中虽然阵列的多核苷酸模板始终连接在固体支持物上，保持多核苷酸模板链的稳定性，但是必须要确保只有一个引物可延伸，其他引物必须完全封闭，在实际操作过程中很难确保其他引物的完全封闭，导致高的测序错误率；wo2007010252公开了在固体支持物上形成双链模板簇，将双链模板簇变性形成单链簇，去除部分双链模板簇的其中一条链，对剩余的一条链进行测序；完成一次测序后，对 剩余部分双模板簇中的与一次测序中序列相同的单链模板去除，对剩余的与该去除的模板链互补的链进行测序，完成双链模板的双末端测序。该方法一次只能对一部分簇的一条链进行测序，不能完全利用所有的簇，导致测序信号强度达不到预期；wo2008041002公开了首先对全部的双链模板簇的其中一条链去除，对剩余的链测序，然后再以剩余的链为模板扩增形成其互补链，对其互补链进行测序，最终实现双末端测序；并具体公开了互补链的形成依赖固体支持物模板上设置的与第一次测序链的3端互补杂交的接头引物，并且该方法也依赖于首先形成双链模板簇，限制了该方法的应用范围。由此需要改进互补链的生成方式，使方法的实施应用不依赖于双链模板簇，也不依赖于固体支持物上特别设置的特殊接头，扩大双末端测序方法的应用范围。
4.例如，wo2016/133764公开了基于链置换原理生成互补链实现双末端测序的方法，通过第一引物与模板链杂交延伸形成于模板链互补的第二链，第二引物与模板链杂交延伸形成第三链的同时置换出第二链，控制第二链的置换，确保第二链在3端与模板链的部分互补杂交，形成部分与模板链杂交，部分悬伸的第二链，对第二链悬伸部分进行测序。该方法实施过程中，对形成的互补链（第二链）的固定是通过第二链靠近3端的部分与模板链部分互补杂交，该固定方式稳定性相对比较差，在延伸测序的反复循环冲洗的过程中容易脱落，降低测序信号，影响测序质量。鉴于此，需要进一步改进生成的互补链的固定方式，提高互补链在循环测序反应中的稳定性。


技术实现要素：

5.本发明的目的之一是提供一种多核苷酸模板配对末端测序方法，提高第二末端测序实施过程中形成的互补链的稳定性，提高测序质量。
6.同时，本发明还在于提供一种实施本发明测序方法的试剂盒。
7.为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：一种模板多核苷酸配对末端测序方法，包括以下操作步骤：s1、提供固定在固体支持物上的阵列的单链模板多核苷酸簇，加入第一测序引物，对单链模板多核苷酸至少部分序列进行测序，获得第一测序引物的延伸多核苷酸链和对应的第一末端序列信息；s2、去除第一测序引物的延伸多核苷酸链，加入延伸引物；其中延伸引物包括连接为一体的第一延伸引物和第二延伸引物，模板多核苷酸上具有第一延伸引物的结合位点和第二延伸引物的结合位点；其中第一延伸引物的结合位点位于第二延伸引物结合位点的上游；s3、将延伸引物与模板多核苷酸退火杂交，在具有链置换反应活性的环境下，第一延伸引物产生的与模板多核苷酸互补的第一延伸链至少部分置换第二延伸引物产生的与模板多核苷酸互补的第二延伸链，第二延伸链存在至少部分不与模板多核苷酸杂交结合，称为第二延伸链的悬伸部分；s4、加入第二测序引物对第二延伸链的悬伸部分进行测序，获得对应的第二末端序列信息，完成模板多核苷酸的配对末端测序。
8.实现配对末端测序的整体方案大体上都是首先对单链模板多核苷酸至少部分完成测序，获得第一端的序列信息；然后生成单链模板多核苷酸的互补链进行测序获得第二端的序列信息。然而，在该整体方案实施过程中最主要的问题是生成的互补链如何能够稳定存在循环测序、冲洗的环境中，即最主要的问题是如何将生成的互补链稳定固定在固相支持物上。为了解决上述问题，本发明对用于与模板多核苷酸互补杂交延伸产生互补链的延伸引物进行特殊设计，形成至少由第一延伸引物、第二延伸引物连接为一体的延伸引物结构，并设计第一延伸引物在模板多核苷酸上的结合位点位于第二延伸引物结合位点的上游。该延伸引物加入阵列的单链模板多核苷酸的固体支持物上，一种情况是延伸引物与一条模板多核苷酸链杂交结合；另一种情况是一条模板多核苷酸链上杂交结合两个延伸引物，每个延伸引物对应与两条模板多核苷酸链杂交结合。
