一种检测加工食品中不同阶段美拉德反应产物的方法与流程

1.本发明涉及食品检测技术领域，具体涉及一种检测加工食品中不同阶段美拉德反应产物的方法。


背景技术：

2.美拉德反应，又称羰氨反应或非酶褐变反应，是指氨基化合物和羰基化合物之间发生的反应，是食品风味产生的主要来源之一。美拉德反应被认为是发生在食品加工过程中最重要的化学反应之一。它影响食品的质量特性，例如颜色，风味，营养价值，以及食品原料的理化属性。
3.美拉德反应途径通常分为三个阶段：初始阶段、中间阶段和晚期阶段。初始阶段涉及的反应物种类数少，反应路径较简单。而美拉德进入中期和晚期反应阶段，由于经过前面阶段的反应，导致大量的中间反应产物产生，这些化合物经过聚合脱氢、重排、异构化等一系列复杂的反应路径，最终生成成色和成香化合物，产物多达成百上千种。糠氨酸(furosine)被认为是早期美拉德反应的重要化学标志物之一。晚期糖基化终末产物(advanced glycation end-products，ages)通常被认为是中期和晚期美拉德反应的标志物。
4.由于美拉德反应相当复杂，产物种类繁多，食品样品难处理等原因，对于食品中美拉德反应产物的检测缺少通用有效的方法。目前国内外的分析方法主要有荧光光谱法、酶联免疫法、气相色谱-质谱法、高效液相色谱法、液相色谱串联质谱法等。其中，荧光光谱法只适用于具有荧光性的产物，酶联免疫法对抗体特异性要求很高，气相色谱-质谱法对目标的衍生化过程太繁琐，液相色谱法的灵敏度不高，液相色谱串联质谱法需要校正基质效应带来的影响等。此外，目前发表的多数方法仅限于一种或几种美拉德反应产物的量化，不能客观反应加工食品中不同阶段美拉德反应产物的含量。


技术实现要素：

5.为了解决上述问题，本发明提出一种检测加工食品中不同阶段美拉德反应产物的方法，该方法可一次性检测加工食品中12种美拉德反应产物，包括糠氨酸furosine、吡咯素pyrraline、甲基乙醛-羟基咪唑酮异构体mg-h1/mg-h2/mg-h3、乙二醛-氢咪唑酮g-h1、羧甲基赖氨酸cml、羧乙基赖氨酸cel、戊糖素pentosidine、精嘧啶argpyrimidine、乙二醛-赖氨酸二聚体gold和甲基乙二醛-赖氨酸二聚体mold，以实现对加工食品中各阶段美拉德反应产物的含量进行全面定量分析。
6.为了实现上述目的，本发明的实施例提出了一种检测食品中不同阶段美拉德反应产物的方法，其包括以下步骤：
7.(1)将食品冷冻干燥后，磨成粉末，加入氯仿-甲醇溶液混合，离心，收集沉淀，沉淀氮吹至近干，再加入硼酸盐缓冲液和硼氢化钠溶液的混合液，室温下孵育，得到孵育液；
8.(2)向孵育液中加入美拉德反应产物的同位素内标品后，进行酸水解，真空离心浓
缩至近干，加水并用超声辅助复溶，过滤去除杂质，得到处理后的食品溶液；
9.(3)配制含有美拉德反应产物标准品的水溶液作为标准溶液，以美拉德反应产物标准品的浓度作为横坐标，以(标准品的积分色谱峰面积/同位素内标品的积分色谱峰面积)*同位素内标品的浓度作为纵坐标制作标准曲线。
10.(4)将处理后的食品溶液进行uplc-ms/ms检测，得到食品中美拉德反应产物的峰面积，代入标准曲线计算得各美拉德反应产物的浓度。
11.根据本发明实施例的一种检测食品中不同阶段美拉德反应产物的方法，该方法对加工食品的可食用部分进行冷冻干燥、研磨成粉、脱脂、孵育处理；再通过酸水解和真空离心浓缩技术提取出样品中的不同阶段美拉德反应产物；之后利用超高效液相色谱串联质谱制作美拉德反应产物的标准曲线：以美拉德反应产物标准品的浓度作为横坐标，以(标准品的积分色谱峰面积/同位素内标品的积分色谱峰面积)*同位素内标品的浓度作为纵坐标制作标准曲线；最后通过超高效液相色谱串联质谱对处理后的样品中的美拉德反应产物进行检测，利用标准曲线进行定量分析。由此，能够多靶标定量加工食品中不同阶段美拉德反应的产物，具体地，可定量出12种(糠氨酸furosine、吡咯素pyrraline、甲基乙醛-羟基咪唑酮异构体mg-h1/mg-h2/mg-h3、乙二醛-氢咪唑酮g-h1、羧甲基赖氨酸cml、羧乙基赖氨酸cel、戊糖素pentosidine、精嘧啶argpyrimidine、乙二醛-赖氨酸二聚体gold和甲基乙二醛-赖氨酸二聚体mold)，且具有线性范围宽、线性度好、灵敏度高等优点。
