肺炎支原体、肺炎衣原体、呼吸道病毒IgM抗体检测试纸条、联合检测卡及其方法、应用与流程

肺炎支原体、肺炎衣原体、呼吸道病毒igm抗体检测试纸条、联合检测卡及其方法、应用
技术领域
1.本发明属于体外诊断试剂技术领域，具体涉及一种肺炎支原体、肺炎衣原体、呼吸道病毒igm抗体检测试纸条、联合检测卡及其方法、应用。


背景技术：

2.肺炎支原体(mycoplasma pneumoniae，mp)是引起上呼吸道感染的常见病原体之一；肺炎衣原体(chlamydia pneumoniae，cp)是人类呼吸道疾病的重要病原体，可引起急慢性呼吸道疾病，社区获得的肺炎、支气管炎和鼻窦炎5-10％由肺炎衣原体引起；呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，rsv)是一种有胞膜的单股负链rna病毒，属副黏病毒科肺炎属，是一个世界范围内严重危害婴幼儿健康的最常见的呼吸道感染性病原体；腺病毒(adenovirus，adv)是病毒性肺炎的主要病原体之一，是一种dna病毒，主要在细胞内繁殖；柯萨奇病毒b组(coxsackievirus group b，coxb)是一类常见的经呼吸道和消化道感染人体的病毒，可引起呼吸道感染、腹泻、脑膜炎、心肌炎、新生儿严重感染等；肺炎支原体/肺炎衣原体/呼吸道合胞病毒/腺病毒/柯萨奇病毒b组的现有检测方法大致相同，培养法具有高敏感性但耗时多，对实验室生物安全等级要求高；分子生物学技术虽然敏感度和特异性都俱佳，并且耗时短，但是需要昂贵的仪器配套以及专业的技术人员，对其在临床上推行有较大的限制作用。


技术实现要素：

3.为了克服现有技术中的上述不足，本发明的目的之一在于提供一种肺炎支原体、肺炎衣原体、呼吸道病毒igm抗体检测试纸条，实现可以体外定性检测人全血或血清样本中存在的肺炎支原体/肺炎衣原体/呼吸道合胞病毒/腺病毒/柯萨奇病毒b组igm抗体，具有灵敏度高、特异性高和耗时短的优点。
4.本发明的目的之二在于提供一种肺炎支原体、肺炎衣原体、呼吸道病毒igm抗体联合检测卡。
5.本发明的目的之三在于提供一种肺炎支原体、肺炎衣原体、呼吸道病毒igm抗体联合检测试剂盒。
6.本发明的目的之四在于提供一种肺炎支原体、肺炎衣原体、呼吸道病毒igm抗体联合检测卡的制备方法。
7.本发明的目的之五在于提供一种肺炎支原体、肺炎衣原体、呼吸道病毒igm抗体的检测方法，可以在仅需一次取样条件下，同时完成五种病原体的检测，极大地方便了患者及临床检验人员，且特异性及灵敏度较好。
8.为了实现上述目的之一，本发明采用以下技术方案：
9.本发明提供一种肺炎支原体、肺炎衣原体、呼吸道病毒igm抗体检测试纸条，包括样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水纸、底板，所述底板的上部贴合有所述硝酸纤维素膜，
所述硝酸纤维素膜上部两端分别贴合有所述金标垫和所述吸水纸，所述金标垫上部一端贴合有所述样品垫，其特征在于，所述金标垫上固定胶体金标记的小鼠igg和胶体金标记的肺炎支原体、肺炎衣原体、呼吸道合胞病毒、腺病毒或柯萨奇病毒b组的重组抗原，所述硝酸纤维素膜依次设有包被鼠抗人igm单克隆抗体的检测线和包被羊抗鼠igg的质控线。
10.为了实现上述目的之二，本发明采用以下技术方案：
11.本发明还提供一种肺炎支原体、肺炎衣原体、呼吸道病毒igm抗体联合检测卡，包括装有肺炎支原体、肺炎衣原体、呼吸道合胞病毒、腺病毒、柯萨奇b组病毒抗体检测试纸条的塑料外壳，其中所述塑料外壳设有五组加样孔和观察窗，所述加样孔在所述样品垫上方，所述观察窗在所述检测线和所述质控线上方。
12.为了实现上述目的之三，本发明采用以下技术方案：
13.本发明还提供一种肺炎支原体、肺炎衣原体、呼吸道病毒igm抗体联合检测试剂盒，包括一种肺炎支原体、肺炎衣原体、呼吸道合胞病毒、腺病毒、柯萨奇病毒b组igm抗体联合检测卡。
14.为了实现上述目的之四，本发明采用以下技术方案：