9.无论是哪种情况，在具有链置换活性的环境下，第一延伸引物的延伸链合成过程中会置换第二延伸引物的延伸链，第二延伸引物形成的与模板多核苷酸互补的延伸链不与模板多核苷酸链结合，悬伸在测序环境中，作为第二端测序的模板链；并且由于第一延伸引物与第二延伸引物连接为一体，第二延伸引物产生的延伸链通过第二延伸引物连接在第一延伸引物上，再通过第一延伸引物的延伸链结合在模板多核苷酸链上，再通过模板多核苷酸链固定在固体支持物上，即通过设计连接为一体结构的第一延伸引物和第二延伸引物，利用链置换扩增的原理产生模板多核苷酸的互补链，并将互补链间接固定在固体支持物上，提高互补链在循环测序环境中的稳定性，提高测序质量，更好地解决现有技术存在的技术问题。
10.为了更进一步提高互补链的稳定性，可选的，延伸引物还包括与第一延伸引物和
第二延伸引物连接为一体的第三延伸引物，第三延伸引物在模板多核苷酸上的结合位点与第一延伸引物相同；步骤s3中延伸引物至少与两条并列的单链模板多核苷酸杂交结合，第三延伸引物产生的与模板多核苷酸互补的第三延伸链至少部分置换第二延伸引物产生的与模板多核苷酸互补的第二延伸链。
11.更进一步的，所述延伸引物还包括与第一延伸引物、第二延伸引物、第三延伸引物连接为一体的第四延伸引物，第三延伸引物在模板多核苷酸上的结合位点与第二延伸引物相同；步骤s3中延伸引物至少与两条并列的单链模板多核苷酸杂交结合，第三延伸引物产生的与模板多核苷酸互补的第三延伸链至少部分置换第四延伸引物产生的与模板多核苷酸互补的第四延伸链。
12.无论延伸引物的连接组成结构是两条、三条或是四条，其与模板多苷酸链的杂交结合反应原理是相同的，只需要确保模板多核苷酸上具有间隔设置的下游结合位点和上游结合位点，不同的延伸引物连接为一体，在具有链置换反应活性的环境下发生链置换扩增反应即可。
13.上述延伸引物中结合位点位于上游的称为上游延伸引物，结合位点位于下游的称为下游延伸引物。为了进一步调高链置换扩增反应的有序和可控性，所述延伸引物中的上游延伸引物的tm值低于下游延伸引物的tm值；更进一步优选的，上游延伸引物与下游延伸引物的tm值差值为5~10℃。
14.为了进一步提高链置换扩增反应的可控性，步骤s3中下游结合位点的延伸引物产生的延伸链完全置换下游结合位点的延伸引物产生的延伸链，被置换出的延伸链不与模板多核苷酸杂交结合，完全悬伸。
15.为了进一步提高互补链的稳定性，上游结合位点的延伸引物产生的延伸链的3’端还具有可衔接部分，对应的延伸链通过可衔接部分固定在固体支持物上。可选的，所述固体支持物上设置有与延伸链可衔接部分相配合的配体结构；进一步可选的，延伸链可衔接部分为生物素，对应固体支持物上的配体结构为链霉亲和素。进一步可选的，延伸链可衔接部分为叠氮基、炔基、硫代磷酸或硫代磷酸酯。
16.可选的，所述单链模板多核苷酸包括第一衔接子、第二衔接子以及插入在第一衔接子和第二衔接子之间的靶dna序列。
17.可选的，第一衔接子包括第一测序引物结合位点、延伸引物结合位点；第二测序引物与第二衔接子的至少部分序列相同。
18.可选的，所述第二衔接子还包括将模板多核苷酸固定在固体支持物上的元件。
19.可选的，所述第一衔接子和第二衔接子还包括标签序列。第一衔接子和第二衔接子可以采用通用的衔接子序列，通过在衔接子序列中插入不同的标签序列，实现对不同来源的dna序列进行同时检测。
20.可选的，所述第一测序引物和第二测序引物的序列相同。
21.可选的，所述第一测序引物和第二测序引物的序列不同。