12.另外，根据本发明上述实施例提出的一种检测食品中不同阶段美拉德反应产物的方法，还可以具有如下附加的技术特征：
13.可选地，步骤(1)中，每1g粉末加入8ml～16ml氯仿-甲醇溶液，剧烈混合5～10min后，5000～6000rpm离心10～15min，收集沉淀，将沉淀氮吹至近干。
14.可选地，步骤(1)中，每，每1g沉淀加入6～9ml硼酸盐缓冲液和硼氢化钠溶液的混合液，于室温下孵育3～5h，获得孵育液。
15.可选地，不同阶段美拉德反应产物包括糠氨酸、吡咯素、甲基乙醛-羟基咪唑酮异构体、乙二醛-氢咪唑酮、羧甲基赖氨酸、羧乙基赖氨酸、戊糖素、精嘧啶、乙二醛-赖氨酸二聚体和甲基乙二醛-赖氨酸二聚体。
16.可选地，步骤(2)中，酸水解为每克沉淀中加入6ml～9ml 12mol/l hcl，110℃酸水解20～24h。
17.可选地，步骤(2)中，真空离心浓缩条件为：真空度0.1～1mbar，温度0～4℃，转速1000～1500rpm。
18.可选地，步骤(2)中，超声的条件为：超声频率20～25khz，超声功率50～100w，时间5～10min。
19.可选地，步骤(2)中，美拉德反应产物的同位素内标品包括mg-h1-d3、g-h1-13c2、cml-d4、cel-d4和gold-15n2。
20.可选地，同位素内标品的浓度为1～5μg/ml。
21.可选地，步骤(3)中，furosine的标准曲线为y＝0.15599x 0.42612，pyrraline的标准曲线为y＝0.16891x 0.02758，mg-h1/3的标准曲线为y＝0.00817x 0.00647，mg-h2的标准曲线为y＝0.01085x-0.00643，g-h1的标准曲线为y＝0.00773x 0.00161，cml的标准曲线为y＝0.01827x 0.00227，cel的标准曲线为y＝0.04269x-0.04979，pentosidine的标准
曲线为y＝0.00437x 0.02940，argpyrimidine的标准曲线为y＝0.01325x 0.07041，gold的标准曲线为y＝0.02036x 0.03308，mold的标准曲线为y＝0.01796x 0.01672。
22.本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
23.图1是本发明实施例的可以定量的12种不同阶段美拉德反应产物的形成示意图；
24.图2是本发明实施例的定量面包中furosine的离子色谱图；
25.图3是本发明实施例的定量面包中mg-h1/3的离子色谱图；
26.图4是本发明实施例的定量面包中mg-h2的离子色谱图；
27.图5是本发明实施例的定量面包中g-h1的离子色谱图；
28.图6是本发明实施例的定量面包中cml的离子色谱图；
29.图7是本发明实施例的定量面包中cel的离子色谱图图；
30.图8是本发明实施例的定量面包中的pentosidine离子色谱图；
31.图9是本发明实施例的定量面包中gold的离子色谱图；
32.图10是本发明实施例的定量面包中mold的离子色谱图；
33.图11是本发明实施例的回收率、日间精密度和日内精密度结果图。
具体实施方式
34.以下通过特定的具体实例说明本发明的技术方案。应理解，本发明提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤；还应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。
35.为了更好的理解上述技术方案，下面更详细地描述本发明的示例性实施例。虽然显示了本发明的示例性实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
36.本发明采用的仪器和试剂为：
37.ab sciex qtrap 5500液质联用仪，美国ab sciex
38.lgj-12型真空冷冻干燥机，北京松源华兴科技发展有限公司
39.ms204/a型电子天平，瑞士mettler toledo
40.allegra x-30r型多功能台式高速离心机，德国beckman coulter
41.n-20型多功能氮吹仪，山东云网数据科技有限公司
42.ed56型自然对流烘箱，德国binder gmbh