15.本发明还提供一种肺炎支原体、肺炎衣原体、呼吸道病毒igm抗体联合检测卡的制备方法，具体步骤如下：
16.s1、采用胶体金标记小鼠igg单克隆抗体，得到所述胶体金标记的小鼠igg；采用所述胶体金分别标记肺炎支原体、肺炎衣原体、呼吸道合胞病毒、腺病毒、柯萨奇病毒b组的重组抗原，得到对应的抗原-胶体金复合物；将所述胶体金标记的小鼠igg和所述对应的抗原-胶体金复合物分别混合，喷涂在所述金标垫上；
17.s2、将鼠抗人igm单克隆抗体包被在硝酸纤维素膜上，形成检测线；将羊抗鼠igg分别包被在位于所述检测线另一侧的所述硝酸纤维素膜上，形成质控线；干燥，制得设有所述检测线和所述质控线的所述硝酸纤维素膜；
18.s3、在底板上分别顺次搭接对应的所述样品垫、所述金标垫、所述硝酸纤维素膜和所述吸水纸，组成对应的板后，切成肺炎支原体、肺炎衣原体、呼吸道合胞病毒、腺病毒、柯萨奇病毒b组igm抗体检测试纸条；
19.s4、将制得的所述肺炎支原体、肺炎衣原体、呼吸道合胞病毒、腺病毒、柯萨奇病毒b组igm抗体检测试纸条各一条，装进所述塑料外壳中，调整所述肺炎支原体、肺炎衣原体、呼吸道合胞病毒、腺病毒、柯萨奇病毒b组igm抗体检测试纸条的位置，使所述加样孔在所述样品垫上方，所述观察窗在所述检测线和所述质控线上方，即得所述肺炎支原体、肺炎衣原体、呼吸道合胞病毒、腺病毒、柯萨奇病毒b组igm抗体联合检测卡。
20.进一步地，所述s1中，干燥的温度为45-55℃，相对湿度≤20％，干燥时间为0.5-2h；所述s2中，干燥的温度为55-60℃，相对湿度≤20％，干燥时间为14-16h。
21.为了实现上述目的之五，本发明采用以下技术方案：
22.本发明还提供一种肺炎支原体、肺炎衣原体、呼吸道病毒igm抗体的检测方法，用肺炎支原体、肺炎衣原体、呼吸道合胞病毒、腺病毒、柯萨奇病毒b组igm抗体联合检测卡对待检样品进行检测，所述检测方法包括以下步骤：
23.s1、将全血待检样品或血清待检样品依次滴加到所述肺炎支原体、肺炎衣原体、呼吸道合胞病毒、腺病毒、柯萨奇病毒b组igm抗体联合检测卡的所述五组加样孔中；
24.s2、再向所述五组加样孔中依次滴加所述样品稀释液，静置后，观察并判读结果；
25.s3、结果判读：若样本液中含有肺炎支原体、肺炎衣原体、呼吸道合胞病毒、腺病毒和/或柯萨奇病毒b组的igm抗体，则在对应试纸条的所述检测线位置上呈现相应的色条带；若待测样本中不含肺炎支原体、肺炎衣原体、呼吸道合胞病毒、腺病毒或柯萨奇病毒b组的igm抗体，则在所述对应试纸条的所述检测线上不显色；同时无论样本液中有无肺炎支原体、肺炎衣原体、呼吸道合胞病毒、腺病毒和/或柯萨奇病毒b组的igm抗体，各检测条的质控线都应呈现色条带，否则，检测无效。
26.进一步地，所述s1中，将10μl的所述全血待检样品依次滴加到所述肺炎支原体、肺炎衣原体、呼吸道合胞病毒、腺病毒、柯萨奇病毒b组igm抗体联合检测卡的所述五组加样孔中或者将5μl所述血清待检样品依次滴加到所述肺炎支原体、肺炎衣原体、呼吸道合胞病毒、腺病毒、柯萨奇病毒b组igm抗体联合检测卡的所述五组加样孔中。
27.进一步地，所述s2中，再向所述五组加样孔中依次滴加90μl所述样品稀释液。
28.进一步地，所述s2中，静置15min-25min后，判读结果。
29.本发明的检测原理：
30.检测阳性样本时，样品中含有的肺炎支原体/肺炎衣原体/呼吸道合胞病毒/腺病毒/柯萨奇病毒b组igm抗体，可分别与金标垫上胶体金标记的肺炎支原体、肺炎衣原体、呼吸道合胞病毒、腺病毒、柯萨奇病毒b组重组抗原结合形成复合物，该复合物在检测线处被鼠抗人igm捕获，从而凝集显色；胶体金标记的小鼠igg与质控线处包被的羊抗鼠igg结合而凝集显色。检测阴性样本时，样本中不含肺炎支原体、肺炎衣原体、呼吸道合胞病毒、腺病毒、柯萨奇病毒b组igm抗体，不能形成免疫复合物，则只能在质控线处显色。因此，无论肺炎支原体、肺炎衣原体、呼吸道合胞病毒、腺病毒、柯萨奇病毒b组igm抗体是否存在于临床样本中，一条红色条带都会出现在质控线(c)处。