22.可选的，第一延伸引物和第二延伸引物通过linker结构连接为一体，第一延伸引物和第二延伸引物的5’端分别修饰能够与linker结构的对应端结构发生化学反应实现共价连接。进一步可选的，第一延伸引物和第二延伸引物5’端修饰结构包括叠氮结构，linker的两端设置有能够与叠氮结构发生点击化学反应的烯基或炔基结构；进一步可选的，
linker结构上还包括至少两个官能团，第三延伸引物和第四延伸引物的5’端分别包括修饰结构，能够与linker结构上对应的官能团共价结合，以实现第一延伸引物、第二延伸引物、第三延伸引物和第四延伸引物连接为一体；进一步可选的，linker结构的官能团可以为叠氮结构，第三延伸引物和第四延伸引物的5’端的修饰结构为能够与叠氮结构反应的烯基或炔基结构。
23.为了维持第一延伸引物、第二延伸引物、第三延伸引物和第四延伸引物连接结构的柔性特性，避免连接结构对各延伸引物与模板链的杂交结合形成空间上的限制，进一步优选的，上述linker结构包括15~20bp的尿嘧啶链；或者上述linker结构也可以是50~60个重复单元的聚合物分子链结构，例如可以是聚乙二醇链结构。
24.可选的，s3中通过加入具有链置换活性的dna聚合酶提供链置换反应活性的环境。
25.进一步的，所述具有链置换活性的dna聚合酶为phi29聚合酶、bst聚合酶、bsu 聚合酶，vent dna聚合酶，bsm dna聚合酶大片段。
26.为了提高链置换扩增反应的有序性和置换扩增质量，延伸引物在模板多核苷酸上的上游结合位点和下游结合位点之间的间隔序列长度为3~10bp。
27.可选的，s1和s4中测序采用的方法包括合成测序法、焦磷酸测序法或连接法。
28.另外，本发明还提供一种试剂盒，用于模板多核苷酸配对末端测序，包括延伸引物，用于产生与模板多核苷酸互补的测序多核苷酸链；延伸引物包括连接为一体的第一延伸引物和第二延伸引物，模板多核苷酸上具有第一延伸引物的结合位点和第二延伸引物的结合位点；其中第一延伸引物的结合位点位于第二延伸引物结合位点的上游。
29.进一步的，上述试剂盒中的延伸引物还包括与第一延伸引物和第二延伸引物连接为一体的第三延伸引物，第三延伸引物在模板多核苷酸上的结合位点与第一延伸引物相同。
30.更进一步，上述试剂盒中的延伸引物还包括与第一延伸引物、第二延伸引物、第三延伸引物连接为一体的第四延伸引物，第四延伸引物在模板多核苷酸上的结合位点与第二延伸引物相同。
附图说明
31.图1 为本发明具体实施方式中产生第二端测序用模板链的原理示意图；图2为本发明具体实施方式中加入由四条连接为一体的延伸引物与完成第一端测序的模板链杂交结合的原理示意图；图3为本发明实施例测序方法运行的绿色荧光信号图像；图4为本发明实施例测序方法运行的红色荧光信号图像。
具体实施方式
32.下面，结合具体实施方式，对本发明做进一步说明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
33.1、单链模板多核苷酸本发明单链模板多核苷酸是指任何单链形式存在的多核苷酸链，作为第一端测序
的模板，可以是线性结构或非线性结构（“dna纳米球”），优选为呈线性结构的单链形式；其中线性结构的单链模板多核苷酸包括第一衔接子、第二衔接子和插入第一衔接子和第二衔接子的靶dna序列，第一衔接子提供第一测序引物结合位点、延伸引物结合位点，第二衔接子至少部分序列与第二测序引物序列相同；在一些实施例中第一衔接子和第二衔接子采用通用序列，实现不同靶dna序列的大规模并行测序，可以通过在第一衔接子和第二衔接子中插入标签序列的方式标记不同的靶dna和测序方向；非线性结构（dna纳米球）的单链模板多核苷酸包括由至少两个靶dan序列形成的单链多联体结构，单链多联体模板多核苷酸的两端设置有第一衔接子和第二衔接子，不同的靶dna序列之间通过第三衔接子间隔连接，第一衔接子和第三衔接子上提供第一测序引物结合位点、延伸引物结合位点，第三衔接子和第二衔接子至少部分序列与第二测序引物序列相同。