43.milli-q advantage a10型去离子水仪，美国bedford
44.zls-3型真空离心浓缩仪，湖南赫西仪器装备有限公司
45.jy92-iidn型超声波细胞粉碎机，宁波新芝生物科技股份有限公司
46.cml、cel标准品，美国cayman chemical
47.furosine、pyrraline、mg-h1/mg-h2/mg-h3、g-h1、cml、cel、pentosidine、argpyrimidine、gold、mold标准品，德国iris biotech gmbh
48.四硼酸钠、硼氢化钠、氢氧化钠、盐酸、甲酸、乙腈，上海阿拉丁生化科技股份有限公司
49.存储瓶，美国agilent technologies
50.0.22μm滤膜、2.5ml注射器、螺纹管、进样瓶、离心管，生工生物工程(上海)股份有限公司。
51.下面参考具体实施例，对本发明进行描述，需要说明的是，这些实施例仅仅是描述性的，而不以任何方式限制本发明。
52.实施例1
53.以面包(优片面包，产自上海桃李有限食品有限公司)为例提取美拉德反应产物：
54.取100g面包样品冷冻干燥，用研钵研磨成均匀的粉末。称取1g研磨后的样品于50ml离心管中，加入8ml氯仿-甲醇溶液(2:1，v/v)，剧烈混合10min后，在5000rpm下离心10min脱脂。分离得到沉淀物，用氮吹仪将沉淀物吹至近干后，将样品转移到螺纹管内，加入6ml混合液，混合液配方为体积比5:1的0.2mol/l ph 9.2的硼酸盐缓冲液与1mol/l用0.1mol/l氢氧化钠溶液配制的硼氢化钠溶液，置于室温下孵育4h。
55.孵育后加入80μl 5μg/ml mg-h1-d3、g-h1-13c2、cml-d4、cel-d4和gold-15n2内标品溶液来校正误差，之后向混合液中加入6ml 12mol/l hcl，在110℃下酸解24h，酸水解释放出美拉德反应产物，使其变成游离态；随后，于0℃，真空度0.1mbar，转速1000rpm下，真空离心浓缩至近干后加入4ml去离子水复溶，在超声频率25khz，功率100w条件下，超声10min。
56.将溶液过0.22μm滤膜，得滤液，取1ml加入进样瓶中。
57.制作标准曲线：
58.用20μg/ml furosine、20μg/ml pyrraline、20μg/ml mg-h1、20μg/ml mg-h2、20μg/ml mg-h3、20μg/ml g-h1、20μg/ml cml、20μg/ml cel、20μg/ml pentosidine、20μg/ml argpyrimidine、20μg/ml gold、20μg/ml mold、5μg/ml mg-h1-d3、5μg/ml g-h1-13c2、5μg/ml cml-d4、5μg/ml cel-d4、5μg/ml gold-15n2配制2ml含100ng/ml内标品的10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、400ng/ml和800ng/ml标准品溶液，配制条件如表1。
59.表1标准溶液配制条件
60.[0061][0062]
以美拉德反应产物标准品的浓度值为横坐标，以(标准品的积分色谱峰面积/同位素内标品的积分色谱峰面积)*同位素内标品的浓度值作为纵坐标来绘制标准曲线。furosine的标准曲线为y＝0.15599x 0.42612，pyrraline的标准曲线为y＝0.16891x 0.02758，mg-h1/3的标准曲线为y＝0.00817x 0.00647，mg-h2的标准曲线为y＝0.01085x-0.00643，g-h1的标准曲线为y＝0.00773x 0.00161，cml的标准曲线为y＝0.01827x 0.00227，cel的标准曲线为y＝0.04269x-0.04979，pentosidine的标准曲线为y＝0.00437x 0.02940，argpyrimidine的标准曲线为y＝0.01325x 0.07041，gold的标准曲线为y＝0.02036x 0.03308，mold的标准曲线为y＝0.01796x 0.01672。r2均在0.99754～0.99982。
[0063]
uplc-ms/ms检测：
[0064]
uplc条件：
[0065]