31.与现有技术相比，本发明具有的有益效果如下：
32.(1)本发明提供的一种肺炎支原体、肺炎衣原体、呼吸道病毒igm抗体联合检测试剂盒，利用免疫层析技术，采用联检的模式，可以体外定性检测人全血或血清样本中存在的肺炎支原体、肺炎衣原体、呼吸道合胞病毒、腺病毒、柯萨奇病毒b组igm抗体，具有灵敏度高和耗时短的优点。
33.(2)本发明提供的一种肺炎支原体、肺炎衣原体、呼吸道病毒igm抗体的检测方法是一种快速免疫学方法，鉴于肺炎支原体、肺炎衣原体、呼吸道合胞病毒、腺病毒和柯萨奇病毒b组感染后症状相似，常合并感染，且均会产生特异性igm抗体，释放到血清等体液中，故采用五联检测试剂盒，在仅需一次取样条件下，同时完成五种病原体的检测，极大地方便了患者及临床检验人员，且特异性及灵敏度较好。
34.(3)本发明提供的一种肺炎支原体、肺炎衣原体、呼吸道病毒igm抗体联合检测卡的制备方法，制备方法简单，成本低廉，易于进行商业化生产。
附图说明
35.为了更清楚地说明本技术实施例中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附
图获得其他的附图。
36.图1是用本技术实施例1提供的试纸条的侧视结构示意图。
37.图2是用本技术实施例2提供的检测卡的俯视结构示意图。
38.图3是本技术实施例5提供的检测卡的检测结果判读示意图。
39.图中：1、样品垫；2、金标垫；3、硝酸纤维素膜；31、检测线；32、质控线；4、吸水纸；5、底板；6、加样孔；7、观察窗。
具体实施方式
40.为了使本技术要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下将结合实施例对本技术的技术方案进行清楚、完整的描述。应当理解此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本技术，并不用于限定本技术。
41.所用的试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
42.实施例1
43.本实施例提供一种肺炎支原体、肺炎衣原体、呼吸道病毒igm抗体检测试纸条，请参阅附图1，该试纸条包括样品垫1、金标垫2、硝酸纤维素膜3、吸水纸4、底板5，底板5的上部贴合有硝酸纤维素膜3，硝酸纤维素膜3上部两端分别贴合有金标垫2和吸水纸4，金标垫2上部一端贴合有样品垫1，在金标垫2上固定胶体金标记的小鼠igg和胶体金标记的肺炎支原体、肺炎衣原体、呼吸道合胞病毒、腺病毒或柯萨奇病毒b组的重组抗原，硝酸纤维素膜3依次设有包被鼠抗人igm单克隆抗体的检测线31和包被羊抗鼠igg的质控线32。
44.实施例2
45.本实施例提供一种肺炎支原体、肺炎衣原体、呼吸道病毒igm抗体联合检测卡，请参阅附图2，检测卡中包括装有实施例1提供的肺炎支原体、肺炎衣原体、呼吸道合胞病毒、腺病毒、柯萨奇b组igm抗体检测试纸条的塑料外壳，其中塑料外壳设有加样孔6和观察窗7，加样孔6在样品垫1上方，观察窗7在检测线31和质控线32上方。
46.实施例3
47.本实施例提供一种肺炎支原体、肺炎衣原体、呼吸道病毒igm抗体联合检测试剂盒，请参阅附图2，将实施例2提供的肺炎支原体、肺炎衣原体、呼吸道合胞病毒、腺病毒、柯萨奇病毒b组igm抗体联合检测卡、样品稀释液、说明书装盒得到试剂盒。
48.实施例4
49.本实施例提供一种肺炎支原体、肺炎衣原体、呼吸道病毒igm抗体联合检测卡的制备方法，具体步骤如下：
50.1)采用胶体金标记小鼠igg单克隆抗体，得到胶体金标记的小鼠igg；采用胶体金分别标记肺炎支原体、肺炎衣原体、呼吸道合胞病毒、腺病毒、柯萨奇病毒b组的重组抗原，得到对应的抗原-胶体金复合物；将胶体金标记的小鼠igg和对应的抗原-胶体金复合物分别混合，各自喷涂到金标垫2上，干燥，形成对应的金标垫2；其中，干燥的温度为45-55℃，相对湿度≤20％，干燥时间为0.5-2h；