34.2、单链模板多核苷酸文库构建2.1文库构建方法概述在许多大规模并行测序技术中，生成测序模板文库的方法有很多种，在某些实施例中，按照“solexa”型测序中通常采用的建库方法，构建线性结构的单链模板多核苷酸文库，将基因组dna首先片段化，然后将dna片段两端连接至平台特异性寡核苷酸衔接子，一端衔接子用于将单个片段固定在固体支持物上，在固体支持物上原位扩增单个片段产生用于测序的单链模板多核苷酸簇；在另外一些实施例中，也可以按照由drmanac等开发的dna纳米球方法，构建非线性结构的单链模板多核苷酸文库，将基因组dna片段化，单个片段用于产生环状dna，平台特异性寡核苷酸衔接子分离基因组dna序列（分离的基因组dna序列的基因组中可以是相邻的），环状dna扩增产生以产生可以固定在固体支持物上的单链多联体。
35.应当可以理解的是，本发明采用本领域公知的文库构建方法，构建包括许多不同的靶dna序列但共享相同的衔接子序列的阵列结构，实现大规模平行测序。
36.2.2 衔接子上述单链模板多核苷酸文库构建中使用到的衔接子可以包含用于将模板dna多核苷酸固定在固相支持物上的元件（比如第二衔接子5’端带有能够与固体支持物上官能团反应的修饰基团），还可以包括限制性内切酶识别位点、延伸引物杂交位点、条形码序列、独特的分子标识符序列和聚合酶识别序列等（比如上述模板多核苷酸结构中第一衔接子、第二衔接子和第三衔接子上设置的延伸引物结合位点、测序引物结合位点、标签序列等）；衔接子序列可以具有适用于特定测序平台和预期用途的长度、结构和其他特性。比如衔接子可以是单链、双链或部分双链，长度可以在10~200个核苷酸、20~100个核苷酸、40~100个核苷酸或50~80个核苷酸的范围内。在一些实施例中，库的不同成员通常将包含公共衔接子序列，尽管库中的不同种类或子类别可具有独特特征，如标签序列或者子属特异性条形码；单独衔接子可以包括多个功能不同的子序列，比如上述线性结构的单链模板多核苷酸的第一衔接子包括第一测序引物结合位点、延伸引物结合位点，不同的功能序列可以根据实际需要选择重叠或者不重叠，相邻或者间隔一定的距离设置。重叠区域可以是5%重叠、10%重叠、20%重叠、30%重叠、40%重叠或者50%重叠，不重叠可以是由1~10、10~20、30~40
或40~50个核苷酸分开。
37.2.3形成固定在固体支持物上的阵列结构的单链模板多核苷酸簇本发明限定单链模板多核苷酸呈阵列形式固定在固体支持物上，可以是以阵列形式固定在平整的固体支持物表面，阵列结构中的所有单链模板多核苷酸处于完全相同且均一的反应环境中；也可以是固体支持物上设置有阵列的凹陷结构，各个单链模板多核苷酸固定在相应的凹陷结构内，每个凹陷结构形成一个独立的反应室；在一些实施例中，采用桥式扩增的方式形成固定在固体支持物上的阵列结构的单链模板多核苷酸；在一些实施例中，采用非桥式扩增的方式，固体支持物上预先固定连接一种能够与片段化dna的一端衔接子杂交结合的接头序列（通常作为形成的单链模板多核苷酸的第二衔接子），采用类似zhaochun ma等在论文《isothermal amplification method for next-generation sequencing》中公开的扩增成簇方法形成固定在固体支持物上的阵列结构的单链模板多核苷酸；应当可以理解的是，本发明也可以采用其他能够通过预先在固体支持物上固定连接一种接头的方式扩增单链片段化dna形成阵列的单链模板多核苷酸簇，簇的形成方式不决定本发明测序方法的实施；在一些实施例中，可以采用由drmanac等开发的dna纳米球方法形成单链多聚体结构的核苷酸模板，固定在阵列的凹陷结构内。