色谱柱：phenomenex kinetex 2.6μm f5 100a 100mm
×
3.0mm；
[0066]
柱温：40℃；
[0067]
流动相：
[0068]
5mmol/l甲酸铵(0.1％甲酸):乙腈(5mmol/l甲酸铵)＝98:2，0～6min，
[0069]
5mmol/l甲酸铵(0.1％甲酸):乙腈(5mmol/l甲酸铵)＝96:4，6～9min，
[0070]
5mmol/l甲酸铵(0.1％甲酸):乙腈(5mmol/l甲酸铵)＝5:95，9～10.2min，
[0071]
5mmol/l甲酸铵(0.1％甲酸):乙腈(5mmol/l甲酸铵)＝98:2，10.2～14min；
[0072]
流速：0.22ml/min；
[0073]
进样量：10μl。
[0074]
采用上述的洗脱条件使furosine、pyrraline、mg-h1/mg-h2/mg-h3、g-h1、cml、cel、pentosidine、argpyrimidine、gold、mold具有适合的保留时间和较好的峰形。
[0075]
质谱条件：
[0076]
离子源：电离子喷雾；
[0077]
扫描方式：正离子模式；
[0078]
检测模式：mrm；
[0079]
离子喷雾电压：5.5kv；
[0080]
雾化气体压力：60psi；
[0081]
干燥器温度：500℃；
[0082]
干燥气体压力：30psi；
[0083]
毛细管电压：500v。
[0084]
mrm质谱参数如表2：
[0085]
表2 mrm质谱参数
[0086][0087]
将处理后的样品进行uplc-ms/ms检测，检测模式为mrm，得到样品中美拉德反应产物的峰面积，求得样品中美拉德反应产物的浓度。
[0088]
样品检测结果如图2-图10所示，面包中furosine、mg-h1/3、mg-h2、g-h1、cml、cel、pentosidine、gold、mold的离子色谱峰。根据标准曲线最终分别求得面包中furosine浓度为10.69μg/g，mg-h1/3浓度为27.63μg/g，mg-h2浓度为16.12μg/g，g-h1浓度为10.42μg/g，cml浓度为3.41μg/g，cel浓度为2.32μg/g，pentosidine浓度为3.25μg/g，gold浓度为9.10μg/g，mold浓度为5.64μg/g。其余美拉德反应产物的浓度均低于仪器的定量限。同时为了验证该方法在面包中的可靠性，通过以下公式对加标浓度为200ng/ml的回收率进行评价：
[0089]
回收率(％)＝(加标后样品的浓度-样品原始浓度)*100％/加入的标准品浓度日内精密度和日间精密度通过在同一天内和连续五天内6次进样结果的相对标准偏差(rsd，％)来评估。
[0090]
结果如图11所示，面包中各种美拉德反应产物的加标回收率在85.90～101.96％，日间精密度≤9.3％，日内精密度≤8.0％，均在合理范围内，表明该方法具有可靠的精密度和准确度。
[0091]
实施例2
[0092]
以薯条(购自肯德基)为例，提取美拉德反应产物的步骤、标准曲线和uplc-ms/ms的仪器条件同实施例1，检测结果为薯条中furosine浓度为0.82μg/g，mg-h1/3浓度为12.41μg/g，mg-h2浓度为9.64μg/g，g-h1浓度为12.83μg/g，cml浓度为3.21μg/g，cel浓度为1.38μg/g，argpyrimidine浓度为0.37μg/g，gold浓度为0.42μg/g。其余美拉德反应产物的浓度均低于仪器的定量限。
[0093]
薯条中各种美拉德反应产物的加标回收率在86.29～111.45％，日间精密度≤9.3％，日内精密度≤8.3％，均在合理范围内，表明该方法具有可靠的精密度和准确度。
[0094]
综上，根据本发明的实施例，可对食品中美拉德反应各阶段产物(早期、中期、晚期)的含量进行全面准确分析。
[0095]
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不应理解为必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例进行接合和组合。
[0096]
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。