51.2)将鼠抗人igm单克隆抗体包被在硝酸纤维素膜3上，形成检测线31；将羊抗鼠igg分别包被在位于检测线31另一侧的硝酸纤维素膜3上，形成质控线32；干燥，制得设有检测线31和质控线32的硝酸纤维素膜3；其中，干燥的温度为55-60℃，相对湿度≤20％，干燥时
间为14-16h。
52.3)在底板5上分别顺次搭接对应的样品垫1、金标垫2、硝酸纤维素膜3和吸水纸4，组成对应的板后，切成对应的试纸条；
53.4)将制得的肺炎支原体、肺炎衣原体、呼吸道合胞病毒、腺病毒、柯萨奇病毒b组病毒igm抗体检测条各一条进行组装，即得肺炎支原体、肺炎衣原体、呼吸道合胞病毒、腺病毒、柯萨奇病毒b组igm抗体联合检测卡；
54.5)进行试剂盒组装时，除一定数量的用铝箔袋密封好的检测卡外，放入对应量的样本稀释液及说明书，完成组装。
55.实施例5
56.本实施例提供一种肺炎支原体、肺炎衣原体、呼吸道病毒igm抗体的检测方法，具体步骤如下：
57.(1)样本处理
58.1.按常规方法采集全血或血清样本，样本采集及保存过程中应保证无菌操作。
59.2.全血标本可采用常规量的肝素(9.8～28iu/ml)、柠檬酸钠(3.8％)、乙二胺四乙酸(4.55mmol/ml
±
0.85mmol/ml)抗凝。
60.3.全血样本不可冻存，置于2～8℃可保存3天，样本于当天采集后检测最佳，已稀释样本不宜存放；血清样本不要反复冻融以防止抗体滴度降低，冻融次数不能多于6次，血清样本置于2～8℃可保存7天，-20℃可保存2年，-70℃可保存5年。
61.4.检测时应将样本融化后混匀，混浊或有沉淀的标本应离心或过滤澄清后检测。
62.(2)试剂盒的使用方法
63.1.使用前请将试剂盒、标本置室温下复温至少半个小时，使其恢复到室温；
64.2.从铝箔袋中取出检测卡，编写标本号，置水平桌面，检测卡如附图2所示；
65.3.向检测卡加样孔6中每孔加入10μl待测全血或5μl待测血清，再加入90μl样本稀释液；
66.4.在15min后，25min内判读结果。
67.(3)阳性判断值
68.肺炎支原体igm抗体阳性判断值为≥1.2(s/c值)，肺炎衣原体igm抗体阳性判断值为≥1.2(s/c值)，呼吸道合胞病毒igm抗体阳性判断值为≥1.2(s/c值)，腺病毒igm抗体阳性判断值为≥1.2(s/c值)，柯萨奇病毒b组igm抗体阳性判断值为≥1.2(s/c值)，根据地域的不同、人群的不同，建议各检验室建立自己的参考范围。
69.(4)结果判断
70.请参阅附图3
71.a、阴性：仅质控线32(c)处出现一条紫红色条带，在检测线31(t)处无紫红色条带出现。阴性结果表明：标本中不含有肺炎支原体/肺炎衣原体/呼吸道合胞病毒/腺病毒/柯萨奇病毒b组igm抗体，或是其含量低于可检测范围。
72.b、阳性：质控线32(c)处出现一条紫红色条带，在检测线31(t)处出现另一条紫红色条带。阳性结果表明：标本中含有肺炎支原体/肺炎衣原体/呼吸道合胞病毒/腺病毒/柯萨奇病毒b组igm抗体。
73.c、无效：质控线32(c)处未出现一条紫红色条带，表明操作过程不正确或检测卡已
损坏。
74.实验例
75.本发明试剂盒的临床性能评估试验
76.用实施例3提供的肺炎支原体、肺炎衣原体、呼吸道病毒igm抗体联合检测试剂盒和普通胶体金法试剂盒分别对50例肺炎支原体、肺炎衣原体、呼吸道合胞病毒、腺病毒、柯萨奇病毒b组病毒感染的患者和50例正常人的血清标本进行检测，结果如表1所示：
77.表1本发明试剂盒和普通胶体金法试剂盒检测灵敏度对比
[0078][0079][0080]
从表中可以看出，使用本发明的肺炎支原体、肺炎衣原体、呼吸道病毒igm抗体联合检测试剂盒检测血清标本特异性优异，相对于普通胶体金法试剂盒，检测灵敏度高，达到96％。
[0081]
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。