38.3、单链模板多核苷酸第一端测序在一些实施例中，单链模板多核苷酸的第一端测序方法包括，按照上述方法提供固定在固体支持物上的阵列的单链模板多核苷酸簇，单链模板多核苷酸的3’端设置第一衔接子、5’端通过第二衔接子固定在固体支持物上，第一衔接子上设置有第一测序引物结合位点，加入第一测序引物，第一测序引物结合在第一衔接子的相应位置，可以通过合成测序方法、连接测序方法或焦磷酸测序方法实施单链模板多核苷酸的第一端测序，获得第一测序引物的延伸多核苷酸链和对应的第一末端序列信息；4、单链模板多核苷酸互补链的生成及第二端测序单链模板多核苷酸互补链的生成原理如图1所示，去除第一测序引物的延伸多核苷酸链，加入延伸引物；其中延伸引物包括连接为一体的第一延伸引物和第二延伸引物，模板多核苷酸上具有第一延伸引物的结合位点和第二延伸引物的结合位点；其中第一延伸引物的结合位点位于第二延伸引物结合位点的上游；将延伸引物与模板多核苷酸退火杂交，模板多核苷酸的第一延伸引物结合位点和第二延伸引物结合位点对应结合有第一延伸引物和第二延伸引物，在具有链置换反应活性的环境下，第一延伸引物产生的与模板多核苷酸互补的第一延伸链至少部分置换第二延伸引物产生的与模板多核苷酸互补的第二延伸链，第二延伸链存在至少部分不与模板多核苷酸杂交结合，称为第二延伸链的悬伸部分，该第二延伸链的悬伸部分是模板多核苷酸的互补链，作为单链模板多核苷酸第二端测序的模板链。
39.在一些实施例中，为了进一步提高链置换扩增反应的可控性，步骤s3中下游结合位点的延伸引物产生的延伸链完全置换下游结合位点的延伸引物产生的延伸链，被置换出的延伸链不与模板多核苷酸杂交结合，完全悬伸。由于本发明下游结合位点的延伸引物可以依次通过上游延伸引物、上游延伸引物的延伸链和模板多核苷酸链间接固定在固相支持
物上，即便在被置换出的下游延伸引物的延伸链完全悬伸的情况下仍然能够稳定固定在固体支持物上，在链置换反应过程中无需通过温度、酶活性、反应时间等反应条件控制链置换的进程，提高整个测序过程的可控性，解决现有技术未解决的技术问题。
40.在一些实施例中，延伸引物中结合位点位于上游的称为上游延伸引物，结合位点位于下游的称为下游延伸引物，为了提高链置换扩增反应的有序性和置换扩增质量，上游延伸引物的tm值低于下游延伸引物的tm值；更进一步优选的，在一些实施例中，上游延伸引物与下游延伸引物的tm值差值为5~10℃；更进一步优选的，在一些实施例中，上游引物结合位点与下游引物结合位点之间的间隔序列长度为3~10bp。
41.实现配对末端测序的整体方案通常是首先对单链模板多核苷酸至少部分完成测序，获得第一端的序列信息；然后生成单链模板多核苷酸的互补链进行测序获得第二端的序列信息。然而，在该整体方案实施过程中最主要的问题是生成的互补链如何能够稳定存在循环测序、冲洗的环境中，即最主要的问题是如何将生成的互补链稳定固定在固相支持物上。为了解决上述问题，本发明对用于与模板多核苷酸互补杂交延伸产生互补链的延伸引物进行特殊设计，形成至少由第一延伸引物、第二延伸引物连接为一体的延伸引物结构，并设计第一延伸引物在模板多核苷酸上的结合位点位于第二延伸引物结合位点的下游。该延伸引物加入阵列的单链模板多核苷酸的固体支持物上，一种情况是延伸引物与一条模板多核苷酸链杂交结合；另一种情况是一条模板多核苷酸链上杂交结合两个延伸引物，每个延伸引物对应与两条模板多核苷酸链杂交结合。
42.无论是哪种情况，在具有链置换活性的环境下，第一延伸引物的延伸链合成过程中会置换第二延伸引物的延伸链，第二延伸引物形成的与模板多核苷酸互补的延伸链不与模板多核苷酸链结合，悬伸在测序环境中，作为第二端测序的模板链；并且由于第一延伸引物与第二延伸引物连接为一体，即便第二延伸引物产生的延伸链完全被置换，与模板多核苷酸链完全分离，第二延伸引物产生的延伸链仍然能够通过第二延伸引物连接在第一延伸引物上，再通过第一延伸引物的延伸链结合在模板多核苷酸链上，再通过模板多核苷酸链固定在固体支持物上，即通过设计连接为一体结构的第一延伸引物和第二延伸引物，利用链置换扩增的原理产生模板多核苷酸的互补链，并将互补链间接固定在固体支持物上，提高互补链在循环测序环境中的稳定性，提高测序质量，更好地解决现有技术存在的技术问题。
43.为了更进一步提高互补链的稳定性，在一些实施例中，延伸引物还包括与第一延伸引物和第二延伸引物连接为一体的第三延伸引物，第三延伸引物在模板多核苷酸上的结合位点与第一延伸引物相同；步骤s3中延伸引物至少与两条并列的单链模板多核苷酸杂交结合，第三延伸引物产生的与模板多核苷酸互补的第三延伸链至少部分置换第二延伸引物产生的与模板多核苷酸互补的第二延伸链。
44.更进一步的，在一些实施例中，延伸引物还包括与第一延伸引物、第二延伸引物、第三延伸引物连接为一体的第四延伸引物，第三延伸引物在模板多核苷酸上的结合位点与第二延伸引物相同；步骤s3中延伸引物至少与两条并列的单链模板多核苷酸杂交结合，如图2所示，第三延伸引物产生的与模板多核苷酸互补的第三延伸链至少部分置换第四延伸引物产生的与模板多核苷酸互补的第四延伸链。
45.应当可以理解的是，无论延伸引物的连接组成结构是两条、三条或是四条，其与模
板多苷酸链的杂交结合反应原理是相同的，只需要确保模板多核苷酸上具有间隔设置的下游结合位点和上游结合位点，不同的延伸引物连接为一体，在具有链置换反应活性的环境下发生链置换扩增反应即可。
46.另外，在一些实施例中，为了进一步提高互补链的稳定性，上游结合位点的延伸引物产生的延伸链的3’端还具有可衔接部分，对应的延伸链通过可衔接部分固定在固体支持物上。可选的，所述固体支持物上设置有与延伸链可衔接部分相配合的配体结构；进一步可选的，延伸链可衔接部分为生物素，对应固体支持物上的配体结构为链霉亲和素。
47.5、延伸引物的连接第一延伸引物和第二延伸引物通过linker结构连接为一体，第一延伸引物和第二延伸引物的5’端分别修饰能够与linker结构的对应端结构发生化学反应实现共价连接。
48.在一些实施例中，第一延伸引物和第二延伸引物5’端修饰结构包括叠氮结构，linker的两端设置有能够与叠氮结构发生点击化学反应的烯基或炔基结构；进一步的，在一些实施例中linker结构上还包括至少两个官能团，第三延伸引物和第四延伸引物的5’端分别包括修饰结构，能够与linker结构上对应的官能团共价结合，以实现第一延伸引物、第二延伸引物、第三延伸引物和第四延伸引物连接为一体；进一步可选的，linker结构的官能团可以为叠氮结构，第三延伸引物和第四延伸引物的5’端的修饰结构为能够与叠氮结构反应的烯基或炔基结构。
49.为了维持第一延伸引物、第二延伸引物、第三延伸引物和第四延伸引物连接结构的柔性特性，避免连接结构对各延伸引物与模板链的杂交结合形成空间上的限制，在一些实施例中，linker结构包括15~20bp的尿嘧啶链。
50.6、链置换活性反应环境的形成链置换活性表示生物、化学或物理试剂引起成对核酸在5’到3’的方向才能够从其互补链中解离，结合并接近于模板依赖性核酸合成的现象，置换在合成过程中遇到的下游dna；链置换开始于配对核酸序列的5’末端，因此酶在置换位点的5’端立即进行核酸合成。新合成的核酸和置换的核酸通常具有相同的与模板核酸链互补的核苷酸序列。链置换活性可以位于与赋予核酸合成的活性的分子相同的分子上，或者可以是单独和独立的活性。例如dna聚合酶，如大肠杆菌dna聚合酶ⅰ，dna聚合酶ⅰ的klenow片段、t7或t5噬菌体的dna聚合酶和hiv病毒转录酶，是具有聚合酶活性和链置换活性两者的酶。例如解旋酶之类的试剂可以与不具有链置换活性的诱导剂结合使用以产生链置换效应。
51.在本发明的一些实施例中，通过采用具有链置换活性的dna聚合酶的方式提供链置换活性反应环境，例如phi29聚合酶、bst聚合酶、bsu dna聚合酶，vent dna聚合酶，bsm dna聚合酶大片段。
52.7、单链模板多核苷酸第二端测序本发明实施例中，第一端测序的模板多核苷酸3’端设置已知序列的第二衔接子，延伸引物以对应的单链模板多核苷酸为模板扩增延伸过程中，上游结合位点延伸引物的延伸链（第一延伸引物的延伸链）置换下游结合位点延伸引物的延伸链（第二延伸引物的延伸链），下游结合位点延伸引物的延伸链与对应的模板多核苷酸互补，包括在靠近5’端的部分形成与模板多核苷酸第二衔接子互补的序列，上游延伸链在替换下游延伸链的过程中，5’端与第二衔接子互补的序列至少部分被置换悬伸，在一些实施例中全部被置换悬伸，在加
入与第二衔接子至少部分序列相同的第二测序引物时，第二测序引物与下游延伸链悬伸部分靠近5’端的与第二衔接子互补的至少部分序列杂交结合，通过合成测序方法、连接测序方法或焦磷酸测序方法以下游结合位点延伸引物的延伸链为模板进行单链模板多核苷酸的第二端测序。
实施例
53.1、构建单链核酸模板：设计第一衔接子序列为：5
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aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgacgctcttccgatct-3’；第二衔接子序列为：5'-gatcggaagagcggttcagcaggaatgccgagaccgatctcgtatgccgtcttctgcttg-3' ；已知序列的phix174基因组序列作为待测序核苷酸链。
54.将第一衔接子和第二衔接子连接在待测序核苷酸链的两端，采用zhaochun ma等在论文《isothermal amplification method for next-generation sequencing》中公开的扩增成簇方法形成固定在芯片上的阵列结构的单链模板多核苷酸；2、第一端测序：设计第一测序引物为5
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acactctttccctacacgacgctcttccgatct-3’；将1um的第一测序引物加入形成单链模板多核苷酸簇的芯片反应室流道中，以不同荧光染料标记的可逆终止子核苷酸为修饰核苷酸原料，在60℃下进行边合成边测序，进行50个循环；之后加热至95℃，使双链结构变性，洗去第一测序引物延伸链；3、第二端测序：设计延伸引物结构为'将2μm的延伸引物加入完成第一端测序的芯片反应室流道中，在50℃下，使延伸引物在含有phi29聚合酶和dntp混合物中延伸30min分钟，形成完成第一端测序的单链模板多核苷酸的互补链；设计第二测序引物为5
’‑
cggtctcggcattcctgctgaaccgctcttccgatct-3’；将1μm第二测序引物加入芯片反应室流道中，以不同荧光染料标记的可逆终止子核苷酸为修饰核苷酸原料，在60℃下进行边合成边测序，进行50个循环；4、序列的确定将第一端测序和第二端测序获得荧光信号图像信息进行处理和整合，如图3和图4所示，如表1所示结果显示，待测序核苷酸链被正确测序。
55.表1
文库测序循环数density（k/mm2）clusterpf（%）phas/prephas%》=q30错误率phix174pe5023679.3read1：0.230/0.166read2：0.238/0.191read1：87.4read2：88.6read1：0.91read2：0.78
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可
以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。